论文题目：基于多元微生物载体的玉米赤霉烯酮高灵敏免疫层析检测方法研究
摘要：玉米赤霉烯酮（ZEN）是一种由镰刀菌属产生的具有雌激素作用的真菌毒素,可通过污染谷物和饲料进入食物链,严重危害人类和动物的健康,近年来已成为食品安全领域的研究重点。因此,研发快速、灵敏、准确的ZEN检测技术对于保障全球食品安全具有重要的现实意义。免疫层析技术（ICA）是将免疫技术、色谱层析技术和纳米材料技术相结合的一种快速检测方法,具有操作简单、成本低廉且不依赖大型设备等优点,被广泛应用于真菌毒素检测。然而传统以胶体金（Au NPs）为标记载体的ICA,由于Au NPs的尺寸小、稳定性差而导致其检测灵敏度较低。相比于Au NPs,微生物（MOs）具有比表面积大、官能团丰富等优势,可利用其作为有效模板制备特定结构和多功能的载体,有望研究开发一种基于MOs标记的新型ICA,以克服传统胶体金的局限性,提高ICA的检测性能。基于此,本文结合MOs的众多优点,设计了四种具有优异特性的MOs载体并探究其合成机理,构建了一系列MOs新型ICA高灵敏检测玉米和小米中的ZEN,并分别对相关检测性能和实际应用潜力进行评价。论文主要研究内容和结果如下:1.金纳米粒子功能化微生物增敏的免疫层析技术检测ZEN利用酵母菌（Yeast）和乳酸菌（LAB）的生物吸附和生物还原作用,与HAu Cl4反应原位合成载有金纳米粒子（Au NPs）的微生物复合材料（Yeast@Au NPs和LAB@Au NPs）。通过对微生物@Au NPs（MO@Au NPs）的合成条件（p H和反应时间）和主要特性（形貌、直径和官能团）等进行探究,证明了合成的MO@Au NPs具有尺寸大（约2μm）、吸附能力强,标记单克隆抗体（m Abs）量少的特点,使得ICA的检测限显著降低。经过优化后,Yeast@Au NPs-ICA和LAB@Au NPs-ICA检测ZEN的线性范围分别为0.375–12 ng/m L和0.18–12 ng/m L,检测限（LOD）分别为0.078和0.118ng/m L,比传统Au NPs-ICA低14倍。同时,该方法对ZEN具有高度特异性,能检测到玉米和小米中含有ZEN的最低量为1.5μg/kg,平均回收率为81.55–127.70%,说明该方法具有良好的稳定性和准确度。2.SABPDs定向修饰抗体的双信号免疫层析技术检测ZEN利用金黄色葡萄球菌（SA）表面蛋白A可以特异性结合m Abs的Fc区域的特点,本研究采用SA和对苯二酚（HQ）作为前体,通过席夫碱反应和自组装策略制备了SA-生物合成聚合物点（SABPDs）,构建了基于SABPDs定向标记的双信号免疫层析技术（SABPDs-DICA）。实验证明SABPDs具有尺寸均一的球菌形态、蓝绿色荧光和可见棕色信号,以及靶向m Abs的Fc区域的能力。并通过计算SABPDs标记m Abs的亲和力常数（ka）和平衡解离常数（KD）,验证了该载体能够保留m Abs固有的生物活性。因此制备的SABPDs不仅能有效暴露m Abs的抗原结合位点,而且赋予了ICA优良的比色-荧光双信号,可进一步提高灵敏度。在最佳条件下,SABPDs-DICA能够检测低至0.036 ng/m L的ZEN,且具有优良的特异性和重复性。SABPDs-DICA在玉米和小米中可检测到的ZEN最低量为0.72μg/kg,回收率良好,并且假阳性率和假阴性率均为0%。以上检测结果与液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）分析结果均一致,实现了该方法对ZEN的高灵敏度和准确性检测。3.一步生物染色的SAD通用型免疫层析技术检测ZEN由于染料具有颜色鲜亮、成本低、与微生物蛋白结合快速等优势,本研究利用生物染色自组装策略为ICA创建SA-染料（SAD）载体,选择刚果红（CR）和异硫氰酸荧光素（FITC）分别嵌入SA中制得SACR和SAFITC,为m Abs的定向固定提供了高亮度和丰富的特异性结合位点。实验揭示了SAD定向结合m Abs的机理并通过计算ka表明SAD具有更高的m Abs生物活性(ka为10~9 M-1),为进一步提高灵敏度提供依据。将SACR和SAFITC应用于ICA分别实现了比色和荧光检测ZEN,结果表明所构建的SAD-ICAs具有更低的检测限（0.013 ng/m L）、良好的相关性（R~2＞0.98）、重现性（RSD＜8%）、特异性以及稳定性。此外,SAD-ICAs在玉米和小米中ZEN最低检测限为0.36μg/kg,平均回收率为81.5-124.6%,该方法与LC-MS/MS分析结果均一致。将SACR和SAFITC混合应用于ICA也成功实现了ZEN的双信号检测。以上结果表明,通过替换不同的染料和相应的m Abs,SAD-ICAs可以推广到其他食品安全危害因子的现场和多模式检测中。4.Ru（bpy）32+掺杂SAQDs的信号增强双读出免疫层析技术检测ZEN为了进一步提高检测性能,本研究利用“时空耦合”策略原位合成SA-量子点（SAQDs）,将Ru（bpy）32+掺入SAQDs中制得SAQDs Ru作为新型载体,建立了基于SAQDs Ru的信号增强双读出免疫层析技术（SAQDs Ru-DICA）。实验探究了SAQDs Ru的合成机理,并证明该载体表现出强发光、优异的稳定性和高ZEN亲和力等特点,可显著提高检测灵敏度。经实验条件优化,SAQDs Ru-DICA的检测限低至0.008 ng/m L（比色模式）和0.0058 ng/m L（荧光模式）,同时具有良好的特异性和可重复性。将SAQDs Ru-DICA与智能手机APP相结合,开发了一种便携式传感系统以实现更加便捷的检测。此外,SAQDs Ru-DICA在玉米和小米中ZEN最低检测限为0.16μg/kg,回收率测定为85.58–118.83%,RSD小于5.62%。同时也对自然污染的实际样品进行了检测,结果与LC-MS/MS检测结果一致,表明该方法在食品安全领域具有广阔的应用前景。
关键词：玉米赤霉烯酮;免疫层析技术;微生物载体;高灵敏;食品安全检测
学科专业：食品科学与工程
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 玉米赤霉烯酮的概述
1.1.1 玉米赤霉烯酮的理化性质
1.1.2 玉米赤霉烯酮的危害
1.1.3 玉米赤霉烯酮的污染现状和限量标准
1.2 玉米赤霉烯酮的检测方法及其研究进展
1.2.1 薄层色谱法(TLC)
1.2.2 高效液相色谱法(HPLC)
1.2.3 液相色谱-质谱联用法(LC-MS)
1.2.4 免疫学检测方法
1.3 提高免疫层析技术灵敏度的方法概述
1.3.1 信号放大技术
1.3.2 新型纳米材料的应用
1.3.3 识别分子的替换
1.3.4 试纸条结构的改进
1.3.5 抗体固定化方法
1.3.6 双信号检测
1.3.7 各种新型方法的结合
1.4 微生物辅助合成纳米材料的研究概述
1.4.1 微生物辅助合成金属纳米粒子(NPs)
1.4.2 微生物辅助合成量子点(QDs)
1.4.3 微生物辅助合成其他纳米材料
1.5 研究目的及意义
1.6 研究内容
1.7 技术路线
第二章 金纳米粒子功能化微生物增敏的免疫层析技术检测ZEN
2.1 引言
2.2 材料与方法
2.2.1 主要材料
2.2.2 试验设备
2.2.3 Yeast@AuNPs和 LAB@AuNPs载体的制备
2.2.4 Yeast@AuNPs-mAb和 LAB@AuNPs-mAb探针的制备
2.2.5 试纸条的组装
2.2.6 性能测定
2.2.7 实际样品的测定
2.3 结果与分析
2.3.1 MO@AuNPs-ICA的原理
2.3.2 研究不同微生物对HAuCl_4的还原能力
2.3.3 Yeast@AuNPs和 LAB@AuNPs载体制备的条件优化
2.3.4 Yeast@AuNPs和 LAB@AuNPs载体的表征
2.3.5 Yeast@AuNPs-ICA和 LAB@AuNPs-ICA条件的优化
2.3.6 Yeast@AuNPs-ICA和 LAB@AuNPs-ICA的性能测定
2.3.7 传统的AuNPs-ICA性能测定
2.3.8 MO@Au NPs-ICA在实际样品中的应用
2.4 讨论
2.5 本章小结
第三章 SABPDs定向修饰抗体的双信号免疫层析技术检测ZEN
3.1 引言
3.2 材料与方法
3.2.1 主要材料
3.2.2 试验设备
3.2.3 SABPDs载体的制备
3.2.4 SABPDs-mAb探针的制备
3.2.5 评估载体对mAbs偶联效率
3.2.6 SABPDs定向结合mAbs能力的验证
3.2.7 试纸条的组装
3.2.8 性能测定
3.2.9 数据处理
3.2.10 实际样品的测定
3.3 结果与分析
3.3.1 SABPDs的合成机理和SABPDs-DICA的检测原理
3.3.2 制备SABPDs的条件优化
3.3.3 SABPDs载体的表征
3.3.4 SABPDs的光学特性和SABPDs-mAb探针的表征
3.3.5 SABPDs定向标记mAbs的验证及其对mAbs活性的影响
3.3.6 非特异性吸附的研究
3.3.7 SABPDs-DICA的条件优化
3.3.8 SABPDs-DICA检测性能的评估
3.3.9 SABPDs-DICA在实际样品中的应用分析
3.4 讨论
3.5 本章小结
第四章 一步生物染色的SAD通用型免疫层析技术检测ZEN
4.1 引言
4.2 材料与方法
4.2.1 主要材料
4.2.2 试验设备
4.2.3 SAD载体的制备
4.2.4 SAD-mAb探针的制备
4.2.5 试纸条的组装
4.2.6 SAD-ICAs的性能测定
4.2.7 数据处理
4.2.8 实际样品的测定
4.3 结果与分析
4.3.1 SAD的合成机理及SAD-ICAs的原理
4.3.2 研究不同染料对SA的着色程度以及在ICA上的适用性
4.3.3 SAD载体的合成和表征
4.3.4 SAD-蛋白质偶联物的表征
4.3.5 SAD定向结合mAbs 的机理及mAbs 的结合量
4.3.6 不同纳米探针的k_a计算
4.3.7 SACR-CICA和 SAFITC-FICA的条件优化
4.3.8 SACR-CICA和 SAFITC-FICA的性能测定
4.3.9 双信号SACR-SAFITC-ICA的条件优化
4.3.10 双信号SACR-SAFITC-ICA的性能测定
4.3.11 SAD-ICAs在实际样品中的应用分析
4.4 讨论
4.5 本章小结
第五章 Ru(bpy)_3~(2+)掺杂SAQDs的信号增强双读出免疫层析技术检测ZEN
5.1 引言
5.2 材料与方法
5.2.1 主要材料
5.2.2 试验设备
5.2.3 SAQDsRu载体的制备
5.2.4 SAQDsRu-mAb探针的制备
5.2.5 试纸条的组装
5.2.6 SAQDsRu-DICA的性能测定
5.2.7 数据处理
5.2.8 实际样品的测定
5.3 结果与分析
5.3.1 SAQDsRu的合成机理与SAQDsRu-DICA的检测原理
5.3.2 SAQDsRu载体的表征及合成机理探究
5.3.3 SAQDsRu的光学特性与SAQDsRu-蛋白质的表征
5.3.4 SAQDsRu-mAb和 ZEN之间的生物亲和力
5.3.5 SAQDsRu-DICA的条件优化
5.3.6 SAQDsRu-DICA的检测性能评估
5.3.7 基于智能手机的集成系统用于ZEN分析
5.3.8 不同方法检测ZEN的性能比较
5.3.9 SAQDsRu-DICA在实际样品中的应用分析
5.4 讨论
5.5 本章小结
第六章 结论
6.1 结论
6.2 创新点
6.3 展望
参考文献
致谢