论文题目：病证结合序贯辨证治疗Graves病临床观察及相关机制探讨
摘要：背景:毒性弥漫性甲状腺肿伴甲状腺功能亢进症（Graves’ Disease,GD）是一种全身性自身免疫性疾病,其特征是甲状腺抗原特异性T细胞浸润到表达促甲状腺激素受体的组织中,GD中的刺激性自身抗体激活促甲状腺激素受体,导致甲状腺增生和不受调节的甲状腺激素产生和分泌。在我国GD的患病率约为0.53%,每年的发病率约在20/10万～30/10万。本病病程长,易复发,临床症状及体征表现明显,对患者的生活、工作、仪表形象影响甚大,已经成为严重危害我国居民生命健康的重大疾病之一。中医在治疗Graves病方面积累了一定经验,在改善症状,抗复发、缩短疗程等方面有一定优势。我们在多年的临床实践中,总结形成Graves病病证结合诊疗方案。在治疗上以中西医结合为主,在西医改善指标的基础上,因病、因人、因时辨证施治,取得显著疗效。前期研究结果显示,病证结合序贯辨证治疗可以提高Graves病的长期缓解率,降低复发率。但目前尚缺乏高质量临床研究证据且作用机制尚未明确,无法大范围推广使用。因此,本研究依托于国家中医临床研究基地开放课题（项目批号:JD2019SZXZD08）,证实病证结合序贯辨证治疗Graves病的效果与优势,探讨中医用药规律及核心处方相关疗效机制,以及相关生物标志物及其代谢途径。第一章:病证结合序贯辨证治疗Graves病的临床观察目的:评价病证结合序贯辨证治疗Graves病的有效性及安全性。方法:采用多中心、随机、开放性、病例对照研究设计,将符合纳排标准的Graves病患者按照3:1的比例随机分配至治疗组、对照组。所有患者均得到饮食及生活方式的指导,治疗组患者予以病证结合序贯辨证治疗,对照组予以西医常规治疗,治疗24周。观察两组的基线指标、有效性评价指标及安全性指标,其中基线指标包括性别、年龄、身高、体重、血压、心率等一般情况,甲状腺体积、肝功、白细胞数量等;有效性评价指标包括主要疗效指标:FT3、FT4、TSH,次要疗效指标:aTPO、aTG、TRAb、ALT、AST、白细胞数量、突眼分级、甲状腺体积、甲亢诊断指数评分、中医症状积分;安全性指标包括一般体检项目检查,肾功能（BUN,Cr）、尿常规、便常规、心电图,不良事件的情况等。结果:①基线:两组患者在年龄、性别、身高、血压、肝功、甲状腺体积等基线水平资料上具有可比性（P＞0.05）。②临床疗效观察:病证结合序贯辨证治疗可以降低FT3、FT4水平（P＜0.05）,可以降低TRAb、aTG、aTPO水平（P＜0.05）,可以改善TRAb转阴率（P＜0.05）,可以缩小GD患者的甲状腺体积（P＜0.05）,可以改善突眼（P＜0.05）,可以降低中医症状积分及甲亢诊断指数评分（P＜0.05）,且治疗组在改善上述指标、症状及体征方面均优于对照组（P＜0.05）。治疗组的总有效率为94.5%,对照组的总有效率为84.74%,治疗组总有效率明显高于对照组（P＜0.05）。治疗组复常时间明显短于对照组（P＜0.05）。③安全性观察:治疗组不良反应发生率为15.8%,对照组不良反应发生率为32.2%,P＜0.01。结论:病证结合序贯辨证治疗Graves病疗效显著,安全性好,不仅能改善甲状腺功能的水平,还可以调节免疫、改善患者临床症状与体征,降低不良反应发生率,缩短甲状腺功能复常时间。第二章:基于数据挖掘的病证结合序贯辨证治疗Graves病的用药规律目的:总结病证结合序贯辨证治疗Graves病的用药规律及核心处方,为网络药理学研究提供数据。方法:通过数据挖掘方法,收集纳入本研究第一部分的Graves病患者处方,提取内容包括一般信息资料（姓名、性别、年龄等）、临床诊疗信息（西医诊断、中医诊断、处方药物名称及用量等）,对提取的内容建立数据库并规范数据库,使用Microsoft Office Excel对用药频次,药物四气、五味、归经、功效进行描述性统计分析,使用IBM SPSS Statistics 22.0软件对纳入处方的药物制作因子分析成分图、树状图和聚类分析,使用IBM SPSS Modeler 18.0软件制作网络图和Apriori算法的关联规则分析。结果:核心处方整理:病证结合序贯辨证治疗Graves病的常用药物包括了甘草、柴胡、大枣、紫苏子、百合、知母、白芍、浙贝母、玄参、乌梅、茯苓、黄连等。药性以性温、寒、平为多;药味以甘、苦、辛为主;归经以归肝经为主;药物功效以清热药与补虚药为主,用药性味合参,兼顾归经,寒温统一,以平为期。高频药物关联分析、因子分析、聚类分析等表明,病证结合序贯辨证治疗Graves病的常用处方包括小柴胡汤、百合知母汤、半夏厚朴汤、五苓散、防己黄芪汤等,常用的药对包括了柴胡-白芍、百合-知母、茯苓-泽泻、首乌藤-酸枣仁、山慈菇-猫爪草等。核心处方为柴胡、紫苏子、黄连、玄参、大枣、白芍、乌梅、百合、知母、木瓜、甘草、浙贝母。结论:病证结合序贯辨证治疗Graves病在用药上性味合参,兼顾归经,寒温统一,以平为期。选方用药灵活多变,注重因病、因人、因时辨证论治,并依据研究结果得出病证结合序贯辨证治疗Graves病的核心处方。第三章:基于网络药理学研究核心处方治疗Graves病的作用机制目的:探讨病证结合序贯辨证治疗的核心处方治疗Graves病的潜在药理作用机制。方法:通过TCMSP数据库对本研究第二部分所得出的核心处方中的所有药物进行主要活性成分的筛查,将全方药物活性成分及相关靶标信息整合去重,再通过Uniprot蛋白质数据库进行信息标准化处理。通过检索DrugBank、TTD、OMIM、GeneCards数据库得到Graves病的疾病靶标,并将以上疾病靶标信息整合去重,再使用UniProt蛋白质数据库将靶标名称标准化,建立Graves病靶标数据库。将核心处方与疾病靶标取交集,再将核心处方-Graves病共同靶标导入至String数据库得到PPI网络,接下来将药物有效活性成分、交集靶标以及疾病靶标等数据整合处理后导入CytoScape3.8.2中,构建“方药活性成分-疾病-靶标”网络图,最后通过Metascape数据库进行GO和KEGG通路富集分析。结果:核心有效成分:基于网络药理学研究发现,核心处方的核心有效成分为槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、柚皮素、β-胡萝卜素、豆甾醇等,具有降低血清中甲状腺激素的水平、调节机体免疫等作用;核心靶标有PTGS2、ESR1、PPARG、ESR2、ADRB2、KDR、TOP2A、CHRM2 等。GO 富集分析发现核心处方可以影响炎症反应的调节、细胞间粘附的调节、活性氧代谢过程、白细胞-细胞粘附的调节、T细胞活化等多种生物过程,可以影响分泌颗粒管腔、囊泡腔、膜筏、膜微区、膜区等细胞组分,可以影响细胞因子活性、细胞因子受体结合、受体-配体活性、信号受体激活剂活性、抗氧化活性等分子功能;KEGG通路富集分析发现核心处方主要作用于TNF信号通路、IL-17信号通路、NF-κB信号通路来治疗GD,还涉及了 AGE-RAGE信号通路、Toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路、Th17细胞分化通路、PI3K-Akt信号通路等多条信号通路。结论:该核心处方可以通过多成分、多靶标、多途径协同治疗GD,其干预机制主要涉及免疫调节、炎症反应、氧化应激等方面。第四章:基于非靶向代谢组学研究病证结合序贯辨证治疗Graves病的作用机制目的:探讨病证结合序贯辨证治疗Graves病的可能生物标志物及其代谢途径。方法:收集治疗组治疗前后的血清样本,运用超高效液相色谱—质谱分析技术检测代谢物。通过运用单变量统计分析（t检验和变异倍数分析）及多元统计分析(无监督的主成分分析（PCA）及有监督的偏最小二乘法分析（PLS-DA）及正交偏最小二乘法分析（OPLS-DA）方法共同筛选出差异代谢物,将筛选后的差异代谢物通过HMDB、Lipidmaps（v2.3）、METLIN数据库以及自建库进行定性分析,最后通过KEGG数据库对差异性代谢物进行通路富集分析。结果:差异代谢物筛选:非靶向代谢组学研究筛选到治疗组治疗前后的103个显著差异性代谢物,以P≤0.05为阈值进行筛选,最终得到12条相关代谢通路。本研究中可以富集到通路的代谢物包括了磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、磷酸鞘氨醇1、鞘磷脂、甲状腺素等;富集的代谢通路包括了甘油磷脂代谢、鞘脂信号通路（鞘脂代谢）、自身免疫性甲状腺疾病、甲状腺激素信号等。结论:病证结合序贯辨证治疗Graves病的潜在生物标志物可能为磷酸鞘氨醇1,干预机制主要涉及鞘脂代谢、甘油磷脂代谢等方面。通过以上研究,确证使用病证结合序贯辨证治疗Graves病疗效显著,安全性好,充分发挥了中医药治疗的优势;明确了该疗法的中医用药规律及其核心处方的相关疗效机制;明确了该疗法治疗Graves病的相关生物标志物及其代谢途径。
关键词：Graves病;病证结合序贯辨证治疗;随机对照试验;临床研究;数据挖掘;网络药理学;LC-MS非靶向代谢组学;作用机制
学科专业：中医内科学（专业学位）
摘要
ABSTRACT
英文缩略语
文献综述
综述一 Graves病中医药治疗进展
1 中医病因病机
1.1 郁怒伤肝
1.2 饮食损脾
1.3 先天体质
1.4 外邪袭肺
2 名医认识
3 治疗
3.1 分期论治
3.2 辨证论治
3.3 病证结合序贯辨证治疗
3.4 中成药
3.5 外治疗法
综述二 Graves病的现代医学研究进展
1 病因及发病机制
1.1 遗传因素
1.2 免疫因素
1.3 环境因素
2 治疗
2.1 ATD治疗
2.2 放射性~(131)I治疗
2.3 外科手术治疗
2.4 新疗法进展
前言
第一章: 病证结合序贯辨证治疗Graves病的临床观察
1 对象及方法
1.1 研究对象
1.2 研究方法
1.3 观察内容
1.4 疗效判定标准
1.5 技术路线图及研究流程
1.6 数据统计分析
2 结果
2.1 基线指标比较
2.2 甲状腺相关指标比较
2.3 临床症状及体征比较
2.4 两组ATD药物使用剂量比较
2.5 两组肝功能受损、白细胞减少及用药情况比较
2.6 临床疗效比较
2.7 两组不良反应比较
3 讨论
3.1 病证结合序贯辨证治疗可以改善甲状腺功能
3.2 病证结合序贯辨证治疗可以改善TRAb、aTG、aTPO水平
3.3 病证结合序贯辨证治疗可以改善Graves病临床症状及体征
3.4 病证结合序贯辨证治疗可以减少ATD药物使用剂量
3.5 病证结合序贯辨证治疗可以改善肝功能受损及白细胞减少
3.6 病证结合序贯辨证治疗可以提高Graves病治疗总有效率
3.7 病证结合序贯辨证治疗可以缩短甲状腺功能复常时间
4 本研究的局限性
5 小结
第二章: 基于数据挖掘的病证结合序贯辨证治疗Graves病的用药规律
1 资料与方法
1.1 文献来源
1.2 检索策略
1.3 纳入标准
1.4 排除标准
1.5 数据规范与数据库的建立
1.6 数据分析
2 结果
2.1 描述性统计分析结果
2.2 药物关联规则分析
2.3 高频药物因子分析
2.4 高频药物聚类分析
3 讨论
3.1 病证结合序贯辨证治疗Graves病的用药特色
3.2 病证结合序贯辨证治疗Graves病的药物配伍及组方规律
4 小结
第三章: 基于网络药理学研究核心处方治疗Graves病的作用机制
1 研究对象
2 研究方法
2.1 核心处方主要活性成分及作用靶标筛选
2.2 Graves病相关靶标筛选
2.3 方药-疾病交集靶标获取
2.4 构建核心处方活性成分-Graves病靶标PPI网络
2.5 “方药活性成分-疾病-靶标”网络图的构建
2.6 GO及KEGG通路富集分析
3 结果
3.1 核心处方主要活性成分及作用靶标预测
3.2 Graves病靶标预测
3.3 方药-疾病交集靶标筛选
3.4 核心处方活性成分-Graves病靶标PPI网络构建
3.5 “方药活性成分-疾病-靶标”网络图的构建
3.6 GO和KEGG富集分析结果
4 讨论
4.1 核心处方治疗Graves病的核心药物活性成分
4.2 核心处方治疗Graves病的主要靶标
4.3 基于信号通路分析核心处方治疗Graves病的潜在作用机制
5 小结
第四章: 基于非靶向代谢组学研究病证结合序贯辨证治疗Graves病的作用机制
1 病例资料
2 材料
2.1 主要设备与材料
2.2 主要试剂
3 实验方法
3.1 血液标本的收集、处理
3.2 超高效液相色谱—质谱分析
3.3 数据预处理
3.4 统计学分析
3.5 差异代谢物筛选
3.6 代谢通路富集分析
4 结果
4.1 血清样品的LC-MS总离子流图
4.2 单变量数据分析
4.3 多元统计分析
4.4 差异性代谢物筛选与鉴定
4.5 KEGG富集通路分析
5 讨论
6 不足与展望
7 小结
研究总结
1 研究思路
2 研究结论
3 本研究创新点
4 不足与展望
参考文献
致谢
附件