环境微生物实验教案

2024-07-14

环境微生物实验教案（精选6篇）

环境微生物实验教案第1篇

实验一显微镜使用与细菌染色法

一、实验目的

1．学习掌握显微镜的结构、功能和使用方法。2．学习掌握细菌简单染色和革兰氏染色方法。

二、显微镜的结构与功能 1．显微镜的结构

显微镜有机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置主要作用是使光学系统，紧固在一个光轴直线上，而且可精确地调节各光学系统部件之间的距离，使显微镜产

生清晰的物象。其组成包括：①镜座和镜臂；②镜筒；③物镜转换器；④载物台；⑤调焦装置（粗调节器和细调节器）。光学系统使显微镜最主要地部分，起分辨和放大目的物地作用。其组成包括：①目镜；②物镜；③集光器；④反光镜；⑤光源（自然光源和电光源）。

光学显微镜基本结构：

1.照明灯(Lamp)2.聚光器(Condenser)3.载物台和切片夹(Mechanical stage and specimenretainer)4.推进器(Mechanicalstage adjustment knob)5.物镜(Objectives)6.粗细螺旋(Course andfine focus knob)7.目镜(Oculars)8.照相机等接口(Connection to camera, etc.)2．显微镜的成像原理

标本得到足够的照明由标本反射或折射出的光线经物镜进入使光轴与水平面倾斜45 度的棱镜，在目镜的焦平面上，即在目镜的视场光阑处，成放大的侧光实像，该实像在经目镜的接目透镜放大成虚像，所以人们看到的实虚像。3．分辨力与数值孔径

显微镜的光学技术参数包括：数值孔径、分辨率、放大率、焦深、视场宽度、覆盖差、工作距离等等。这些参数并不都是越高越好，它们之间是相互联系又相互制约的，在使用时，应根据镜检的目的和实际情况来协调参数间的关系，但应以保证分辨率为准。1．数值孔径

数值孔径（又称开口率numerical aperture 简写NA）是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断两者（尤其对物镜而言）性能高低的重要标志。其数值的大小，分别标刻在物镜和聚光镜的外壳上。数值孔径是光线投射到物镜上的最大开口角度一半的正弦，乘上标本与物镜间介质的折射率的乘积。用公式表示如下：NA=nsinu/2 成正比，与焦点的距离成反比。显微镜观察时，若想增大NA 值，孔径角是无法增大的，唯一的办法是增大介质的折射率n 值。基于这一原理，就产生了水浸物镜和油浸物镜，因介质的折射率n 值大于1，NA 值就能大于1。2．分辨率

显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距。其计算公式是σ = λ/NA 式中σ 为最小分辨距离；λ 为光线的波长；NA 为物镜的数值孔径。可见物镜的分辨率是由物镜的NA 值与照明光源的波长两个因素决定。NA 值越大，照明光线波长越短，则σ 值越小，分辨率就越高。要提高分辨率，即减小σ 值，可采取以下措施

（1）降低波长λ 值，使用短波长光源。（2）增大介质n 值以提高NA 值（NA=nsinu/2）。（3）增大孔径角u 值以提高NA 值。（4）增加明暗反差。3．放大率和有效放大率

由于经过物镜和目镜的两次放大，所以显微镜总的放大率应该是物镜放大率和目镜放大率的乘积。显然，和放大镜相比，显微镜可以具有高得多的放大率，并且通过调换不同放大率的物镜和目镜，能够方便地改变显微镜的放大率。放大率也是显微镜的重要参数，但也不能盲目相信放大率越高越好。显微镜放大倍率的极限即有效放大倍率。分辨率和放大倍率是两个不同的但又互有联系的概念。当选用的物镜数值孔径不够大，即分辨率不够高时，显微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放大倍率，得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像，称为无效放大倍率。反之如果分辨率已满足要求而放大倍率不足，则显微镜虽已具备分辨的能力，但因图像太小而仍然不能被人眼清晰视见。所以为了充分发挥显微镜的分辨能力，应使数值孔径与显微镜总放大倍率合理匹配。4．镜头的识别

低倍、高倍和油镜接物镜的识别方法，可直接读它上面刻的倍数，简便方法是低倍镜较短，高倍镜较长，油镜更长且上面刻有黑圈。使用时一定要识别清楚，不可认错，否则在转换物镜时会碰压镜头，损坏物镜的危险。放大倍数越高的接物镜它的焦距越小，工作距离也越小，因此油镜观察时镜头和玻片极为接近，使用时应该注意。

三、实验方法

1．用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作简单染色：涂片→干燥→固定→染色→镜检

（1）涂片：在玻片中央滴一滴蒸馏水，然后取菌少许，洗入蒸馏水滴中，做成薄薄一层。

（2）干燥：细菌涂片一般应让他自然风干。有时为使它干得快些，可以把涂片小心在酒精灯火焰上微微加热烘干。

（3）固定：细菌涂片常用火焰固定法。即将涂片不快不慢地在火焰上通过2-3 次，菌体受热固着于玻片上。

（4）染色：细菌简单染色常用石炭酸复红或草酸铵结晶紫为染色剂。在已固定的涂片上加一大滴石炭酸复红染色液，使盖住整个涂抹面，静置染色1 分钟。（5）水洗：染色完毕用自来水把玻片上的染色液冲洗干净。

（6）镜检：将染色片晾干，或用吸水纸把多余的水吸去晾干，再用显微镜观察。2．用大肠杆菌(E.coli)和金色葡萄球菌(staphylococcua aureus)作革兰氏染色: 染色方法的要点及原理：先用结晶紫染色，再加碘液固定，酒精处理后用番红复染。革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

染色的具体步骤：涂片→固定→初染→媒染→脱色→复染→镜检（1）取菌按常法涂片、干燥、固定。（2）草酸铵结晶紫染色1 分钟。（3）充分水洗后加碘液处理1 分钟。

（4）水洗后酒精脱色15-20 秒。（用酒精连续滴洗，至不溶出颜色为止）。（5）水洗后加番红染色1 分钟。

（6）充分水洗，吸去余水后晾干，镜检。

四、作业

1．画出你在油镜下观察到的细菌形态并注明放大倍数？ 2．在染色中，固定一步起何作用？酒精脱色一步为何是关键？ 3．用油镜观察应注意哪些问题？滴加香柏油起什么作用？ 4．油镜使用完后应如何处理？

实验二放线菌与霉菌形态观察

一、实验目的

1．学习掌握插片法和水浸片法观察放线菌和霉菌的方法。2．学习掌握低倍镜和高倍镜观察丝状菌体的技能。

二、实验内容

1．用插片法观察绘图放线菌的形态并注意“三丝”分化。将灭菌的盖玻片斜插在涂布放线菌孢子的培养基的平板上，一半露在外面，恒温培养后在培养基表面和盖玻片上部都有放线菌生长，小心取出盖玻片，放在干净的载玻片上，在显微镜下直接观察。

2．用水浸片法观察：青霉（Penicillium.sp）、曲霉（Aspergillus.sp）的形态和分生孢子。根霉（Rhigopus.sp）的假根和孢囊孢子。梨头霉（Absidia.sp）的接合孢子，木霉（Trichederma.sp）的形态，注意分枝形态。

霉菌菌丝一般可从培养体上直接调取，作成水浸片。具体方法：在清洁载玻片中央，加蒸馏水一滴，用解针挑取少量菌丝放入水滴中，这时两手各持针一支，将菌丝分开，不使缠结成团。挑开菌丝后，轻轻加上盖玻片，注意不要产生气泡，先用低倍镜后用高倍镜观察。

三、作业

1．绘图、记录南昌链霉菌、青霉、木霉、曲霉和根霉的形态。2．绘图、记录梨头霉的接合孢子形态。3．用水浸片法观察丝状真菌应注意哪些事项？

实验三污水环境细菌运动性与原生动物、藻类的形态观察

一、实验目的

1．学习掌握用悬滴法观察细菌运动性的方法和技术。2．学习掌握用水浸片法观察原生动物和藻类的形态。

二、实验内容

1．用悬滴法观察污水中细菌的运动性，注意运动方向。2．用水浸片法观察原生动物的形态、运动性并注意分类。（1）鞭毛虫类（Flagellata）：绿眼虫、波豆虫（2）肉足虫类（Sarcoclina）：变形虫、太阳虫

（3）纤毛虫（Ciliata）：草虫、肾形虫、钟虫、豆形虫、漫游虫等 3．用水浸片法观察藻类的形态、种类并注意分类。（1）绿藻：空球藻属（Fudoria）珊藻属（Scendesmus）鼓藻属（Cosmarium）小球藻属（Chlorella）盘星藻属（Pediastrum）

（2）裸藻：眼虫藻属（Euglena）（3）硅藻：舟形藻属（Navicula）直链藻属（Melosira）平板藻属（Tabellaria）

三、作业

1．绘图记录细菌的运动方向，悬滴法观察应注意哪些事项？ 2．绘图记录原生动物、藻类的形态、种类和名称。

实验四微生物的大小测定与数量的测定

一、实验目的

1．学习了解测微尺的结构，掌握测定微生物大小的方法。2．观察酵母菌的形态，掌握鉴别死活酵母菌的方法。

3．学习了解血球计数板的结构，掌握微生物数量测定的方法。

二、实验内容

1．在低倍镜和高倍镜下求出目镜测微尺的校正值。（1）目镜测微尺和镜台测微尺

目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片的中央刻有一小尺，它是在5 毫米内作50 等分刻制的，每一等份为0.1 毫米。另一规格是5 毫米作100 等分，每等分为0.05 毫米。镜台测微尺是刻在载玻片中央的小尺，它是在1 毫米内作100 等分刻成的，每等分10 微米。

（2）目镜测微尺校正的方法

将镜台测微尺上面的透镜片取下，把目镜测微尺放在光阑上，刻度朝下。把镜台测微尺置于载物台上，用低倍物镜检视，使测微尺位于视野中央。注意区分视野内两把尺哪个是目镜测微尺，哪个是镜台测微尺。利用推进器或转动目镜使两尺的第一条线（0 线）互相重合，然后找出另一条重合线。如重合线较多选取距0 线最远的重合线。记下两条重合线之间两尺的刻度，依公式算出目镜测微尺的校正值。目镜测微尺校正值（每刻度微米数）= 两重叠刻度间镜台测微尺格数×10 两重叠刻度间目镜测微尺格数

2．用美兰水浸片法观察酿酒酵母（saccharomyces cerevisiac）的形态，注意出芽繁殖

和死活酵母菌的染色形态，并测量大小。3．用血球板计算黑曲霉孢子的数量。（1）血球计数板

利用血球计数板在显微镜下直接计数是一种常见的微生物计总数的方法。因为计数板载片和盖片间的容积一定，所以可以根据显微镜下观察到的微生物数目来计算单位体积内微生物总数。血球计数板是一只特制载玻片。载片上有两个方格网，每一方格网共分九个大方格，其中间的一个大方格用来做微生物计数，所以又称为计数室。计数室的刻度一般有两种，一种是每个大方格分成16 个中方格，每中方格又分成25个小方格。另一种是一个大方格分25 个中方格，每个中方格又分成16 个小方格，不论哪一种，一个大方格，都等分成（25×16 或16×25）400 个小方格。因为每个大方格边长为1 毫米，载片与盖片间距离为0.1 毫米，所以每个计数室（1 个大方格）体积为0.1 立方毫米。测出每个中方格菌数，就可以算出一个大方格的菌数，由此推算出1 毫升菌液内所含的菌数。一个大方格是16 个中方格时，应当数4 角4 个中方格（即100 个小方格）的菌数，一个大方格是25 个中方格时，除取4 角4 个中方格外，还要数中央一个中方格（即为80 个小方格）的菌数。计算公式如下： 16×25 计数板：

总菌数/ml= ×400×10000×稀释倍数=每个小方格内菌数×4×106×稀释倍数 25×16 计数板：

总菌数/ml= ×400×10000×稀释倍数=每小方格内菌数×4×106×稀释倍数（2）血球计数板计数方法

①视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释，以每小格的菌数可数为度。②取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。

③将黑曲霉孢子悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。

④静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。

⑤计数时若计数区是由16 个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4 个大方格（即100 小格）的菌数。如果是25 个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l 个大方格的菌数（即80 个小格）。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。

⑥测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。

三、作业

1．测量酵母菌的大小（高倍镜）：菌名宽（目镜格数）长（目镜格数）平均

2．在不改变目镜和目尺，而改变物镜来测定同一酵母菌时，其结果是否相同，为什么？

3．根据你的操作，用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？

实验五培养基的制备与灭菌

一、实验目的

1．学习掌握培养基的制备原理与方法。2．学习掌握玻璃器皿的包扎与灭菌方法。

3．学习掌握高压蒸汽灭菌，干热灭菌的原理与方法。

二、实验内容 1．玻璃器皿的包扎

（1）每4-5 人为一组包扎：直径9 厘米培养皿3 包，每包6 皿，1ml 吸管2 支，5ml吸管2 支，玻璃刮铲3 支。

（2）每一小组制备18×180mm 试管无菌水5 支，每支4.5ml 自来水，250ml 三角瓶带玻璃珠无菌水1 瓶，装自来水45ml，以上塞好棉塞包扎后待灭菌。2．培养基制备

（1）培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。（2）制备流程：称量→溶解→蒸煮→调pH→分装→包扎→灭菌（3）高氏一号培养基配方

可溶性淀粉 20g K2HPO4 0.5g KNO3 1g MgSO4.7H2O 0.5g NaCl 0.5g FeSO4 10mg 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml PH 值 7.2—7.4（4）每小组制备高氏培养基250ml，分装15*150mm 试管8-10 支，余液分装250ml 三角瓶2 瓶，塞棉塞包扎待灭菌。（5）关键步骤及注意事项 ①要严格按配方配制。②调pH 不要过头。

③干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70ºC 以下放物、取物。

④高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。3．消毒（disinfection）与灭菌（sterilization）消毒：用化学或物理的方法杀死微生物的营养体。灭菌：用物理或化学的方法杀灭物体上一切微生物。

（1）干热灭菌法：把待灭菌的物品均匀地放入烘箱中，升温至160ºC，恒温1 小时即可。此法适用于玻璃皿、金属用具等的灭菌。

（2）高压蒸汽灭菌法（一般121ºC，30min，适用培养基）：把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进行的，以大量蒸汽使其中压力升高。由于蒸汽压的上升，水的沸点也随之提高。在蒸汽压达到1.055 公斤/厘米2 时，加压蒸汽灭菌锅内的温度可达到121ºC。在这种情况下，微生物（包括芽孢）在15-20 分钟便会被杀死，而达到灭菌目的。如灭菌的对象是砂土、石蜡油等面积大、含菌多、传热差的物品，则应适当延长灭菌时间。

（3）间歇灭菌法：待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1 次，每次煮沸1h，连续3d 重复进行。在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在37ºC 恒温条件下培养过夜，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。

（4）巴氏灭菌法：有些食物会因高温破坏营养成分或影响质量，如牛奶、酱油、啤酒等，所以只能用较低的温度来杀死其中的病原微生物，这样既保持食物的营养和风味，又进行了消毒，保证了食品卫生。该法一般在62ºC，30 分钟既可达到消毒目的。此法为法国微生物学家巴斯德首创，故名为巴氏消毒法。4．棉塞的制作

三、作业

1．高氏一号培养基属于何种性质培养基？有沉淀吗？为什么？

2．高压蒸汽灭菌的过程中，应注意哪些事项，最关键的因素是什么？为什么？

实验六环境微生物的分离与生理鉴定实验

一、实验目的

1．学习掌握平板稀释法分离环境微生物的技术。2．学习掌握微生物生理生化鉴别的基本方法。3．学习掌握无菌操作技术。

二、实验内容 1．土壤微生物的分离

分离微生物是，一般是根据该微生物对营养、pH、氧气等要求的不同，供给它们适宜的生活条件，或加入某种抑制剂造成只利于该菌种生长，不利于其他菌种生长的环境，从而淘汰不需要的菌种。分离方法用稀释平板分离法，其最终目的是要在培养基上出现欲分离微生物的单个菌落，同时还可以测定分离的微生物的数量。

（1）方法：将土样随机称取10g，加入至装有90 ml 无菌水带玻璃珠的三角瓶中，旋转震荡30min，作逐级分离，逐级稀释见下图，用无菌吸管吸取不同稀释度菌悬液0.1ml 涂布平板。（2）稀释度选择：

①牛肉膏培养基：10 皿(稀释度10﹣4,10﹣5,10﹣6,三个重复,一个备用)； ②高氏一号培养基：10 皿(稀释度10﹣3,10﹣4,10﹣5,三个重复，一个备用)； ③真菌培养基：10 皿(稀释度10﹣3,10﹣4,10﹣5,三个重复,一个备用)；

2．用大肠杆菌和枯草芽孢杆菌分别接种糖发酵培养基、石蕊牛乳培养基、蛋白胨培养基和淀粉培养基作生理鉴别实验。（1）糖发酵试验

各种细菌由于具有不同的酶系统，致使它们能利用不同的底物，或虽然可以利用相同的底物，却产生不同的代谢产物，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别细菌。糖发酵是最常用的生化反应，存在于大多数细菌中。不同的细菌在糖的分解能力上存在很大的差异。有些细菌能分解某种糖并产生酸性物质(如乳酸、丙酸、醋酸等)和气体(如二氧化碳、氢、甲烷等)，而有些细菌只产生酸不产生气体。例如大肠杆菌分解乳糖和葡萄糖产酸并产气，普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，但不能分解乳糖。酸的产生可利用指示剂来判断。在培养基中加入溴甲酚紫(pH5．2 为黄色，pH6．8 为紫色)，当发酵产酸时，使培养基由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵试管中倒置的德汉氏小管中有无气泡的出现来验证。（2）石蕊牛乳试验

牛乳中通常含有蔗糖、乳糖、蛋白质、酪素等成分。微生物对牛乳的利用主要是指乳糖及酪蛋白的分解利用。牛乳中常加入石蕊作酸碱指示剂和氧化还原指示剂。微生物对牛乳的利用可分三种情况：①酸凝固作用：微生物发酵乳糖后产生许多酸，使石蕊变红，同时酸度很高时，可使牛乳凝固。②凝乳酶凝固作用：某些微生物能分泌凝乳酶，使牛乳中的酪蛋白凝固，这种凝固作用在中性环境中发生，通常这类微生物还具有水解蛋白质的能力，从而会产生一些碱性物质，是石蕊变蓝。③胨化作用：酪蛋白被水解变得清亮而透明，胨化作用可以在酸性或碱性条件下进行，并且一般石蕊色素还原脱色。（3）产氨和产硫化氢试验

某些微生物具有脱氨酶，能使氨基酸在各种作用下脱去氨基而生成氨，氨的产生可用红色石蕊试纸夹悬于培养试管的棉塞下检验，培养后试纸变蓝，即判为产氨。

某些微生物能分解培养基中的含硫氨基酸生成硫化氢。可用醋酸铅试纸，接种试验菌于培养液中，立即将试纸悬夹于棉塞下，纸条下端与液面接近，但不可接触。如试纸变黑为正反应即产硫化氢。（4）淀粉水解试验

某些微生物具有淀粉酶，可以使淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖，而另一些微生物则没有这种特性。将试验菌在淀粉水解培养基的平板上划“+”接种。培养后打开皿盖，滴加碘液于培养基，轻轻旋转培养皿，使碘液铺满整个平板。因培养基内含淀粉，遇碘立即变兰，但如果供试菌能分解淀粉，则菌落周围淀粉已被水解，此时遇碘不变色，因而菌落外围出现无色透明圈。

三、培养基的配制 1．牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏 3g 蛋白胨 5g NaCl 0.5g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml PH 值 7.2—7.4 2．高氏一号培养基可溶性淀粉 20g K2HPO4 0.5g KNO3 1g MgSO4.7H2O 0.5g NaCl 0.5g FeSO4 10mg 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml PH 值 7.2—7.4 使用时加1%重铬酸钾溶液0.5ml/250ml 培养基。3．马丁培养基葡萄糖 10g 蛋白胨 5g KH2PO4 1g 琼脂 20g MgSO4.7H2O 0.5g 自然PH 值

蒸馏水 1000ml 煮溶后加1%孟加拉红3.3ml,搅匀。（8 磅即112℃灭菌30min）4．糖发酵培养基牛肉膏 3g 蛋白胨 5g 葡萄糖 5 g 水 1000 ml PH 值 7.2-7.4 加溴甲酚紫1.6%的酒精溶液1ml（8 磅即112℃灭菌30min）

溴甲酚紫1.6%酒精溶液的配制：称溴甲酚紫1.6g 溶于50ml 酒精（95%），再加入蒸馏水50ml，用滤纸过滤后用三角瓶装，放冰箱备用。5．石蕊牛乳培养基

牛奶（1000g）→煮沸→离心（4500 转/分钟，5 分钟）→去脂→调PH 值 7.2→加入石蕊液使牛奶成兰色→分装15×150ml 试管→8 磅灭菌20 分钟。石蕊液配制：称2.5g 石蕊，加50ml 蒸馏水研磨，研磨石蕊时，先加少许蒸馏水研磨，研磨过程中慢慢滴加蒸馏水，研磨到无颗粒为止，再进行抽滤。6.淀粉水解培养基蛋白胨 10g NaCl 5g 牛肉膏 5 g 可溶性淀粉 5g 琼脂 20g 蒸馏水 1000 ml PH 值 7.2 7．产硫化氢培养基蛋白胨 20g NaCl 5g 牛肉膏 2.5 g 柠檬酸铁铵 0.5g 硫代硫酸钠 0.5g 蒸馏水 1000 ml

三、作业

1．平板稀释分离环境微生物应注意哪些事项？ 2．生理鉴别试验的原理与反应有哪些？

实验七环境微生物分离与生理鉴定结果检查

一、实验目的

1．学习掌握四大类微生物菌落形态的识别。

2．学习掌握环境微生物生理鉴定结果分析的原理与方法。3．学习掌握微生物纯化培养接种的无菌操作技术。

二、实验内容

1．四大类微生物菌落形态识别

（1）细菌：菌落表面光滑或粗糙，边缘整齐或不规则，奶油状。

（2）放线菌：菌落表面呈绒状，粉状或绒毛状，有些产色素，有同心环，不易调起。

（3）酵母菌：菌落大而厚，湿润粘稠，易调起，多数呈乳白色，少数红色。（4）霉菌：菌落大而疏松，呈绒毛状、絮状或蜘网状，有色素，比细菌大数倍到几十倍。

2．土壤中细菌、放线菌、霉菌分离的结果统计 3．生理生化鉴定结果检查项目 E.coli B.subtilis CK 备注糖发酵产酸产气产酸产气石蕊牛乳凝固液化凝固液化蛋白胨产NH3 产H2S 产NH3 产H2S 产淀粉酶

4．菌落纯培养斜面接种

将分离到的放线菌单菌落，通过无菌操作技术移接到斜面培养基，30℃培养5-7 天。

实验八水中总大肠菌群的测定－多管发酵法

一、实验目的

结合水净化工程中的细菌检验，掌握水环境监测中和给水水质检验中大肠杆菌群数的测定方法，同时通过大肠杆菌群的测定，了解大肠杆菌群的生化特性。

二、原理

总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。多管发酵法的原理是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过初发酵试验、平板分离和复发酵试验等三个步骤进行实验求得水样中的总大肠菌群数。试验结果以最可能数（most probable number），简称MPN 表示。

三、仪器

高压蒸气灭菌器；恒温培养箱；冰箱；生物显微镜；载玻片；酒精灯；镍铬丝接种棒；培养皿（直径100mm）；试管（18×180mm）；吸管（1、5、10mL）；烧杯；锥形瓶；采样瓶等等。

四、培养基的制备：

1.乳糖蛋白胨培养液：将10g 蛋白胨、3g 牛肉膏、5g 乳糖和5g 氯化钠加热溶解于1000mL 蒸馏水中，调节溶液pH 为7.2—7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管中，于115℃高压灭菌器中灭菌20min，贮存于冷暗处备用。

2.三倍浓缩乳糖蛋白陈培养液：按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。除蒸馏水外，各组分用量增加至三倍。3.品红亚硫酸钠培养基

（1）贮备培养基的制备：于2000mL 烧杯中，先将20—30g 琼脂加到900mL 蒸馏水中，加热溶解，然后加入3.5g 磷酸氢二钾及10g 蛋白胨，混匀，使其溶解，再用蒸馏水补充到1000mL，调节溶液pH 至7.2—7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加10g 乳糖，混匀，定量分装于250 或500mL 锥形瓶内，置于高压灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。

（2）平皿培养基的制备：将上法制备的贮备培养基加热融化。根据锥形瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液（1000mL 培养基约加20mL5%碱性品红乙醇溶液），置于灭菌试管中；再按比例称取无水亚硫酸钠（1000mL 培养基约加5g 无水亚硫酸钠），置于另一灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10min（灭菌）。用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液内至深红色再退至淡红色为止（不宜加多）。将此混合液全部加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡）。立即将此培养基适量（约15mL）倾入已灭菌的平皿内，待冷却凝固后，置于冰箱内备用，但保存时间不宜超过两周。如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。

五、测定水源水总大肠菌群实验步骤

1、初发酵试验

于各装有5mL 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5 个试管中（内有倒管），分别加入 10mL 水样；于各装有10mL 乳糖蛋白胨培养液的5 个试管中（内有倒管），分别加入1mL 水样；再于各装有10mL 乳糖蛋白胨培养液的5 个试管中（内有倒管），分别加入1mL1： 10 稀释的水样。共计15 管，三个稀释度。将各管充分混匀，置于37℃恒温箱内培养24h。（2）平板分离：上述各发酵管经培养24h 后，将产酸、产气及只产酸的发酵管分别接种于品红亚硫酸钠培养基上，置于37℃恒温箱内培养24h，挑选符合下列特征的菌落。

2、平板分离

品红亚硫酸钠培养基上：紫红色，具有金属光泽的菌落；深红色，不带或略带金属光泽的菌落；淡红色，中心色较深的菌落。取有上述特征的群落进行革兰氏染色：

①用已培养18—24h 的培养物涂片，涂层要薄。②将涂片在火焰上加温固定，待冷却后滴加结晶紫溶液，1min 后用水洗去。③滴加助染剂，1min 后用水洗去。④滴加脱色剂，摇动玻片，直至无紫色脱落为止（约20—30s），用水洗去。⑤滴加复染剂，1min 后用水洗去，晾干、镜检，呈紫色者为革兰氏阳性菌，呈红色者为阴性菌。

3、复发酵试验

上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选该菌落的另一部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），每管可接种分离自同一初发酵管（瓶）的最典型菌落1—3 个，然后置于37℃恒温箱中培养24h，有产酸、产气者（不论倒管内气体多少皆作为产气论），即证实有大肠菌群存在。根据证实总大肠菌群存在的阳性管数，查后附表1“最可能数（MPN）表”，即求得每100mL 水样中存在的总大肠菌群数。我国目前系以1L 为报告单位，故MPN 值再乘以10，即为1L 水样中的总大肠菌群数。

例如，某水样接种10mL 的5 管均为阳性；接种1mL 的5 管中有2 管为阳性；接种1：10 的水样1mL 的5 管均为阴性。从最可能数（MPN）表中查检验结果5-2-0，得知100mL 水样中的总大肠菌群数为49 个，故1L 水样中的总大肠菌群数为 49×10=490 个。对污染严重的地表水和废水，初发酵试验的接种水样应作1：

10、1：100、1：1000 或更高倍数的稀释，检验步骤同“水源水”检验方法。如果接种的水样量不是10mL、1mL 和0.1mL，而是较低或较高的三个浓度的水样量，也可查表求得MPN 指数，再经下面公式换算成每100mL 的MPN 值。

六、思考题

1、你认为要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作?关键在哪一步?为什么?

2、大肠菌群测定利用了它的哪些生化特性？

表1 最可能数(MPN)表

（接种5 份10mL 水样、5 份1mL 水样、5 份0.1mL 水样时，不同阳性及阴性情况下100mL 水样中细菌数的最可能数和95%可信限值）

实验九

空气微生物检测（平皿落菌法）

实验目的和原理：用营养琼脂培养基培养细菌；用查氏琼脂培养基培养霉菌；用高氏淀粉琼脂培养基培养放线菌。通过实验了解空气中微生物的分布，学习习近平皿落菌法检测空气微生物。

实验器材：高压蒸汽消毒锅，恒温培养箱，超净工作台，玻璃皿，营养琼脂培养基，查氏琼脂培养基，高氏淀粉琼脂培养基。方法与步骤：一．培养基制备

1．营养琼脂培养基：牛肉膏1.5g，蛋白胨5g，NaCl 2.5g，琼脂10g，加水至500ml，加热、搅拌至琼脂溶解，调pH7.2~7.4，121℃蒸汽灭菌20分钟。

2．查氏琼脂培养基：NaNO3 1g，KCl 0.25g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 0.25g，FeSO4 0.005g，琼脂10g，蔗糖15g，加水500ml，加热、搅拌至琼脂溶解，115℃蒸汽灭菌20分钟。

3.高氏淀粉琼脂培养基：可溶性淀粉10g先用少量冷水调成糊状，在火上加热，然后加水及KNO30.5g，K2HPO4 0.25g NaCl 0.25g，MgSO4 0.25g，FeSO4 0.25g，琼脂10g，加热溶化，调pH7.0~ 7.2，补足水至500ml，121℃灭菌20分钟。二.每组15个平皿灭菌将营养琼脂培养基、查氏琼脂培养基、高氏淀粉琼脂培养基，三种培养基各倒5个平板，冷凝。

2.在一定面积房间或室外，按4角和中央5点，每种培养基每点放一个平板，打开盖，室内放置10分钟，室外放置3分钟后盖盖，营养琼脂培养基在37℃培养24h，查氏和高氏培养基在28℃培养48h。

3.培养结束，观察各种微生物的菌落形态，将微生物种类、菌落数和计算结果记录于下表：

三．计算：空气微生物数(个/m3)=5个皿平均菌落数×50000÷平皿底面积（cm2）÷暴露时间（min）

四．卫生标准：我国还无统一的空气卫生标准，室内一般以500～1000/m3作为参考指标。

地点

采样时间

细菌菌落

霉菌菌落

放线菌菌落

计算结果（个/m3）

细菌数量

霉菌数量

放线菌数量

实验九菌种保藏

一、实验目的

1.学习并掌握菌种保藏的基本原理。2.掌握常用的几种不同的菌种保藏方法。

二、实验原理

微生物个体微小、代谢旺盛、生长繁殖快，如果保存不妥容易发生变异和杂菌污染，甚至导致细胞死亡等现象。因此，保存好菌种是非常必要和重要的。常用的菌种保藏方法包括传代培养法、载体法、悬液法、冷冻法和真空干燥法

三、试剂与器材

1.材料大肠杆菌、青霉菌、放线菌

2.试剂液体石蜡、甘油、五氧化二磷、95％乙醇、10％盐酸、无水氯化钙、食盐、干冰

3.器材无菌吸管、无菌滴管、无菌培养皿；安额管、冻干管、40目与100目筛子、油纸、滤纸条(0.5X1.2cm)、干燥器、真泵器、真空泵、真空压力表、喷灯、L形五通管、冰箱、低温冰箱(—30℃)、超低温冰箱和液氮罐等。

四、实验内容

1.斜面保藏法 2.液体石蜡法 3.穿刺保藏法 4.砂土管保藏法

5.冷冻真空干燥保存法

五、关键步骤及注意事项

1.清楚各种保藏方法的优缺点，针对不同要求选择适宜的保藏方法。2.熔封安瓶时防止封闭不严。3.液氮冻存操作应防止冻伤。

六、思考题

根据你自己的实验。谈谈1--2种菌种保藏方法的利弊?

环境微生物实验教案第2篇

开放基金课题管理办法（试行）

一、总则

第一条

本着“开放、竞争、协作、创新”的原则，为了在环境微生物利用与安全控制领域创造良好的科研条件和学术环境，聚集和培养优秀科技人才，加强与国内外知名学者交流，提升国内整个领域的研究水平，重点实验室每年将筹集一定的经费作为开放基金，支持本领域相关课题的研究。

第二条

为完善开放课题的管理和实施，充分发挥开放课题对国家环境保护环境微生物利用与安全控制重点实验室科研工作的强化和补充作用，特制定本办法。

二、基金资助范围

第三条本重点实验室的主要研究方向为：污染物生物毒性与风险评价；污染物生物降解机制与调控；环境微生物资源开发与污染治理；有害环境微生物控制。以下各领域内的课题申请将获得优先资助。

1、(1)(2)(3)(4)

2、(1)(2)(3)

3、(1)(2)污染物生物毒性与风险评价新型毒性检测方法和体系的建立；

各类污染物生态风险和健康风险的指示性生物标志物的筛选；重要环境污染物的筛选与诊断；

污染物的健康与生态风险综合评价方法及指标等。污染物生物降解机制与调控境微生物及其群落结构的监测技术；

典型环境的环境微生物群落功能结构和多样性解析；污染物的生物转化与分解的机理及调控等。环境微生物资源开发与污染治理

环境污染物高效降解微生物的分离、筛选与功能开发；环境微生物产品的开发与利用；(3)基因工程微生物的构建及其环境释放安全性、有毒有害有机物的生物控制技术与工艺；

(4)(5)(6)(7)(8)

4、(1)(2)(3)(4)污染控制工程中的生物学过程与控制理论；污染环境的生物净化与生态修复原理与技术；功能微生物产品的安全评价及技术规范；功能微生物检测的技术标准与规范；环境污染生物控制技术标准与规范等。有害环境微生物控制病原微生物的现代检测技术；再生水消毒技术；

病原微生物的高效控制原理与技术；有害藻类的高效控制原理与技术等。

第四条

基金资助三种形式的课题：一是国内外科研人员都可以在本实验室课题申请指南范围内提出课题申请，经学术委员会和实验室主任批准资助后，作为本实验室的客座研究人员，来本实验室开展项目研究；二是申请人在其原单位独立完成的课题；三是申请人自带一定经费，仅来本重点实验室利用仪器设备的课题；申请人来本重点实验室进修的课题。基金资助力度为2-5万/课题，课题研究期限一般不超过2年，若已超过申请书所确定的截止时间半年仍未结题者，实验室将不再预留此项研究经费，如必须持续较长时间的重大课题，可分阶段申请。

三、基金申请与审批

重点实验室每年公布一次《国家环境保护环境微生物利用与安全控制重点实验室开放基金申请指南》，自公布之日开始受理开放基金的申请，申请时间以电子邮件申请时间为准，逾期不报，又不在规定期限内说明理由的项目，视为自动放弃处理。

第五条

申请者必须是某企事业单位固定研究工作人员，是项目的实际主持人，一般要求具有博士学位或中级及以上专业技术职称。在读研究生和已离退休的科研人员不得作为申请项目的负责人，但可作为项目组成员参加研究。

第六条

申请人应根据《国家环境保护环境微生物利用与安全控制重点实验室开放基金研究课题管理办法》，按规定格式填写《国家环境保护环境微生物利用与安全控制重点实验室开放课题基金申请书》。

第七条

课题申请书先由学术委员会审核、择优推荐，最后由实验室主任批准，并建议资助金额，正式接受申请人为本实验室的客座研究人员。实验室将学术委员会的评审结果报送主管部门备案。

第八条

申请者和项目组主要成员的申请项目数，连同在研的基金项目数不得超过两项。已获得资助者再次申请，申请书须附已资助项目的研究进展报告或结题报告和主要研究成果(一式一份)。

四、课题的管理

第九条

课题获得批准后，申请人需和重点实验室签订课题协议/合同。并严格按照协议内容开展课题工作和经费使用。如需中途改变计划或变更课题研究内容、范围以致影响最终成果时，必须得出书面报告，经实验室主任同意，重点课题需报实验室学术委员会批准。

第十条

在课题中期时，申请人需提交课题进展报告，汇报课题进展情况及取得的阶段性成果。

第十一条

实验室管理人员有权检查资助课题及其执行情况，发现问题时，有权将问题报告、提交给实验室主任和学术委员会。视问题的严重程度，实验室主任和学术委员会均有权要求课题负责人对课题进行整改、暂时中止或取消基金资助。

第十二条

开放课题成果的主要体现方式是发表高水平的论文或申报专利。对每个课题要求在核心刊物上发表论文2篇以上，其中一篇为SCI收录的论文。

第十三条客座人员在实验室工作期间要遵守实验室各种规章制度和仪器操作规程以及校纪校规。损坏仪器设备与其他财物者，要酌情赔偿。

五、课题经费的使用与管理

第十四条放基金资助项目纳入清华大学科研财务，建立课题帐户，实行单独核算，由课题负责人掌握经费使用权，所有有效单据经课题负责人、经办人及验收人签字后，在开支范围内在科研财务进行财务结算。课题工作末，课题负责人应提交本课题执行情况报告。对执行情况较差的课题，实验室有权中止资助。

第十五条课题经费只能用于立项开放课题的研究工作。开放课题经费的支出范围包括：

1．与资助课题直接有关费用（包括材料费、仪器及设备购置费、仪器设备租用及维修费、加工费、测试费、燃料动力费等），不少于总资助额的60%。

2．凡在本实验室从事研究工作的单位人员，在清华大学内住房费、交通费和生活补贴，参照清华大学科技处客座人员有关待遇规定办理，经费由所参加的课题经费中支付。

3．参加学术会议(会议论文成果应与开放课题的研究内容有关)及论文的打印、邮寄和发表费等。不超过总资助额的15%。

4．客座研究人员在实验室从事研究工作所需的差旅费。

5．客座研究人员在执行课题期间，需要回原单位办事或参加其他学术活动，需经实验室主任同意，其往返路费、旅差费由原单位负责。

6．参与研究的学生的劳务费，不超过总资助额的15%。

第十六条课题应尽可能使用本实验室的仪器设备，因工作需要且本实验室确实无力解决的少量设备和测试项目，经本实验室批准后方可外购、外测，并凭发票在本项经费中支出，并按照清华大学有关物资管理条例办理固定财产登记。所购的设备归本实验室所有，相关测试资料归本实验室归档。

第十七条课题研究结束后，节余的经费及剩余的原材料、消耗性器材等一律留在本实验室，不得带走或它用。

六、学术成果管理

第十八条基金资助项目完成后，请认真填写项目结题报告，交实验室主任签字通过、存档，并作为下一期申请的依据之一。基金资助项目的有关论文、专著、成果评议鉴定资料等，均应标注：

中文：国家环境保护环境微生物利用与安全控制重点实验室，清华大学，北京，100084 英文：State Environmental Protection Key Laboratory of Microorganism Application and Risk Control(MARC), Tsinghua University, 100084 Beijing, China 并标注获得“国家环境保护环境微生物利用与安全控制重点实验室开放基金资助(No.MARC ××××××)”。未标注的，验收时不计入成果。

第十九条自带项目和经费在本实验室工作取得的成果或发表论文需注明“国家环境保护环境微生物利用与安全控制重点实验室完成”。

第二十条基金资助项目所取得的成果（包括收集到的资料、研究报告、相应软件及其测试检验报告等）归研究者及本实验室共同所有。

第二十一条本管理办法由国家环境保护环境微生物利用与安全控制重点实验室负责解释。

清华大学

国家环境保护环境微生物利用与安全控制重点实验室

2011年9月

微生物实验室环境条件及监测第3篇

1 从建筑上来说:

微生物实验室分为无菌操作间和缓冲间, 实验人员应先进更衣室, 然后到缓冲间, 最后进无菌室。实验室的工作区域与办公区域明显分开。无菌操作间应符合响应洁净级别的操作环境, 采用局部百级措施时, 其环境应符合万级洁净度要求, 每立方米直径大于等于0.5微米的尘埃粒子数应是小于等于350000个, 30分钟尘降菌落数小于等于3cfu/立方米。如果空气洁净度达不到这一要求, 建议内设一超净工作台。进入无菌间应有人净和物净的设施;无菌操作间应根据检验品种的需要, 保持对邻室的相对正压或相对负压, 并定期检测洁净度。如果是做医药的企业, 日常洁净区的万级和百级区域的浮游菌也是要月检测一次的, 这是国标浮游菌检测方法上面规定的。检测洁净度首要的是对无菌室消毒效果进行监测:用直径9cm营养琼脂平板做空气暴露采样, 一般可采3个点 (呈对角线) , 暴露5min后置36℃培养24h观察菌落数目。按下列公式计算结果:空气细菌菌落总数 (cfu/m3) =5000N/A*T, A:平板面积 (平方厘米) T:平均暴露时间 (min) , N:平均菌落cfu/平皿。普通无菌室的消毒效果每月至少应进行一次监测。其次, 消毒后, 对无菌实验进行空气质量监测:将直径9cm的普通营养琼脂平皿放在无菌室四角及中央各一块 (设一块空白对照) , 打开平皿盖扣放平皿旁, 暴露10分钟盖好。将平皿至37℃培养24小时, 观察结果:计算5个平皿中的平均菌落数。

2 从仪器设备来说:

实验设备应满足检验工作的需要。微生物实验室必须配备培养箱、高压灭菌锅、紫外灯、冰箱等设备。这里着重介绍一下紫外灯和高压灭菌锅。紫外灯是微生物室主要的消毒工具, 紫外灯的穿透能力特别弱, 因此必须定时定期对紫外灯进行清洁。一般情况下每月使用浸有75%乙醇的抹布擦拭灯管一次, 擦拭前先拔掉插头并冷却10分钟, 还应经常检测紫外灯的照射强度, 当照射强度低于原始照射强度的70%时, 应由专业人员更换灯管, 一般情况下每三个月检查一次紫外灯的照射强度, 记录监测结果 (<200) 。对紫外线灯管的监测可以采用下列方法:用中心波长253.7nm的紫外线强度仪 (标定有效期内需经中国计量院检测, 测定值ⅹ校正系数=灯管真正照度值) 在灯管垂直下方1m处测定。新购置的灯管应≥90uw/平方厘米, 使用中的灯管应≥70uw/平方厘米。这里需要特别注意的是:在消毒照射时, 工作人员应佩带保护眼镜, 以防紫外线损害角膜而引起急性角膜炎。

对微生物室常用的试管、吸管、营养琼脂平板等器皿的消毒, 实验室最常用的灭菌器是手提式高压灭菌锅。它的工作原理是通过使锅内压力增加, 温度也随之增加从而提高蒸气温度, 进而达到彻底灭菌之目的。对手提式高压锅进行监测可以采用下列方法:样品数量:3件, 步骤:将生物指示剂放置被消毒物品中心部位和外层各一个, 按常规消毒。消毒后的生物指示剂以无菌手续放入溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水内, 在55-60℃温箱中培养7天, 观察最终结果。如有嗜热脂肪杆菌生长, 培养基由紫色变为黄色, 包内包外有一菌片长菌视为高压锅灭菌不和格。

3 从位置和结构布局来说:

实验室工作面积和总体布局应能满足从事检验工作的需要, 实验室布局应采用单方向工作流程。微生物实验室的位置应距离车间、锅炉房、交通要道稍远些, 以减少烟囱和马路上的灰尘的侵袭。房屋结构应能防震、防火、防尘、光线要充足。房屋应建成套间互相隔开。抗生素微生物检验室应分为半无菌操作间和缓冲间, 半无菌操作间设有紫外灯, 操作台应稳固, 并保持水平, 实验室内应光线明亮, 配有控制温度、相对湿度的设备, 并应注意交叉感染。微生物检验室的环境温湿度也需要监控, 一般建议温度为20℃左右, 湿度50-60左右。

4 从实验室内部环境来说:

实验室的墙壁、天花板和地面应平整、易清洁、不渗水、耐化学品和消毒剂的腐蚀。地面应防滑, 不得铺设地毯。每个实验室设地漏, 可减少跑水事故的危害。实验室地面要湿式拖扫, 禁止干拖干扫。需消毒时, 可用有效氯为500-10000mg/l的氯消毒液喷洒或拖地, 消毒液用量不小于100ml/立方米。污染区和清洁区拖把应分用, 不得混用。使用后, 用上述消毒液浸泡30分钟, 再用水清洗干净, 悬挂晾干。

总之, 由于环境条件既包括物理因素、又包括化学因素和生物因素, 不良的环境条件会使微生物的生长受到抑制, 甚至导致菌体的死亡。但是某些微生物产生的芽孢, 对恶劣的环境条件又有较强的抵抗能力。当微生物的不同种类出现在一个限定的空间内, 它们之间互为环境, 相互影响, 既有相互依赖又有相互排斥, 表现出相互间复杂的关系, 而这种复杂性又严重影响微生物的实验结果, 影响数据的真实性, 可靠性。因此, 控制微生物实验室的环境并定期对其进行监测, 是企业、质检人员首要考虑并实施的问题。这既是实验的要求, 也是对企业、对消费者负责的表现。

参考文献

[1]赵传孝, 韩绍英, 姜彦祥, 龚国华.食品检验技术手册.中国食品出版社1990:143-145.

[2]王叔淳.食品卫生验手册.化学工业出版社1996:423.

环境微生物实验教案第4篇

摘要：环境工程微生物学是环境工程专业的一门专业基础课，具有很强的实践性和应用性，但是由于种种传统的原因，其实验教学方面存在明显的问题。结合环境工程微生物学的实验教学特征，以培养学生的动手能力和创新思维为目标，通过优化实验教学内容，改进教学方法，实行全过程质量管理等对实验教学进行改革与探索，以便进一步提高实验教学质量。

关键词：环境工程微生物学;实验教学;改革;探索

中图分类号：X172 文献标志码：A 文章编号：1002-2589（2015）26-0142-02

当前环保事业成为经济发展新的增长点，同时亦推动了环境工程及相关技术的快速发展，社会急需具有工程应用能力、创新能力，且短时间内能够担当起治理环境污染重任的高级专业人才。近年来我国环境工程专业教育迅速发展，且《环境工程微生物学》是环境工程专业的一门核心专业基础课[1]。该课程要求学生将理论与实践相结合，需要大量的实验来巩固和加深学生对基本知识和基本技能的掌握与理解，但实验教学的内容过于偏重基础，缺乏专业特点。因此，近年来我们对实验教学进行改革与探索，重点放在培养学生独立思考、观察、分析和解决问题的能力，以提高学生的实验水平，树立实事求是的科学态度和工作作风。

一、实验教学改革的方法

（一）转变思想观念，提高微生物学实验在教学体系中的地位

1.教师引导学生重视实验教学

高校学生综合素质的提高需要理论教学和实验教学相结合，离开了实验的教学，学生的素质不可能得到全面发展。要想提高实验教学质量，就需要教师从根本上转变传统的教学观念，对于《环境工程微生物学》这类实验性及应用性很强的学科，在教学过程中教师要深刻认识到实验教学对于工科学生的重要性，把实验教学和理论教学摆在同等重要的位置上。在实验过程中教师要对学生认真负责，严格要求，同时也要引导学生重视实验课程，使学生认识到实验教学在提高自己实验操作水平、创新能力以及综合素质等方面具有非常重要的作用[2]。

2.学生自我重视实验教学并能培养兴趣

随着人类不断增长的物质、文化和健康的需要，对环境的要求也越来越高，微生物技术作为环境保护、污染治理和保持生态平衡的一种重要手段，有着举足轻重的作用。环境工程微生物学是在环境科学的基础上发展起来的一门边缘性学科，它为学生提供了广泛的微生物学基础知识和实验操作技能[3]。所以学生应该培养对微生物学实验课程的兴趣，重视微生物实验课程，熟练地掌握必要的实验技能，加深微生物技术在环境污染防治中的重要作用，养成理论联系实际的作风和独立工作的能力，提高自身的专业素质，为将来从事环境工程的研究工作打下坚实的基础。

（二）实验教学内容的改革

1.在学生掌握基础性实验的前提下，增加一些创新性、综合性较强的实验

目前，环境工程微生物学课程的实验仍以基础性试验为主，例如细菌形态的观察、光学显微镜的操作、微生物的染色、细胞的计数、培养基的制备及灭菌等。因此，可以增加一些创新性和综合性的实验项目。例如，对我们日常生活中的饮用水可以进行水中细菌菌落总数的测定，来检验是否符合饮用水卫生标准。这样可以将理论与实际结合，在保证基本教学内容的前提下，使得学生对所学内容融会贯通并加以活学活用，从而使实验教学达到培养学生的实际操作能力和创新能力的效果。

2.针对专业特点，最大程度地实现实验内容多样化

传统的环境工程微生物学实验在教学内容上比较单一，这在很大程度上抑制了学生的学习兴趣。针对这一特点，必须在最大程度上丰富实验内容，以提高学生的积极性。如：首先制备各类培养基，然后采取不同的环境样品接种培养，通过观察菌落和个体形态，纯化细菌，放线菌和霉菌，之后学生自己分离，将自己分离纯化的菌种为材料进行后续实验[2]。结合环境工程专业中处理废水的设备和构筑物，也可以进行微生物实验来研究微生物资源处理的方法。

3.建立开放实验室，拓展实验内容

由于课堂时间的限制，环境工程微生物学实验课主要进行的是基础实验的训练。但是仅仅掌握基本的实验技能根本满足不了社会对环境工程专业人士的要求。因此，在不影响教学的情况下，建设开放型实验，对学生进行专业技能就显得非常必要[4]。没有实验教学内容和学时的限制，学生根据自己的兴趣自主设计实验内容，不仅可以使学生巩固基本知识和基本技能，还可以提高他们的创新能力和综合素质。

（三）教学方法的改进

1.注重实验前准备工作

传统实验课教学的教学形式大部分都是学生使用教师课前准备好的实验仪器及试剂，根据实验指导书上的实验步骤以及实验注意事项等进行实验，最后对实验结果简单处理就构成了实验报告，在整个实验教学过程中学生不需要很多的思考[5]。在这种教学模式下，学生不能发挥主观能动性，对实验方法和内容没有深刻的印象，使学生逐渐养成了学习的惰性。针对这种情况，老师必须要求学生写出预习报告及实验方案（包括实验目的，原理，仪器，材料，方法，步骤）并且每个小组要能够大致讲解实验目的，原理，方法步骤及注意事项等。注重实验前的准备工作可以帮助学生养成一个好的习惯，也有助于实验有效地完成。

2.重视应用多媒体教学

微生物个体微小，肉眼难以看清，传统实验室没有配备多媒体设备，老师在实验课中的口头讲解，很难给学生留下深刻的感性认识[5]。大多数学生完全按照授课老师的讲述与操作演示依葫芦画瓢，这样学生仅仅是机械被动地接受知识。这种教学形式完全没有考虑学生的学习主观能动性，不能加深学生对微生物的實验操作规程的理解和实验技巧的掌握。而多媒体课件教学具有很多优点，如信息量大、直观形象且生动、易于理解等，从而在教学中发挥重要作用。因此在环境工程微生物学实验教学中，部分采用多媒体教学的方式，使微生物实验的观察和操作更加直观、生动，从而使微生物学实验课变得更有趣味性，激发学生思维[6]。

3.将理论知识用于实际中

环境工程微生物学是环境工程专业的专业基础课，在保证学生掌握相关基础实验理论知识的同时，应该将理论知识用于实践。例如，可以对学校周边三里河的污水进行检测和分析来确定自己周边环境的质量水平，也可以对我们平时的生活饮用水进行细菌菌落总数的测定，来判断其是否符合饮用水卫生标准。这样对所学内容的拓展和综合运用，能够满足学生的研究热情和创新欲望，把环境工程微生物学理论知识与实际相结合，提高学生应用环境工程微生物学理论知识来分析和解决环境问题的能力。

（四）注重全过程管理，规范考核标准

在实践教学过程中，全过程管理也是直接决定实验成败的关键[7]。在实验过程中，学生根据选题进行文献查阅，然后通过小组讨论确定本组最终的实验方案。要求在实验方案中写清实验的技术路线，实验方法以及需要的仪器、药品及其相关的数量。指导老师依据实验室的实验条件进行审核每一个小组的实验方案，只要是条件允许的实验就可以完全按学生的方案进行。这样学生对每一步实验能做到心中有数，也迫切希望看到自己设计的实验能够有一个完美的结果[7]。这一举措极大促进了学生进行实验的积极性，同时也培养了学生的独立分析解决问题能力和同学之间互相协作意识;在实验过程中，教师全程指导，遇到错误的实验操作可以及时纠正，有问题及时解决，保证实践过程的顺利进行;同时通过整个过程的指导，老师对每位同学的实验态度充分了解，这样进行成绩考核时可以做到有据可依，公平公正。最后总结报告的撰写环节要求学生按照给定的模板进行规范撰写，使学生初步了解研究性论文的撰写方法，为后续其他的实践环节及毕业论文的撰写打下坚实的基础[7]。传统实验课程考核方式注重实验结果和实验报告的准确性，而不注重实验细节及具体操作步骤，这种考核方式严重打击了认真动手操作学生的积极性，同时助长了学生抄袭实验结果的陋习。对实验教学环节进行过程考核和结果考核，既能够对学生实验动手的技能、对实验原理的理解以及对实验疑难问题解析进行检查，又能够帮助老师发现实验教学中的不足从而加以改进，提高教学质量。在考核过程中不仅能够加强学生的实验技能，还可以使学生养成科学严谨的态度[8]。

二、改革预期效果分析

通过对环境工程微生物课程综合实践环节的改革，提高了实验课程效率及综合实践课程的效果，可以得到学生们的普遍支持与认可。新实践课程体系中，学生自己实际动手操作实验的每一个步骤，教师仅起检查和辅导示范的作用，能够使每一位学生明白每一步实验如何操作，培养了学生整体的实验观念和细心操作的习惯。新实践课程体系的建立及学生主体地位的充分体现，很大程度上激发了学生的学习兴趣和学习热情，使学生学习的积极性、主动性得到了提高。特别是实验内容的优化和实验方法的改进，夯实了学生的基本实验技能，加深了学生对专业知识的理解，并且可以将实验操作结合到应用性试验中，提高综合运用知识、分析和解决问题的能力。总之，经过大胆的改革，打破传统的实验教学模式，提高环境工程微生物学实验教学效果，培养具备理论知识扎实，动手能力强的新世纪创新人才。

三、结语

环境工程微生物学实验教学改革与探索的方向仍然要以提高学生自主设计、创新和综合能力的培养为主，要打破传统的教学模式，充分调动学生的积极性，主动性，使学生能够认真对待每一次实验，掌握基本的实验操作技巧，提高教学质量和效率，培养“厚基础、宽口径、强能力、高素质”的高层次人才。

参考文献：

[1]刘宏，吳春笃，黄勇强.环境工程特色专业建设与思考[J].中国科教创新导刊，2007（5）：56-57.

[2]张大全，郑红艾.环境工程微生物学实验教学改革的探索[J].中国科教创新导刊，2001（28）：1-2.

[3]周群英，王士芬.环境工程微生物学[M].北京：高等教育出版社，2008：1-9.

[4]聂文杰.高校开放式实验室建设探索[J].技术与创新管理，2011（32）：423-425.

[5]邵继海，魏祥东，周细红，等.“质量工程”背景下的环境工程微生物学实验教学改革探索[J].生物学杂志，2010，3（27）：106-109.

[6]陈向东，唐兵，彭珍荣，等.充分利用现代化手段提高微生物学教学水平[J].中国大学教学，2002，2（3）：51-52.

[7]杨莹.环境工程微生物实践教学改革探讨及效果分析[J].课程教育研究，2013（6）：264.

环境微生物学实验报告第5篇

一、实验目的

(1)了解普通光学显微镜的构造及原理，掌握显微镜的操作及保养方法。(2)观察、识别几种原核微生物。真核微生物的个体形态，学会生物图的绘制。

二、实验器皿与材料

(1)器皿：显微镜、擦镜纸、二甲苯。

(2)材料：示范片：细菌三形(球状、杆状、螺旋状)、弧状(硫酸盐还原菌)、丝状(浮游球衣菌等)、细菌鞭毛及细菌荚膜。放线菌、颤蓝细菌、微囊蓝细菌或念珠蓝细菌等。

三、实验步骤

(1)将标本片放在载物台上，使观察的目的物置于圆孔正中央。(2)将镜头换成低倍镜，将粗调节器向下旋转(或载物台向上旋转)，眼睛注视物镜。当物镜的尖端距离载玻片约0.5cm处时停止旋转。

(3)左眼对着目镜观察，将粗调节器向上旋转，如果见到目的物，但不十分清楚，可用细调节器调节，直至目的物清晰。此时找到目的物并移至中央。(4)换成高倍镜，观察目的物，旋转细调节钮，直至视野清晰。(5)观察示范片，绘出其形态图。

四、思考题

(1)使用油镜时，为什么要先用低倍镜观察?答：为了找到目的物并移动到中央。

(2)要使视野明亮，除采用光源外，还可采取哪些措施?

答：调大孔径光阑，调整光源。如果是用反光镜的显微镜，用凹面镜可使视野明亮。

五、生物图

实验二、微生物培养基的配制与灭菌

一、实验目的

(1)熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。

(2)了解配置微生物培养基的基本原理，掌握配置、分装培养基的方法。(3)学会各类物品的包装、配置(稀释水等)和灭菌技术。

二、实验器皿与材料

(1)实验器皿：高压蒸汽灭菌器、干燥箱、煤气灯、培养皿、试管、刻度移液管、锥形瓶、烧杯、两桶、药物天平、玻璃棒、玻璃珠、石棉网、药匙、铁架、表面皿、pH试纸和棉花等。

(2)材料：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、NaOH和琼脂等。

三、实验原理

培养基是微生物生长的基质，是按照微生物营养、生长繁殖的需要，由碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、钠、钙、镁、铁及微量元素和水，按一定的体积分数配置而成。调整合适的pH，经高温灭菌后以备培养微生物之用。由于微生物种类及代谢类型的多样性，因而培养基种类也多，它们的配方及配制方法也各有差异，但一般的配制过程大致相同。

四、实验步骤

1、取100mL蒸馏水倒入锥形瓶;

2、称取牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl0.5g，琼脂20g;3、用100g/LNaOH调节pH至7.2~7.4;4、盖上棉塞，121℃下灭菌15~20min。

五、思考题

1、固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问题?答：(1)加热器功率不能太高，也不能太低。太高，容易沸腾和把培养基烧

焦;太低，培养基容易凝固。

(2)受热要均匀，可以垫上石棉网，要用玻璃棒不停缓慢搅拌。

(3)加热完毕后，要在合适的`温度(60℃左右)倒平板，防止凝固。2、培养基中加琼脂的作用是什么?答：琼脂的作用就是让培养基凝固。3、如何检查培养基灭菌是否彻底?

答：将灭菌后的培养基按灭菌锅内不同位置,每处抽取数管标号,置25至30

摄氏度培养一周左右进行检查,若培养基无什么变化说明灭菌效果较好

实验三、细菌的革兰氏染色

一、实验目的

(1)了解细菌的涂片及染色在微生物学实验中的重要性。

(2)学会细菌染色的基本操作技术，从而掌握微生物的一般染色法和革兰氏染色法。

二、染色原理

微生物细胞由蛋白质、核酸等两性电解质及其他化合物组成。所以，微生物表现出两性电解质的性质。两性电解质兼有碱性基和酸性基，在酸性溶液中解离出碱性基，呈碱性带正电;在碱性溶液中解离出酸性基，呈酸性带负电。经测定，细菌等电点(pI)在2~5之间时，大多以两性离子存在，当细菌在中性、碱性或偏酸性溶液中时，细菌带负电荷，所以容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的为多。

微生物体内各结构与染料结合力不同，故可用各染料分别染微生物的各结构以便观察。

三、实验器皿、试剂、材料

(1)器皿：显微镜、接种环、载玻片、酒精灯。

(2)试剂：草酸铵结晶紫染液、革兰氏碘液、体积分数为95%的乙醇、质量浓度为5g/L的沙黄染色液等。

(3)材料：枯草杆菌、大肠杆菌。

四、实验步骤

(1)涂片：载玻片滴一滴蒸馏水蘸菌染匀(2)初染：用草酸铵结晶紫染液染色1~2min后水洗(3)媒染：用革兰氏碘液染色1~2min后水洗

(4)脱色：滴加体积分数为95%的乙醇，约45s后水洗(5)复染：滴加番红染色2~3min后水洗并干燥(6)镜检：用显微镜观察菌体形态

五、思考题

(1)要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作?关键在哪几步?为什么?

环境微生物实验教案第6篇

加入时间：2006-10-31 9:32:3

3病原微生物实验室生物安全环境管理办法

《病原微生物实验室生物安全环境管理办法》已于2006年3月2日经国家环境保护总局2006年第二次局务会议通过，现予公布，自2006年5月1日起施行。

国家环境保护总局局长周生贤

二○○六年三月八日

主题词: 规章病原微生物实验室办法

病原微生物实验室生物安全环境管理办法

第一条为规范病原微生物实验室(以下简称“实验室”)生物安全环境管理工作，根据《病原微生物实验室生物安全管理条例》和有关环境保护法律和行政法规，制定本办法。

第二条本办法适用于中华人民共和国境内的实验室及其从事实验活动的生物安全环境管理。

本办法所称的病原微生物，是指能够使人或者动物致病的微生物。

本办法所称的实验活动，是指实验室从事与病原微生物菌(毒)种、样品有关的研

究、教学、检测、诊断等活动。

第三条国家根据实验室对病原微生物的生物安全防护水平，并依照实验室生物安全国家标准的规定，将实验室分为一级、二级、三级和四级。

一级、二级实验室不得从事高致病性病原微生物实验活动。

第四条国家环境保护总局制定并颁布实验室污染控制标准、环境管理技术规范和环境监督检查制度。

第五条国家环境保护总局设立病原微生物实验室生物安全环境管理专家委员会。专家委员会主要由环境保护、病原微生物以及实验室管理方面的专家组成。病原微生物实验室生物安全环境管理专家委员会的主要职责是：审议有关实验室污染控制标准和环境管理技术规范，提出审议建议；审查有关实验室环境影响评价文件，提出审查建议。

第六条新建、改建、扩建实验室，应当按照国家环境保护规定,执行环境影响评价制度。

实验室环境影响评价文件应当对病原微生物实验活动对环境可能造成的影响进行分析和预测，并提出预防和控制措施。

第七条新建、改建、扩建三级、四级实验室或者生产、进口移动式三级、四级实验室，应当编制环境影响报告书，并按照规定程序报国家环境保护总局审批。承担三级、四级实验室环境影响评价工作的环境影响评价机构，应当具备甲级评价资质和相应的评价范围。

第八条实验室应当按照国家环境保护规定、经审批的环境影响评价文件以及环境保护行政主管部门批复文件的要求，安装或者配备污染防治设施、设备。

污染防治设施、设备必须经环境保护行政主管部门验收合格后，实验室方可投入运行或者使用。

第九条建成并通过国家认可的三级、四级实验室，应当在取得生物安全实验室证书后15日内填报三级、四级病原微生物实验室备案表（见附表），报所在地的县级人民政府环境保护行政主管部门。

第十条县级人民政府环境保护行政主管部门应当自收到三级、四级病原微生物实验室备案表之日起10日内，报设区的市级人民政府环境保护行政主管部门；设区的市级人民政府环境保护行政主管部门应当自收到三级、四级病原微生物实验室备案表之日起10日内，报省级人民政府环境保护行政主管部门；省级人民政府环境保护行政主管部门应当自收到三级、四级病原微生物实验室备案表之日起10日内，报国

家环境保护总局。

第十一条实验室的设立单位对实验活动产生的废水、废气和危险废物承担污染防治责任。

实验室应当依照国家环境保护规定和实验室污染控制标准、环境管理技术规范的要求，建立、健全实验室废水、废气和危险废物污染防治管理的规章制度，并设置专（兼）职人员，对实验室产生的废水、废气及危险废物处置是否符合国家法律、行政法规及本办法规定的情况进行检查、督促和落实。

第十二条实验室排放废水、废气的，应当按照国家环境保护总局的有关规定，执行排污申报登记制度。

实验室产生危险废物的，必须按照危险废物污染环境防治的有关规定，向所在地县级以上地方人民政府环境保护行政主管部门申报危险废物的种类、产生量、流向、贮存、处置等有关资料。

第十三条实验室对其产生的废水，必须按照国家有关规定进行无害化处理；符合国家有关排放标准后，方可排放。

第十四条实验室进行实验活动时，必须按照国家有关规定保证大气污染防治设施的正常运转；排放废气不得违反国家有关标准或者规定。

第十五条实验室必须按照下列规定，妥善收集、贮存和处置其实验活动产生的危险废物，防止环境污染：

（一）建立危险废物登记制度，对其产生的危险废物进行登记。登记内容应当包括危险废物的来源、种类、重量或者数量、处置方法、最终去向以及经办人签名等项目。登记资料至少保存3年。

（二）及时收集其实验活动中产生的危险废物，并按照类别分别置于防渗漏、防锐器穿透等符合国家有关环境保护要求的专用包装物、容器内，并按国家规定要求设置明显的危险废物警示标识和说明。

（三）配备符合国家法律、行政法规和有关技术规范要求的危险废物暂时贮存柜（箱）或者其他设施、设备。

（四）按照国家有关规定对危险废物就地进行无害化处理，并根据就近集中处置的原则，及时将经无害化处理后的危险废物交由依法取得危险废物经营许可证的单位集中处置。