植物染色体工程

植物染色体工程（精选8篇）

植物染色体工程 第1篇

植物细胞与染色体工程国家重点实验室

开放课题申报指南

（2018）

一、总则

植物细胞与染色体工程国家重点实验室（以下简称实验室）作为我国农业生物学领域的一个应用基础研究实验室，面对国家需求，致力于为我国农业科技发展做出应有的贡献。实验室在李振声院士提出的“少投入、多产出，护环境，可持续发展”的总体研究思路的指导下，面向国家粮食安全和农业可持续发展的重大战略需求，瞄准植物科学国际前沿，聚焦小麦、水稻、大豆、玉米等主要农作物遗传育种的重大关键科学问题，开展基础与应用基础研究。尊照国家重点实验室“开放、流动、联合、竞争”的原则，特设置开放课题基金。开放课题的设定和管理规定遵照《国家重点实验室建设与运行管理办法》（国科发基【2008】539号）、《国家重点实验室专项经费管理办法》（财教【2008】531号）文件精神制定。

开放课题基金面向国内外从事基础理论研究和应用基础研究的大学、研究所等单位。凡具备申请条件的研究人员均可提出申请。申请应符合实验室当年发布的课题申请指南，依照“公平竞争、择优支持”的原则，经过同行专家评审后确定。

二、资助范围

围绕植物细胞与染色体工程国家重点实验研究方向的领域，以小麦、水稻、大豆、玉米等作物为主要研究对象的研究，包括以下几个研究方向：

1.作物基因组学研究 2.植物养分及光能高效利用 3.植物抗病分子机制 4.株型与光合产物的有效分配

5.作物的品质性状形成的分子机制及改良 6.染色体工程及作物品种的分子设计

开放课题应与实验室目前从事的研究项目相结合。并与实验室现有课题组形成合作研究。开放课题基金优先资助学术思想新颖，立论根据充分，研究目标明确、研究内容具体的项目。

三、申请条件

凡申请者请首先确定与植物细胞与染色体工程国家重点实验室的研究组合作，联合提出申请报告，并须具备下列条件：

1.需在与重点实验室研究组建立合作关系的基础上提出申请； 2.在所申请的相关领域有相当的理论和技术积累； 3.具有副高级（含副高级）以上专业技术职称； 4.研究内容必须符合开放课题基金的资助范围； 5.应得到所在单位或部门的同意；

6.按时提交申请，手续完备，所需资料齐全。

四、申报程序

申请开放课题基金必须按规定的格式实事求是地填写（植物细胞与染色体工程国家重点实验室开放课题基金申请书）。

申请者所在单位应签署意见，单位领导在申请书上签字并加盖单位公章，向植物细胞与染色体工程国家重点实验室报送《申请书》一式2份，同时须提交电子版（PDF文件）申请书至：brzhang@genetics.ac.cn（邮件需抄送合作研究组组长）

开放课题基金的受理申请时间为3月15日—4月15日（以邮戳或者email发件日期为准）。

五、审批程序

开放课题基金的评审按同行专家评阅决定的程序进行。

植物细胞与染色体工程国家重点实验室负责开放课题基金的申请受理工作。

六、课题及成果管理

开放课题资助年限一般为2年。

重点实验室对每项开放课题根据申请者要求，确定一位实验室的课题组长作为该项开放课题的项目合作者，并负责开放课题基金的实施管理。管理内容包括：

1．在课题研究过程中，如研究计划有较大变动，须经重点实验室审批。2．经费管理

（1）每项课题经费将直接下达到重点实验室内部申请者的合作研究组，不外拨。

（2）开放基金是重点实验室为开放课题投入的专项经费，必须专款专用。（3）开放课题经费使用范围：主要用于课题研究所需要的材料费、分析测试费、仪器设备租用费等；国内外学术会议和国内外刊物的论文发表费以及客座研究人员来重点实验室工作的津贴、补助、交通费和住宿费。

（4）课题结束后，课题研究人员应及时作出经费使用决算。3．课题监督

实验室主任和实验室学术委员会主任负责监督和检查课题进展及执行情况，发现问题时，有权调整或中止项目及资助。

4．课题验收

课题结束后2个月内，申请人员应认真填写《课题总结报告》。报告内容应包括工作总结、课题完成情况、成果目录和论文目录等。报告经项目合作者审查签署意见后，交由重点实验室验收。逾期不按要求提交总结报告者，取消其今后申请植物细胞与染色体工程国家重点实验室开放课题基金的资格，并通报其工作单位。

课题实施结束后完成既定要求，达到预定目标的，若需继续深入研究，可向本重点实验室提出申请，并其研究课题确有重大研究价值需继续追加资金的，报学术委员会同意后方可追加资金予以支持。

5．成果说明

申请人员在开放课题基金资助下取得的成果（包括专利、学术论文的知识产权等），归研究者个人与植物细胞与染色体工程国家重点实验室共享。开放课题研究成果发表论文时，按研究者实际工作量确定署名顺序，并必须在论文中注明受中国科学院遗传与发育生物学研究所植物细胞与染色体工程国家重点实验室开放课题项目基金资助。

七、经费下拨

每项开放课题总经费为10万元人民币。

项目经费下拨时间为课题被批准后的1个月内一次拨付。

注：上述规定最终解释权归中国科学院遗传与发育生物学研究所植物细胞与染色体工程国家重点实验室所有。

……………………………………………………………………………………………………… 通讯地址：北京市朝阳区北辰西路1号院2号，100101

中国科学院遗传与发育生物学研究所

植物细胞与染色体工程国家重点实验室

联 系 人： 张佰茹（010-64806537，brzhang@genetics.ac.cn）

植物染色体工程 第2篇

1.卡诺氏液的作用是提前把处于分裂旺盛时期的细胞及时的固定下来，比如上午的8点到10点是根尖分生区分裂比较旺盛的时期，为了试验的安排方便，可以先在上午固定下来，下午或者之后再做有丝分裂个过程的观察。而低温诱导也是同样的道理，低温诱导后，在分裂旺盛的时候固定下来，方便之后的观察。2.用改良苯酚品红染液，不用龙胆紫的原因是，龙胆紫容易染色过深，不能很好的区分染色体数目的变化，而改良苯酚品红染液对细胞核有很好的染色效果，对细胞质在短时间内不能染色。3.实验中，在染色前应该先将根尖压碎，这样能使得更多的细胞被染色，因为课堂时间有限，不能使得染色时间太长，所以采用这样的办法。

4.洋葱根尖的有丝分裂周期为12h，根尖分裂最旺盛的时间段在上午的8点到10点。

植物染色体工程 第3篇

这部名为《中国主要经济植物基因组染色体图谱》的图书由国家科学技术著作出版基金资助、科学出版社出版，南开大学教授陈瑞阳等编著，为栽培植物的杂交育种和起源进化提供了基础资料。

据介绍，这部书共5册，分别绘制了我国果树及其野生近缘植物、农作物及其野生近缘植物、园林花卉植物、竹类、药用植物的染色体图谱。

染色体结构和功能的研究一直是生命科学中的重要基础研究领域。染色体的数目和形态结构具有种的特异性，是遗传学、细胞生物学、进化生物学、分类学的重要基础。

陈瑞阳说，我国是世界上栽培作物最早和最大的起源地，至今在全国各地还生长着很多珍贵的栽培作物野生祖先及其近缘植物，如野生大豆、野生稻、野生茶和各种野生果树等。

植物染色体工程 第4篇

1　取材及处理

建议实验材料采用大蒜(2n=16)。大蒜不仅根萌发量大，根尖细胞分裂旺盛，分裂指数高，而且大蒜细胞染色体长度相差不大，为中部或亚中部着丝粒染色体，便于计数。因此选用大蒜作为实验材料，除便于染色体计数外，还节约实验成本。

大蒜有休眠期，因此在发根前，可先把其放入4℃冰箱1d以打破休眠期，这样可增加大蒜的出根数目而且根生长较为整齐。具体做法是：选取健壮的蒜瓣，剥去枯皮，将3～4个蒜瓣用牙签并排穿起，放入盛有清水的烧杯中，以水浸没大蒜根部为宜，室温培养，如果室温较低，可放入恒温培养箱(温度25℃左右)，3～4d即可得到合适长度的蒜根。待根生长到2～3cm时，把整个装置转入4℃的冰箱中，低温处理36h。移入室温培养24h左右，再剪取根尖用于实验。低温处理后再转入室温培养一段时间，这一步骤对改善观察效果非常重要。因为低温处理破坏纺锤体的形成后，导致大部分分裂期细胞停滞于中期，这时候的染色单体尚未分开，只有极少量在低温处理前处于后期的细胞这时候才有染色体数目的变化，能看到染色体数目变化的细胞是非常少的。由于低温处理时间较长，滞留在分裂中期的细胞可直接进入间期，这时细胞染色体的数目加倍。通过再转入室温培养，这些染色体数目加倍的细胞从间期进入分裂期，染色体数目发生变化的细胞增多，视野中能看到染色体数目变化的细胞数大大增加。

2　固定

固定的作用是将根尖细胞杀死，使根尖分生组织的细胞固定在有丝分裂的不同时期。但在实验中发现，用卡诺氏液(无水酒精：冰醋酸=3：1)固定根尖24h(教材中是固定0.5～1h)，根尖细胞分散程度较好，有利于染色体数目的观察。

3　制作装片

3.1解离

解离是实验成功的关键步骤之一。解离可以除去细胞间的果胶，使细胞壁纤维素软化，从而使得细胞在压片时容易分散，适当延长解离时间有助于细胞分开。解离中，关键是时间的把握。教材中提到常温下在解离液中解离3～5min，时间太短，观察时细胞重叠在一起，可以适当延长为8～10min，效果较好。为了缩短时间，也可将盛有解离液和根尖的小烧杯放在60℃左右的温水中3～5min，同样可以观察到较好的实验结果。

3.2漂洗

漂洗最好用蒸馏水，除了洗去解离液防止解离过度外，也可起到低渗作用，使细胞体积有一定的膨胀，便于以后染色体形态的观察。

3.3染色

用改良苯酚品红溶液进行制片染色，结果可使其染色体部分染色较深，而细胞质部分基本不染色，色差很明显，利于观察。为了提高染色效果，可先将根尖用镊子捣碎后再染色。充分捣烂后，细胞完全分散，细胞核内的染色体容易被碱性染液染色，又缩短了染色时间，为8～10min左右。

3.4制片

染色后，蓋上盖玻片。在盖玻片上面铺上吸水纸，用拇指垂直压片，稍用力。用力不可太轻，否则细胞分散不好。压片后，拿走吸水纸，用左手把盖玻片固定住，右手持镊子，用钝端轻轻倾斜敲击盖玻片(操作时要防止盖玻片与载玻片间发生滑动)，促使材料呈雾状均匀分散。教科书上采用盖玻片上再加载玻片的方法容易滑动，操作不方便，效果也不好。

4　总结

植物细胞工程教案 第5篇

一、教学目标

1、细胞的全能性（理解）

2、简述植物组织培养和植物体细胞杂交技术。（知道）

二、教学重点和难点 1.教学重点

（1）植物组织培养的原理和过程。（2）植物体细胞杂交的原理。2.教学难点 植物体细胞杂交

三、教学过程 导入：

我们已经所学及疑问

1、有性生殖中，受精卵经分裂、分化形成各种组织、器官，最后形成个体。三倍体如何繁殖后代？

2、细胞的全能性

体细胞具有全能性的原因是什么？

各种细胞表达全能性的能力是否一样？

在生物体内，体细胞有没有表达全能性，为什么？ 体细胞在什么条件下才会表达全能性?

（一）植物组织培养

1、概念

2、植物组织培养的过程。（如下）

脱分化 再分化

外植体 → 愈伤组织 → 根、芽 →植物体

3、条件

4、证明：

（二）植物体细胞杂交

1、过程 植物细胞A 植物细胞B ↓ 去壁

↓

原生质体 A 原生质体B

↓

↓

原生质体融合↓ 再生细胞壁

杂种细胞

2、优点： 克服远源杂交不亲和障碍，培育作物新品种。↓ 细胞分裂

愈伤组织

↓细胞分化

植物细胞工程实验题 第6篇

答：工作原理：在密闭的高压灭菌锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸气温度下，持续15—30分钟，可杀灭各种微生物及高度耐热的芽孢。

注意事项：

a 待灭菌的物品放置不宜过紧；

b 堆放灭菌包时应注意安全阀放汽孔位置必须留出空气，保障其畅通，否则易造成锅体爆裂事故。

c 必须将冷空气充分排除，否则锅内温度达不到规定温度，影响灭菌效果； d 灭菌完毕后，不可放气减压，否则瓶内液体会剧烈沸腾，冲掉瓶塞而外溢甚至导致容器爆裂。须待灭菌器内压力降至与大气压相等后才可开盖。

2、超净工作台的工作原理是什么？

答：鼓风机送入的空气先通过一个前置过滤器，滤掉大部分尘埃，再经过一个高效过滤器，除去了大于0.3um的尘埃、真菌和细菌孢子等。从而形成连续不断的无尘无菌的超净空气层流，其流速为24~30m/min，这样的流速不会妨碍酒精灯的燃烧，同时工作人员在这样的无菌条件下操作可保持无菌材料在转接过程中不受污染。

3、母液配制的注意事项。

答：1）配制母液所需药品应采用分析纯或化学纯试剂。

2）配制母液用水为蒸馏水或去离子水，试剂可以通过加热或磁力搅拌器加热溶解。

3）母液保存时间不宜过长，如发现母液有混浊或沉淀现象发生，则弃之不用。

4）母液浓度不能过高，否则易产生结晶，影响试验效果。

5）在配制大量元素母液时，混合、溶解各种无机盐时要注意先后顺序，尽量把Ca2+，SO42-,PO43-等离子错开分别溶解，同时稀释浓度要大些，并要慢慢地边混合边搅拌。

4、培养基配制过程中应注意哪些因素？培养基为什么要煮沸后再分装？

答：培养基配制过程中应注意PH和灭菌；①PH影响外植体和培养材料对离子的吸收，过酸过碱的培养基影响培养材料的生长；此外，琼脂培养基的PH值还影响到培养基的凝固状况。②灭菌，植物组织培养必须在无菌环境中进行。培养基煮沸后再分装的原因：因为含琼脂的培养基会在40℃左右时凝固，因为要先在水浴中加热，使其成为均匀液态时在尚未冷却情况下尽快分装。

5、培养基的灭菌过程。

答：①检查灭菌锅外层锅内水位，水量过少时应加水。把分装好的培养基及其他需灭菌的各种器具和蒸馏水放入灭菌锅的消毒桶内。

②盖上锅盖，注意按照说明操作并确定已盖好，设置好温度和时间参数，开启电源加热灭菌。

③灭菌时间到后，先切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，待灭菌锅压力表指针降到0时，打开排气阀，旋松螺栓，开启锅盖，取出已灭菌的培养基。④刚灭过菌的培养基成液体状，取出时不要用力摇动，否则会导致部分培养基沾附在瓶壁。放置在水平桌面上自然冷却。在室温下放置1-2天，观察有无微生物生长，以确定培养基是否彻底灭菌。经检查没有杂菌生长的方可使用。

6、调节pH值应该调高0.2-0.3个单位，为什么？

答：因为在高压灭菌过程中，培养基的某些成分会发生分解氧化，常使培养基的pH值发生一定幅度的变化，pH值的变化方向和幅度取决于多种因素，如培养基的成分，浓度，灭菌时间及温度等，因此在设定培养基pH值时应根据实际情况做适当调整。

7、哪些因素影响培养基的凝固？

答：1）pH值调节不准确，偏酸 ；

2）灭菌时间过长，破坏了琼脂的结构； 3）琼脂质量及用量的问题。

8、1mol/L HCl和NaOH的配制方法？

答：如要1mol/L HCl 配制1L（36%盐酸密度 1.18g/mL，37%盐酸密度 1.19g/mL，）

方法一：须配制1mol/L × 1L= 1mol HCl，则 1 × 36.5÷ 36% ÷1.18 =85.9mL。

方法二：1.18 × 1000 × 36% ÷ 36.5 = 11.64 mol/L，根据m1*v1=m2*v2，v1=（1mol/L × 1L）÷ 11.64 mol/L = 85.9 mL。即取36%盐酸溶液85.9 mL定容于1L的蒸馏水水中。1mol/L NaOH的配制方法：取40g NaOH固体溶解于蒸馏水中，最后定容至1L。

9、为什么常在消毒液中加入1～2滴表面活性剂如吐温80？

答：吐温80作为一种表面活性剂，具有乳化、扩散、增溶、稳定等作用。在消毒液中加入1～2滴吐温80可以促使消毒液更充分地湿润整个外植体组织，进而将消毒液渗透、扩散到菌团内部，达到更好的消毒效果。

10.在接种过程中，通过哪些措施来防止杂菌对接种工具、接种材料的污染？  污染原因归结为3个方面: 1）是组织培养室或接种室的清洁问题;2）是外植体自身带菌;3）是组织培养过程各环节操作不适宜或不严格。

11、胡萝卜切块灭菌后为什么要反复清洗？在接种时为什么一定要切割胡萝卜块的外围？切割多大接种才最合适？被接种的部位一定要含有哪种组织，为什么？

增殖率=（增殖的外植体数量/接种外植体数量）*100%；

增殖系数（倍数）= 继代培养后产生的茎芽总数/继代接种时的外植体个数； 污染率=（污染的外植体数量/接种外植体数量）*100%；

植物基因工程课件 第7篇

植物基因工程课件

(1)植物基因转化受体系统的条件

(2)植物基因转化受体系统的类型和特性。

(3)植物基因工程载体的种类和特性

(4)根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能：T-DNA、Vir区操纵子的基因结构与功能。

(5)农杆菌Ti质粒基因转化机理

(6)农杆菌Ti质粒的改造及载体构建

(7)载体构建中常用的选择标记及报告基因

(8)根癌农杆菌的转化程序及操作原理

(9)外源基因在植物中的表达

了解植物基因转化受体系统的类型、特性掌握Ti质粒的结构与功能，植物载体构建原理，植物基因工程常用的载体类型。

重点

根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化的原理和方法

难点

植物载体构建原理

关键点

转基因植物的获取和检测

教学目的和要求

教材分析

主要教具和设备材料

投影仪、电脑、常规教学设备板书与多媒体授课相结合

教法 思考题

1. 植物基因工程载体种类?

2. 根癌农杆菌转化程序?

心得

在自然界的许多双子叶植物中，常常发生一种严重危害植物生长的病害——冠瘿。已知90多科，600多种双子叶植物都能感染这种病。一般认为单子叶植物和裸子植物对此病不敏感。70年代中期，世界上几个实验室发现诱发肿瘤的根癌农杆菌中含有大量的诱瘤质粒Ti(tumor-inducing plasmid),且证实了肿瘤的形成正是由于pTi中的特定片段——T-DNA转移并稳定地整合进植物细胞核基因组中的结果;由于其上载着的冠瘿碱合成基因和激素合成基因表达，因此分泌冠瘿碱并形成肿瘤。人们就把这种冠瘿的形成过程称作天然的植物细胞转化系统。

农杆菌将自身的DNA插入植物细胞诱发肿瘤只对其本身是有益的，重要原因之一是因为农杆菌诱发植物细胞合成冠瘿碱为自己提供食物。植物自身不能利用这种物质，只能为它的合成付出代价，别的细菌也不能利用它，在自然条件下，只有农杆菌能分泌分解冠瘿碱的酶，将这些特异产物作为唯一的碳源和氮源来利用。

肿瘤的产生是由于T-DNA上的激素合成基因所致，刺激细胞生长而产生肿瘤，这是T-DNA转入的一个副产品。

Ti质粒给自己设计出一套为其自身存活的非常优秀的进化格局：它感染植物细胞，使之出现愈伤组织增生，后者便产生出供带有Ti质粒的细菌用作能源、碳源和氮源的冠瘿碱;而冠瘿碱的产生又可激发Ti质粒转移到原先没有存在这种质粒的土壤农杆菌中去，如此周而复始得到不断发展。

Ti质粒是一类理想的植物基因工程载体，通过它们可以将外源DNA转移到植物细胞，并再生出能够表达外源基因的转基因植物。 Ti质粒还具有若干其他载体所不具备的优点：

(1)T-DNA能够进行高频的转移，而且这种转移的DNA通常是以未发生变化的完整形式整合到植物的核基因组上。

(2)Ti质粒不存在包装限制问题，大到50kb的外源DNA也能顺利地包装与转移。

一、植物基因工程载体种类

据载体的功能和构建过程，可把有关载体分为四大类型(九种载体)。 克隆载体、中间载体、卸甲载体、转化载体

据载体的功能和构建过程，可把有关载体分为四大类型，九种载体。

1、克隆载体(目的基因的克隆载体)

通常由多拷贝的E.coli小质粒为载体 功能：保存和克隆目的基因。

2、中间载体又分为中间克隆载体和中间表达载体。

中间克隆载体：由大肠杆菌质粒插入T-DN段及目的基因、标记基因等构建而成。

功能：构建中间表达载体的基础。

分为：中间粘粒载体、质粒粘粒愈合载体、基因标记载体。 中间表达载体：含有植物特异启动子的中间载体

功能：作为构建转化载体的质粒。

3、卸甲载体

解除武装的Ti质粒或Ri质粒。(onc+ -------- onc-) 功能：作为转化载体的受体质粒

4、转化载体

最后用于目的基因导入植物细胞的载体，亦称工程载体。 它是由中间表达载体和卸甲载体构建而成。

分为一元载体系统(顺式载体)和双元转化载体系统(反式载体)。 一元载体系统包括共整合载体和拼接末端载体(SEV)。

二、根癌农杆菌Ti质粒

1、Ti质粒的类型、结构与功能

(1)类型

Ti质粒是根癌农杆菌染色体以外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，分子量为95~156 x 106D，约150 ~ 200 Kb长。根据其诱导的冠瘿碱种类不同，Ti质粒可分为三类： 章鱼碱型(octopine)：pTiAch5, pTiA6NC, pTiB653, pTiAg162 胭脂碱型(nopaline)：pTiT37, pTiT38, pTiC58

农杆碱型(agropine)和农杆碱素型(agrocinopine)或琥珀碱型(succinamopine)

(2)结构和功能

各种Ti质粒都可分为四个区：

①T-DNA区(transferred-DNA regions)：是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA。该DN段上的基因与肿瘤的形成有关。

②Vir区(Virulence region)：该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。T-DNA区与vir区在质粒上彼此相邻，合起来约占Ti质粒DNA的1/3。

③Con区(region of replication)：质粒结合转移位点编码区，该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因(tra)，调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此，称之为接合转移编码区。

④Ori区(origin of replication)：该区段基因调控Ti质粒的自我复制，称之为复制起始区。

3种成分与Ti质粒肿瘤诱导有关:

T-DNA：它可转移至宿主细胞，是一种可移动因子。

毒性区：vir基因可产生转移活动蛋白，对增强植物细胞的转化是必须的。 土壤农癌杆菌染色体基因:间接参与转化，负责将细菌细胞接合于植物上。

2、T-DNA的基因结构和功能

(1)T-DNA的结构特点 长约23Kb

在T-DNA的5’和3’端都有真核表达信号，如TATAbox，AATAAbox及polyA等。

T-DNA的两端左右边界各为25bp的重复序列，即边界序列，分别称之为左边界(BL或TL)和右边界(BR或TR)。该25bp边界序列属保守序列(TGACACGATATAT TGGCGGGTAAAC)。通常右边界序列更为保守，左边界在某些情况下有所变化。左边界的缺失突变仍能致瘤，但右边界缺失则不致瘤，这时几乎完全没有T-DNA的转移，这说明右边界在T-DNA的转移中的重要性。

胭脂碱型肿瘤，为一连续的一段序列，长约23.4Kb，有肿瘤系，仅一个拷贝，有的T-DNA是多拷贝的。

章鱼碱型肿瘤：T-DNA分左右两部分(TL-DNA和TR-DNA)，各自带有左右边界序列。左区的顺序变化不大，长度约13Kb，通常一个拷贝，但也有几个拷贝首尾相连排列。含章鱼碱合成酶基因和致瘤基因。TR-DNA较短，长约6-7Kb，拷贝数达数个 或数十个，有的肿瘤系中没有TR-DNA。TR-DNA编码5个基因，如甘露碱和冠瘿碱合成酶基因。

(2)T-DNA上的编码基因及功能

章鱼碱型和胭脂碱型T-DNA的转录有下述共同特点： T-DNA的两条链都是有意义链;

T-DNA上每个基因都有各自的启动子; 基因的转录由植物细胞RNA聚合酶II完成;

T-DNA具典型的真核生物RNA合成起始和终止的调节信号，在其5’端转录起始处有TATA和CAAT盒。另外，至少在5个T-DNA基因中发现有一个8bp的相同顺序(TTTCAA GA)，同时AATAAA加尾信号也在同一条链上发现。

植物或农杆菌中可能有甲基化或去甲基化的调节基因活性。 3、Vir区操纵子的基因结构与功能

毒性区的大多数基因产物都控制T-DNA的转移，这个区域的突变往往导致农杆菌感染植物能力的下降。

(1)Vir区操纵子的基因结构

章鱼碱型Ti质粒：Vir区大小为40kb，含有VirA、B、C、D、E、F、G、H(PinF)等8个操纵子，共24个基因。大多数操纵子含有多个基因VirA(1)、VirB(11)、VirC(2)、VirD(4)VirE(2)、VirF(1)、VirH(2)。

胭脂碱型Ti：有7个操纵子，少一个VirF，它们的第一个操纵子也不同，章鱼碱型Ti是VirH，而胭脂碱型Ti是Tzs，其功能也不同。 Vir区基因的表达有两种方式：

组成型表达;在无植物诱导分子存在下依然保持一定的表达水平，virA，virG、virH 诱导型表达：这些基因的表达必须在土壤农杆菌感染植物时，在植物受伤组织分泌的信号分子作用下才能启动表达，如virB、C、D、E

virG虽属于组成型表达，但有植物信号分子存在下表达量提高10倍，也具诱导表达特性。

(2)Vir区操纵子的基因的功能

①Vir A 单个基因，2.4kb，仅编码一条多肽。Vir A编码一种结合在膜上的化学受体蛋白(92KD)，可直接对植物产生的酚类化合物感应，是一种感应蛋白。

Vir A的活化：当AS与Vir A的受体部分结合后，会使整个Vir A蛋白构象发生变化，其C端活化。Vir A蛋白的胞质区有自激酶的功能，可在保守的组氨酸残基上磷酸化，从而Vir A蛋白被激活。激活后的Vir A具有转移其磷酸基至Vir G蛋白的一个宿存的天冬氨酸残基的能力，使Vir G蛋白激活。

②Vir G Vir G ，只有1Kb，单基因，编码DNA结合蛋白,其C端有DNA结合活性，N端具有磷酸化的酸性结构。

从总体效应讲，Vir G基因是属于组成型表达的，这对于细菌迅速地将外部环境信号传递到细胞内十分有利。

当磷酸化的A蛋白将其磷酸基转到Vir G保守的天冬氨酸残基上时，使Vir G蛋白活化，活化Vir G蛋白可以二体或多体形式结合到Vir启动子的特定区，从而成为其它Vir 基因转录的激活因 子，打开Vir B、C、D、E、H等几个基因。Vir A或G突变后会减弱或完全失去对其他Vir 位点活化的诱导，VirA及 Vir G 的这种调控作用被称为双因子调控体系。 ?Vir H、Vir F及Tzs

这些基因对质粒是特异的，在章鱼碱型中有Vir F、Vir H，在胭脂碱型中有Tzs。

Vir H：对植物产生的某些杀菌或抑菌化合物起解毒作用，从而使自身生不受抑制，可增强致瘤能力。

Vir F：编码一个23KD蛋白，通过Vir 系统传递到植物细胞中，对T-DNA起运输作用。

Tzs：大部分胭脂碱型菌株的Ti质粒上均有Tzs基因，转运玉米素合成酶基因，在细菌中表达后将玉米素分泌到细胞外。该细胞分裂素被植物吸收后，能促进农杆菌感染部位的植物组织脱分化和细胞分裂，提高植物对农杆菌转化的感受性。

三、农杆菌Ti质粒基因转化机理

1. T-DNA的加工及转移

首先在下链25bp重复序列的右边界左起第3和第4碱基间剪切，从缺口的3’端开始合成新的DNA链，并一直延伸到左边界第22bp处。置换出原来的下链，形成ssDNA，即T链。

VirD蛋白的功能：VirD1及 VirD2分别编码16KD和47KD蛋白，与T-DNA的加工有关，决定在边界重复序列的特定位点上形成切口，产生T链断裂。 VirD2蛋白的功能：①特异剪切，并与T链的5’端共价结合。②导向功能;

2.T链蛋白复合体的形成及VirE的功能

T链必须横向跨越细菌细胞膜、细菌细胞壁、植物细胞壁、植物细胞膜及核膜才能整合进植物基因组。

T链以一种DNA-蛋白复合体(T复合体)的形式存在。

目前已知至少两种Vir特异蛋白即VirE2和VirD2与T链蛋白复合体的形成有关。

VirE2的功能：编码ssDNA结合蛋白，该蛋白可非特异地一与任何ssDNA结合，通过与T链非共价结合，VirE2可包被T链形成细长的核-蛋白丝，使ssDNA抗3’和5’外切核酸酶和内切核酸酶。

3、T链复合体通过细菌细胞膜的转运及VirB的功能

(1)VirB的功能

VirB启动子有11个基因，大多数编码跨膜蛋白或膜结合蛋白，能在膜上形成一种类似细菌接合转移时从供体菌转至受体菌所必须的结构——接合孔或性毛。T-DNA通过这种孔由细菌进入植物细胞。同时，VirB也可能起运输和提供能量的作用。 按功能，可将VirB蛋白分成五类：

R：在内膜上或内膜内的某些蛋白，可能作为T复合体的受体;

A：此类蛋白可能作为能源，作为一种ATP酶促进T复合体被泵出细菌细胞，VirB11可能是这种A类蛋白。

C：形成通道的作用，如：VirB4是一种富集蛋白，无疏水区，无信号肽，可能在T链转运中起一种结构作用，形成至少一部分特殊的通道结构。

S：载体蛋白，起运载T 复合体穿过通道的作用，这类蛋白可能与所有膜成分(内膜、外膜及周膜)有关。

P：位于外膜上，可能作为结合植物细胞膜的一种受体。

(2)T复合体向植物细胞核的转运

VirD2可能以一种极性方向，将T复合体定向至核孔，而VirE2则作为一种促进因子，保证很长的T复合体在进入核孔时不受干扰。 在T-DNA转移过程中，VirD2具有火车头的作用，牵制T复合体以5’端到3’端的方向向核迁移，而VirE2则只助推器的角色，帮助未折叠的长形T复合物不被打断，并方便其向核运动。 已知VirE2-ssDNA可以抗拒内切酶的作用，如核酸外切酶VII对VirE2-ssDNA降解能力将相当于对ssDNA的6%，对S1核酸酶的效果也相似。

4、细菌染色体上与T-DNA转移有关的基因

目前已知农杆菌染色体上有10个基因与T-DNA转移有关，它们主要涉及细菌与植物细胞的接触和细菌向植物伤口的趋化性。

chvE——编码一个葡萄糖和半乳糖结合蛋白，主要结合组成植物细胞壁的单糖;可能由于识别植物受伤产生的糖单体，导致细菌向植物伤口的趋化性;在低pH值、磷酸饥饿条件下启动VirG表达。

chvD——编码一种细菌ATP结合蛋白，在低pH值、磷酸饥饿条件下诱导VirG蛋白含量升高，然后VirA接受AS信号，刺激VirG转化成活性形式，启动其他VirG 基因表达。

chvA 、chvB、chvC——与环状?-1，2-葡聚糖的合成和运输有关; chvB产物催化合成葡聚糖， chvA产物将多糖从胞质运到胞外，影响农杆菌对植物细胞的附着能力。

pscA和Exoc——与多糖的合成有关，并影响农杆菌对植物细胞的附着能力。

四、农杆菌Ti质粒的改造及载体构建

1、野生型Ti质粒直接作为基因工程载体的障碍：

(1)分子量大，160~240Kb;

(2)有各种限制性内切酶的多个切点;

(3)T-DNA区中含有许多编码基因与基因转移无关，如致瘤基因，其存在还会导致植物体丧失形态发生能力;

(4)Ti质粒不能在大肠杆菌中复制。

2、Ti质粒构建的几个重要因素

(1)右边界序列;

(2)完整的Vir基因群;

(3)有独特的酶切点;

(4)有在植物中可表达的选择性基因;

(5)有在细菌中可表达的选择性基因;

(6)章鱼碱型农杆菌品系需要独特的增强子。

3、载体构建

先将T-DN段克隆到大肠杆菌质粒中，并插入外源基因，最后通过三亲交配或接合转

移把外源基因引入农杆菌Ti质粒上。

Ti质粒的载体系统分两类：一元载体和双元载体

例：双元载体的构建

双元载体系统由两个分别含T-DNA和Vir区的相容质粒构成。

(1)构建原理

Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T-DNA的转移，T-DNA和Vir区处于不同的Ti质粒上同样能起到转移T-DNA的作用。

双元载体含有广泛寄主范围质粒的复制起点(oriv)，从而代替了在共整合载体中用以重组的同源区，它们能在任何农杆菌寄主里自发复制。所以寄主仅需一套完整的vir质粒就可。主要的转移区载在小重组Ti质粒上。

(2)微型Ti质粒(mini-Ti plasmid)

含有T-DNA边界，缺失Vir基因的质粒;含广谱质粒的复制位点OriV及选择标记基因。

(3)辅助Ti质粒

含Vir区段的Ti质粒，helper Ti,是T-DNA缺失的突变型Ti(卸甲Ti)，提供Vir基因功能，反式激活T-DNA的转移。

LBA4404中含有pAL4404(pTiAch5的衍生质粒)，野生型Ti也可做Helper Ti,有更强的毒性。

五、根癌农杆菌侵染植物细胞的机理

1、根癌农杆菌的生物学特性

分类

农杆菌属，也称土壤杆菌属和根瘤菌属，是同属于根瘤科的革兰氏阴性菌。

土壤杆菌属有4 个种：根癌农杆菌、放射形农杆菌、毛根农杆菌和悬钩子农杆菌。

根癌农杆菌，根据其诱导植物细胞产生的冠瘿碱种类不同可分为三种类型即章鱼碱型、胭脂碱型和农杆碱型。

生活习性

土壤杆菌属都是土壤习居菌，主要生活在曾被多种植物生活过的土壤中，好氧，但也能在低氧压的植物组织中生长，最适温25~30℃，pH4.0~12.0,最适pH6.0~9.0。 形态结构

农杆菌细胞呈杆形，0.8x1.5~3.0μm,以1~4根周生鞭毛运动，不形成芽孢，菌落无色，随菌龄增加，光滑的菌落逐渐变成有条纹，但也有许多菌株生成的菌落呈粗糙型。 寄主范围

根癌农杆菌广泛存在于双子叶植物中，根据不完全统计，约有93属643种双子叶植物对根癌农杆菌敏感。裸子植物对该菌同样具敏感性，能诱发肿瘤，对绝大多数单子叶植物无侵染能力。

2、根癌农杆菌侵染的诱导信号及作用机理

(1)酚类化合物

酚类物质——农杆菌浸染植物细胞所必需的诱导物，同时将其作为趋化物来识别。 实验证明，一些植物中常见的酚类化合物的混合物都可激活Vir区基因。如：儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、β-羟基苯甲酸、原儿茶酸、香草醛。

Stachel等在烟草叶片的伤口诱出液中确认了两种主要的Vir区基因诱导物：乙酰丁香酮AS和羟基乙酰丁香酮OH-AS。AS效果最好，0.5~1.0μmol/L即可诱导Vir活化。

(2)中性糖和酸性糖

中性糖在Vir基因诱导和致病毒力中也起重要作用。Shimoda等人，在限定AS诱导条件下，

发现许多中性糖(L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-艾杜糖、D-半乳糖、D-塔罗糖、2-脱氧-D-葡萄糖)都可增强一些Vir区基因的诱导。这些中性糖是通过chvE和VirA起作用，chvE编码葡萄糖和半乳糖结合蛋白，识别伤口产生的糖单体，导致农杆菌的趋化作用。

酸性多糖是组成植物细胞壁中果胶质的主要成分。最近的实验证明，酸性糖(胡萝卜根提取物中蒸馏出来)可改变农杆菌基因的表达。蛋白质标记实验表明，至少有10种蛋白质合成被其诱导，一种被阻遏。

(3)pH值

5.0~5.5的低pH值。诱导物对pH的要求是<.6.0, 在农杆菌培养在含有酚类化合物(AS)的培养基中时，pH5.0 ~5.8Vir的诱导达到一个最高水平

3、根癌农杆菌的侵染能力及其特异性

(1)常用的根癌农杆菌

胭脂碱型(Nop)菌株：染色体背景为C58，生长快，不结球，转化中容易操作，常用的菌株有C58、pGV3850、A208SE等。

章鱼碱型(Oct)菌株：染色体背景为Ach5，生长慢，结球，转化中难操作，培养后不易洗掉，常用的菌株有LBA4404,LBA1010,GV2260,GV3111SE,K61等。

农杆碱型(Agr)菌株，也称琥珀碱型(Suc)：染色体背景为A281或A136，具有胭脂碱型菌株的特点，以A136为染色体背景的常用菌株是EHA101，生长快，不结球，侵染能力强，常用的菌株有A281、EHA101、EHA105等。

(2)、根癌农杆菌的侵染能力差异

根据侵染能力大小将农杆菌分为：

广宿主菌株：大多数双子叶、若干裸子植物、少量单子叶植物;如：pTiB0542、pTiA6; 窄宿主菌株：有限的几种植物上诱发肿瘤，如pTiAg162,仅能在葡萄的几个品种上诱发肿瘤。 不同植物对农杆菌侵染的敏感性不同，在转化中，二者的选配十分重要，要选农杆菌与植物之间有高侵染力的配合。如：杨树茎，用C58优于LBA4404;苹果，6种基因型比较，叶：EHA101(pEHA101)优于LBA4404，C58;茎：A281优于C58，ACH5，A348。

农杆菌的染色体背景对宿主范围同样有着重要作用。因为除Vir区功能外，农杆菌对植物表面识别与结合有关的功能还取决于农杆菌染色体上基因位点。农杆菌所展示出不同的生长速率、多糖产生和对植物细胞的毒力都会影响转化率和宿主范围。

六、根癌农杆菌转化程序及操作原理

1、根癌农杆菌Ti质粒转化的基本程序

(1) 选择适宜的培养基，使创伤部位能产生尽可能多的再生植株。

(2) 确定供体植物最适的培养条件。

(3) 确定最佳外植体类型、大小、部位等：再生途径，愈伤组织起源(细胞类型、层次)，

保证转化愈伤组织和芽原基由创伤部位的浅层细胞发育而来。

(4) 确定适宜的抗生素水平：抑菌抗生素Cef ，Cb ，能抑制细菌生长，还能保证愈伤组

织正常生长和分化。

(5) 确定选择压力的最低水平。

(6) 优化农杆菌接种和共培养条件改进筛选条件，促进抗性细胞恢复再生能力：采用无毒的生化物质。

2、根癌农杆菌的培养、纯化、保存及工程菌液的制备

(1)农杆菌的培养

常用的农杆菌培养基有 LB、YEM、YEB、TY、523、PA及 MinA等培养基。

这些培养基中，LB、YEB、YEM及523属富集培养基，其营养成分丰富，包括有各种有机成分。在这些培养基中农杆菌生长快，分裂旺盛，它们是常用 制备工程菌液的培养基。 ? PA和 TY培养基是属营养较好的培养基，氨基酸及碳源、氮源都很丰富。农杆菌在这些培养基上生长也很快，是常用的农杆菌选择培养时的培养基。

MinA培养基与前几种培养基有明显差异：只提供必要的无机盐，并用葡萄糖和(NH4)2SO4 提供碳源和氮源。

Minimal只用相应的冠瘿碱如 NOpaline、Octopine等取代蔗糖、氨基酸和无机氮作为农杆菌的碳源和氮源。

农杆菌在MinA和Minimal培养基上生长较慢。在进行三亲杂交时通常用这两种培养基，并加相应的抗生素选择转化的农杆菌。含重组质粒的大肠杆菌及含辅助质粒 pRK20 13的HB101因不能利用冠瘿碱作为碳源和氮源而不能生长，同时还存在抗生素的选择，因此有利于选择转化的农杆菌的`生长。

农杆菌的生长周期

农杆菌培养方式：分为固体平板培养和液体振荡培养，

固体培养一般需2～3d，液体培养生长更快，一般需1～2d。

农杆菌接种在培养液后，并不立即开始增殖。一般在25～30℃时，需1～2 h细菌才开始分裂。

当生长开始后，细菌数目以一恒定的指数速率倍增，直至培养基成分改变和供氧缺乏时才停止增殖。当细菌增长速率达到对数指数时称之为对数生长状态。

当细菌密度达到 177/ml时，空气中的氧气便难以很快地扩散到细胞内。在振荡或通气条件下培养，细菌浓度也很少超过 2～3 X 109/ml。

测定农杆菌浓度的方法：最简单的方法是光密度测定法。将菌液装入比色杯汽在分光光度计上选用600nm波长测定其OD值。光密度与浓度换算公式是1OD约等于 8 X 108/ml。

(2)工程菌的纯化

纯化菌种的方法主要采用常规的微生物纯化方法，即划线法。用接种针划线，然后用石蜡膜封口，将平皿倒置放恒温箱内，在25～28℃条件下培养过夜，次日或即日看到分离的单菌落。挑取单菌落接种在液体培养基内进行液体振荡培养。

(3)工程菌侵染悬浮液的制备

液体振荡培养的工程菌，通常培养 12～24 h后即可达到对数生长期。用离心管取一定数量的菌液进行4000r/min离心，倒掉上清液，再加入植物外值体诱导愈伤组织或分芽的液体培养基，使其光密度OD值达到0.5，即可用作接种外植体的工程菌液。

注意：因为农杆菌培养基中通常含有抗生素，它对外植体的生长、脱分化或分化有不良影响，放需通过离心除去细菌培养基，加入植物培养基。也有的做法是，将农杆菌加入植物培养基后再振荡培养 12 h，当细菌生长达到对数生长期后再离心，倒掉上清液，用新的植物液体培养基稀释至一定OD值，再作为工程菌液使用。

(4)工程菌的保存

菌种的保存的目的是创造一个适合细菌休眠的环境(低温、干燥、缺氧)，使其得以长期保存。其功能在于尽量减少菌株的传代次数;使菌种经保存后不死亡、不污染杂菌，并保持其原有性状，降低菌种的变异率;最终目的是的基因不能丢失。

菌种保存的方法根据其保存时间长短可分为三种方法：

短期保存〔数月)：采用斜面或平板保存法。斜面菌种置于4℃可保存数月，平板用石蜡膜密封后也可在低温0～4℃下放置数月。

中长期保存(数年)：中长期保存采用穿刺法，这是一种菌种接入柱状培养基的方法。经常应用的是半固体柱状培养基，用接种针沾取少量问后直接插入柱状培养基中。需注意的是，要从培养基中间插入，直插到接近管底，但不要穿透培养基，再慢慢按原途径拔出接种针，切勿搅动，以免使接种线不整齐而影响观察，甚至会因用力搅动造成空隙太大进入空气，而影响保存效果。穿刺培养的菌种用蜡封口，在室温下可保存数年。

长期保存菌种：主要采用甘油保存法。在7%二甲基亚(DMSO)或 15%甘油中，菌种可于- 70℃冰箱或液氮中长期保存。当甘油含量增加40～ 50%时，细菌可在- 20℃或- 70℃条件下，保存若干年而不失活。将冰冻菌种从冰柜中取出时，应当放在冰浴上慢慢融化，不可直接将其放室温下，否则会导致菌体失活，更不能直接接种至液体培养基内28℃振荡培养。

3、Vir基因活化诱导物的使用

(1)诱导物：

常用诱导物是乙酰丁香酮(AS)和羟基乙酰丁香酮(OH-AS)，其中效果优是AS。但最近又有新的发现，有两种特殊化合物比AS的诱导活性高10～100倍。

(2)诱导物的使用方法

在农杆菌液体培养时加 AS，加入时间-般在制备工程菌浸染液使用前4～6 h加入。使农杆菌既处于对数生长期，又处于vir基因高度活化状态，从而提高侵染能力。也有的在农杆菌悬浮液离心后用植物外植体培养基稀释成侵染液时加入。

AS加在农杆菌和外植体共培养的培养基中。共培养的过程是Ti质粒实现 T-DNA转化时期。一般农杆菌附着 16 h后才能进行转化，这时需要vir基因的高度活化。因此，许多科学家赞成这种使用方法。

在农杆菌液体培养基中及共培养基中都加入AS。这种方法似乎最牢靠，只不过是使用的AS诱导剂太多了。

(3)诱导物使用的pH值

pH值对vir区的活化有着明显的影响，从理论上讲含AS的培养基pH值为5.0～5.6时， Vir区基因的诱导达到最高水平。

pH值改变 0.3，即对多种植物的转化率有明显影响。

章鱼碱型和农杆碱型菌系比胭脂碱型和琥珀碱型需要更低的pH值。

通常农杆菌培养时pH值为7.2。这种生长旺盛的菌株的vir基因均处于不活化状态。而组织培养基中的pH值常为5.8，有利于vir基因的活化。在vir基因活化诱导中应调整培养基的pH值。

4、外植体的选择

Mayer等指出，转化只发生在细胞分裂的一个较短的时期内，可能只有处于细胞分裂周期的S期才具有外源基因的转化能力，因为核基因组DNA正在复制时才能使外源DNA整合。因此细胞具有分裂能力是转化的基本条件。

(1)外植体的种类

叶片、叶柄、子叶、子叶柄、下胚轴、茎、花茎、匍匐茎、块;茎尖分生组织、芽、根、合子胚或体细胞胚，以至成熟的种子等都可作为外植体转化。但各种外植体材料的转化率有明显差异。

最佳共培养的时间：

农杆菌转化时，并不“侵入”到植物细胞中去，而是把T-DNA转移到植物细胞。农杆菌附着后不能立即转化，只有在创伤部位生存16h之后的菌株才能诱发肿瘤，这一段时间称为“细胞调节期”。因此，共培养时间必须长于 16h。共培养时间太长，由于农杆菌的过度生长，植物细胞因受到毒害而死亡。共培养时间对转化率有着很大影响，而且不同物种、外植体种类、农杆菌菌株的最佳共培养时间不同。

确定最佳共培养时间的方法主要采用gus基因瞬时表达测定法，即共培养后定时测定外植体的gus基因颜色反应，统计瞬时表达率及表达面积，以表达率高，表达面积大为优。同时还要考虑外植体的受损害程度，以保证外植体的旺盛生长为直。最后还要以获得的转化愈伤组织频率或转化不定芽频率为最终依据。

农杆菌的增殖适度

在共培养时农杆菌增殖生长不良，外植体切口边缘只有很少的农杆菌生长，则转化的机率很小。反之，农杆菌在外值体四周过度增殖，可引起对外植体的毒害，致使其褐化死亡。 控制农杆菌增殖适度的原则是既要使菌株在外植体边缘特别是切口面旺盛增殖生长，又不应过度，一般以覆盖切口面为适度。 控制农杆菌增殖的方法有以下几种：

1)调整工程菌液的浓度，生长太快则应降低菌液浓度。

2)控制共培养时间，农杆菌的增殖生长适度也是确定共培养最佳时间的指标，共培养时间太长可造成农杆菌过度生长。

3)使用抗生素调控农杆菌的增殖生长。一种方法是在共培养基中加入适量的抗生素如羧苄青霉素或头孢霉素。另一种方法是共培养2～3d后的外植体需用含抗生素的液体共培养基充分洗涤，以除去过量的农杆菌，然后转到新鲜的共培养基上继续共培养。共培养结束时若仍存在农杆菌过度增殖，则可再用上述洗涤培养基充分洗涤后进行愈伤组织诱导或不定芽分化培养 。 共培养中激素的影响

共培养时培养基中是否加激素，文献报道不一，有的不加激素，有的则认为加激素后促进外植体细胞分裂，保持细胞活力，也有利于转化后细胞的生长，从而提高转化率。

如 Mansur等(1993)用 A281菌株与花生叶片外植体共培养时，加激素比不加激素的肿瘤诱导率提高约 30%。

目前大多数研究者采用加激素的方法，而且共培养基与愈伤组织诱导或不定芽诱导培养基相同。

(4)外植体脱菌及选择培养 外植体的脱菌培养 脱菌培养，即把共培养外植体转移到含有抗生素的培养基上。常用的脱菌抗生素有羧苄青霉素(Carb)、头孢霉素(Cef) 等。这些抗生素不仅对农杆菌有杀伤或抑菌作用，而且对植物细胞同样有一定的生物效但对不同植物的不同外植体产生的影响不同。

Holford 等(1 992 )指出，Carb 的分解物为生长素及苯乙酸，因此 Carb 可刺激愈伤组织的增殖。Howe 等( 1994 )观察到对杨树的愈伤组织诱导有抑制作用。在甘蓝研究中发现，Carb 抑制根分化，Cef 抑制芽分化，因此芽分化阶段需用Carb， 生根阶段则用Cef。 抗生素的使用浓度一般为500mg/L 左右。其使用原则是在达到抑制农杆菌生长的目的后，尽量降低其浓度。

脱菌培养的时间：脱菌培养的时间，一般需5～6次继代培养，但仍然不能把残留的农杆菌杀死，特别是共生在维管束和细胞间隙中的农杆菌。如果停止使用抗生素后的外植体又有农杆菌可再使用抗生素脱菌。也有的植物一直使用抗生素，直到试管苗形成。

(5)转化体的选择培养

?选择压： 选择抗生素如 Km，加入选择培养基后，对细胞的生长产生一种选择作用，

称之为选择压。加入的抗生素浓度愈大，选择压也愈大。选择培养基中抗生素的浓度，即选择压的强度，也要根据植物的特性而定，较敏感的植物要用较低的 Km浓度。一般浓度范围是 Km 50～ 100mg/L， hpt 10~20mg/L， ppt 5～20mg/L。

?选择的方法：前期选择、延迟选择和后期选择。

前期选择：就是外植体共培养后，在转入愈伤组织或不定芽诱导的一开始就加入选择压，相当于前面讲到的先选择后再生。

延迟选择：当愈伤组织和不定芽诱导培养时开始不加选择压，过一周或一定时间后再加入选择压，这样既有利于转化细胞生长又不会产生更多的嵌合体 后期选择：即相当于前面说的先再生后选择，有利于提高转化率。

选择培养过程中转化和再生细胞的一致性

在选择培养条件下再生细胞和转化细胞是否一致，关系到能否得到真正的转化，只有同时具有再生和转化潜力的细胞才有可能分化成转基因植株。因此再生部位和可被转化的细胞部位应该发源一致，反之得到的可能是假转化体。假转化体在继代选择培养基上生长不良而死亡，或呈白化。

七、根癌农杆菌Ti质粒转化的方法

1、整体植株接种共感染法

该途径是模仿农杆菌天然的感染过程，人为地在整体植株成创伤部位，然后把农杆菌接种在创伤面上，或用针头把农杆菌注射到植株体内，杆菌在植株体内进行侵染实现转化，获得转化的植物细胞，因此也称之为体内转化。为了获得更高的转化频率，一般采用无菌的种子实生苗或试管苗。它是最简便的转化法。

优点：

实验周期短;

充分利用了这些无菌实生苗的生长潜力;避免在转化中其他细菌的污染;菌株接种的伤口与培养基分离，以免农杆菌在培养基上过度生长，允许在无抗生素的培养基上进行;

具有较高的转化成功率。

缺点：

转化组织中常混有较多未转化的正常细胞，即形成严重的嵌合体; 需要大量的无菌苗材料; 转化细胞的筛选比较困难。

2、叶盘转化法

(1)叶盘法转化的操作

打孔器从消毒叶片上取得叶圆片

叶盘在过夜培养的对数生长期的农杆菌的菌液中浸数秒种后，置于培养基上共培养 待菌株在叶盘周围生长至肉眼可见菌落时再转移到含有抑菌剂的培养基中除去农杆菌。

同时在该培养基中加入抗生素进行转化体选择，3~4周培养可获得转化的再生植株。

优点：操作简单、重复性高、适用性广 (2)转化苗的保持与繁殖

主要采用两条途径实现转化苗的保持与繁殖。

营养繁殖途径，它包括试管苗的无性快速繁殖及嫁接、扦插等田间的无性繁殖方式。 该途径保持繁殖转化苗时应注意如下：

①正确使用激素浓度，低水平的激素能有利于保持外植体活力，并刺激休眠侧生分生组织的发育及侧枝形成。适当提高分裂素浓度有利于芽的分化，形成原始转化苗的无性系克隆。因此可根据实验目的选择细胞分裂的浓度。

②为消除残留的农杆菌在繁殖培养基中加入抑菌抗生素是明智的种子繁殖：

这对于转基因植株的正常表达、遗传特性及向生产化过渡具有重要作用。该途径的主要操作是将转化试管苗在小花盆中移栽成活，然后转入田间，开花时套袋隔离防止杂交授粉及向环境中释放转化的花粉。结种后注意收割种子，保存。

3、原生质体共培养转化方法

(1)操作步骤：

①从叶片分离原生质体，在26t下暗培养24 h，然后转移到lX下继续培养48h;

②在细胞即将分裂，新的细胞壁物质已经形成时，加入活化的农杆菌悬浮液。农杆部原生质体的比例以1：1000左右为宜。共培养约2～3 d;

③再加入选择标记的抗生素对转化体进行选择培养约3～4周后可产生肉眼可见的小块转化愈伤组织;

④将小块愈伤组织转移到固体培养基上再生愈伤组织，此时继续保持选择压力，以便保证只有转化愈伤组织才能不断生长;

⑤将转化愈伤组织转入固体分化培养基，获得转化再生植株。其他步骤与叶盘法相同。

(2)原生质体共培养法的优点及一些技术问题原生质体的密度一般以105～106个/ml为宜。

在农杆菌和原生质体共培养期民农杆菌附着在原生质体上，超过32小时之后方可除菌洗涤，也就是要有一定的附着时间。

原生质体出现新形成的细胞壁物质是农杆菌转化的基本条件，这是因为细胞壁物质与农杆菌的附着有关。未形成新细胞壁物质的原生质体没有农杆菌的附着，也没有转化进行。 在共培养过程中，某些二价阳离子(Mg2+)为农杆菌的附着和转化所必需。二价离子的整合物EDTA可以抑制农杆菌对植物细胞壁的吸附及转化作用，因为上述 Mg2+(不是 Ca2+)与农杆菌附着到植物细胞壁有关。 共培养转化似乎是在单细胞或二细胞阶段发生，因此获得的转化愈伤组织大部分是来自一个细胞。

八、癌农杆菌转化系统的评述

优点：

成功率高，效果好。该转化系统是模仿或称之为利用天然的转化载体系统，不管是用菌株接种整体植物的伤口，还是直接侵染离体培养细胞，通常都可以获得满意的转化频率。

在所有的转化系统中，Ti质粒转化系统是机理研究得最清楚的，方法最成熟，应用也最广泛。

Ti质粒的T-DNA区可以容纳相当大的DN段插入，目前已把长达50kb的异源DNA序列通过T-DNA完整地转移到植物细胞中。

T-DNA上含有引导DNA转移和整合的序列，以及能够被高等植物细胞转录系统识别的功能启动子和转录信号，使插入到T-DNA区的外源基因能够随同T-DNA一道在植物细胞中表达。

可根据人们的需要连接不同的启动子，使外源基因能够在再生植株的各种测器官中特异性表达，例如在果实中表达，在叶中表达，甚至仅在根中表达，即可进行人为地控制。

农杆菌Ti质粒转化系统转化的外源基因以单拷贝为多数，遗传稳定性好，并且多数符合孟德尔遗传规律，因此转基因植株能较好地为育种提供了中间选育材料。

植物染色体工程 第8篇

一、实验材料的处理

1.洋葱幼根的培养

剥去老皮, 稍去老根, 置于玻璃槽内, 注水以浸没根基部为宜。25℃左右下约4~5天根基部即长出大量2~3 cm长的幼根, 提供有丝分裂和低温诱导。

2.低温处理

在实验前1天, 待幼根长出2~3 cm左右时, 将实验所需材料移入4℃冰箱中, 继续诱导培养24~36 h。

3.苯酚品红的改良

母液A:取3 g碱性品红, 溶解在100 m L的70%乙醇中。母液B:取母液A 10 m L, 加入90 m L的5%苯酚溶液。取B液45 m L, 加入6 m L冰醋酸和6 m L的37%甲醛, 此为苯酚品红染色液。改良苯酚品红:取10 m L苯酚品红染液, 加入90 m L的45%冰醋酸和1.8 g山梨醇即可。

二、方法步骤

三、实验操作注意事项

1.采用“统一时间”“同步操作”的原则;

2.有丝分裂和低温诱导间组进行, 按表操作, 上课时, 在第一时间剪取根尖解离;

3.在等待的时间里, 做实验设计方面的探究;

4.采用“镊子背敲打法”制片, 两组间对比观察。

将观察根尖分生组织细胞有丝分裂和低温诱导植物染色体数目变化, 按照探究性实验教学模式进行实验设计, 经过学生分组实验的实践检验, 极大地提高了实验教学效果, 展示了探究性实验的魅力。用“镊子背敲打法”制片, 显微观察效果的确很好。

摘要：探讨低温诱导植物染色体数目变化与有丝分裂同步操作对比观察的实验改进方法。

关键词：有丝分裂,低温诱导,植物染色体,同步观察

参考文献

[1]郭丽红, 王淑静.提高细胞有丝分裂实验效果综合分析[J].实验科学与技术, 2010, 8 (3) :13-14.