论文题目：基于Lab色彩模型探讨健康人不同舌象微生物特征及与T2DM的对照研究
摘要：研究背景舌诊作为望诊的重点内容,是获取中医临床辨证论治所需客观指标的重要方法之一。现代科技背景下,中医微观化、客观化领域的现代化研究方兴未艾,并把舌诊作为一个重要突破口。中医学强调整体观,并以司外揣内、见微知著等基本原则指导理论研究与临床实践,而微生态学作为细胞及分子水平的生态学,二者在基本理论观点上具有相似性,这也是二者得以合作的切入点。随着舌苔微生态领域研究的逐渐深入以及更新更好的微生物技术的使用,将能更好的发现理解疾病与中医舌象变化、舌苔微生态之间的相互关系及变化规律,不断深入挖掘中医舌诊的科学内涵,使中医舌诊更好地在临床实践乃至现代医学诊疗中发挥优势与作用。然而目前舌苔微生态研究多集中于特定疾病的特定舌苔类型,受疾病特异性因素干扰,研究结果可重复性差。本研究以健康人群的八种舌苔类型为主要研究对象,通过宏基因组测序的方式探寻不同舌象的微生物学特征及与疾病的关系。研究目的从舌苔微生物的角度,研究中医舌象的科学规律与形成机制,揭示现代医学背景下中医舌象可能的生物学基础。描绘健康人舌象的微生物学特征,寻找不同舌象各自的标志性微生物,与糖尿病相同舌象相对照,寻找“异病同证”背景下的疾病特异性相关的特征微生物。同时运用现代科技手段探索中医舌象诊断标准化,建立可靠的舌象辅助辨证方法,为进一步相关研究奠定方法学基础。研究方法在舌象辅助辨证的基础上,我们将健康人群的舌苔按颜色、厚度和湿润度分为八种类型,包括薄白、薄白腻、白厚腻、白厚燥、薄黄、薄黄腻、黄厚腻、黄厚燥。首先使用中国上海DAOSH公司研制的DS01-G舌象采集仪,对健康志愿者和糖尿病患者的舌苔进行标准化拍照。其次在口腔清洁后使用无菌植绒棉拭子按标准化操作流程在舌中部位采集微生物群,并保存在微基微生物标本冻存管,-80度冰箱内保存。使用蛋白酶K裂解结合苯酚氯仿提取法从样品中提取总DNA。在1.2%琼脂糖凝胶上运行样品检测。测序文库由 NEBNext（?）UltraTM DNA Library Prep Kit for Illumina（?）（New England Biolabs公司,美国）构建。利用微基生物技术（上海）有限公司的Illumina Novaseq 6000、150-bp配对末端技术对基因组文库进行了测序。将预测的基因进行聚类,并使用CD-HIT包构建非冗余基因目录（参数:一致性identity=95%,覆盖率coverage=90%）。利用BEDtools中的基因组计算覆盖度功能快速估算了基因的丰度。使用DIAMOND软件对非冗余数据库（Non-Redundant Database,NR）进行分类。使用R语言函数中的cor.test进行相关性系数的计算和检验,使用R的igraph软件（版本1.2.5）进行共生网络构建。使用R中的prcomp和分类学丰度信息执行主成分分析,并通过R中的ggplot2将其绘制。使用非参数秩和检验对微生物群结果进行分析,使用 LEfSe v1.0 进行 LEfSe 分析。统计学使用 SPSS（版本 24）及 Microsoft Excel 2020软件,P值＜0.05被认为有显著统计学意义。研究结果研究一:1.舌象辅助辨证我们分析了 72例入组舌象中间部位的L值、A值与B值。结果显示,LAB色彩量化体系与人工舌象诊断存在显著相关性。其中反应色彩亮度的L值在各组中无显著差异。B值与苔色正相关,白苔整体B值低,黄苔整体B值高。在利用道生手持舌象仪拍摄条件下,b值低于8.5可判定为白苔,高于8.5可判定为黄苔;A值与舌苔厚薄呈负相关,薄苔整体A值高,厚苔整体A值底。白苔中低于21为厚苔,高于21为薄苔,黄苔中低于17为厚苔,高于17为薄苔。研究二:1.基线特征通过病例筛查入组的180人中,最终有94人的舌苔样本被用于舌苔微生物群分析。队列中女性占74.47%,男性占25.53%。每组的年龄一般在45岁至55岁之间,组间无显着性差异。最常见的舌苔是薄白、薄黄腻和薄白腻,每种舌苔人数超过20例。72.24%的舌苔可以定义为薄苔,而27.76%属于厚苔,白色舌苔的百分比为57.45%,高于黄色舌苔的42.55%,腻苔受试者比例69.15%。2.舌苔微生物群落特征研究人群中最丰富的属是普雷沃氏菌（Prevotella）,平均丰度为15.7%,奈瑟菌（Neiseria）为13.1%。其次依次为链球菌（Strptococcus）为10.8%,放线菌（Actinomyces）为8.8%,韦永氏菌（Veillonella）为8.4%等。最常见的门系是厚壁菌门（Firmicutes）,达到最高丰度27.9%,其次是拟杆菌门（Bacteriodetes）,变形菌门（Proteobacteria）,放线菌门（Actinobacteria）和梭杆菌门（Fusobacteria）,其丰度分别为21.9%、19.9%、18.9%、5.7%。根据主成分分析结果发现相对于不同的舌苔类型,它们的微生物β多样性并没有存在显著差异。3.不同舌苔类型特征微生物选取LDA高于3的细菌作为特征微生物。其中薄白苔为芽孢杆菌目（Bacillales order）;白厚腻舌苔为微小球菌（Megasphaera micronuciformis）,韦永氏菌（Vellonella）及婴儿链球菌（Streptococcus infantis）;薄黄苔为变形菌门（Proteobacteria）;黄厚腻舌苔为产黑素普雷沃菌（Prevotella melaninogenica）及殊异韦荣菌（Veillonella dispar）。4.不同舌苔微生物的临床疾病对应关系白厚腻苔的韦永氏菌是一种特定的“寒态”胃炎的致病菌,微小球菌在胃癌患者的舌苔中富集,而婴儿链球菌则表明了癌前级联反应;薄黄苔中莫拉菌属（Moraxella genus）和细长肾形奈瑟氏菌（Neisseria elongate）是口咽部常见的细菌菌群。莫拉菌属可以增加引起机会性感染的风险,而细长肾形奈瑟氏菌有机会引起心内膜炎、骨髓炎和胰腺癌;黄厚腻舌苔的产黑素普雷沃菌（Prevotella melaninogenica）和殊异韦荣菌（Veillonella dispar）与食管鳞状细胞癌、口腔鳞状细胞癌相关,短小奇异菌（Pobium parvulum）能够引起脓毒症,等。5.舌苔微生物群的共生网络白厚腻舌苔中高度富集的婴儿链球菌（Streptococcus infantis）与链球菌（Streptococcus peroris）呈正相关;薄黄苔特征菌细长肾形奈瑟氏菌（Neisseria elongate）与生痰二氧化碳嗜纤维菌（Capnocytophagas sputigena）呈正相关;黄厚腻舌苔中,产黑素普雷沃菌属（Prevotella melaninogenic）、殊异韦荣菌（Veillonella dispar）和短小奇异菌（Atopobium parvulum）呈显著正相关性,表明这些细菌在黄厚腻舌苔中的共存和共生关系。6.糖尿病疾病特异性细菌标志物在糖尿病患者的黄厚腻舌苔中,二氧化碳嗜纤维菌属（Capnocytophagagenus）高度富集,这种具有潜在致病能力的细菌与牙周炎和1型糖尿病密切相关。与糖尿病患者相比,产黑素普雷沃菌属（Prevotellamelaninogenic）在健康人群中更显著地富集。7.糖尿病黄厚腻苔与健康人黄厚腻苔的功能差异T2DM患者相较于健康人具有更高水平的抗药性基因表达,主要为大环内酯类抗生素;T2DM患者相较于健康人具有更高水平的碳水化合物酶表达,主要为糖苷水解酶;T2DM患者具有更高水平的ABC转运蛋白、AMPK信号通路、FoxO信号通路、胰岛素信号通路、过氧化物酶体、催乳素信号通路等聚类基因表达,健康人具有更高水平的细胞凋亡聚类基因表达,提示胆固醇的转运调节、催乳素水平、氧化还原反应及细胞凋亡可能是二者生理病理功能方面的主要差异。结论基于Lab色彩体系辅助中医舌象辨证研究结果显示了中医舌象辨证的主观性,发现A、B色彩量化能够规范、辅助中医辨证,总结出A、B值辅助辨证的具体参考数值,具有很强的实用性。本研究结果经更多舌象图片辨证与数字化的验证之后,能够实现色彩量化辅助、规范舌象辨证的广泛应用。随后通过宏基因组测序对微生物组成进行了研究,确定了具有健康人群不同类型舌苔的独特细菌特征,构建了舌苔微生物间的共生关系。这为破译舌苔形成机制提供了有价值的参考,为今后的中医现代化诊断提供了方便。此外,我们进一步研究了健康个体和糖尿病患者之间的差异标记细菌,证明了疾病对舌苔微生物的特异性影响,并强调了在健康人群中识别不同舌苔类型标记细菌的必要性。
关键词：舌诊;微生物组;舌苔菌群;糖尿病;色彩分析
学科专业：中医内科学
摘要
ABSTRACT
文献综述
综述一 舌苔微生物在现代医学诊疗中的潜在作用
参考文献
综述二 中医舌苔菌群研究进展
参考文献
前言
研究一 基于Lab色彩模型辅助中医舌象辨证
1 材料与方法
2 结果
2.1 舌象图片中部位置的设定及中医医生舌象辨证流程
2.2 L值与舌象分类不相关
2.3 利用B值进行白苔与黄苔的区分
2.4 利用A值进行薄苔与厚苔的区分
2.5 a值，b值与舌象判定的相关性分析
3.讨论
研究二 基于宏基因组学探讨健康人不同舌苔微生态特征及与T2DM的对照研究
1 研究目的
2 材料与方法
3 研究结果
3.1 基本信息
3.2 舌苔微生物群落特征
3.3 与不同舌苔类型的特征细菌有关的疾病
3.4 舌苔微生物群的相关网络分析
3.5 疾病特异性舌苔细菌标志物
4 讨论
结语
创新点
存在问题与不足
参考文献
致谢
附件