论文题目：葫芦素B作用于口腔鳞状细胞癌的网络药理学分析及实验研究
摘要：目的:口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）是一种发病率较高,预后较差的恶性肿瘤,目前缺乏理想的治疗药物。葫芦素B（cucurbitacin B,Cu B）是一种四环三萜类小分子化合物,具有多种生物学功能,尤其抗肿瘤方面倍受关注。本研究通过网络药理学、体内动物实验和体外细胞实验,探讨Cu B对OSCC的作用和潜在机制。方法:第一部分:葫芦素B作用于口腔鳞状细胞癌的网络药理学分析:通过CTD数据库、HERB数据库、ETCM数据库和Pharm Mapper数据库预测Cu B的相关靶点;使用Gene Cards、OMIM数据库收集OSCC的潜在治疗靶点;通过Venn图获取Cu B-OSCC的交集靶点;基于STRING平台构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络,并且通过Cytoscape软件进行可视化分析,以筛选核心基因;基于Metascape平台,进行了GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析,以筛选核心通路;通过Autodock vina 1.1.2软件对Cu B和核心基因进行分子对接,以验证药物和核心小分子之间的结合力。第二部分:葫芦素B作用于口腔鳞状细胞癌的体外细胞实验研究:本部分研究内容是将Cu B作用于SCC25和CAL27细胞,以验证网络药理学的分析结果。采用CCK-8法分别在24h、48h和72h检查Cu B对细胞生长抑制作用;采用集落形成实验检测Cu B对细胞克隆形成能力的影响;采用细胞划痕实验检测Cu B对细胞迁移能力的影响;流式细胞术检测Cu B对细胞周期和凋亡的影响;采用Western blot检测Cu B作用后,对关键通路信号分子的蛋白表达水平的影响。第三部分:葫芦素B在4NQO诱导的口腔鳞状细胞癌动物模型中的体内研究:通过4NQO饮水法诱导C57BL/6小鼠舌部口腔鳞状细胞癌的发生。同时,连续20周给小鼠腹腔注射Cu B,停药观察4周,总计24周。通过记录小鼠饮水和体重情况,观察药物对小鼠饮水和整体状况的影响;将小鼠解剖,对舌组织进行肉眼观察及组织病理学诊断,研究Cu B对OSCC的抑制作用。结果:网络药理学分析结果:1.Cu B预测到317个靶点,OSCC相关治疗靶点有1584,二者取交集后共获得134个共同靶点。2.我们对交集靶点进行PPI分析显示,PIK3R1、SRC、STAT3、AKT1和MAPK1是其中的核心靶蛋白。3.GO功能富集分析显示,生物过程（BP）共富集到1805个条目;细胞组分（CC）共有88个条目;分子功能（MF）共富集到137个条;KEGG通路富集结果显示,共富集到188条通路,PI3K-AKT是其中最为关键的通路。4.分子对接结果显示,Cu B和PIK3R1、SRC、STAT3、AKT1和MAPK1之间的结合力均小于-6 kcal/mol,说明药物和小分子之间结合良好,Cu B可能通过核心靶点对OSCC发挥作用。体外细胞实验结果:1.通过CCK8实验发现Cu B能抑制SCC25和CAL27细胞生长,且具有浓度和时间依赖性。集落形成实验表明Cu B对SCC25和CAL27细胞的克隆形成能力具有抑制作用。这均说明Cu B能抑制癌细胞增殖。2.流式细胞实验表明与未加药组相比,Cu B处理后SCC25和CAL27细胞的细胞周期阻滞在G2期,并且Cu B处理组的SCC25和CAL27细胞凋亡均增加,差异具有统计学意义。这均说明Cu B能通过阻滞细胞周期和诱导凋亡抑制癌细胞增殖。3.细胞划痕实验表明与未加药组相比,Cu B处理后SCC25和CAL27细胞的迁移明显减少,几乎没有迁移。这说明Cu B能抑制OSCC细胞的迁移能力。4.在体外细胞实验进行Western Blot实验验证药物对关键通路的调控作用,结果显示Cu B能在SCC25细胞中抑制PI3K-AKT通路相关信号分子p-PI3K、p-AKT、p-m TOR的磷酸化。这说明Cu B可能通过调控核心通路PI3K-AKT抑制OSCC生长。体内动物实验结果:1.饮4NQO水的各组小鼠间饮水量统计学没有差异,说明4NQO对各组小鼠诱癌作用相同。2.实验末期,Cu B治疗组比模型组小鼠体重要重,差异具有统计学意义,说明经Cu B治疗后小鼠整体状态更佳,体重更重。3.通过肉眼观察和组织病理学分析,发现经Cu B治疗后小鼠病情更轻,说明Cu B能抑制4NQO诱导的小鼠口腔癌进展。结论:1.网络药理学分析表明Cu B作用于OSCC的靶点共有134个,其中PIK3R1、SRC、STAT3、AKT1和MAPK1是较为关键的5个,并且分子对接表明Cu B和核心靶点结合良好。Cu B作用于OSCC的核心通路是PI3K-AKT通路。2.体外细胞实验表明,Cu B能抑制SCC25和CAL27细胞增殖,迁移,能将SCC25和CAL27细胞的细胞周期阻滞在G2期,并诱导细胞凋亡。Western Blot实验表明Cu B能调控PI3K-AKT通路的表达。3.我们通过体内动物实验表明Cu B对4NQO诱导的C57BL/6小鼠口腔黏膜癌变模型有抑制作用。
关键词：葫芦素B;口腔鳞状细胞癌;网络药理学;分子对接;PI3K-AKT通路
学科专业：口腔临床医学
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前言
第一部分 葫芦素B作用于口腔鳞状细胞癌的网络药理学分析
1 数据库与方法
1.1 数据库与软件
1.2 CuB靶点预测
1.3 OSCC靶点预测
1.4 构建CuB与 OSCC交集靶点基因Venn图
1.5 构建共同靶点蛋白相互作用(protein-proteininteraction,PPI)网络及筛选核心靶点
1.6 GO及 KEGG通路富集分析
1.7 分子对接
2 结果
2.1 CuB和 OSCC的预测靶点
2.2 CuB和 OSCC交集靶点的蛋白互作网络(protein-proteininteraction,PPI)分析
2.3 GO和 KEGG富集分析
2.4 分子对接
3 讨论
3.1 CuB的生物学功能
3.2 CuB作用于OSCC的核心靶点
3.3 CuB抗 OSCC的关键通路
4 结论
第二部分 葫芦素B作用于口腔鳞状细胞癌的细胞实验研究
1 材料与方法
1.1 主要细胞、药物和试剂
1.2 主要仪器和设备
1.3 细胞培养
1.4 药物溶液配置
1.5 CCK8测细胞增殖
1.6 平板克隆实验测细胞增殖
1.7 伤口愈合实验测细胞迁移能力
1.8 流式细胞术测细胞周期
1.9 流式细胞术测细胞凋亡
1.10 Western blot检测关键通路相关靶蛋白的表达
1.11 统计分析
2 结果
2.1 CCK8检测CuB对 OSCC细胞的生长抑制作用
2.2 CuB抑制OSCC细胞集落形成
2.3 CuB对 OSCC细胞周期、凋亡的影响
2.4 CuB对 OSCC细胞迁移的影响
2.5 CuB抑制PI3K-AKT通路活化
3 讨论
3.1 CuB抑制SCC25和CAL27细胞增殖、迁移、阻滞细胞周期在G2期以及诱导凋亡
3.2 CuB抑制PI3K-AKT通路的表达
4 结论
第三部分 葫芦素B在4NQO诱导的口腔鳞状细胞癌动物模型中的体内研究
1 材料与方法
1.1 实验动物
1.2 实验试剂
1.3 实验设备
1.4 实验分组及处理
1.5 给药方法与药物剂量
1.6 实验过程
1.7 组织病理学分析
1.8 统计分析
2 结果
2.1 小鼠饮水情况
2.2 小鼠体重情况
2.3 小鼠舌部黏膜情况
3 讨论
3.1 4NQO诱导口腔鳞状细胞癌动物模型
3.2 葫芦素B抑制4NQO诱导的小鼠口腔癌模型
4 结论
参考文献
综述 葫芦素 B 的抗癌作用研究进展
参考文献
致谢
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