论文题目：20（S）-原人参二醇型皂苷通过EGFR-MAPK信号通路抑制A549细胞增殖
摘要：人参具有大补元气、生津止渴和补血养血等功效,在中国有悠久的药用历史。2012年原卫生部发布的《中华人民共和国食品安全法》和《新资源食品管理办法》规定,批准人参（人工种植）作为新资源食品,为人参的发展的应用提供新方向。人参皂苷作为人参中主要的活性成分之一,拥有多种药理学活性。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）磷酸化激活后,能够调节细胞增殖、凋亡、周期和侵袭等进程。EGFR在肿瘤细胞中呈现过度表达或异常激活状态,诱导肿瘤细胞发生和发展。肺癌位于癌症死亡率首位,且主要为非小细胞型肺癌（non small-cell lung cancer,NSCLC）。因此,研究从人参皂苷中筛选靶向EGFR抑制肺癌细胞增殖的化合物具有重要意义,为人参的应用提供新方向和思路。本文的主要研究内容和结论如下:（1）分子水平上建立均相时间分辨荧光（homogenous time-resolved fluorescence,HTRF）筛选平台,从人参皂苷中筛选高活性和高选择性EGFR酪氨酸激酶抑制剂。对ATP浓度、EGFR激酶浓度及反应时间优化后,确定体系反应条件为:EGFR激酶浓度0.0041 ng/μL,反应时间40 min,ATP浓度为1.41μM。选用星形孢菌素（staurosporine）作为阳性对照对筛选平台准确性进行验证。共筛选出20（R）-Rg3、20（S）-Rg3、20（R）-Rh2、20（S）-Rh2、Rc、CK、20（R）-PPD、20（S）-PPD、20（R）-Rg2、F1、20（R）-PPT、20（S）-PPT和Pseudoginsenoside Rh2等13种人参皂苷能够抑制EGFR激酶活性,并且原人参二醇型皂苷抑制效果优于原人参三醇型皂苷。细胞水平上,对HTRF平台筛选出的人参皂苷继续进行细胞抗增殖活性筛选。基于A549人非小细胞型肺癌细胞模型,通过MTT实验最终选择有明显的抑制作用的人参皂苷20（S）-Rg3、20（S）-Rh2和20（S）-PPD。同时,MRC-5人正常胚肺成纤维细胞MTT实验证实,人参皂苷20（S）-Rg3、20（S）-Rh2和20（S）-PPD对正常肺细胞生长增殖无明显抑制。选用人参皂苷20（S）-Rg3、20（S）-Rh2和20（S）-PPD对A549细胞发挥IC20、IC40和IC60抑制效果的浓度进行后续研究。这三种人参皂苷均属于原人参二醇型皂苷,并且互为代谢产物。模拟水平上,通过分子对接和动力学模拟分析,证实EGFR蛋白与人参皂苷20（S）-Rg3、20（S）-Rh2和20（S）-PPD能够通过疏水作用和氢键作用稳定结合,结合稳定性由高到低:20（S）-Rg3、20（S）-PPD和20（S）-Rh2。（2）Ras-Raf-MEK-ERK级联信号是MAPK通路的重要组成部分之一,调控细胞的增殖分化、凋亡、转移和侵袭等生理进程。本研究利用实时荧光定量PCR、Western blot等手段,探究不同浓度人参皂苷20（S）-Rg3、20（S）-Rh2和20（S）-PPD处理下,对A549细胞EGFR-MAPK信号通路基因m RNA和蛋白表达水平的影响。结果表明,人参皂苷20（S）-Rh2能够抑制EGFR激酶Tyr1068位点的磷酸化,而人参皂苷20（S）-Rg3和20（S）-PPD并不通过Tyr1068位点抑制EGFR蛋白的磷酸化。人参皂苷20（S）-Rg3主要抑制Ras和Raf激酶活性;人参皂苷20（S）-Rh2主要抑制B-Raf和Raf-1磷酸化,抑制下游靶蛋白MEK和ERK的表达;人参皂苷20（S）-PPD主要抑制B-Raf磷酸化,抑制下游靶蛋白MEK和ERK的磷酸化激活。人参皂苷20（S）-Rg3、20（S）-Rh2和20（S）-PPD能够通过抑制EGFR-MAPK信号通路的激活,抑制A549细胞增殖。对EGFR靶蛋白的抑制效果从强到弱分别为:20（S）-PPD、20（S）-Rh2和20（S）-Rg3。利用细胞划痕实验对培养0、6、12和24 h后的细胞迁移情况进行测定。结果表明,人参皂苷20（S）-Rg3处理24 h时,A549细胞愈合率与DMSO对照组相比明显下降,并呈现剂量依赖性,从24.63%下降到21.92%（24μM）、19.66%（30μM）和17.10%（37μM）。人参皂苷20（S）-Rh2处理仅6 h时,在浓度22μM和35μM条件下,A549细胞愈合率与DMSO对照组相比已经显著下降,仅为6.76%和6.35%。人参皂苷20（S）-PPD处理12 h时,A549细胞愈合率与DMSO对照组相比下降,从17.00%下降到9.37%（36μM）、13.41%（41μM）和14.22%（46μM）,其中在浓度36μM时显著抑制。人参皂苷20（S）-Rg3、20（S）-Rh2和20（S）-PPD能够抑制细胞的迁移。抑制效果呈现一定的时间和剂量依赖性,即在长时间和高浓度条件下,抑制效果较好。（3）利用流式细胞术检测不同浓度人参皂苷20（S）-Rg3、20（S）-Rh2和20（S）-PPD处理下对A549细胞凋亡的影响。结果表明,人参皂苷20（S）-Rg3、20（S）-Rh2和20（S）-PPD处理后,整体细胞凋亡率均有上升。另外,利用实时荧光定量PCR、Western blot等手段,探究人参皂苷20（S）-Rg3、20（S）-Rh2和20（S）-PPD处理下,对A549细胞细胞凋亡信号通路的调节因子基因m RNA和蛋白表达水平的影响。结果表明,人参皂苷20（S）-Rg3、20（S）-Rh2和20（S）-PPD能够通过调控Caspase-9、Caspase-3、PARP1、STAT3、Bcl-XL、Survivin等关键因子基因m RNA和蛋白表达水平,促进A549细胞凋亡。（4）利用流式细胞术检测不同浓度人参皂苷20（S）-Rg3、20（S）-Rh2和20（S）-PPD处理下对A549细胞周期循环进程的影响。结果表明,20（S）-Rg3、20（S）-Rh2和20（S）-PPD处理后,能够将细胞周期循环阻滞于G0/G1期,从而抑制A549细胞的增殖。对细胞周期循环抑制效果从强到弱分别为:20（S）-PPD、20（S）-Rh2和20（S）-Rg3。另外,利用实时荧光定量PCR、Western blot等手段,探究20（S）-Rg3、20（S）-Rh2和20（S）-PPD处理下,对A549细胞细胞周期信号通路的调节因子基因m RNA和蛋白表达水平的影响。结果表明,人参皂苷20（S）-Rg3、20（S）-Rh2和20（S）-PPD能够通过调控细胞周期信号通路中Cyclin、CDK、Cdc25等关键因子,主要是下调Cyclin A2、Cyclin D1、Cyclin E1与CDK蛋白形成复合物的含量,抑制细胞周期向S期的转换,阻滞循环于G0/G1期。
关键词：20（S）-原人参二醇型皂苷;表皮生长因子受体;MAPK信号通路;细胞凋亡;细胞周期
学科专业：食品科学与工程
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指导小组对博士论文的评阅意见
答辩决议书
中文摘要
Abstract
第1章 绪论
1.1 人参皂苷
1.1.1 人参皂苷的结构及分类
1.1.2 人参皂苷的药理学活性
1.2 表皮生长因子受体
1.2.1 EGFR的结构和功能
1.2.2 EGFR与肿瘤
1.2.3 以EGFR为靶点发挥抗肿瘤作用的天然化合物
1.2.4 EGFR下游信号转导通路
1.3 非小细胞型肺癌的研究进展
1.3.1 非小细胞型肺癌概述
1.3.2 化学合成治疗肺癌的EGFR酪氨酸激酶抑制剂
1.4 本文的研究意义与主要研究内容
1.4.1 研究意义
1.4.2 研究内容
第2章 表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的筛选
2.1 材料与设备
2.1.1 细胞株
2.1.2 材料与试剂
2.1.3 仪器设备
2.2 实验方法
2.2.1 均相时间分辨荧光分析对激酶活性进行筛选
2.2.2 细胞抗增殖活性筛选
2.2.3 分子对接
2.2.4 分子动力学模拟
2.3 结果与讨论
2.3.1 EGFR激酶实验筛选平台的确定
2.3.2 基于HTRF平台从人参皂苷中筛选EGFR酪氨酸激酶抑制剂
2.3.3 人参皂苷抑制A549细胞的增殖
2.3.4 模拟结果分析
2.4 本章小结
第3章 20(S)-原人参二醇型皂苷对A549细胞EGFR-MAPK通路的影响
3.1 材料与设备
3.1.1 细胞株
3.1.2 材料与试剂
3.1.3 仪器设备
3.2 实验方法
3.2.1 实时荧光定量PCR检测EGFR-MAPK通路基因mRNA表达水平
3.2.2 Western blot检测EGFR-MAPK通路蛋白表达水平
3.2.3 细胞转移和侵袭
3.3 结果与讨论
3.3.1 20(S)-原人参二醇型皂苷对EGFR-MAPK通路的调节
3.3.2 20(S)-原人参二醇型皂苷抑制A549细胞的迁移
3.4 本章小结
第4章 20(S)-原人参二醇型皂苷对A549细胞凋亡的影响
4.1 材料与设备
4.1.1 细胞株
4.1.2 材料与试剂
4.1.3 仪器设备
4.2 实验方法
4.2.1 流式细胞术检测细胞凋亡
4.2.2 实时荧光定量PCR检测细胞凋亡通路相关基因mRNA表达水平
4.2.3 Western blot检测细胞凋亡通路相关蛋白表达水平
4.3 结果与讨论
4.3.1 20(S)-原人参二醇型皂苷促进A549细胞凋亡
4.3.2 20(S)-原人参二醇型皂苷对细胞凋亡通路的调节
4.4 本章小结
第5章 20(S)-原人参二醇型皂苷对A549细胞周期的影响
5.1 材料与设备
5.1.1 细胞株
5.1.2 材料与试剂
5.1.3 仪器设备
5.2 实验方法
5.2.1 流式细胞术检测细胞周期
5.2.2 实时荧光定量PCR检测细胞周期通路相关基因m RNA表达水平
5.2.3 Western blot检测细胞周期通路相关蛋白表达水平
5.3 结果与讨论
5.3.1 20(S)-原人参二醇型皂苷阻滞A549细胞周期
5.3.2 20(S)-原人参二醇型皂苷对细胞周期通路的调节
5.4 本章小结
第6章 结论与展望
6.1 全文结论
6.2 创新点
6.3 展望
参考文献
致谢