兽医生物制品电子教案

2024-05-27

兽医生物制品电子教案（精选6篇）

兽医生物制品电子教案第1篇

乌兰察布职业学院《兽用生物制品技术》精品课程

第一章

绪

论

第一节

兽用生物制品的概念与命名原则

一、兽用生物制品与兽用生物制品技术

（一）兽用生物制品的概念

兽用生物制品：是根据免疫学原理，利用微生物、寄生虫及其代谢产物或免疫应答产物制备的一类物质。这类物质专供相应疾病的诊断、预防和治疗之用。狭义上讲，兽用生物制品主要指疫苗、免疫抗血清及诊断制剂；广义上讲，兽用生物制品还应包括各种血液制剂、抗生素、非特异性免疫制剂等。由此可见，兽用生物制品的含义和内容也将随着科学技术的发展而成为兽用保健制品。

（二）兽用生物制品技术概念与内容兽用生物制品技术：兽用生物制品技术是在动物微生物、免疫学、动物传染病的基础上，采用生物学、生物化学及生物工程等技术和方法，研究和制备兽用生物制品，用以解决动物疫病防治的一门新兴应用技术。

主要内容包括两个方面：1是兽用生物制品的生物学，即研究病原微生物及宿主的关系。2是研究兽用生物制品的工艺学、制造、保藏、使用方面的内容。

二、兽用生物制品的命名原则

农业部规定的《兽医新生物制品管理办法》有10条原则

1、命名原则：明确，简练，科学。

2、不用商品名和代号。

3、一般制品为：动物名称+病名+制品名称，如猪瘟兔化弱毒疫苗。

4、共患病不列出动物名：如破伤风类毒素或抗毒素。

5、疫苗名称要规范，主动免疫的菌苗，疫苗统称为疫苗。

6、分活疫苗和死疫苗。

7、同一类不同毒株的疫苗，全称后面加括号注明，如猪丹毒活疫苗（GC42）--是哈尔滨兽研所通过豚鼠370代选育后，再通过雏鸡42代选育成的弱毒疫苗。猪丹毒活疫苗（G4T10）是江苏兽研所，将370代的菌，再通过培养基里加锥黄素，50代选育的。

8、联苗：动物名称+若干病名+X联苗，如猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联疫苗。简称猪三联。

9、多价苗：动物名+病名+若干血清型+X价疫苗，如仔猪黄白痢K88，K99，P987三价弱毒疫苗。

10、生物制品制造方法不注明，属企业秘密。

第二节兽用生物制品的分类及应用

一、兽用生物制品的分类

兽用生物制品种类繁多，只有进行分类，才便于学习和实践中使用和区别，常规的分类有两种，1是按性质和用途分类；2是按物理和制造进行分类，下面先讲第一种分类方法。

（一）兽用生物制品按性质分类：

有预防用的疫苗和类毒素，有诊断用的诊断剂，有治疗用的高免血清，有调整微生态平衡的微生态制剂，以及非特异免疫增强剂等。

1、疫苗（vaccine）：接种动物能产生自动免疫的一类生物制品，有微生物、寄生虫及其代谢产物组成。

过去人们习惯将病毒、立克次氏体制成的叫疫苗，将细菌、支原体和螺旋体制成的叫菌苗。现在农业部统一规定，“由特定细菌、病毒、立克次氏体、螺旋体、支原体，及寄生乌兰察布职业学院《兽用生物制品技术》精品课程

虫制成的主动免疫制品，一律称为疫苗，可分别叫它们什么细菌疫苗或什么病毒疫苗。

（1）常规疫苗：由病原微生物完整本身加工制备的叫之。

A、灭活疫苗（死疫苗）：用物理或化学方法将病原微生物杀死，仍保留免疫原性。一般是由强毒力微生物制成，多加上佐剂，提高免疫效果。

灭活疫苗的优缺点：

优点：a，安全，无副作用，不返祖不散毒。

B，不中和母源抗体和机体抗体。

C，运输保存方便，多为水剂湿苗。

缺点：a，需多次免疫，抗原用量大，价格贵。

B，只能注射，需要佐剂，仅刺激体液免疫。

弱毒疫苗的优缺点和灭活疫苗相反，不再重复。a)自身或自家灭活疫苗

从患病动物自身病灶分离病原微生物制成的灭活疫苗，如人反复葡萄球菌感染，可选用此方法做苗；对动物可用本场分离的病菌制成灭活疫苗，用于本场，具有抗原的针对性，如仔猪黄白痢自家灭活疫苗，链球菌自家灭活疫苗。b)组织灭活疫苗

利用含病原微生物多的组织制成的灭活疫苗，如兔瘟灭活疫苗，猪园环病毒自家组织灭活苗。B、活苗（弱毒疫苗）

用人工方法使病原微生物变异减毒而制成。

分强毒活疫苗，如宋朝我国制备的人痘疫苗；还有中等毒力的鸡新城疫I系，法氏囊中等毒力苗，传支H52等。

弱毒疫苗：卡介苗—人工培育13年230代；鸡新城疫I系—自然脱毒筛选；炭疽疫苗—高温诱变。猪瘟兔化弱毒疫苗—钝感动物。

化学诱变疫苗：猪丹毒疫苗—培养基里加锥黄素；仔猪副伤寒疫苗—培养基里加醋酸砣；猪肺疫疫苗—培养基加海鸥洗衣粉。

a)同源疫苗：由病原微生物本身减毒制成，大多数是这样的疫苗。

b)异源疫苗：含同类属抗原的非同种微生物制备成。如：鸡马立克氏病，用火鸡疱疹病毒疫苗预防；犬瘟热病---用人麻疹疫苗可以预防；人天花病—用牛痘疫苗预防。

在疫苗中，仅有少数是异源疫苗，即不同微生物，同类抗原少，像钥匙开锁一样，其他钥匙开这个锁纯属偶然。

c)单价疫苗：利用同一株微生物（这个微生物就一个血清型）或一种微生物的单一抗原制成。如猪大肠杆菌K88疫苗，禽流感H5N1疫苗。d)多价疫苗：是同一种微生物的若干血清抗原菌株制成，如：大肠杆菌K88，K99，P987三价疫苗；口蹄疫O、A双价疫苗。

e)混合疫苗，又叫联苗：不同微生物按一定方法混合制成，如：猪三联疫苗，即是猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联疫苗。

（2）新型疫苗

A.亚单位疫苗：利用微生物一种或几种亚单位结构制成的疫苗。如：流感的血凝素，神经氨酸酶，肺炎双球菌的荚膜多糖等，都可以做成疫苗。

B.化学疫苗：用化学方法提取微生物的有效免疫成分而制成。比亚单位疫苗更简单，如提取荚膜多糖可以做成。

C.合成肽苗：人工合成肽抗原，与适当载体和佐剂配合而成。如流感病毒的乌兰察布职业学院《兽用生物制品技术》精品课程

18肽疫苗，口蹄疫的多肽疫苗已经使用。

D.基因工程疫苗：通过DNA重组技术而制成的新型疫苗，主要有： a)基因缺失疫苗：切除病原微生物的有害基因而制成，如伪狂犬TK基因缺失，还有gE，gG基因的缺失。

b)基因工程活载体疫苗：将目的基因插入到细菌或病毒体内表达。如将流感病毒血凝素基因插入到牛痘疫苗，将志贺氏菌的基因插入到沙门氏菌中表达。

c)病毒抗体复合物疫苗：是由相应抗体包埋病毒制成。特点是安全，病毒缓慢释放。

d)基因疫苗：即DNA疫苗，将编码某种蛋白质的DNA注入体内，在体内表达出某种蛋白质抗原，具有免疫作用。

自杀DNA疫苗：为防止DNA重组或改变机体的基因，或使机体致癌，设计了自杀DNA疫苗，即该基因注入体内后，复制若干代后自动关闭。e)抗独特疫苗：利用抗原和抗体是镜像关系原理设计出的疫苗。

Ag------动物---Ab1-Ab1-----动物---Ab2（抗独特疫苗）

Ab2----动物----Ab3，这里Ag和Ab2是一样的，Ab1和Ab3是一样的。

利用抗独特疫苗免疫动物，使动物产生的抗体（Ab3=Ab1）可对抗原来的。微生物。

E.类毒素（脱毒毒素）: 由细菌外毒素经过0、3%--0、4%甲醛处理脱毒制成，如破伤风类毒素，白喉类毒素。

2、诊断剂

用于免疫学诊断，是由抗原或抗体组成，原理是抗原或抗体是特异性结合，利用已知一方，可以检测另一方的存在。实际中可以用于传染病诊断，抗体水平检测以及病原微生物的鉴定。常用的有以下6类方法：

2)凝集反应用的抗原或抗体：如鸡白痢或布氏杆菌凝集抗原。3)补体结合反应用的抗原或抗体。

4)沉淀反应：炭疽沉淀反应—ascoli实验，法氏囊抗体检测。5)标记用抗原或抗体：荧光抗体，酶标抗体-elisa 6)鉴定细菌用的多价血清或因子血清—沙门氏菌 7)PCR-聚合酶链反应

3、高免血清

人工高度免疫动物提取的血清，用于传染病的治疗和紧急预防—如猪瘟血清，小鹅瘟血清，法氏囊卵黄抗体等。

4、微生态制剂

即益生素或叫EM（有效的微生物制剂），是有益的活菌制剂，调节机体微生态平衡，达到预防或治疗疾病的目的。常见的细菌有乳酸杆菌、双歧杆菌、地衣芽孢杆菌，蜡样芽孢杆菌等。

益生元：促进有益细菌生长的物质，如双歧因子，寡聚糖等。

(二)按制造方法和物理性状分类

1、普通制品：一般方法制备的生物制品，如炭疽杆菌芽孢苗。

2、精制制品：对普通制品进行浓缩和精制，如精制的破伤风类毒素或抗毒素。

3、液状制品：也叫湿苗，多为灭活疫苗或诊断制品。

4、冻干制品：将疫苗冷冻干燥，可更好保护微生物的活性，弱毒疫苗多为冻干制品，另激素、血清、补体等也可以冻干。乌兰察布职业学院《兽用生物制品技术》精品课程

5、佐剂制品：非特异增强疫苗的免疫应答物质，如铝胶，蜂胶，油类，卡介苗等。

二、兽用生物制品的应用 1.用于动物疫病的防治 2.用于动物疫病的诊断 3.用于动物疫病的治疗

4.用于动物的保健

第三节兽用生物制品的发展史与发展前景

一、兽用生物制品的发展史

古代历史上的成绩：早在1000多年前，宋真宗时期，我国人民就已经会用痊愈天花病人的干痘痂粉，吹入鼻孔，预防人的天花病，叫吹花。后传给俄罗斯和土、耳其等国家。预防牛瘟，我国甘肃省早知道，用康复牛的血，灌服给其他牛，可以预防牛瘟。

1796年，英国乡村医生琴纳，用牛痘浆给人接种预防天花成功，1980年全世界消灭了天花疫苗也叫牛痘苗的代名词（vaccine），沿用至今。

1881-1884年，法国巴斯德，发明了炭疽疫苗、禽霍乱疫苗及狂犬疫苗。1921年，卡介苗诞生，用13年230代培育成功。后又发展有白喉抗毒素及破伤风类毒素和抗毒素。

我国猪瘟兔化弱毒疫苗质量世界第一；发明的牛肺疫兔化弱毒疫苗，为我国消灭牛肺疫起到了关键作用，马传贫白细胞活疫苗，为我国填补了空白，猪三联弱毒疫苗，也是我国首创—打破了细菌和病毒疫苗不能混合生产的历史。

其次，畜禽常用的疫苗和血清，我国都可以自己生产。

特殊疫苗，我国研制有鸡球虫病疫苗，猪囊虫疫苗及弓形体疫苗。还有水产用的嗜气单胞菌疫苗和草鱼出血热灭活疫苗。辅助治疗的副免疫制品有猪干扰素，白细胞介素等。

冻干技术的改进，用真空箱内压盖技术，为弱毒疫苗生产质量提高作出了贡献。

华中农大程焕春院士，自主开发研制的伪狂犬基因缺失疫苗，填补了我国该疫苗的空白。

我国除上述生物制品外，还开发研制了大量诊断试剂，传统有鸡白痢全血平板凝集抗原和布氏凝集抗原，结核菌素等。新研制有ELISA各种诊断试剂，基本满足国内畜禽疾病的诊断。

2001年时，我国兽医生物制品有188种，灭活疫苗56种，活疫苗57种，抗血清7种，诊断试剂61种，其他制品7种。最近几年，我国新增生物制品更多，有力的促进了我国畜牧业的发展。

二、兽用生物制品的发展前景

我国养殖业发展速度快，猪鸡的饲养跃居世界第一。但是，畜禽疫病十分严重，我国畜禽出栏率比外国发达地区低的多。新疫病不断出现，旧的病死灰复燃。当前，迫切需要高质量的生物制品来解决问题，今后生物制品的方向应该是：

1、传统疫苗为主，多联多价苗倍出

传统疫苗有质量稳定，价格低廉的优势，在农村广大地区，起主导作用；一些多联多价疫苗，将降低劳动成本，成为畜牧业发展的新需求。

2、提高疫苗质量，研制新型疫苗

SPF，是指无特定病源动物，鸡胚，细胞是弱毒疫苗质量的关键，但是，部分疫苗不是用SPF原料生产的，造成疫苗的污染和散毒，需要从原料上进行治理。还有新的疫病无疫苗预防：圆环病毒，蓝耳病，鸡白痢等，需要加大研究力度。

3、研究新型的基因工程疫苗是发展方向我国已经有伪狂犬基因缺失疫苗，对筛选野毒携带起重要作用，如果把这个技术推广到乌兰察布职业学院《兽用生物制品技术》精品课程

猪瘟等其它疫苗上，将更好地净化野毒的携带者。DNA疫苗也是发展的方向。

4、试剂盒标准化，简单化

当前我国试剂盒不稳定，非特异性高，需要国家扶持和发展；国外质量高，但价格贵，不适用农村推广；操作麻烦也是解决的问题。

5、微生态制剂、寄生虫疫苗、鱼类疫苗发展空间大

我国加入WTO，要求出口绿色产品，为达到这个质量，就需要微生态制剂；寄生虫和鱼类疫苗特少，需要研究开发。

6、加快生物制品GMP建设，与世界接轨

全国06年就要求兽医药厂，必须达到GMP标准，否则要关闭；但是，有借批号的，合并、分厂现象多。是上有政策，下有对策。

7、完善兽医法规，加强生物制品管理

我国已经颁布了《中华人民共和国防疫法》和《兽医生物制品管理办法》，问题是执行不力，监督不力，需要进一步完善和加强。学习外国兽医官制度，是当务之急。

思考题：

1、基本概念：兽用生物制品，兽用生物制品技术，疫苗，弱毒疫苗，灭活疫苗。

2、简述生物制品的分类与应用。

3、简述生物制品的命名原则。

4、结合我国兽用生物制品现状，试述兽用生物制品的发展前景。

第二章

细菌和病毒的培养技术

第一节

细菌培养技术

细菌培养技术是生物制品制造的基础，一些内容在微生物学已经学习过，这里主要讲一些重要的细菌培养技术。

一、细菌培养技术

熟悉细菌的生长曲线，因为不同的生物制品，要用不同时期的细菌，如细菌疫苗，要数期或稳定期细菌；芽孢疫苗，要衰老期细菌；外毒素要老龄细菌。

其次，要根据不同细菌用不同的培养基进行培养，用不同的培养方法（需要氧气，微需氧，厌氧。另培养温度，pH，渗透压等。）。

二、细菌培养的基本技术步骤：先分离出单个菌落→斜面培养基→生化或血清鉴定→菌种保存→生产生物制品→先接种到斜面菌种→小三角瓶肉汤→大三角瓶肉汤。

（一）细菌分离培养（目的是稀释病料，得到单个典型菌落）。

1、需氧菌分离培养：分段划线、倾注培养。

2、微需氧培养：鸭疫巴氏杆菌，牛布氏杆菌病，猪传染性胸膜肺炎菌等，用蜡烛缸方法。

3、厌氧菌培养：用疱肉基，物理除氧气（加氮气，氢气），化学除氧：焦性没食子酸加烧碱。

（二）细菌的规模培养

生物制品是产品，一般要大规模培养，才能满足基层需要。

1、菌种接种量：1-3%，过少生长慢，过度带入有害产物多，影响生长。

2、培养时间：菌苗，对数期和稳定期的细菌好；芽孢疫苗：衰老期细菌；外毒素：需要1周时间培养。在培养过程中，如果有少量污染，可以提前灭活终止培养。

3、培养方法：根据不同制品的性质和要求，选育不同方法。乌兰察布职业学院《兽用生物制品技术》精品课程

①固体表面培养：多用于诊断剂，也有菌苗生产。可随意调节细菌浓度，但操作麻烦，劳动量大。

培养方法有克氏瓶，大平皿，到入菌夜，L玻棒刮抹接种，培养后加生理盐水，再用L棒刮洗下细菌混悬液。

②液体静止培养：一般细菌疫苗多用，用大三角瓶（5000ml）或发酵罐，装入培养基1/2—-2/3量，需氧培养，要5小时摇动一次，增加氧气浓度。培养厌氧细菌，可以装满培养基，上面加少量石蜡油，隔绝空气，下加肝块或肉渣（疱肉基），它们氧化，吸收氧气，达到除氧气目的。液体培养含菌量低，多需要浓缩。

③液体深层通气培养（发酵罐）：可自动调节温度、氧气、pH、营养、搅拌，注意消泡沫和污染。

④透析培养：半渗透膜作用，营养可以不断补充，可以提高细菌和毒素含量。⑤连续培养：营养不断加入，培养好的细菌不断流出。

（三）细菌计数技术

细菌疫苗必须有一定含菌量，才有好的免疫效果。所以，应该对生产的疫苗计算含菌量。

1、直接显微镜检查计数

①定量定面积染色计数：10vul菌夜，涂抹1cm2面积的载玻片上，干燥固定染色，油镜下观察，油镜直径是0、16mm，视野面积是0、02mm2，1cm2面积有50万个油镜视野，多观察几个视野，算出一个视野细菌平均数X50万X100，即每ml含细菌量。

②比例法计数（也叫对照法）

如用已知人红细胞为500万/mm3（可以把红细胞0、4%甲醛固定，长期使用），取一环红细胞放在载玻片上，另取一环菌夜与红细胞混匀涂片，干燥固定染色，显微镜下检查，如，果平均每个视野是一个红细胞，10个细菌，那么，被检查细胞为5000万/ mm3，1ml是500000万个细菌。

③估计计数法

接种环直径在0、5cm，取一环细菌液，涂抹在载玻片上，大约0、5—1 cm2，干燥固定染色，显微镜检查，如果每个视野平均是1—9个细菌，菌夜含量是105-6个/ml，10—99为107-8个/ml，100以上为109-10个/ml，密不可计为1010个以上/ml。

④红细胞计数室法：

X（细菌量）Y/80*400*稀释倍数*10=细菌数/ mm3，变ml乘1000。（Y是5个中方格细菌总数，乘10是计数室的高度为0、1mm，计数室1内mm2，有400个小格，有25个中格，每个中格是16个小格）。该方法多用于计数大的细菌或酵母菌、细胞。、比浊比色法

①比浊管法

含菌量与浑浊度正比，用已知菌含量的试管与标准比浊管相比，找出规律，如1亿细菌=1号比浊管颜色，10亿等10号，以后，用未知细菌液与标准管比色，得出大致细菌含量。

②美蓝还原褪色法：含细菌多，使美蓝褪色快。10ml牛奶，加1ml美蓝液（1/3000），37度水浴，褪色少于20分钟，细菌多于2000万/ml，20-2小时，为400—2000万；2----

5、5小时为50—400万；

5、5小时以上，为少于50万/ml，为一级牛奶；如果用于细菌苗，应先用已知细菌找出规律。

3、活菌计数：原理，一个菌落是一个细菌的后代，数菌落就知道含菌量，也叫菌落形成单位—CFU：colony format unite。

①倾注法（GB方法）：菌液10倍递减稀释，选2-3个稀释度，各取1ml于平皿，加45-50营养琼脂，37度培养，计算菌落，乘稀释倍数，即每ml细菌数。

②平板表面涂布法：先做好营养琼脂平板，将不同稀释度菌液0、1ml加上，玻璃棒刮乌兰察布职业学院《兽用生物制品技术》精品课程

匀，37度24h培养，计算菌落乘稀释度乘10=菌数/ml ③微量滴板法：将不同稀释度菌液，各取0、02ml滴在营养琼脂板上，一板可以滴多点，自然扩散，37度培养，计算每点菌落乘50乘稀释度=菌数/ml。

三、培养基

微生物学已经学过，自己温习，重点熟悉：

1、不同微生物用不同的培养基来培养

2、注意各种营养物资浓度配比

3、调节合适的pH范围

第二节病毒的培养技术

一、病毒的复制与培养

病毒为专性细胞寄生物，必须在活细胞内生存，其复制过程是：吸附，进入，脱壳，生物合成，装配和释放。微生物已经讲，自己复习。

二、病毒的动物接种增殖

（一）、病毒材料的处理

1、病毒的释放：剪碎研磨，冰冻融及超声波处理。

2、除杂菌：细菌过滤器过滤，高速离心取上清夜；其次是抗生素处理，加500—1000u青霉素和链霉素，4度过夜杀菌。

（二）动物选择

1)健康动物、SPF动物； 2)未接种相应病毒疫苗动物 3)适宜年龄和体重 4)易感动物。

（二）接种方法：皮下，肌肉，静脉，腹腔，脑，胸腔等

三、鸡胚的接种

（一）鸡胚的选择

1、健康的SPF鸡胚

2、白壳，薄壳消毒蛋

3、没免疫相应病毒疫苗 4、5-7天照蛋，去无精、死胚鸡蛋

5、画出气室，接种24h照蛋，定时收病毒。

（二）鸡胚的接种和收获

避开血管和心脏，确定接踵部位，先碘酒消毒，再酒精消毒，用三棱针或12号针头钻孔，然后可以接种。预先准备好病料，注射器，融化的石蜡。

1、卵黄囊接种：用5-8天鸡胚，在气室中心，胚胎对侧刺入3cm（先用三棱针钻孔）。用于病毒，立克次氏体，衣原体接种。

2、尿囊腔接种，用9-11日鸡胚，在气室边缘下2cm，避开血管，40°进针0、5-

1、5cm。适应鸡新城疫，鸭肝炎，鸡传染支气管炎病毒接种。

3、羊膜腔接种：用10-12日鸡胚，在胚胎对侧进针，有抵抗时注入病毒。

4、绒毛尿囊膜接种：选11—13日鸡胚，先造人工气室，然后在人工气室内注射，适合痘病毒，疱疹病毒等。

另外，还有脑，胚体，静脉接种，难度大，科研使用。

不同病毒用不同接种途径，培养时间不同，收获组织也不同。

（三）影响禽胚增殖病毒的因素乌兰察布职业学院《兽用生物制品技术》精品课程

1、种蛋质量：要用SPF蛋，母源抗体存在，抗生素（对立克次氏体和衣原体）。

2、孵化环境：温度是37、8--38℃，湿度53-57%，通风，定时翻蛋。

3、接种技术：无菌操作和消毒，收获根据不同病毒，收获病毒时间不同，不要臭蛋和浑浊蛋。收获后测效价，加双抗-20℃保存。

四、细胞增殖病毒技术

1、细胞培养概念：利用机械、酶、化学方法使组织或单层细胞分散成单个或2-4个细胞的悬液，进行培养。

(1)原代细胞：新鲜组织制备的单细胞进行培养，一般仅可以传代3代。

(2)二倍体细胞：自继代细胞选出的也特殊生物学标志的细胞，染色体是二倍体，可传代50-100代，主要做疫苗生产。

(3)传代细胞：非二倍体，多为癌细胞，可无限生长，如Hela细胞，多用做病毒研究，不能做疫苗生产。

2、细胞培养的方法

(1)静止培养：细胞悬液接入培养瓶中，密封置温箱培养，细胞沿瓶子壁长成单层，为最简单培养病毒方法。

(2)转瓶培养：细胞悬液在转瓶旋转培养，10-20转/h，细胞贴壁生长，需要营养液少。(3)悬浮培养：通过震荡，转动使细胞悬浮于液体中培养。

(4)微载体培养：以固体小颗粒为载体，便于细胞附着，载体扩大了表面积。(5)中空纤维培养：细胞在中空纤维内生长。(6)微囊化培养：细胞在微囊中生长。

3、细胞的制备

细胞间有胶原蛋白，要破坏它们才变成分散单细胞。

1)机械分散：将组织剪碎成1mm3小块，再挤压通过铜丝网孔，可得到单细胞。2)酶消化法：常用胰酶破坏细胞间质，活力1：250，浓度是0、25%，pH7、4-

7、6。3)鳌合剂分散法：EDTA可除去维护细胞间结合的Ga++和Mg++，常用于单层细胞的分散。

4、细胞培养的要素

(1)营养物资：培养液（含氨基酸，犊牛血清，维生素，盐，糖等成分）。现多用成品细胞培养基，engle液，RPMI-1640和DMEM等。

(2)接种量：与单细胞生长成正比，量过大，因细胞碎片产生毒性作用，过小，不易长成单层。不同细胞有不同接种量，如鼠肾细胞50万/ml，鸡成纤维细胞20—40万ml，猪肾细胞80万/ml，血球计数室计数。

(3)pH、温度、气体环境：pH7、2-

7、4，不低于6、8，不高于7、6；温度一般是37℃，过高容易死亡，过低生长慢，20--25℃，细胞缓慢长。气体环境，一是橡皮塞蜜蜂培养；二是CO2培养箱培养。

5、污染问题：

细菌、真菌、支原体污染，加一定量抗生素可杀菌，如加青链霉素100u，有霉菌污染加制霉菌素。

病毒污染：有组织代毒和培养带毒，前者用SPF动物组织可以解决，后者注意灭菌和消毒。

胶原虫：（存在犊牛血清），血清37℃培养1个月以上，高速离心，检查沉淀物。

5、病毒增殖技术

(1)选敏感动物细胞。乌兰察布职业学院《兽用生物制品技术》精品课程

(2)(3)(4)(5)注意营养，温度和pH。

接种量和方法：1-10%接种，V/V；分同步和异步接种。支原体污染，加抗生素。

细胞病变：CPE，有圆缩、聚合、合胞体、包涵体，轻微病变，以及无细胞病变。

(6)收获：CPE到80%收获，反复冻融，离心取上清夜，测效价，加双抗，-20℃保存。

思考题：

1.细菌规模化培养方法有哪些？ 2.细菌计数技术有哪些？

3.用动物培养病毒时，如何选择动物？

4.用鸡胚培养病毒的接种方法有哪些？如何收获病毒？ 5.细胞培养的方法有哪些？ 6.细胞培养病毒需要哪些条件

第三章灭活剂、冻干保护剂、与免疫佐剂

第一节灭活剂

一、灭活与灭活剂

（一）灭活：杀死病原微生物，但不影响免疫原性；其次是破坏血清的补体，以免干扰血清学反应结果。

灭活剂：灭活微生物的化学试剂。

（二）灭活方法：物理灭活：加热、及射线灭活微生物，此方法免疫原性易破坏，现很少使用（血清56°C半小时灭活补体用此方法）。

化学灭活：用化学试剂将病原微生物杀死，此方法经常使用。

二、常用的灭活剂种类和原理

（一）甲醛：是最古老常用的灭活剂，现在我国用的26种灭活疫苗，均以甲醛为灭活剂。

性质：甲醛为刺鼻的气体，水溶液叫福尔马林，浓度为36%-40%。10°C以下易聚合成三聚甲醛或多聚甲醛，为白色沉淀。

原理：甲醛的醛基起灭活作用，可使

蛋白质的氨基→羟甲基胺

羧基→亚甲基二醇单酯

羟基→羟甲基酚

巯基→硫代亚甲基二醇

浓度：需氧菌甲醛浓度到0、1%--0、2%，厌氧菌0、4%--0、8%，病毒0、05%--0、4%，原则是浓度低，时间短，温度低可以灭活细菌，尽量减少破坏抗原（通常加入量，以福尔马林量计算，不再折合甲醛浓度）。

（二）烷化剂：将烷基引入，形成烷基取代物，使微生物变性死亡。

原理：主要破坏病毒的核酸，作用于A：G碱基，引起DNA单链断裂或双链铰连。

此类常用于病毒灭活，种类有AEI—N-乙酰乙烯亚胺，加入浓度到0、05%。

BEI—二乙烯亚胺，浓度0、02%；EEI—2—乙基乙烯亚胺，GDA—缩水甘油醛。

灭活后加硫代硫酸钠可终止灭活，防止抗原损失。

保存：AEI，0--4°C一年，--20°C二年；BEI 0--4°C保存一个月。乌兰察布职业学院《兽用生物制品技术》精品课程

（三）苯酚（石碳酸）人类用的第一个消毒药，具有特殊气味的无色结晶，易潮解成水溶液，与光、氧后颜色变紫色。

原理：蛋白质变性以及抑制氧化脱氢酶，芽孢和病毒对它抵抗力强。灭活浓度：抑菌作用是0、2—0、5%（血清防腐），杀菌是1%，杀葡萄球菌是3%。消毒常用它的衍生物，来苏儿（甲酚皂）3—5%浓度，特殊气味，覆盖其他气味，也是医院常用的。

（四）结晶紫（龙胆紫），也叫紫药水，碱性染料，也叫甲紫或甲基青莲，化学名，六甲基副玫瑰苯胺。

原理：碱性阳离子可结合细菌阴离子羧基；干扰细胞壁粘肽合成；常作用于革兰氏阳性菌。

生物制品的应用有猪瘟结晶紫疫苗，鸡白痢染色抗原。

（五）β—丙酰内酯

良好病毒灭活剂，性状是无色有气味液体，易潮解和高温失效，5°C密封保存好，现主要用于狂犬灭活苗。

三、影响灭活作用的因素

（一）药物的特异性：酚类不能杀灭真菌和病毒，阳离子的结晶紫，主要作用于G+菌。

（二）微生物的种类和特异性：G+菌和G-菌对药物敏感不一样，繁殖体和芽孢对药物敏感也不一样。

（三）药物浓度：浓度愈大，灭活越快，抗原也损失大；但是，95%酒精没75%酒精杀灭细菌好。

（四）温度：温度与灭活成正比，每升高10度，金属类杀菌作用增加2—5倍。但高温超过40°C，抗原也损失大。

（五）时间：灭活时间与温度和浓度成反比，即灭活杀菌长，温度旧低，浓度也低，就可以杀灭细菌。

（六）pH：碱性快，酸性慢，酸性环境对抗原保护好。

（七）有机物存在：环境的有机物减低灭活的效果，微生物也是有机物。

四、灭活疫苗时的注意事项 1、2人参加灭活，注意药品名和量，灭活后标记。

2、37°C灭活一天后，接种适宜培养基—无菌检查。

3、动物试验，灭活苗制成后，注射小白鼠0、2ml，两只，观察3天。

4、使用试验：用户可先注射1-2头，观察1—2天，看有无过敏，应激等反应，证明安全，才全群使用。

思考题：

1、什么叫灭活和灭火剂？

2、灭活剂的种类有哪些？

3、影响灭活的因素是什么？

4、灭活的注意事项有哪些？

第二节冻干保护剂

冻干保护剂也叫稳定剂，是防止微生物在冻干过程中受到破坏。A、按作用原理分两类：

渗透剂：能渗入细胞，使胞内外渗透压平衡，防止慢冻时损伤细胞。有甘油，蔗糖，而甲基亚砜。

非渗透剂：防止细胞内外物质交换在速冻时保护细胞。有蛋白质，聚乙烯吡咯酮。B、按保护剂分子量分类：乌兰察布职业学院《兽用生物制品技术》精品课程

低分子量保护剂：糖、氨基酸类。高分子量保护剂：脱脂牛奶、明胶。C、按化学性质分类：

复合物：脱脂牛奶，血清。糖类：蔗糖、乳糖。

盐类：乳酸钙、谷氨酸钠。醇类：甘油，山梨醇，甘露醇。酸类：柠檬酸，氨基酸。

聚合物：葡聚糖，聚乙烯吡咯酮。

一、冻干保护剂的组成和作用

按组成将保护剂分为营养液，赋形剂，抗氧化剂。

营养液：使受损细胞修复：脱脂牛奶，蛋白质，氨基酸，糖类。赋形剂：骨架作用，制品形成网孔结构，易溶解----蔗糖，乳糖。抗氧化剂：保护酶类，防止氧化—VC，VE，硫代硫酸钠。保护剂的作用：

1)防止细胞内水结晶和细胞失去水分。2)平衡细胞内外渗透压，防止细胞破裂。3)助于细胞修复以及冻干后复苏。

二、影响冻干保护剂效果的因素

判断保护剂的好坏，从冻干后的存活率，以及生物制品的保质期研究。然后对不同物质筛选不同配方，选出好的保护剂。

1、保护剂的种类：不同微生物用不同的保护剂。

2、保护剂的浓度：5—10%的葡萄糖保存大肠杆菌存活率高。

3、保护剂配制方法：糖、血清、维生素不能高温灭菌，糖可以114°C30分钟灭菌，其他可以过滤除菌。

4、保护剂的pH：一般为6-8。

三、常用的冻干保护剂

生物制品保护剂很多，各国家不同，如鸡新城疫苗（ND），我国是5%蔗糖脱脂牛奶；日本是5%乳糖、0、15%聚乙烯吡咯酮、1%马血清。

(一)不同微生物用不同保护剂

细菌疫苗：10%蔗糖；5%蔗糖脱脂牛奶；5%蔗糖、1、5%明胶；10-20%脱脂牛奶。厌氧菌苗：0、1%谷氨酸钠、10%乳糖；10%脱脂牛奶；

7、5%葡萄糖血清。病毒疫苗：多用混合保护剂，如5%蔗糖脱脂牛奶。

（三）几种常用的保护剂

5%蔗糖脱脂牛奶—新城疫疫苗明胶蔗糖保护剂---禽霍乱疫苗聚乙烯吡咯酮乳糖—厌氧菌

SPGA（蔗糖76、62g，磷酸二氢钾0、52g，磷酸氢二钾1、62g，谷氨酸钠0、83g，牛血清蛋白10g，去离子水1000ml）鸡马立克氏疫苗。

保护剂的添加：一般是疫苗和保护剂1：1加入（5%蔗糖脱脂牛奶—新城疫疫苗），还有是按疫苗量加入保护剂到规定浓度（如5%蔗糖明胶保护剂，加疫苗是先配浓度高的40%的蔗糖、12%明胶，然后按疫苗1份，保护剂7份混合。）。

弱毒疫苗饮水：加0、2%奶粉，以中和水中的有害离子和毒性物质。思考题：乌兰察布职业学院《兽用生物制品技术》精品课程

1、什么叫冻干保护剂？组成和作用是什么？

2、影响冻干保护剂效果的因素有哪些？

3、常用冻干保护剂有哪些？

第三节免疫佐剂

一、佐剂的概念：

概念：adjuvant一词来源于拉丁语，即辅佐之意。免疫佐剂是一种非特异免疫增强剂，先注射或和抗原同时注射，能明显增强免疫反应。最新概念：凡是增强抗原特异性免疫反应的物质，均叫佐剂。

作用机理：

1、抗原递程—助于吞噬细胞的吞噬和抗原传递。

2、抗原寻找—增加抗原目标，改变抗原构型，吸引吞噬细胞。

3、免疫调节—增强免疫应答，包括细胞免疫和体液免疫。佐剂的分类：

按物理性质：颗粒型佐剂，非颗粒佐剂。按生物学性质：微生物和非微生物佐剂。按存储时间：储存型和非存储型。

（一）颗粒型佐剂—将抗原包括成颗粒状。

1、盐类佐剂—氢氧化铝胶，明矾，磷酸三钙等。

2、油类佐剂 A、弗氏佐剂：1935年，美籍匈牙利学者Freund发明，分弗氏不完全佐剂：矿物油75-85%+加羊毛脂（乳化剂）15—25%，充分乳化即成，简写FIA,Freunds incomplete advuant；弗氏完全佐剂：是在FIA中加入死结核杆菌或卡介苗即成，缩写FCA.。

B、矿物油司本佐剂（现在经常用的，以后专讲）

3、免疫刺激复合物佐剂—简写ISCOM佐剂（皂苷类）。

4、蜂胶佐剂

5、脂质体佐剂

其它佐剂—MF59，微胶囊佐剂。

（二）非颗粒佐剂

1、肽类佐剂：胞壁酰二肽（结核杆菌细胞壁），脂肽及免疫调节多肽。

2、表面活性剂：海藻糖合成的衍生物。

3、核酸类：合成核苷酸聚合体，次黄嘌呤衍生物，免疫刺激序列DNA。

4、含硫复合物：左旋咪唑（既可驱虫，又可免疫增强）。

5、高分子碳水化合物，香菇多糖。

6、细胞因子：IL—1、2、4；干扰素，转移因子等。

8、其它，霍乱毒素，类毒素。

二、常规免疫佐剂

（一）盐类佐剂

1926年Gleny使用铝胶佐剂，几十年来，人畜疫苗已经广泛使用该佐剂。

作用机理：a，储存和延缓吸收；b、增加抗原表面积；c、形成巨噬细胞肉芽肿（增强体液和细胞免疫）。

1、氢氧化铝胶

合成方法：有三种，铝粉加烧碱；明矾加碳酸钠以及明矾加氨水等。

明矾加氨水方法：20%澄清的明矾水，温度60度，边搅边加氨水，到pH8时停止，然乌兰察布职业学院《兽用生物制品技术》精品课程

后打磨均匀，清水漂洗多次硫酸根离子，到pH7时既可，装瓶高压灭菌，用时20%加入疫苗。

2、明矾：有钾明矾和胺明矾，主要是吸附、沉淀、浓缩作用；精致10%明矾水，灭菌，25度保存，按疫苗量1—2%加入，摇匀即可，有沉淀作用。主要用于破伤风类毒素的沉淀和气肿疽灭活疫苗的使用。

3、磷酸三钙佐剂，与铝胶同样作用，制作简便。

将灭菌的20%氯化钙2、5ml加入100ml疫苗中摇匀，再加入20%磷酸氢二钠7、5ml，摇匀即成白色絮状沉淀。加的次序不能错，该佐剂沉淀作用比铝胶强。

（二）油类佐剂（矿物油司本佐剂）

乳化剂是一种降低其它溶液表面张力作用的物质，可使一种物质分散混合于另一不相容的液体中。司本80或吐温80既是乳化剂。他们可使油类和水剂疫苗乳化均匀。

疫苗水剂是分散相（内相）,油类为连续相（外相），两者中间是乳化剂，可以做成油包水，W/O；也可以做成水包油，O/W;前者不易吸收，储存时间长。后者容易吸收和释放。

最常用是白油司本佐剂

方法：制备油相：94%杭州10号白油，加6%司本80（HLB，亲水亲油值，值高亲水强，值低亲油强），HLB是4、2，混合后加2%硬质酸铝，熬化溶解，高压灭菌备用。水相：疫苗加4%吐温80（HLB 15）搅拌均匀即成。按油：水，3—1：1进行高速搅拌或胶体磨磨3遍就成。如果搅拌油中慢慢加入水相，制成是油包水，W/O，反之是水包油，O/W。

油乳疫苗检验：

1、粘度检测：口径Ф1、2mm吸管，吸1ml乳剂，放出0、4ml的时间在2—6秒为宜，不可多于10—15秒，注射困难。

2、稳定性检查：①加速老化试验，37度，10—30天，不破乳；②离心3000转/分钟，15分钟不分层，可以保存一年。

（三）蜂胶佐剂

1、蜂胶的理化特性：蜂胶含树脂、蜂分泌物，蜂蜡、花粉及其它多种物质，为固体粘稠状，冷硬热软，灰褐色，20-40度发粘，15度下变硬脆，60-70度液化。

等级：乙醇溶解后测含量，含66-70%为一级；61-65%为二级；56-60%三级；50-55%是四级。方法：

2、5克蜂胶，加乙醇冷浸24h，滤纸过滤，45度干燥，计算浸出物的含量。

2、作用：抗菌抗病毒、抗肿瘤、消炎和免疫增强作用。

3、蜂胶的使用

①蜂胶处理：4-8度粉碎，过筛，1：4加入乙醇浸泡24-48h，过滤去渣，算出含量，4度保存。

②蜂胶的加入：一般按疫苗量的到10mg/ml，摇匀成乳浊状。山东滨州兽医研究所生产蜂胶系列疫苗。

三、新型免疫佐剂

（一）细胞因子类佐剂

IL-1:淋巴细胞活化因子，活化多种免疫细胞

IL-2：T细胞生长因子，也促进B细胞增殖，应用多。IL-4：B细胞刺激因子

IL-12：B细胞产生的，促进淋巴细胞成熟干扰素：抗病毒，抗肿瘤，免疫调节。

（二）免疫刺激复合物（iscom）

是抗原：皂苷：胆固醇=1：1：1制成，为脂质效泡，作用，提高抗原传递，可与多种疫苗混合，还可以粘膜免疫。乌兰察布职业学院《兽用生物制品技术》精品课程

（三）脂质体

人工合成多层脂质小体，包埋抗原，提高抗原传递。

（四）MF59佐剂 4、3%角鲨烷+0、5%吐温80+0、5%司本85组成，多用于病毒疫苗佐剂，可刺激体液免疫也可以细胞免疫。思考题：

1、什么叫佐剂？作用原理是什么？

2、佐剂按物理性质，可分为哪些种类？

3、什么叫弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂？

4、什么叫细胞因子？又和特点？主要有哪些？

5、常规佐剂有哪些？新型佐剂有哪些？

6、铝胶和司本油类佐剂如何配制？

第四章菌（毒）种选育技术及疫苗制备技术第一节菌（毒）种选育技术

一、兽用生物制品菌（毒）种的标准

1、生物学性状明显，历史清楚：形态、生理、生化典型、血清学、来源、代数等清楚。

2、遗传学纯一稳定：稳定纯一的菌种，才能制造出高质量稳定的疫苗。

3、免疫抗原、反应抗原好：：高质量疫苗的基础。

4、毒力在适当范围内：灭活疫苗应该是强毒，弱毒疫苗安全，中等毒力的如ND-I系，IBD中等毒力苗。测定毒力要用敏感动物进行。

二、强菌（毒）种的选育

1、强毒种的用途：灭活疫苗、诊断试剂、抗血清、攻毒试验。

2、强毒种来源：典型传染病分离培养，保藏中心提供。

3、强毒种分离：a、纯粹试验（分离培养、鉴定）。

B、致病力（动物、鸡胚、细胞试验）。

C、抗原性（免疫及反应抗原试验）

D、稳定性（传代不变异）

达到：毒力强，纯粹，抗原好，稳定的菌种，最后冻干保藏。这就是强毒菌种的标准复壮：弱毒菌种在敏感动物或细胞上多次传代，达到毒力增强的目的（日本731部队用人试验，目的是增强细菌毒力，做细菌武器使用。）。

三、弱（菌）毒种的选育

1、用途：弱毒疫苗，诊断试剂，免疫血清。

2、来源：自然界筛选和人工诱变。

3、弱毒筛选途径：

自然界弱毒筛选：同源弱毒—新城疫I系

异源弱毒—火鸡疱疹病毒疫苗

它们都是在自然界寻找发现的。人工诱变筛选：化学诱变：洗衣粉、锥黄素、醋酸铊等加入培养基。

物理诱变：高温培养，干燥，紫外线等。

生物诱变：通过钝感动物，细胞以及细胞培养获得。

4、初选的依据：

a)生物性状改变—猪丹毒杆菌变长丝状，菌落光滑变粗糙。b)病毒蚀斑变异。乌兰察布职业学院《兽用生物制品技术》精品课程

c)d)e)f)温度敏感变异。药物敏感变异营养变异宿主变异

第二节细菌性疫苗和类毒素的制备技术

制造优良疫苗的关键：a、优良的菌种，b、适宜的培养方法；c、良好生产工艺；d、严格的检验和标准。

一、细菌性灭活疫苗的制备程序

1、种子：毒力强，免疫原性好，1—3个菌株，菌种逐级扩大培养。

2、培养：选适当培养基和方法，如固体或液体培养，要计数活菌和观察纯度。

3、灭活和无菌检查：加适量甲醛37度灭活24h，接种斜面培养基无菌检查，4、浓缩提高含菌量：离心或沉淀方法。

5、配佐剂分装：加20%铝胶，或油2：1水油乳化，无菌分装，加塞，封蜡，标签和装箱。

6、动物安全试验，接种小白鼠0、2ml观察3天，健活。

二、细菌性活疫苗的制备程序

1、菌种：中监所提供冻干种。

2、培养：1-3%量接种，检查纯度和计数。

3、浓缩：离心或吸附沉淀法（用0、2-0、25%羧甲基纤维素浓缩。

4、配苗和冻干：加入合适浓度保护剂，分装，冻干，加塞，封口，标签和装箱。

5、动物安全试验。

三、类毒素的制备程序

1、菌种与毒素

中监所分发或批准的产毒效价高、免疫力强的菌株，必要时可对菌种进行帅选。

2、脱毒

甲醛溶液法

3、类毒素的精制

（1）物理学方法

冷冻干燥、超滤、蒸发、冻融等

（2）化学沉淀法

酸沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法等

（3）层析法

凝胶过滤、离子交换层析法

第三节病毒疫苗的制备技术

一、病毒性组织苗的制备程序

病毒在易感动物体内增殖，用含毒量高的组织制造疫苗，叫灭活组织苗，如兔瘟，自家组织灭活苗；弱毒疫苗有猪瘟兔化弱毒疫苗。

（一）自家组织灭活苗

1、选症状典型、含毒量高的组织。

2、称重和打匀：一般按组织和生理盐水按1：5—8打匀。切碎组织，捣碎机打匀，1：5加生理盐水，加青链霉素各1000u/ml。

3、冻融和过滤：冰柜反复冰冻和融化三次，释放病毒，4层纱布过滤。

4、灭活：加0、4%甲醛灭活，37度24h，5、无菌检查：接种斜面培养基，培养24h，无细菌生长。菌苗4层纱布再过滤一次。

6、加佐剂分装：加20%铝胶，分装。乌兰察布职业学院《兽用生物制品技术》精品课程

7、动物安全检查:接种小白鼠0、2ml，观察3天，无反应，安全。

（二）病毒弱毒疫苗

1.选易感的SPF动物，年龄大小一致。

2.毒种：选适宜毒力的病毒，减少传代次数，选适宜接种途径。

3.观察、收获和测效价：观察食欲、体温、精神等，符合症状者剖杀，取含度高组织测效价，符合效价可以做疫苗。

4.研磨、稀释和杀菌：将组织剪碎研磨，按1：10—1：100加入稀释剂，过滤，1双抗500-1000u/ml，0-4度处理过夜。

5.无菌检查，半成品疫苗接种适宜培养基培养，无细菌生长。6.加保护剂冻干分装。

7.动物安全试验，接种适宜动物，3天安全。

二、病毒性禽胚培养疫苗的制备程序

除禽病可以用禽胚外，其它正粘病毒（流感）、副粘病毒等，都可以用禽胚培养，生产工艺简单，质量容易控制。

（一）鸡胚的选择：SPF、未免疫、未用抗生素，适宜的鸡胚龄。

（二）种毒和继代：冻干毒要鸡胚活化三代以上，效价合格方可使用。

（三）接种与收获

接种，合适部位、合适时间，适宜浓度和量，如ND Ⅰ系，为10-3、1ml接种。ND Ⅱ系是用10-4、1ml接种.培育及收获：NDⅠ系，为38、5-39℃,60-70%湿度培育，收24-48h的鸡胚，0-4℃冷却，收尿囊液。

（四）检查无菌和效价。ND NDⅠ系效价是1：80以上合格。

（五）配疫苗：

1.湿疫苗：尿囊液加双抗，-20℃保存1-2年，0-8℃保存3-6个月。用时按10-4稀释，每鸡一滴。

2.冻干疫苗：尿囊液适当稀释10-2，加等量保护剂，双抗，分装冻干，-15℃一年保存。

3.油乳灭活疫苗：尿囊液适当稀释10-2，加0、1%甲醛灭活，加双抗，按油：水疫苗，3-1：1乳化即成，3-15度保存半年，小鸡0、1-0、2ml，大鸡0、5—1ml。

三、病毒性细胞培养疫苗的制备程序

(一)种毒和继代：毒种要经过毒力、安全、无菌检查合格才可以做毒种。其次，毒种要细胞适应后可以大规模培养。

（二）营养液：多用专门商品培养基。

（三）细胞制备：多用原代细胞和二倍体细胞，选择依据：病毒适应性高、毒价高，细胞来源方便、制备简单，生命力强。不能用癌细胞或其它含逆转录病毒的细胞。

（四）接毒和收获：接毒分同步和异步，同步即细胞分装后不久接种，如细小病毒。异步是细胞形成单层后接种，如猪水泡病病毒。一般按1—2%量接种，70-85%细胞病变时收获。

（五）配疫苗：

1、灭活苗，加入灭火剂，阻滞剂，再加佐剂混合而成。

2、冻干疫苗，加保护剂混合，分装冻干。

第四节寄生虫疫苗的制备技术

是新发展的疫苗，临床主要用的有鸡球虫疫苗及原虫疫苗。大寄生虫因为抗原复杂，不可做疫苗。

（一）致弱疫苗

1、虫体致弱，筛选天然弱毒虫株做疫苗。乌兰察布职业学院《兽用生物制品技术》精品课程

2、人工致弱：体内传代致弱，牛巴贝斯虫在犊牛传15代成弱毒。

体外传代致弱，如艾美尔球虫通过鸡胚传代，牛泰勒虫是淋巴细胞传代致弱，还有放射线和药物致弱。

（二）抗原疫苗：大量提取寄生虫有效保护性抗原制成。

1、寄生虫抗原苗：获取大量虫体----机械粉碎裂解----提取抗原浸出物---浓缩配苗。

2、分子水平寄生虫疫苗；通过基因生物工程，获取大量纯化的寄生虫功能抗原，制成疫苗。

第五节基因工程疫苗的制备技术

目前利用基因工程技术研制可发的新型疫苗主要有：重组亚单位疫苗、活载体疫苗、基因缺失疫苗、DNA疫苗、多肽疫苗、转基因植物疫苗等。

基因工程疫苗的优点： 1.安全性好；

2.减少或消除了常规活疫苗或死疫苗难以避免的热原、变应原、免疫抑制原和其它有害的反应原；

3.稳定性好，便于保存和运输,更适合于疫病的控制和消灭计划。思考题：

1．生物制品毒种标准是什么？ 2.强毒、弱毒菌种如何选育？

3.简述以下疫苗制备流程（细菌灭活苗，细菌活疫苗，病毒性组织苗）。4.简述类毒素的生产要点。

第五章诊断用生物制品制造技术

利用微生物、寄生虫及其代谢产物，或动物血液、组织制备的，专供诊断动物疫病、监测动物免疫状态及鉴定病原微生物的制品称为诊断制剂或诊断液。

第一节

诊断抗原

诊断抗原按性质分为颗粒性抗原、可溶性抗原两种，颗粒性抗原主要用于凝集性反应，可溶性抗原可用于沉淀性反应极其他种类的诊断试验。按照诊断试验的种类可将诊断抗原分为凝集反应抗原、沉淀反应抗原、补体结合反应抗原、中和试验抗原及变态反应抗原等。

一、凝集反应抗原

凝集反应抗原有直接凝集反应抗原和间接凝集反应抗原两种。1.凝集反应抗原制备方法

一般选择符合要求的合格菌株，若型别不同，则根据需要选择使用。接种于适宜培养基培养。用含福尔马林生理盐水洗下培养基上的细菌，经一定时间灭活，或用生理盐水洗下后加热灭活。将灭活的菌液过滤，除去大颗粒，离心弃上清，将沉淀用福尔马林生理盐水或石炭酸生理盐水稀释成每毫升含规定菌数。经无菌检验、特异性检验和标化合格者即为浓菌液。间接凝集抗原制备使用的载体多为红细胞。先取可溶性抗原，然后将抗原按量吸附于双醛化的载体红细胞上，使红细胞致敏，即为间接凝集反应。2.常用的凝集反应抗原

目前应用的有布氏杆菌凝集反应抗原、马流产凝集反应抗原、猪萎缩性鼻炎凝集反应抗原、鸡白痢伤寒多价平板凝集试验抗原。

二、沉淀反应抗原乌兰察布职业学院《兽用生物制品技术》精品课程

根据使用方法不同，沉淀反应抗原可分为环状反应抗原、絮状反应抗原、琼脂扩散反应抗原和免疫电泳抗原等。1.沉淀抗原制备方法（1）细菌沉淀抗原制备

选择适宜菌种接种于合适的培养基上培养。培养完毕后收集细菌培养物，灭菌、研磨成菌粉，按一定比例加入0.5%石炭酸生理盐水浸泡，过滤后的滤液即为沉淀抗原。也可将收集的细菌培养物直接加入一定量的福尔马林或酒精，静置一定时间；或加入一定量醋酸，100℃水浴30min；或用裂解菌体等方法提取抗原，然后离心，收集上清，必要时浓缩即成为沉淀抗原。（2）病毒沉淀抗原制备

选用适宜的动物组织或细胞培养病毒。收获含毒高的动物组织制成匀浆，加入缓冲液或生理盐水，裂解细胞，置于40℃浸毒。高速离心取上清，灭活后即成沉淀抗原。

2.常用的沉淀反应抗原

鸡法氏囊病琼脂扩散反应抗原、马立克氏病琼脂扩散反应抗原、标准炭疽抗原、小鹅瘟病沉淀抗原、山羊痘沉淀抗原等。

三、补体结合反应抗原

补体结合反应是一种广泛应用的经典性检测抗原抗体的方法，补体结合反应抗原主要用于检测相应抗体。

1.补体结合反应抗原制备方法

（1）细菌性抗原制备

先将合格的菌株在培养基上大量培养，然后用0.5%石炭酸生理盐水冲下，收集菌液，高压灭菌或加温水浴灭活，或加福尔马林灭活，然后离心除去上清，将沉淀悬浮于0.5%石炭生理盐水中，置冷暗处浸泡一段时间，收集上清即为抗原。

（2）病毒性抗原制备

病毒在细胞上大量增殖后，收获病毒液，冻融3次，3000r/min离心30min，收集上清，经适当处理即为抗原。2.常用的补体结合反应抗原

鼻疽补体结合试验抗原、布鲁氏菌补体结合试验抗原、马传染性贫血补体结合试验抗原等。

四、变态反应抗原制造

细胞内寄生菌，如鼻祖杆菌、结核杆菌、布氏杆菌等，在感染过程中引起以细胞免疫为主的变态反应，即感染机体再次遇到同种病原菌或其代谢产物时出现一种具有高度特异性和敏感性的异常反应，据此，临床上常用以诊断某些传染病。引起变态反应的抗原物质又称为变应原。

1.变态反应抗原制备方法

变态反应抗原的制备分为粗变态反应抗原和提纯变态反应抗原两种方法。

（1）粗变态反应抗原制备

选择抗原性良好的病原菌，接种于甘油肉汤培养基上培养2~4个月，收集培养物，然后高压灭菌，过滤，滤液即为粗变态反应抗原。

（2）提纯变态反应抗原

将菌种接种于合成培养基上，培养2~4个月，高压灭菌，过滤，在滤液中加入4%三氯醋酸，使蛋白质沉淀，去上清，把沉淀物悬浮于1%三氯醋酸中，离心洗涤3次，将沉淀物溶于PH值为4.0磷酸盐缓冲液中，测定蛋白质含量，分装备用或冻干保存。

第二节

诊断抗体

一、诊断血清诊断血清，是一类是利用体外抗原抗体反应来诊断疫病或鉴别微生物的生物制剂。通常用抗原免疫动物制成，有些则需再经吸收除去非特异性抗体成分后供诊断用。含有多型或多群抗体的称为多价诊断血清，含有一种抗体的称为单价诊断血清。单含有鞭毛抗体成分的称乌兰察布职业学院《兽用生物制品技术》精品课程

为H血清。

二、单克隆抗体

(一)单克隆抗体的概念

单克隆抗体是指由一个B细胞分化增殖的子代细胞(浆细胞)产生的针对单一抗原决定簇的抗体。这种抗体的重链、轻链及其V区独特型的特异性、亲和力、生物学性状及分子结构均完全相同。

(二)单克隆抗体的制备

B细胞的制备

2.骨髓瘤细胞的制备 3.饲养细胞的制备

4.选择培养基 5.细胞融合 6.杂交瘤细胞筛选 7.杂交瘤细胞筛选

8.杂交瘤细胞冻存 9.单抗的生产

第三节

标记抗体

具有示踪效应的化学物质与抗体结合后，仍保持其示踪活性和与相应抗原特异结合能力，此种结合物称为标记抗体。

一、荧光素标记抗体

将荧光素和抗体结合所制备的结合物称为荧光素标记抗体。荧光素是一种染料，在紫外光、蓝紫光等短光波照射下而被激活释放出可见光，称为荧光。

二、酶标记抗体

将酶和抗体结合所制备的结合物称为酶标记抗体。酶标记抗体可与相应抗原形成酶标记的免疫复合物。结合在免疫复合物上的酶，在遇到相应的底物时，催化无色底物发生水解、氧化或还原，生成有色产物，从而出现颜色变化。

三、放射性同位素标记抗体

将某种放射性同位素与抗体标记起来，具有高灵敏度、精确性特异性。

四、胶体金标记抗体

将胶体金和抗体结合所制备的结合物称为胶体金标记抗体。

思考题：

1.什么叫诊断抗原？包括哪些种类？ 2.简述单克隆抗体的概念机制备要点。

第六章治疗用生物制品的制造技术

第一节免疫血清的制备

一、免疫动物的选择

制备免疫血清的动物有马、牛、绵羊等。用同种动物生产的称同源血清，用异种动物生产的称异源血清。为了避免疫病的传播，制备抗血清时，一般要求用异种动物，通常用马和牛等大动物制备。生产中制备免疫血清用马较多，因为血清渗出率较高，外观颜色较好。由于动物存在个体免疫应答能力差异，所以选定动物应有一定的数量，一个批次应用多头动物。

二、免疫抗原的制备

制造免疫血清的抗原，一般是用微生物或其毒素，或微生物的提取物等纯化的完全抗原。1.细菌免疫原制备基础免疫用抗原多为疫苗或死菌，而加强免疫的抗原，一般选用乌兰察布职业学院《兽用生物制品技术》精品课程

毒力较强的菌株。多价抗病血清用的抗原，要求用多血清型菌株。菌种接种于最适生长的培养基，按常规方法进行培养。通常活菌抗原需用新鲜培养菌液，并按规定的浓度使用，培养时间较死菌抗原稍短为好，多用16~18h培养物，经纯粹检查，证明无杂菌者，即可作为免疫抗原。为减少由培养基带来的非特异性成分，可通过离心，弃上清，再将菌体制成一定浓度的细菌悬液，作为免疫原。

2.病毒免疫原制备以病毒为免疫原，须通过反复冻融或超声裂解方法，将病毒从细胞中释放出来，并尽可能地提高病毒滴度和免疫原性。如猪瘟血清，基础免疫的抗原，可用猪瘟兔化弱毒疫苗；加强免疫抗原，则用猪瘟血毒或脾淋毒乳剂等强毒。猪接种猪瘟强毒发病后5~7d，当出现体温升高及典型猪瘟症状时，由动脉放血，收集全部血清，经无菌检验合格后即可作为抗原使用。接种猪瘟强毒的猪，除血中含有病毒外，脾脏和淋巴结也有大量的病毒，可采集并制成乳剂，作为抗原使用。

3.抗毒素血清免疫原制备免疫原可用类毒素、毒素或全培养物（活菌加毒素），但后两者只有需要加强免疫刺激的情况下才应用，一般多用类毒素作免疫原。

三、免疫程序

免疫程序分为两个阶段，第一阶段为基础免疫，第二阶段为加强免疫。从被免疫动物初次接受免疫原刺激，到产生少量抗体，这段时间在制造程序中称为基础免疫。基础免疫对第二阶段的加强免疫有重要关系。

1．基础免疫通常先用本病的疫苗按预防剂量作第1次免疫，经1~3周再用较大剂量的灭活苗或活菌或特制的灭活抗原再免疫1~3次，即完成基础免疫。基础免疫大多数1~3次即可，抗原无须过多过强，可为加强免疫产生有效地回忆应答打下基础。2.加强免疫亦称高度免疫。一般在基础免疫后2~4周开始进行。注射的抗原可采用灭活抗原，也可采用强毒微生物。微生物的毒力越强，一般免疫原性越好。免疫剂量逐渐增加，每次注射抗原间隔时间多为5~7d，加强的注射次数要视血清抗体效价而定。再用强毒微生物进行加强免疫时，必须在强毒动物舍或负压隔离器中进行，并采取严格的控制措施，以防散毒。

3.免疫途径免疫原注射途径一般采用皮下或肌肉注射。如果免疫剂量大，应采用多部位注射法，尤其在应用油佐剂抗原时更应注意此点。

四、血液采集与血清提取

1．采集次数和方法一般血清抗体的效价高峰在最后1次免疫后的7~10d。采血可以全放血或部分采血，即1次采集或多次采集，尽可能做到无菌操作。多次采血者，按体重每千克采血约10ml。全放血者，在最后1次高免之后的8~11d进行放血。放血前，动物应禁食24h，但需饮水以防止血脂过高。

2.血清的分离采血时一般不加抗凝剂，全血在室温中自然凝固。待血液凝固后进行剥离或者将凝血切成若干小块，并使其与容器剥离。先置于37℃1~2h，然后置于4℃冰箱过夜，次日离心收集血清。如果采集的血量较大时，可采用自然凝固加压法。

第二节卵黄抗体的制备

产蛋的禽类感染某些病原后，其血清和卵黄内均可产生相应的抗体，而且，卵黄中的抗体水平同样也随抗原的反复刺激而升高。因此，通过免疫注射产蛋鸡，即可由其生产的蛋黄中提取相应的抗体，与高免血清一样只限用于相应疫病的治疗和紧急预防接种。该类制剂称为卵黄抗体（IgY）。

一、使用范围

治疗鸡法氏囊炎病、新城疫病、小饿瘟、鸭病毒肝炎，仔猪黄白痢等。

二、制备过程乌兰察布职业学院《兽用生物制品技术》精品课程

1．免疫：开产前一个月健康鸡群，免疫3次法氏囊炎灭活疫苗，每次1-2ml，间隔10天一次，最后一次10天测效价，到1：128合格。

2.制备：0、3%新洁尔灭消毒鸡蛋—分离蛋黄---按1：3加入生理盐水—高速搅拌—加双抗1000u/ml，单层纱布过滤分装，冰冻保存（成品效价在1：16以上）。

3．使用：皮下或肌肉注射1-2ml/kg，病重隔天一次，也可以加水中饮用。免疫时间半个月，半月后需再注射疫苗。

参照上述血清的制备方法，其它抗血清也可以做，只是免疫的抗原不一样。

思考题：

1、简述免疫血清制备要点及保存方法。

2、简述卵黄抗体的制备要点和保存方法。

第七章

实验动物

第一节常用实验动物的特性与应用

一、小鼠：用途，半数致死量实验，药物及生物制品实验等。注意，小白鼠对热敏感，不可超过32℃

二、大鼠：用途，基本同小白鼠，并对维生素，氨基酸敏感，可做营养实验。

三、豚鼠：用途，做补体使用；变态反应；不合成维生素C；对抗生素敏感；对霉变饲料和温度敏感。

四、家兔：用途，生物制品制造；药品安全、效力、热原质实验；对细菌和病毒敏感。

第二节实验动物的遗传控制与微生物控制

一、实验动物的遗传质量控制

（一）实验动物的遗传学分类：

1.近交系动物：一般称纯系动物，近交连续20代以上，近交系数达88、6—99、8%，现有品系在300种以上。

2.封闭群动物：五年内不引进，群内随机交配，一般是50—100头的群。

3.突变系动物：由于正常染色体个别基因发生突变，而导致动物性状的改变。

全球有350种，大鼠50种，如癫痫大鼠，高血压大鼠，裸鼠（无胸腺），不同肿瘤多发鼠。可用于研究病的的机理和治疗药物。

4.杂交群动物：两品或多品系之间有针对性的杂交，具有强的生命力和高的生产性能。如猪三元杂交：杜洛克♂+长白—大约克♀→杜长大，为我国主流商品猪品系。

（二）实验动物遗传控制质量方法 1.生产过程控制 2.遗传监测

二、实验动物的微生物控制

（一）实验动物的微生物控制分类

农业部规定生物制品实验使用动物要求达到清洁级动物，鸡，鸭胚胎要求达到SPF标准。1.普通级动物：（一级动物），未特殊控制的动物，但不携带人畜公患微生物，如沙门氏菌，结核杆菌，巴氏杆菌，李氏杆菌，钩端螺旋体，皮肤霉菌及体外寄生虫。2.清洁级动物（二级动物）：种群来自剖腹产SPF动物，饲养管理卫生，种群清楚，微生物控制达到清洁动物标准。3.SPF动物（三级动物）：不存在某种病原微生物或寄生虫的动物。通过检查淘汰阳性动物选育。原种群多来自无菌动物或悉生动物基础上选育。乌兰察布职业学院《兽用生物制品技术》精品课程

4.无菌动物（四级动物）：GF—germ free animals。指体内检查不出任何细菌、病毒、寄生虫的动物。是由剖腹产，无菌环境饲养的动物。5.悉生动物（gnotobiotic animals）：是有无菌动物人工植入某种已知微生物的动物。如单菌动物，双菌动物，三菌动物，也可以叫X联悉生动物。

（二）实验动物的微生物学监测

按照国家标准《实验动物微生物学等级及监测》（GB14922.1—2001）和《实验动物微生物学等级及监测》（GB14922.2.2—2001）。思考题：

1.什么叫实验动物？有何特点和用途？

2.按遗传和微生物控制，实验动物可分哪些种类？ 3.常见实验动物的特性和用途？

第八章

生产的主要设备及污物处理

第一节灭菌器与空气净化设备

一、高压蒸汽灭菌器

原理：水煮开后，压力与温度成正比，加快提高了灭菌效果；一般培养基灭菌温度是121、3℃，15—30分钟，含糖培养基一般为110℃灭菌。

注意事项：

1.水位：加水到隔板处，检查设备仪表，密封圈。

2.排冷空气：一般是压力到3-5磅时开放气阀，排冷空气；也可以开始就开放气阀，等热气不断冒出时，关闭放气阀。

3.灭菌温度和时间：不同物品，用不同的温度和时间。

4.灭菌结束后，压力到零时，开盖取物（不及时用锅内物品，也要开放气阀，防止压力表损坏）。

二、干热灭菌器

原理：干热160-170℃2个小时，达到灭菌效果。注意事项：

1.仅供耐热物品的灭菌，不能灭菌培养基以及塑料制品。2.灭菌后，温度下降到60℃时才可以开门取物。3.灭菌物品5天内用完。

三、电离辐射灭菌

利用γ射线电离辐射，穿透物品，杀死其中的微生物。适用于各种怕热的物品，穿透力杀菌。

优点：a、消毒均匀；b、价格便宜；c、常温可以灭菌；d、不破坏包装；e、消毒快；f、穿透力强。

缺点：一次投资大，放射工作人员要专业培训；用放射材料 60Co。

2原理：水被电离成H和OH离子，以及自由基、过氧化氢。破坏核酸、酶和蛋白质。

四、无菌室

微生物无菌实验室分4级，一级最低，P3实验室是叫生物安全防护三级实验室，（P—protect保护），该实验室是密封，负压，用于烈性传染病病原微生物的检查，没有这乌兰察布职业学院《兽用生物制品技术》精品课程

个实验室，不允许检查诊断像“非典”，禽流感，口蹄疫等传染病。防止病原扩散。

一般无菌室多由自己设计和建设，主要要密封房间，配紫外线灯，有缓冲间，递物口，空气过滤窗口，专用衣服和鞋，定时消毒，紫外线灯高度不超过2米。

五、净化工作台

原理：无菌空气由上往下吹在工作台面，保证了操作环境的无菌。

用前消毒药水搽洗，紫外线灯照射半小时，然后开风扇操作。一般半年一检修，过滤器18个月一更换。营养平板打开在工作台5-10分钟，盖上培养，无菌才说明工作台效果好。

第二节

微生物培养装置

一、温室

多自己设计，装电炉多个，风扇，控温仪表，多层格架，保温材料墙壁，主要保证温度室内均匀稳定就可以。

二、细胞培养转瓶机

细胞培养专用，主要是生产病毒疫苗使用。

三、发酵罐

小的几升，大的上百吨，主要有自动灭菌，调温，搅拌，供无菌空气，测Ph,消沫，补液等。

四、生物反应器

自动细胞培养器，可自动控制O2，N 2，CO 2的浓度，自动稳定pH，温度，转速等。

五、微生物浓缩装置

中空纤维超滤膜，可浓缩不同微生物，提高疫苗浓度。

六、孵化器

可自动控温，鼓风，翻蛋，降温，加湿等功能。

第三节

乳化器

一、胶体磨

是制备油乳疫苗的主要设备，通过机器的高速剪切力，摩擦力，离心力和震荡，达到混匀油水的目的。一般要通过三遍，油乳疫苗才均匀和稳定。

二、高压均浆机

制备油乳疫苗用，高压产生空穴效应，湍流，剪切力，把油水混匀。

三、高速捣碎机

实验室用于小量油乳疫苗的制备，也可以用于卵黄抗体的打匀。一般一次可以混匀300-500ml，高速搅拌2-3分钟一次，最少搅拌三次。

第四节、冷冻真空干燥设备

实验室有小型冻干机，通过实验了解。主要有冷冻，真空泵，仪表，载物盘，压盖旋转把手。

第五节冷冻干燥疫苗分装包装设备

主要有：理瓶旋转工作台，多头自动分装机，胶塞定位机，自动灌装半加塞联动机。

第六节

冷藏设备

主要有冷库，冷藏运输车和液氮罐（196℃，保存马立克氏疫苗）。

第七节带毒污水与废弃物处理

一、污水处理

流程：带毒污水—滤出粗渣—一级沉淀—沉淀池（臭氧和化学药处理）--接触池—检验乌兰察布职业学院《兽用生物制品技术》精品课程

合格—暴晒—排放—养鱼专用塘。

二、带毒粪便、垫草等

小量垫草可以焚烧，粪便可以生物发酵2年以上。

三、动物尸体和脏器

焚烧或高压灭菌思考题：

1.生物制品有哪些灭菌和净化设备？

2.高压灭菌和干热灭菌的原理和注意事项？ 3.培养设备有哪些？

4.乳化、冻干、分装及冷藏设备有哪些？ 5.带毒污水、废物及动物尸体如何处理？

第九章

兽用生物制品质量监控

第一节生物制品监察制度

一、生物制品管理体系

1.机构：中国兽医监察所

2.职能：A、负责生物制品监督检查和仲裁。B、检验用标准品、参照品，生产和检验的菌毒种。C、对生物制品成品的检验和判定。3.文件：

1)1952年公布了《兽医生物制品制造及检验规程》。

2)2002年3月，发布了兽药GMP规范《兽药生产质量管理规范》。由管理机构，管理职能和管理文件，三项形成了生物制品管理体系。

二、菌毒种的管理

菌种、毒种和虫种分三批管理：A、原种由研究单位和中国兽药监察所管；B、基础种由中检所或委托单位管；C、生产种由企业自己保管和传代，记录。

保管要做到：A、严格登记制度，由档案，单位介绍信和公章。B、寄发菌毒种必须装入金属筒密封邮寄。C、烈性菌毒种需专人来领取，经农业部批准。

三、防止散毒的原则和措施

生物制品制造涉及到病原微生物，因此，要防止散毒。措施有：厂址选择，厂房布置和厂内隔离区，污水污物处理方法，野生动物防范，生产程序和人员素质。

四、新生物制品制造及进口生物制品管理

新生物制品生产要报5项材料：菌种情况；免疫原性；生产检验步骤；免疫期；田间试验数据。5项都需报中检所。

进口生物制品，必须有进口兽药登记许可证，注册审批程序有：资料申请—农业部药政处预审—评审委员会初审—中检所质量复核及临床试验—新兽药审评委员会审议—农业部审批—颁发《进口兽药登记许可证》。

仅科学实验，农业部审批就可以，不需要注册。

第二节兽用生物制品质量管理规范（GMP）

一、GMP的内容、原理和特点

（一）GMP的基本内容

1969年，世界卫生组织宣布了《药品生产和质量管理规范》。GMP:good manufacturing practices。1989年，我国颁布了《兽药生产质量管理规范》，2002年3月修订，6月实施。乌兰察布职业学院《兽用生物制品技术》精品课程

GMP包括三个内容：人员，厂房设备和管理制度和要求。

（二）特点：

GMP实施包括两个方面：一是政府兽药行政管理，把GMP作为兽药企业生产的最低要求；二是兽药企业以GMP作为产品质量保证的法规，自觉落实。

二、GMP对人员的基本要求

管理人员、技术人员和生产人员要具备大专学历；并要有实践经验、管理经验和质量意识。并要经上岗专业培训。

三、GMP硬件要求

包括厂房、设备、环境和污水处理，工艺，实验动物的具体要求等。

四、GMP软件要求

包括卫生及无菌管理操作规程，生产管理文件，制度和记录；质量管理系统的人员及实施方案及记录。

第三节兽用生物制品的质量检验

主要是对成品的检验，包括5个方面:抽样；无菌和纯粹检验；安全检验；效力检验；物理性状检验等。

一、抽样：要有代表性。

人的生物制品是按0、4√￣抽样，兽药是500L以下抽5瓶，500—1000L抽10瓶，1000以上抽15瓶。冻干每柜抽5瓶；诊断液每批抽5瓶。

二、无菌和纯粹检验

（一）检验用的培养基：不同疫苗选不同的培养基来培养。

（二）检验方法

1.含防腐剂、抗生素、灭活剂的制品要稀释10倍检验。2.培养要需氧和厌氧同时培养。

3.发现个别有污染要重新检验，并加大检验量。

（三）污染杂菌病原性及计数

1.病原鉴定，疫苗稀释后注射小白鼠实验。

2.杂菌计数不可超标准（各疫苗有标准，如猪瘟，每头份含菌不超过75个）。

（四）禽沙门氏菌检验

鸡胚疫苗要接种麦康凯和SS平板培养，检验沙门氏菌。有些制品要检验支原体和衣原体。

三、安全检验

疫苗最需要是安全

（一）安全检验的内容;1.外源性病原的检查：如动物带毒，组织代毒。2.灭活检查：用适宜培养基和培养方法和敏感动物。

3.残余毒检验:如炭疽疫苗可使小白鼠死亡，兔子不死亡。4.对胚胎的影响：猪瘟病毒影响胎儿。

（二）检验的要点

1.实验动物选敏感和清洁动物。

2.安全剂量要大于免疫剂量5—10倍。3.外源病原检查：选合适培养基和方法。

（三）结果判断

结果从严处理，不合格的重新检验，可疑的重新检验，不合格要扩大检验量；选敏感动物检验。乌兰察布职业学院《兽用生物制品技术》精品课程

四、效力检验：是检验生物制品免疫效果、治疗效果、诊断的准确性。

（一）检验内容：

1.免疫原性：抗原要有针对性，和已知血清反应。2.免疫的持续期：决定免疫效果和接种次数。3.热稳定性：决定保质期。

4.抗原量的测定：决定最小免疫剂量，用半数保护量测定，或测细菌或病毒的含量。

（二）检验要点：

1、动物保护力试验

1)定量免疫定量攻毒。2)变量免疫定量攻毒。3)定量免疫变量攻毒。4)免疫抗体的测定。

2、活菌计数和病毒量测定

1)活菌计数：计算每mlcfu，活菌一般达到百亿/ml。芽孢达到1500-2500万/ml.2)病毒量测定:马立克火鸡疱疹病毒每瓶含毒量不低于5000pfu,新城疫半数感染量EID50≥10-6.3血清学实验,测定不同疫苗的抗体效价.五、物理性状检验

(一)外观：检查封口，装量，标签，沉淀，冻干苗干缩，溶解情况，霉变等。

（二）残余水分检验：冻干疫苗不超过4%，用真空干燥箱测定，60-70℃3h，计算前后重量。卡氏测定法：1分子水和1分子碘化合，溶液由棕色变无色，滴定计算出碘的用量，就知道水的含量。

（三）真空度检验：高频火花枪测定，颜色是紫色、白色或粉红色合格。思考题：

1.生物制品的特殊性是什么？

2.生物制品质量含义是什么？朱兰质量螺旋模式是什么？ 3.生物制品监察制度包括什么内容？ 4.GMP的含义和内容有哪些？ 5.成品检验包括哪些内容？

6.无菌或纯粹检验、安全检验、效力检验各包括哪些内容？

兽医生物制品电子教案第2篇

浙江省江山市中等专业学校张容

【教材】王社光、刘强。《生物基础》.高等教育出版社.2005.6.第1 版【课题】第7章生物技术及其应用

第一节生物技术的形成与发展第二节生物技术的基本内容

【教学目标】

知识与技能：掌握现代生物技术的概念和生物技术的基本内容，了解生物技术发展史上的重要事件和进展；初步掌握现代生物技术五个工程的基本过程；了解五个工程的意义和用途。

过程与方法：通过对比法培养学生观察能力，使学生能正确认识生物技术在我们现实生活中的作用，并加深对概念的理解，进而对生物技术的内容形成规律性认识。

情感态度与价值观：通过教学，使学生的科学态度、思想情趣得到陶冶；通过生物技术工程这些内容的讲授。激发学生爱科学的思想感情，培养学生对事业的责任感。激发学生积极进取的兴趣和科学情感，培养积极探索的科学精神。【教学重点、难点】

重点：生物技术工程的内容。难点：生物技术工程的内容与步骤。【课时安排】2学时

【主要教学方法】讲授、PPT演示实验、讨论【教学用具】多媒体及PPT 【教学过程设计】

第7章生物技术及其应用

第一节生物技术的形成与发展

一、现代生物技术定义

1982年国际合作及发展组织对生物技术这一名词定义:生物技术是应用自然科学及工程学的原理,依靠微生物、动物、植物体作为反应器,将物料进行加工以提供产品来为社会服务的技术。伴随着基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程和蛋白质工程等的形成与发展,构成了现代生物技术这一内涵。

二、生物技术的进展 1、1943年,大规模工业生产青霉素,以及后来的多种抗生素生产与利用,标志着传统生物技术发展的鼎盛时期,为生物技术的发展起到了划时代的作用。1944年,美国著名微生物学家Avery首先

证明基因就是DNA分子,是生物的遗传物质。随后的1953年,美国科学家沃森和克里克发现了DNA双螺旋结构,奠定了现代分子生物学的基础。从此,生命科学的发展开始进入现代生物技术的时代。

2、表7 1现代生物技术发展史上的重要事件

3、生物技术已成为21世纪发展最快的学科之一,其发展趋势主要体现在以下几个方面:(1)基因操作技术更加成熟与完善,使得转基因植物和动物取得重大突破。(2)医学生物技术为人类疾病治疗和健康等发挥巨大的作用。

(3)基因组及编码蛋白质的结构与功能研究成为今后生物技术的热点问题。(4)生物芯片广泛应用,(5)干细胞生物学技术的研究与应用,使治疗性器官移植成为可能。

(6)利用计算机技术对生物信息进行处理、贮存、分析和解释,形成新的生物信息学科。

第二节生物技术的基本内容

现代生物技术主要包括基因工程、细胞工程、酶与发酵工程、组织工程、蛋白质工程、抗体工程、干细胞技术、克隆技术、转基因技术、高通量筛选技术以及生物芯片等。但总的来说,一般分为基因工程、发酵工程、酶工程、细胞工程和蛋白质工程五个部分。

一、基因工程

1972年,Berg Jackson将猿猴病毒基因组sv40的DNA通过λ噬菌体导入大肠杆菌后获得表达,成功地完成了世界上首次DNA体外重组实验,标志着基因工程技术的开始。

1、定义：基因工程又称DNA重组技术,是在基因水平上进行的遗传操作。主要是通过有机合成,或者以mRNA为模板,利用反转录酶合成碱基因互补的DNA,按照人们的需要对DNA序列进行设计、剪接、修饰加工,再和载体DNA(质粒)连接在一起重新导入细胞,大量繁殖,生产所需要的蛋白质、激素、疫苗、酶等,培育出具有某些特殊性能的转基因动、植物新品种。

总之,基因工程的最终目的是把一个生物体中的遗传信息(DNA)转入另一个生物体,并表达出其特有的、人们需要的性状。

2、基因工程主要包括以下几个步骤：

(1)提取供体生物的目的基因(外源基因),用限制性内切酶切开,将含所需性状的目的基因连接到另一DNA分子上(常用大肠杆菌),形成新的重组DNA分子。

(2)转化过程。将重组DNA分子转入受体细胞,并在受体细胞中复制保存。

(3)对受体细胞进行筛选和鉴定,以保存并复制含有目的基因的细胞,一般通过特殊培养基进行选择性培养,淘汰没有转化的细胞,筛选出那些带有目的基因的外源DNA重组质粒。

(4)对含有重组DNA的细胞进行大量培养,并检测外源基因是否表达。

基因工程的意义在于:大规模生产生物分子;设计构建新物种;搜集、分离、鉴定生物信息资源。在医学上、轻工食品上、环保上的应用,农林领域带来的是第二次农业大革命。

二、发酵工程

1、定义：发酵(fermentation)来自拉丁语“发泡”(fervere)一词,当时是指酒精发酵时产生二氧化碳的现象。

狭义的发酵是指微生物的一种呼吸类型, 广义发酵,是指利用微生物制造和生产各种目的产物的过程,包括利用好氧微生物进行的需氧发酵、利用兼行厌氧微生物进行的兼气发酵和利用厌氧微生物进行的厌氧发酵。

发酵主要应用于工业、农业、食品卫生、医学、环境保护等领域。

2、发酵工程主要包括四个方面的内容和步骤:(1)发酵原料的预处理。(2)菌种的活化和种子扩大。具体操作为: 种子培养培养容器为5 ～ 10 mL试管。

一级种子培养将种子接种到200 ～ 1 000 mL锥形瓶中,在振荡器内培养。二级种子培养将一级种子接种到10 ～ 100 L的种子发酵器内培养。(3)微生物发酵和控制。(4)发酵产物的分离提取。

对发酵液进行浓缩、纯化过程是提纯产品的过程。

三、细胞工程

1定义：细胞工程是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法,通过某种工程学手段,按照人们的设计蓝图,进行细胞整体水平或细胞器水平上的遗传操作,即将具有某种特定基因和性状的细胞与异种细胞融合,形成新型细胞,使其具有两种亲本细胞的基因和特点。

2、细胞工程的主要步骤分两部分,一是上游工程,包含细胞培养、细胞遗传操作和细胞保藏三个步骤;另一部分是下游工程,是用已转化的细胞来生产生物产品的过程。

(1)细胞培养：包括单个细胞培养、组织培养和器官培养。(2)细胞融合(3)细胞亚结构移植

四、酶工程

1、酶工程的主要任务是通过预先设计、经人工操作而获得大量所需的酶,并使酶发挥最大的催化功能。

2、酶工程的内容主要是:酶的生产分离纯化、酶的固定化、酶及固定化酶的反应器、酶与固定化酶的应用等。

1)酶的来源 2)酶的分离纯化过程

3)酶的固定化，酶的固定化方法主要有三种:(1)载体结合法(2)交联法(3)包埋法(4)酶反应器

五、蛋白质工程

1、定义：蛋白质工程主要是在明晰编码蛋白质的基因DNA碱基排列顺序或蛋白质的氨基酸序列的基础上进行的,通过定点突变技术更换蛋白质分子的某一特定氨基酸,即更换一个片段,修饰改造现在已有的酶、多肽激素、疫苗等,使之具有某些新的特性,满足人类的需要。

2、蛋白质工程一般需经过以下步骤: ①分离纯化需要改造的目的蛋白;②对已分离纯化的蛋白进行氨基酸序列测定、X射线晶体衍射分析、核磁共振分析等一系列测试,尽可能多地获得该蛋白的结构和功能的数据;

③通过蛋白序列设计核酸引物或探针,从cDNA文库或核基因文库中获取编码该蛋白的基因序列;④设计改造方案;⑤对基因序列进行改造;⑥将经过改造的基因片段插入适当的表达载体,并通过蛋白质加以表达;⑦分离、纯化经过改造的蛋白质,并对其进行功能检测。◆习题与答案:

一、名词

1、生物技术：生物技术是应用自然科学及工程学的原理,依靠微生物、动物、植物体作为反应器,将物料进行加工以提供产品来为社会服务的技术。

2、转基因动物：是用实验方法，把外源基因导入到动物体内，这种外源基因与动物本身的染色体整合，这时外源基因就能随细胞的分裂而增殖，在体内得到表达，并能传给后代。：

3、克隆：是指生物体通过体细胞进行的无性繁殖，以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群。通常是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因组织后代的过程。

4干细胞：是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。

二、简答

什么叫基因工程,简述基因工程步骤? 答：基因工程又称DNA重组技术,是在基因水平上进行的遗传操作。主要是通过有机合成,或者以mRNA为模板,利用反转录酶合成碱基因互补的DNA,按照人们的需要对DNA序列进行设计、剪接、修饰加工,再和载体DNA(质粒)连接在一起重新导入细胞,大量繁殖,生产所需要的蛋白质、激素、疫苗、酶等,培育出具有某些特殊性能的转基因动、植物新品种。

基因工程主要包括以下几个步骤:(1)提取供体生物的目的基因(外源基因),用限制性内切酶切开,将含所需性状的目的基因连接到另一DNA分子上(常用大肠杆菌),形成新的重组DNA分子。

(2)转化过程。将重组DNA分子转入受体细胞,并在受体细胞中复制保存。

(4)对含有重组DNA的细胞进行大量培养,并检测外源基因是否表达。◆板书设计：

第一节生物技术的形成与发展

一、现代生物技术定义

二、生物技术的进展

第二节生物技术的基本内容

一、基因工程

1、定义：

2、基因工程主要包括以下几个步骤：

二、发酵工程

1、定义：

2、发酵工程主要包括四个方面的内容和步骤:

三、细胞工程

1、定义：

2、细胞工程的主要步骤：

四、酶工程

1、定义：

2、酶工程的内容：

五、蛋白质工程

1、定义：

2、蛋白质工程一般需经过以下步骤:

◆课后评价与思考：

《生物基础》电子教案

浙江省江山市中等专业学校张容

【教材】王社光、刘强。《生物基础》.高等教育出版社.2005.6.第1 版【课题】第7章生物技术及其应用

第三节生物技术的应用

【教学目标】

知识与技能：掌握现代生物技术在各领域应用的基本情况，了解生物技术在人类社会发展上的巨大作用。

过程与方法：通过案例教学使学生对生物技术工程的作用有进一步的认识。培养学生的观察能力，使学生能理论联系实际正确地进行分析，认识新事物和掌握新技术。

情感态度与价值观：通过教学，使学生对待新事物、新技术的认识得到提高。培养其学习科学的兴趣、努力的掌握新技术，并运用技术为社会作出自己的贡献。【教学重点、难点】

重点：生物技术在各领域的应用难点：生物技术在各领域的应用【课时安排】1学时

【主要教学方法】讲授、PPT演示、讨论【教学用具】多媒体及PPT 【教学过程设计】

第7章生物技术及其应用

第三节生物技术的应用

现代生物技术产业自20世纪80年代兴起,90年代形成热潮后,给农林、食品、医药等行业带来了前所未有的发展。2000年世界生物技术产品市场接近4 000亿美元。

一、生物技术在农作物种植上的应用

主要是利用细胞工程和基因工程操作技术。农作物利用生物技术主要在以下方面:

1、提高农作物产量和改进农产品品质

2、进行抗逆与抗病虫害育种

3、培育抗除草剂农作物

4、生物肥料

5、利用转基因植物生产医药品和贵重蛋白

二、生物技术在园艺上的应用

人们想方设法改进花色色泽、花形外观以及延长花的保存期

在果树上的应用, 如果树的育种，抗病虫害,抗逆,提高果品甜度、香味、色泽及个体形状、大小等性能的新品种会给人们带来更大的希望。

三、生物技术在林业上的应用

1、培育抗性优异的基因工程林木

2、利用植物组织培养技术快速繁殖林木

四、生物技术在畜牧业上的应用

1、转基因动物。转基因动物的研究,目前主要有如下方面:(1)转基因动物生物反应器。(2)转基因动物作为移植器官的供体。(3)转基因技术用于动物育种和改良。

2、克隆技术

克隆技术具有广阔的应用前景,主要有四个方面的内容: ①培育优良畜种和生产实验动物;②生产转基因动物;③生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法;④复制濒危的动物物种,保存和传播动物物种资源。

3、干细胞技术

4、利用基因工程技术生产疫苗

五、生物技术在医学等领域中的应用

1、基因工程药品。几种主要的基因工程药品：(1)人胰岛素。(2)人生长激素(3)细胞因子(4)生长因子。(5)疫苗

2、生物技术在疾病诊断与治疗中的应用

3、展望未来医药卫生领域中的生物技术。未来医学领域中的生物技术可预期取得的突破有以下几个主要方面:(1)转基因动物生产的“转基因药物”将进入市场。(2)人型单克隆抗体的制备将取得新突破。(3)基因治疗将逐步实现临床应用。(4)生产技术的各个环节将不断得到改进。

◆习题与答案：简答：

1、简述克隆技术应用前景? 答：克隆技术具有广阔的应用前景,主要有四个方面的内容:①培育优良畜种和生产实验动物;②生产转基因动物;③生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法;④复制濒危的动物物种, 保存和传播动物物种资源。

2、简述转基因动物生物反应器在药品生产方面的意义? 答：利用转基因动物的乳腺组织作为生物反应器,能够生产出具有完全生物活性的药用蛋白,纯化简单,投资少,成本低,对环境无任何污染。这样的生物工厂,就是一座天然原料加工厂,只要提供牛羊饲料,就可以从其乳汁中源源不断地获得人类所需要的药用蛋白。

3、简述生物技术在农业上的应用? 答：

1、提高农作物产量和改进农产品品质。

2、进行抗逆与抗病虫害育种。

3、培育抗除草剂农作物。

4、生物肥料。

5、利用转基因植物生产医药品和贵重蛋白。

4、简述生物技术在医药行业的应用? 答：

1、基因工程药品：(1)人胰岛素(2)人生长激素(3)细胞因子(4)生长因子(5)疫苗。

2、生物技术在疾病诊断与治疗中的应用，细胞工程在疾病诊断和治疗中的应用,主要是单克隆抗体制备技术;基因工程则以基因诊断和治疗开辟了医学的新纪元。

3、展望未来医药卫生领域中的生物技术未来医学领域中的生物技术可预期取得的突破有以下几个主要方面：(1)转基因动物生产的“转基因药物”将进入市场。(2)人型单克隆抗体的制备将取得新突破。(3)基因治疗将逐步实现临床应用。(4)生产技术的各个环节将不断得到改进。

5、谈谈你对转基因食品的认识?(略)

◆板书设计：

第三节生物技术的应用

一、生物技术在农作物种植上的应用

二、生物技术在园艺上的应用

三、生物技术在林业上的应用

四、生物技术在畜牧业上的应用

五、生物技术在医学等领域中的应用

兽医生物制品电子教案第3篇

1 兽医生物制品的发展简史

兽医生物制品的起源自中国古代起, 人们就懂得通过接种痂皮来抵御天花, 只是当时的人们并不了解其中的奥妙。随着免疫学的蓬勃发展, 人们开始有意识得制造生物制品, 以期能够达到预防治疗疾病的目的。

1.1 兽医生物制品发展起源

19世纪, 法国学者、免疫学的奠基人之一路易·巴斯德 (Louis Pasteure) 发明了禽霍乱疫苗、炭疽高温减毒苗和狂犬病干燥脊髓疫苗, 使疫苗的研究进入了一个崭新的阶段。在此阶段, 疫苗的生产是极为原始的, 产量小质量差。主要是利用肉汤全培养物制造的疫苗, 用于动物或人体后常产生严重的副作用, 疫苗的主要类型是活疫苗。

巴斯德对疫苗的研究, 影响是极其深远的特别是对预防医学和微生物学的影响最深。同时由于巴斯德在疫苗研究方面的工作, 证明了微生物的毒力在实验室里通过人工的方法是可以加以改变的, 使其毒力丧失或减弱, 成为无致病力的微生物。减弱或丧失毒力的微生物仍保留其良好的免疫原性, 以该种微生物加工制作的疫苗免疫动物或人, 可得到免疫保护来预防由该种强毒微生物引起的相应传染性疾病。

1.2 灭活苗的出现

灭活疫苗出现的较晚。制作疫苗的方法一般采用肉汤培养物。稍后改用琼脂表面培养物。杀菌方法多采用加热杀菌法, 疫苗的含菌量以湿重计算。最早研制的灭活疫苗是用加热杀死的猪霍乱沙门是杆菌制成的疫苗 (1884~1886) , 免疫鸽子后被免疫的鸽子获得了免疫保护, 能耐受强毒猪霍乱沙门氏杆菌的攻击。但数量有限, 效果欠佳。人们在研究减毒苗的时候发现活疫苗由于残留强毒和弱毒反强的危险, 又重新研制灭活疫苗, 尤其当有了理想的免疫佐剂之后, 种类不断增加, 如猪丹毒灭活氢氧化铝疫苗、禽霍乱灭活氢氧化铝疫苗等。特别是以轻质矿物油为佐剂的油佐剂灭活苗, 由于免疫期长, 十分安全, 无副作用而深受用户的青睐, 其发展前景非常广阔。

1.3 免疫血清的研究

在免疫血清研究方面, 贝林和北里二氏 (1890) 发现破伤风毒素免疫的动物血清中有中和相应毒素的能力, 卡尔默特 (1894) 研制成功了抗蛇毒血清, 并开辟了血清疗法, 为制备各种免疫血清提供了根据。由于免疫血清有产量小、价格贵、免疫保护期短等特点, 而不能大面积推广。目前只有抗破伤风血清用量最大。人们常利用成年禽类 (鸡、鸭、鹅) 等同种动物或一种动物 (猪、牛、羊) 制备高免血清, 用以防治畜禽传染性疾病并取得了良好的效果。同时也给成年禽类进行超免处理后采集所产生的蛋, 制成超免卵黄抗体来防治这些疾病效果也极其显著。

跨入20世纪, 兽医生物制品取得了迅猛发展。卡尔默特和介林二氏 (1923) 研制成功了卡介苗;威尔斯提德 (1923) 发明了铝胶佐剂;拉蒙 (1923) 利用加热与甲醛溶液处理毒素, 可使其脱去毒力类毒素, 利用类毒素免疫动物同样获得免疫保护;拉蒙和施米德二氏 (1936) , 以及福罗德 (1935) 分别研究了明矾、氢氧化铝和矿物油的佐剂效应, 对兽医生物制品起到了极其重要的促进作用。伍德拉夫和古德帕斯特 (1931) 在鸡胚内复制痘病毒获得成功, 以及后来的组织与细胞培养复制病毒, 为病毒疫苗的研究进入一个较高层次奠定了基础。这一时期, 疫苗的生产仍处于手工操作阶段, 但产量逐步扩大, 质量也不断改进。

从20世纪50年代开始, 疫苗的生产发生了巨大的变革。近30年来, 特别是60年代以后, 随着基础科学的发展与进步, 推动了微生物学与免疫学的研究促进了兽医生物制品生产的大发展, 无论数量与质量上都有很大提高, 由于发酵工业的兴起, 带动了疫苗生产向工业化规模发展。同时由于各种抗菌药株的产生, 使得已经停产多年或被重视的疫苗又重新受到重视, 亦取得了重大的成就。

2 我国兽医生物制品发展现状

兽医生物制品是控制和消灭畜禽传染病的重要武器, 对畜牧业经济的发展, 保障人民生命健康具有重要意义。我国兽医生物制品的研究, 从1928年起虽然开始作了一些工作, 但国民党政府极不重视支持, 解放前此方面工作进展缓慢, 疫病不能控制, 听其自然。新中国建立后, 新政府对动物免疫工作日渐重视。经过60余年的发展, 我国已建立了具有一定规模与水准的兽医生物制品厂25家, 共生产猪、禽、牛、羊、马、经济动物、犬、猫和鱼类疫苗八大系列100余种, 基本上满足了国内需要, 有的疫苗在国际上享有盛誉, 如猪瘟兔化弱毒疫苗和马传染性贫血疫苗等。

3 兽医生物制品的发展趋势

3.1 第二代疫苗—基因工程疫苗

百余年来, 虽然疫苗的生产不断改进与创新, 但就其性质来说, 仍然属于第一代疫苗。自基因工程技术引进疫苗研究领域之后, 使疫苗的研究与生产发生了革命性变化, 于是便产生了第二代疫苗—基因工程疫苗。在兽医领域已研制了口蹄疫基因工程疫苗和犊牛、仔猪下痢大肠杆菌基因工程疫苗。基因工程疫苗的载体已由质粒改为痘病毒, 并可将几种基因片段重组在一个痘病毒的载体, 并可将几种基因片段重组在一个痘病毒的载体上产生一种基因工程联合疫苗, 使制造疫苗的技术又向前迈进了一大步。

3.2 合成肽疫苗

合成肽疫苗为第三代疫苗。具有抗原性的肽段完全用生物化学的方法进行人工合成后, 再与高效的免疫佐剂相配合制成疫苗, 其特点是, 可以大量人工合成, 并且抗原性专一, 无副作用。这种疫苗的生产是由基因工程阶段进入了分子工程阶段, 是高科技产品, 它将代表着21世纪生物制品的发展方向。

3.3 抗独特型抗体疫苗

20世纪70年代后期, 出现了一种非抗原性疫苗—抗独特型抗体疫苗。它既非抗原物质的本身, 也非人工合成抗原本身, 而非是抗原物质的“模拟物”。当用该种物质给动物接种时, 动物并没有接触到病原微生物抗原, 却可产生对相应病原微生物抗原的免疫力, 故又称此种疫苗为内在抗原疫苗。虽然这些高科技产品目前仍处于试验阶段, 离直接投入生产实践应用尚有一段距离。传统的第一代疫苗目前仍是当家品种, 所以对其有必要进行改进和提高。

读生物制药却收到“兽医”毕业证第4篇

李明（化名）是化州市新安镇人，2010年没有考上高中，在家务农。7月底，化州市综合职业技术学校一份录取通知书突然发到他家，上面称，他已被该校录取。“从没有报过这所学校，但父母觉得我年纪还小，应该到学校去继续学习。”李明于是入学。

经过2年学校理论学习和学校安排的几个月入厂实习，2013年7月份，他和其他同学回校领取所学专业的毕业证，发现学校发给大家的是畜牧兽医证。

“这差距也太大了，我们都无法接受。”李明称，他们班上27名同学，没有一个人同意领取和专业完全不对口的毕业证。大家向学校讨说法，但是学校领导对他们一直是避而不见，双方这样僵持着，直到现在。

此前，该班的一些学生自行找到一些生物制药厂实习。“拿到毕业证就可以转正，可是全被毕业证给卡了。”王华（化名）现在深圳一家制药厂上班，“正式工一个月2600元，我还只能拿1500元。”

王华说，他们班上27名学生，因没有毕业证，大多只能找一些和所学专业无关的工作，有的进了宾馆做招待，有的进了鞋厂做普工，“学校学的东西对他们找工作没有起到一点作用。”

日前，化州市综合职业技术学校2013年生物制藥专业的班主任张老师接受采访时称，据她了解，从毕业到目前，班上27名学生，还没有一个学生到学校领取畜牧兽医毕业证。由于一些原因，在以后，学校也基本不可能给学生们发他们所学专业的生物制药专业毕业证。

该校一位负责人称，学校曾主动与学生们协商过，但学生们要价太高，协商最终没有达成。该负责人没有透露学校开设的生物制药专业，却给学生们发畜牧兽医毕业证的具体原因。据《南方都市报》

第五节生物的变异电子教案第5篇

题：第二章第五节

生物的变异

主备人:王慧君

备课组成员：王慧君

王东

第课时

总第____课时

备课时间: _________________________________ 授课时间:_________________________________

教学目标：

教学重点：

引起生物变异的两种原因，理解生物的性状既受遗传物质的控制又受环境因素的影响。

教学难点：

引起生物变异的两种原因。

教学课时：课时，本节为第课时

教学过程：

复习旧知（出示投影）

1、我们把兔的毛色、人的耳朵有没有耳垂、豌豆植株的高矮称为___________。

2、把同种生物同一性状的不同表现形式称为___________。

3、上题中，涉及了哪些相对性状，请同学们一一找出来？

4、我们把生物亲子间的相似性叫__________。

把生物亲子间和子代个体间的差异叫__________。

一、联系生活，形成认识——生物的变异普遍存在板书

一、生物的变异_______存在板书普遍

过渡：为什么生物的变异会存在，生物变异的原因是什么，让我们一起来探究一种变异现象——花生果实大小的变异，来解释这些问题。板书

二、引起变异的原因

二、产生疑问，分组探究——探究花生果实大小的变异

探究计划——取样、测量、记录、求平均值、统计、画直方图、讨论。

三、设计问题串，层层深入

师：将学生探究结果的平均值写在黑板上，投影学生画的直方图，并据其中的一张图引导学生分析讨论。引导问题

①据图说出这种花生果实长度的分布范围？最小是多少毫米，最大是多少毫米？

生：答出花生果实长度的分布范围。

②根据这张图中的数据，你能得出什么结论？生：同一品种的花生果实有长有短

③为什么同一个品种的花生果实有大有小，这种变异是什么原因造成的？生：环境板书环境

④根据探究结果区分大花生和小花生，从两种花生果实长度的平均值，你能得出什么结论？

生：大花生果实长度的平均值都大于小花生。

⑤大花生和小花生果实长度的平均值有差异，这种差异是由什么决定的？生：遗传物质

二次备课

板书遗传物质

师：花生果实大小变异，有的是环境引起的，有的是遗传物质引起。

⑥把大花生的种子种在贫瘠的土壤中，把小花生种到肥沃的土壤中，它们结出的果实会怎样呢？你做出推测的依据是什么？生：讨论分析与交流。

⑦大花生种在贫瘠的土壤中果实会变小，把小花生种到肥沃的土壤中果实会变大，引起变异的原因是什么？这种变异能遗传给后代吗？

生：只是由于环境改变引起的变异。不能遗传，因为遗传物质没有改变。师：也就是说，单纯由环境引起的变异，如果遗传物质没有改变，就不会遗传给后代。属于不遗传的变异。

板书

三、变异的分类不遗传的变异

⑧什么样的变异能遗传呢？像绿色的玉米地里出现了一株白化苗，这株白化苗能遗传吗？

生：能遗传，因为遗传物质发生了改变。板书可遗传的变异

⑨从大花生中取一粒粒大饱满的种子种不去，所收获的果实都大吗？为什么？生：不一定，花生果实的大小出除了受遗传物质的影响，还受环境的影响。师：说明环境与遗传物质对生物性状的影响中，遗传物质是主要原因。

二次备课

三、课堂小结

谈谈你的收获和想法

四、课堂练习

练习册

五、布置作业

练习册

板书设计第五节生物的变异

一、生物的变异普遍存在

二、引起变异的原因环境

遗传物质

三、变异的分类

不遗传的变异可遗传的变异

教后反思

兽医微生物实习报告第6篇

二．实习材料

实验动物：一只被感染小鼠，一只健康小鼠

实验器械，主要包括：小鼠解剖工具手术剪、镊子、蜡盘、钉子，接种棒、酒精灯、打火机、记号笔、手套、载玻片、枪头、注射器、离心管。

实验材料：麦康凯琼脂平板、各种染色液（结晶紫溶液、碘溶液、酒精、沙黄水）、蒸馏水、培养基（普通肉汤培养基、蛋白胨培养基、葡萄糖蛋白胨培养基、固体培养基）、PBS重悬液、生化试验材料（微量发酵管（葡、乳、枸、尿素、麦、甘醇、蔗、硫）、对二甲基氨基苯甲醛、乙醚、甲基红、vp甲乙液）。

实验主要仪器：离心机，分光光度器，温箱，摇床，超净工作台

三．实习内容

以柯赫法则为主线，通过对感染小鼠的剖解采样、分离培养、镜检、扩增培养，然后把得到的纯培养物对健康小鼠进行再次接种以获得被感染小鼠，再次重复以上操作，把获得的纯培养物通过镜检观察和做生化实验来鉴定出感染小鼠的致病菌。

四．实习操作进程

第一天：实验设计、讨论症状、分离剖解实验设计：以小组为单位进行实验设计，明确此次实验主要法则是：柯赫法则。在老师的指导下确定此次实习的主要步骤，讨论实验中可能遇到的问题以及注意事项。讨论症状：比较观察健康小鼠与病鼠，可见到病鼠一般呈萎靡状，不活跃。每组领取一只感染小鼠观察症状，体表基本正常。分离剖解：先将麦康凯琼脂平板分三区，依次写上肝、脾、心。右手抓起小鼠尾巴，将小鼠摇晕，采用颈椎脱臼法将小鼠处死。将小鼠尸体仰卧固定于蜡盘上，充分露出胸腹部。先用小鼠腹部柔软部用剪刀剪一小口，然后从该小口处往上、往下剪将皮毛剥离，剥离腹膜暴露出肝脏和脾，可观察到有轻微的肝肿胀，颜色变淡。将肝和脾切开一小口，用接种环取样，在麦康凯琼脂平板的相应区域进行划线分离。再打开胸腔观察，可见胸腔有出血现象和凝血块，剪开心包膜，将心脏切一小口，用接种环取样，在麦康凯琼脂平板的相应区域进行划线分离。写上班级组别，日期，置于温箱中培养至第二天早上8点。

第二天：挑取单菌落，镜检，扩增培养，重悬，测OD配浓度，小鼠腹腔注射挑取单菌落：观察麦康凯琼脂平板上菌落的形态为圆形，边缘整齐，表面光滑，暗红色，圆心处颜色较边缘浅。挑去单个菌落，画上记号准备做后续试验。镜检：选取所挑选菌落的一半进行抹片。取干净玻片，滴半滴去离子水，用接种环挑取菌进行抹片、干燥固定、采用格兰染色法染色：草酸铵结晶紫染色1-2’，水洗，革兰氏碘液媒染1-2’，水洗，95%酒精脱色约30’’-1’，水洗，沙黄水溶液复染10 ’ ’-30 ’ ’，水洗。吸干，镜检。观察到该菌被染成红色，是格兰阴性菌。扩增培养：选取剩余的菌接种到肉汤培养基中，置于温箱培养9个小时至菌的生长对数期。4 重悬测OD值配浓度：下午5点左右，将培养的菌转入无菌小管中离心，离心后可见菌沉

于管底，在超净工作台内操作，去上清液，用枪头吸取PBS液至去了上清液的菌管中，反复吹打使其重悬，然后再次离心，去上清，重悬，通过分光光度计测得OD590的值，配成2*10^7CFU浓度的菌液。小鼠腹腔注射：每组挑选一只健康小鼠，在头部或尾部做上记号，用右手抓住鼠尾，将其摇晕，令其前爪抓住铁丝盖上，然后用左手的拇指和食指捏住小鼠头颈部皮肤，并翻转左后使其腹部朝上，将其尾巴夹在左手掌与小指之间，右手把持注射器吸取2mL菌液，在股后侧面插入针头，先刺入皮下，后进入腹腔，注射时阻力，皮肤也无泡隆起。注射完将小鼠放回鼠笼即可。

第三天：观察小鼠发病情况

小组成员分时间段观察小鼠感染情况，见小鼠濒死的尽快解剖接种分离致病菌。若一整天未见小鼠有异常情况的等第二天解剖

第四天：剖解划线培养

虽然小鼠未见萎靡，由于预订的感染时间差不多，可以进行解剖接种第一天的操作，可见体表有淤血点，剖开的小鼠肝脏流出大量的血液。其余均同第一天的操作，将麦康凯琼脂平板的上所接的菌置于温箱中培养。

第五天：生化鉴定

观察到平板上只有一个较小的暗红色菌落，挑取该菌落进行扩增培养9小时至细菌生长的对数期。下午6点观察，培养液依旧是澄清的，很可能没有长菌。为做进一步的验证，进行生化试验。将该菌接入微量发酵管（）和蛋白胨以及葡萄糖蛋白胨中，培养至第二天看结果。

第六天：观察结果，整理报告

生化试验无任何反应，说明接的菌为杂菌或污物，整理实验报告并分析失败原因。

六．实验结果与分析

此次试验失败

给小鼠攻毒，未能分离出致病菌，因此也无法鉴定出小鼠被感染的病原菌为何种肠杆菌科

试验失败原因可能有：