病毒的繁殖教学设计

病毒的繁殖教学设计（精选5篇）

病毒的繁殖教学设计 第1篇

第一阶段：感染

结果是寄生到其他程序中

在详细说明感染机理前，首先看一下感染途径，因为如果不了解病毒是如何进入到个人电脑的，就无法往下进行。

9成以上是通过电子邮件感染的

病毒主要通过（1）电子邮件、（2）外部介质、（3）下载这3种途径入侵个人电脑。

（1）电子邮件，是指把蠕虫和特洛伊木马本身以及受病毒感染的文件作为电子邮件附件等发送出去。有的是普通用户在不知道附件已经感染病毒的情况下发送了病毒邮件，有的是蠕虫本身自动地向外界发送邮件。而特洛伊木马则是由图谋不轨的第三者（即 ）发送的。

而且受病毒感染的不仅仅限于附件。比如，Windows附带的Outlook Express等常用电子邮件软件，大多都会利用Web浏览器的功能，解释并显示邮件正文中所描述的HTML代码。而病毒脚本往往就隐藏在HTML邮件当中。

（2）外部介质，是指用户从别人那里借来带有病毒的软盘和光盘等介质后，病毒就会由这些介质入侵到自己的电脑中。尽管很多情况是由于从别人那里借来的软盘等介质中带有病毒而被感染，但也不完全如此，过去就曾发生过多起市售软件中含有病毒的情况。

另外，通过外部介质的感染并不仅限于通过软盘和硬盘上的文件进行感染。有些病毒会隐藏在软盘和硬盘的起动区域中，这种情况稍后会作详细介绍。如果利用这种带病毒的外部介质起动个人电脑，就会受到病毒感染。

（3）下载，是指用户从Web站点和FTP服务器中下载感染了特洛伊木马和病毒的文件。公司内部LAN上的文件服务器和不同电脑之间的文件共享都有可能成为感染病毒的原因。

另外，在第三种感染途径中还存在极少数特殊情况。比如，99年曾在业界引起轩然大波的“Worm.ExploreZip”病毒，只要LAN上的其他个人电脑把起动系统的分区设置为完全共享，该病毒就会随意地发送自身的拷贝并实施感染，

也就是说，即便电脑用户不进行下载，电脑也会自动下载并运行病毒。

在这三种感染途径中，所占比例最大的是电子邮件。据受理日本国内病毒相关损失情况报告的日本信息处理振兴事业协会（IPA）表示，最近9成以上都是通过电子邮件感染的。就在数年前绝大多数还都是通过外部介质感染，由此可以看出电子邮件的普及对病毒感染造成了多么大的影响。也就是说病毒和电子邮件之间存在一种息息相关的关系。

感染目标有3个

不过，即便病毒通过上述三种途径进入了个人电脑，也不会直接产生什么问题。只有在用户无意中打开了电子邮件附件、执行了病毒程序那一刻起才会引发感染。这一点非常重要，请读者务必谨记。

用户一旦不慎起动病毒，感染即随之开始。根据病毒感染的不同目标，大体上可以把病毒分为如下3种：

・引导区感染型：

感染硬盘和软件中保存起动程序的区域

・可执行文件感染型：

感染扩展名为.com和.exe等程序（可执行文件）

・脚本感染型：

感染微软Office产品（Word等）的文档文件和HTML文件等

下面依次对这3种病毒加以介绍。

在个人电脑起动时同时开始运行

首先来看一下引导区感染型病毒（图4）。此类病毒感染软盘和硬盘的引导扇区（起动区域）。

引导扇区是指在个人电脑起动的初始状态下被访问的特殊区域，该区域保存了起动电脑所需的小程序。在硬盘中称为主引导记录（MBR）。引导区感染型病毒就感染这些小程序。病毒感染引导扇区后，在操作系统起动之前病毒就会被读入内存，并由CPU执行。在这种状态下只要在电脑中插入其他软盘等外部介质，就会一个不落地感染所使用的软盘。

病毒的繁殖教学设计 第2篇

1 病原学研究

1.1 PRRSV 的分类

第1 0届国际病毒学大会, 国际病毒分类委员会将PRRSV列入新设立的套氏病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒属。依据血清学试验及基因序列的差异, 将PRRSV划分为欧洲型和美洲型2个基因型。欧洲型毒株主要流行于欧洲地区 , 其代表性 毒株为Lelyst advi r us ( LV) ; 美洲型毒 株主要流 行于美洲和 亚太地区 , 代表性毒 株为ATCCVR- 2332血清学试验表明 , 这2种毒株之间拥有共同的抗原决定簇, 属一种病毒, 但二者之间存在抗原性差异, 仅有较少的交叉反应[2]。二者基因序列同源性仅55%~ 70%, 但在病毒形态结构、复制特点、细胞嗜性、传播方式及引发的疾病症状等方面保持相同[3]。朱建平[4]利用蛋白质组学技术对PRRSV强、弱毒株在PAM和Marc- 1 45细胞上的增殖特性进行了比较研究。 细胞病变观察和间接 免疫荧光检 测结果显示 , 二者在体外 均可以感染PAM细胞 , 其中强毒Hu N4株感染PAM细胞CPE较为明显。比较Hu N4株与Hu N4- F1 1 2株在PAM细胞和Marc- 1 45细胞的生 长曲线 , 结果显示 , 强、弱毒在PAM细胞和Marc- 1 45细胞生长趋 势存在明 显差异, 其中强毒Hu N4株在PAM细胞上增殖能力 明显强于 弱毒株 , 而弱毒Hu N4- F1 1 2株在Mar c- 1 45细胞上的增殖能力明显强于其在PAM细胞上的增殖能力。

1.2 PRRSV 的形态特征

PRRSV为有囊膜 的单股正 链RNA病毒, 纯化的病毒粒子在电镜下呈球形 , 直径为40~ 80 nm, 内有一个 呈立体对称具 有电子致密 性的核衣 壳 , 直径为25~ 35 nm, 外包被脂质双层膜, 衣壳表面有突起, 长5~ 8 nm。核衣壳内含有单股线状基因组RNA, 大小约1 5 kb, 是动脉炎病毒属4种成员中最大的一种[5]。汪铭书 等 [6]研究结果 显示, PRRSV病毒粒子呈球形, 有囊膜, 大小45~ 65 nm, 内含直径25~ 30 nm的核衣壳。病毒感染细胞后以细胞内吞方式进 入细胞, 在胞浆内复 制, 装配好的病毒以出芽或细胞外分泌释放到细胞外。感染细胞超微结构变化主要表现为:细胞胞浆空泡增多, 内质网扩张, 线粒体增 生、嵴肿胀 、脱落, 最后空泡化, 细胞表面的 微绒毛脱落, 出现典型的细胞凋亡特征, 并观察到凋亡小体, 最后整个细胞裂解、破碎。

1.3 PRRSV 的起源

有研究者提出了关于PRRSV起源的假说[7]。其认为, PRRSV起源于淋巴囊炎病毒 ( LDV) 。可能在1 9世纪的欧洲中部, LDV通过口服或伤口途径从发生感染的野家鼠传播至当时广泛存在的欧亚野猪, 并通过不断地适应选择, 至出现适应性宿主。野猪的初始感染可能发生在德国东部, 但在1 91 2年, 欧亚野猪被 引进至美 国及其他 各个地区, 使该病毒传播到了美洲大陆。病毒在欧洲和北美2个大陆上不同野猪群中独立地变异、进化, 进化选择出具有更好生长潜力的变异毒株, 同时病毒从野猪群传到了家猪群, 并通过不断的变异进化, 形成了目前的美洲型和欧洲型PRRSV。研究者 通过试验 对PRRSV起源进行了探讨。蒋小红[8]应用针对PRRSV的N基因的特 异性引物P1 /P2, 对从广西南宁市郊区收集的仔猪病料进行检测, 结果为阳性。将材料接种于易感细胞Marc- 1 45细胞, 经过6代盲传 , 结果出现了典型的细胞病理变化 ( CPE) , 与对照株 病变相似 , 经鉴定为PRRSV。

1.4 PRRSV 的培养特性

PRRSV在猪肺泡巨噬细胞 ( Por ci neAl veol ar Macr ophages, PAMs) 内生长迅速且致细胞病变。 有的毒株 ( ATCC VR- 2332) 可在非洲绿猴肾细胞的传代细胞 ( CL- 2621) 上生长并致细胞病变。PRRSV最初用PAMs分离得到。PAMs和血单核细胞仍然是仅有的有效用于病毒体外培养的猪源细胞[9]。另外野毒株和疫苗株的体外培养用源于MARC- 1 04猴肾细胞系的2个非猪源细胞亚克隆 ( CL- 2621与MARC- 1 45) 。常规的诊断调查和许多试验研究表明, PRRSV的欧洲型毒株用PAMs可以成功地分离到, 而绝大多 数PRRSV的美洲型 毒株用CL2621、MARC- 1 45可以分离到[10]。

1.5 致病机理

PRRSV主要侵入 单核细胞 分化较好的子细胞, 因为这些细胞具有PRRSV感染所需的受体。其经呼吸道侵入机体时, 首先与PAM上的受体结合, 然后经受体介 导的内吞 作用进入PAM, 在PAM内大量地复制增殖 , 导致细胞破裂崩解, 使细胞比例由正常的90%降至50%甚至更少。研究发现 , PRRSV早期感染可导致PAM对外源性抗原递呈功能下降, 进而影响机体的体液免疫应答。导致机体 易继发感 染多杀性 巴氏杆菌、链球菌、猪副嗜血杆菌、放线杆菌、支原体、圆环病毒等病原, 使疾病恶化, 死亡率大幅上升 [11]。孟帆等[12]利用透射电镜对山西省PRRSV变异株感染猪的肺脏、淋巴结等组织进行超微病理变化的观察。结果发现, 肺脏、脾脏、肝脏、肾脏、淋巴结各组织细胞均被不同程度地感染, 各种细胞器遭受普遍的膜结构损伤, 而以线粒体和细胞核变化较严重。 万根等[13]研究结果 表明 , 在“猪高热病”疫情中PRRSV和PCV2起了重要作用。

PRRSV在PAM中大量增殖 , 随细胞的崩解而侵 入血液及 淋巴循环 系统 , 在血液中的巨噬细胞和单核细胞内迅速增殖, 导致病毒血症出现, 病毒随血流及淋巴循环分布到全身各组织器官的巨噬细胞, 导致全身淋巴结的充血肿大和相 应组织器 官不同程 度的病变, 包括脑炎、心肌炎、动脉炎等[14]。

2 PRRSV 的分子生物学研究

2.1 PRRSV 的基因组结构

众多研究 者通过进 行大量研 究 , 探索了PRRSV的基因组结构 ( 图1) 。研究结果表明, PRRSV基因组全长1 5 kb , 含有8个开放式 阅读框。ORF1 a和ORF1 b位于基因组的3′端, 占整个基因的80%。编码病毒 的复制酶和RNA聚合酶活 性蛋白, ORF1 a编码区有 一个疏水区, 有一个推定的丝氨酸 蛋白酶区和半胱氨酸富集区。ORF1 b鉴定处4个独特区, 分别为含有芯髓序列S/GDD的聚合酶 基元序列 ( mot if) , 该序列见于所有正链RNA病毒的RNA聚合酶;富含半胱氨 酸和组氨 酸的锌指 区 ( zi nc- f i nger domai n) ; 结合三磷酸腺苷或蜗牛酶基元序列;以及其他功能不明的保守 区。ORF2- ORF在基因组 的5′端 , ORF2、ORF3和ORF4分别编码 病毒相关蛋 白GP2、GP3、GP4, ORF5、ORF6和ORF7分别编码病毒囊膜蛋白 ( GP5) , 膜蛋白 ( M) 和核衣壳蛋白 ( N) 。

2.2 病毒基因组编码的蛋白

PRRSV基因组编 码的蛋白 有复制酶、聚合蛋白和结构蛋白。ORF1编码复制酶和聚 合蛋白是 唯一的非 结构蛋白, 参与病毒的复制。ORF1编码的聚合蛋白经裂 解后产生6个非结构 蛋白 ( NSP1α、NSP1β和NSP2~ 5) 。其中NSP2的氨基酸序列在美洲株和欧洲株之间的同 源性仅有32%, 研究表明 , NSP2蛋白基因中含有B细胞表位免疫的优势基因;NSP1α和NSP1β包含2个类木瓜蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶区[15]。ORF1 b编码的聚合蛋白长约1 463个氨基酸, 被ORF1 a编码的蛋白酶切割后形成Rd Rp、CP2、CP3、CP4共4个蛋白。陈樱[16]PRRS阳性病料ORF5~7基因的全长序列克隆和序列分析, 得到1 2个ORF5基因 , 8个ORF6基因和5个ORF7基因。

GP2蛋白有2个明显的疏 水峰和糖基化位点, 通过二硫键和其他结构蛋白形成同源或异源多聚体。GP3为高度糖基化 的结构蛋 白[17], 具有7个糖基化位点。GP4有4个糖基化位点, 其N- 端和C- 端具有高度的疏水区。GP5为糖基化的囊膜蛋白, 又称E蛋白, 含4个糖基化 位点和一 段31个氨基酸的信号肽, 该蛋白含有一段很大的内部疏水区。GP5有6个抗原决定簇, 能诱导机体产生特异性中和抗体。Lopez等[18]认为, 中和抗体在抗PRRSV感染的保护性免 疫中扮演 着重要的 角色。Ol eksi ewi cz等 [19]从PRRSV c DNA噬菌体文库中筛选出2个位于GP5蛋白上的B细胞抗原位点A和位点B, 位点A为非中和抗原位点, 在分离株中高度可变, 具有免疫优势;抗原位点B可被单抗ISU25- C1和猪中和血 清抗体识别, 不被非中和抗体识别, 在分离株中高度保守, 在PRRSV感染连续存在, 没有免疫优势。推测位点A可能诱导机体产生抗GP5抗体, 故GP5蛋白B位点抗原对设计PRRSV疫苗十分有用。研究证实, PRRSV的基质蛋白和囊膜糖蛋白GP5是淋巴细 胞增生性 应答的靶点。 另有报道, GP5可诱导并引发细胞凋亡[20]。

ORF1编码病毒RNA复制酶 , 是病毒产生的唯一非结构性蛋白, 参与病毒复制。ORF1 a所编码的寡聚蛋白经加工后, 成为6种非结构蛋白。ORF1 b所编码的寡 聚蛋白长 约1 463个氨基酸, 为ORF1 a编码的蛋白酶所切割, 并形成Rd Rp、CP2、CP3、CP4共4个蛋白[21]。ORF2~ORF7编码病毒的 结构蛋白 , 均含有糖基化位点及C端和N端疏水序列。将ORF2~ORF5编码的囊膜蛋白分别命名为GP2、GP3、GP4、GP5[22]。

ORF6编码非糖基化蛋白 , 即基质蛋白 ( M蛋白) , 分子量为1 8~ 1 9 ku。VR2332型和LV型分别含 有1 74和1 73个氨基酸。M蛋白的N端有3个疏水性跨膜区, 针对该蛋白的单抗从欧洲和北美洲的分离株中识别出2个共同和1个独特的抗原决定簇。M蛋白在所有的PRRSV株间高度保守, 在欧、美型毒株间也最为保守。通过感染猪康复血清的West ern免疫印迹试验证明了M蛋白具有很强的免疫原性, 感染后1 0 d就可以检 测该抗体 应答。表达重组的M蛋白可作为血清学试验的靶抗原。

ORF7编码核衣壳 ( N) 蛋白具有一个糖基化位点, 但非糖基化蛋白。N蛋白有6个疏水区及至少5个抗原决定簇, 其中既有对所有毒株保守的共同决定簇, 又有北美洲各型和欧洲各型的特异性决定簇。推测C末端对抗原决定簇的形成起重要作用。N蛋白在病毒粒子中含量较高, 占病毒蛋白总量的20%~ 40%, 具有较高的免疫原性。通过West ernblot证明猪感 染PRRSV后最早出现 ( 约7 d) 的是针对蛋白的 抗体, 且该抗体可持续存在半年以上, 因此, N蛋白可作为PRRSV抗体的检测抗原, 无论早期还是晚期都有重要的诊断学意义;但该抗体为非中和抗体, 对机体无保护作用, 无免疫学价值。

2.3 病毒遗传变异与重组

研究发现, PRRSV不同分离株核苷酸序列存在广泛而明显的变异[23], 这是因为PRRSV的复制依赖于RNA聚合酶, RNA聚合酶缺乏校正功能 , 使RNA合成易于发生碱基错配, 在PRRSV感染传代过程中, 随着病毒RNA的不断复制, 重组累积结果导致病毒基因组拥有极高的突变频率, 遗传特性发生变化;另一方面是环境压力选择因素, 疫苗免疫及弱毒感染给病毒造成的生存压力使PRRSV发生适应性突变, 导致PRRSV出现分子结构和毒力等方面的变异[24]。

细胞培养的PRRSV存在RNA的同源重组现象, 核酸序列分析表明, 各自分别发生了重组, 重组粒子由ORF3与ORF4相关蛋白组成 , 重组频率为2%~1 0%。自然界 的PRRSV也存在重 组现象。RNA重组现象是否与遗传变异有关尚无定论。据推测, 亚基因组m RNA种类也可能与RNA重组有关, 因此, 对RNA重组研究不仅 要在基因组RNA水平上进行, 还须在亚基因组m RNA水平上进行。李国江等[25]采用RT- PCR方法扩增了JL/07/SW毒株GP5蛋白和猪IL- 1 8基因。将该基因克隆入真核表达载 体p EG- FP- N1 , 获得重组 质粒p EGFP- GP5和p EGFP- IL1 8- GP5。将重组质 粒转染Marc- 1 45细胞 , 通过West er n bl ot t i ng和gr een f l uor escent检测产物的表达情况。结果显示, 所构建的2个重组质 粒在Marc- 1 45细胞中能进行有效的转录, 所构建的重组质粒p EGFP- GP5和p EGFP- IL1 8GP5在Mar c- 1 45细胞中得到表达。

3 分子生物学诊断

PRRSV的ORF6和ORF7分别编码病毒的膜蛋白 ( M) 和衣壳蛋白 ( N) , 是整个基因组 比较保守 的序列 , 所以 , 各种分子 生物学诊 断方法多 缘于此段基 因。

3.1反转录聚合酶链式反应 (RT-PCR) 目前, 很多研究者应用RT- PCR分子生物学诊断方法对PRRSV进行了研究。蔡家利等[26]根据PRRSV美洲毒株的基因序列, 设计一对能同时扩增M和N基因的序列引物。从流产猪胎儿组织中扩增出约91 8 bp的基因片段。但是因为PRRSV存在欧洲型和美洲型2种基因型, 利用这对引物进行RT- PCR能否同时检测PRRSV欧洲毒株和美洲毒株尚需探讨。岳丰雄等[27]建立了一种能够同时检测猪圆环病毒2型 ( PCV2) 、猪细小病毒 ( PPV) 、猪伪狂犬病病毒 ( PRV) 及PRRSV的多重PCR方法 ( m PCR) 。该方法对猪瘟病毒、大肠杆菌和双蒸水的PCR扩增结果均为阴性; 该m PCR方法对PPV的最低检 测量为8.64×1 0- 3μg, PRV的最低检 测量为2.36×1 0- 3μg, PRRSV的最低检测量为3.68×1 0- 3μg, PCV2的最低检 测量为2.90×1 0- 4μg。黄良宗等[28]应用Primer3.0和Omega2.0, 根据PRV、PRRSV和猪流感病毒 ( SIV) 保守基因设计了3对多重PCR引物, 建立PRRSV、SIV和PRV单项PCR检测方法, 并在优化单项PCR反应条件 ( 引物浓度、Mg2+浓度、退火温度等) 基础上初步建 立了PRRSV- PRV- SIV多重PCR检测方法 , 并分别用多重PCR和单项PCR/RT- PCR检测1 0份临床病料, 两者符合率 为96.6%。崔立等[29]根据Gen Bank中PRRSV ORF7及PPVVP2基因序列设计合成引物, 建立了分别用于检测PRRSV、PPV的RT- PCR及PCR方法。刘志杰等[30]采用多重PCR方法, 对贵州省清镇市某猪场送检病料进行了猪病毒性疫病的病原快速检测。诊断结果表明, 该例患病猪为PPV、猪圆环病毒2型 ( PCV2) 、PRRSV 3种病毒的混合感。

3.2 核酸探针杂交技术

核酸探针 杂交技术 同样是PRRSV生物监测的重要技术之一。Sur等[31]应用地高辛标记制备PRRSV特异性c DNA探针, 建立了检测PRRSV的RNA的原位杂交技术。核酸探针杂交技术可以在多 种组织的 感染细胞 内检测到PRRSV的RNA, 比免疫组化具有更高的敏感性和特异性。杨汉春[32]用探针对阳性重组质 粒的DNA、HCVRNA、PPVDNA、PRVDNA的斑点杂交检测结果表明, 探针对同源质粒DNA显示强阳性, 而对HCVRNA、PPV DNA、PRV DNA显示为阴性。敏感性检测结果表明, 探针检测的敏感性可达l pg。任慧英等[33]利用ORF6片段的463 bp的c DNA探针对仔 猪分别人工感染ATCCVR- 2332株及北京分离株B96- 4后不同时间呼吸系统及繁殖系统中病毒核 酸的分布 进行了研 究。结果显示, 在感染后30 h, 即可在鼻黏膜、气管、肺脏、睾丸、附睾、精囊、前列腺、子宫、扁桃体等组织中检出阳性杂交信号, 且一直持续到感染后28 d。其中扁桃体中病毒的数目远多于呼吸系统及繁殖系统组织中的数目, 说明扁桃体可作为活体检查临床诊断重要靶器官[34]。

4 展望

随着分子生物学、分子免疫学和细胞生物学的快速发展, 对PRRSV的结构和功能研究正在不断地深入, 但仍有很多问题尚不十分清楚, 如病毒编码蛋白的结构与功能关系、病毒抗原和毒力变异的分子基础及其对免疫系统的抑制机理等。因此, 今后的研究应侧重于病毒基因变异与重组机制, 病毒复制机理, 病毒编码蛋白结构与功能的关系, 病毒抗原和毒力变异的分子基础等方面。

摘要：猪繁殖与呼吸综合征病毒 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV) 是严重威胁养猪业发展的一种烈性病原。从介绍其分类、形态特征、起源及培养特性等病原学研究出发, 分析了其分子生物学研究, 并阐述了其分子生物学诊断方法, 包括反转录聚合酶链式反应 (RT-PCR) 及核酸探针杂交技术等, 为有效控制该病的发生提供了理论依据。

造成繁殖母猪死胎的6种病毒病 第3篇

1. 高致病性猪蓝耳病

高致病性猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸综合征病毒变异毒株引起的一种急性高致死性传染病。母猪感染后流产,产死胎、弱仔等。仔猪感染后表现呼吸困难、败血症等症状,发病率可达100%,死亡率可达50%以上。临床表现为体温明显升高,可达41℃以上;眼结膜炎,眼睑水肿;咳嗽、气喘等呼吸道症状;部分猪出现后躯无力、不能站立或共济失调等神经症状。病理指标可见脾脏边缘或表面出现梗死灶,显微镜下见出血性梗死;肾脏呈土黄色,表面可见针尖至小米粒大出血斑点,皮下、扁桃体、心脏、膀胱、肝脏和肠道均可见出血斑点。部分病例可见胃肠道出血、溃疡、坏死。

免疫程序:商品猪在仔猪断奶后初免。在疫病流行地区,可根据实际情况在初免后一个月加强免疫1次;种猪70日龄前免疫程序同商品猪,种母猪以后每次配种前加强免疫1次,种公猪以后每隔4～6个月加强免疫1次。疫苗选用高致病性猪蓝耳病灭活疫苗、高致病性猪蓝耳病弱毒疫苗。疾病高发地区,根据监测情况,报农业部兽医局批准后,可使用高致病性猪蓝耳病毒株弱毒疫苗进行免疫。

2. 猪乙型脑炎

猪乙型脑炎主要通过蚊蝇传播,夏季多发。公猪主要表现为睾丸炎,性机能减退,精液品质下降;母猪则表现为配种困难、流产、死胎等。除青年母猪以外,其他猪感染后多为亚临床症状,经产母猪血液抗体高,无其他症状。青年母猪的死胎、木乃伊胎的发生率高达40%,新生仔猪死亡率为42%。剖检可见死胎脑积水,胎盘水肿,公猪睾丸硬化,与阴囊粘连,胸腹积水,浆膜表面有出血斑,淋巴结充血或肝脾有坏死灶。

免疫程序:后备公、母猪在配种前3周及1周分别接种1次乙型脑炎弱毒疫苗;每年蚊蝇出现前(4～5月份)对公、母猪连续进行两次乙型脑炎弱毒疫苗接种。

3. 猪细小病毒病

猪细小病毒病特点是感染的母猪特别是头胎母猪产死胎、畸形胎、木乃伊胎、弱仔及健康仔猪,此外无其他明显的症状。头胎或经产母猪主要的(通常也是惟一的)临诊症状是繁殖障碍。如果在同一时期内有多头母猪(特别是头胎母猪)发生流产、胚胎发育异常、产死胎、木乃伊胎等现象,且无其他任何临诊症状,同时证明有传染性,应考虑有本病的可能。

免疫程序:使用细小病毒灭活苗免疫接种,后备母猪配种前1个月首免,间隔12天后二免;产第一胎后15天免疫1次,每头肌注疫苗2头份。免疫3次后可不再进行免疫,能获得终生免疫。

4. 猪繁殖与呼吸综合征(猪蓝耳病)

猪繁殖与呼吸综合征以繁殖障碍和呼吸系统症状为特征。患病母猪表现为体温稍有升高,双耳、腹部、乳房皮肤发绀,流产,产死胎、木乃伊胎和弱仔,呼吸困难;新生仔猪表现呼吸困难和高致死率(80%~100%),剖检可见小面积肺炎病变区、肠系膜淋巴结水肿,皮下水肿,胸腹腔不等量积液,脐部肿大、出血。临诊指标:妊娠母猪感染后症状明显,至少20%胎儿死产,8%以上母猪流产和哺乳仔猪死亡率达26%以上。上述3个指标同时有两个符合时,即可认为本病的临床诊断成立。

免疫程序:用灭活疫苗免疫效果好,哺乳仔猪出生后7日龄每头肌注2毫升,后备母猪体重75千克时首免,间隔3周再加强免疫1次,每头肌注4毫升;种公、母猪每半年免疫1次,每头肌注4毫升。不主张使用弱毒苗,因为活苗接种有可能造成疫苗病毒的持续性感染和长期带毒,并感染尚未接种疫苗的猪。

5. 口蹄疫

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的偶蹄兽的一种急性热性高度接触性传染病。临诊上以猪的口腔黏膜、鼻吻部、蹄部及乳房皮肤发生水泡和溃烂为特征。妊娠母猪感染后可发生流产、死胎。仔猪因心肌炎死亡时剖检可见心肌松软,心肌切面有淡黄色斑点和条纹,有“虎斑心”之称,还可见出血性肠炎。

免疫程序:按说明注射口蹄疫O型灭活疫苗,在规定的地区范围内可使用合成肽疫苗或空衣壳复合型疫苗。规模养殖时,仔猪28～35日龄时进行初免,免疫剂量为成年猪的1/2,1个月后加强免疫1次,以后每隔4～6个月免疫1次;农户散养时,春、秋两季对所有猪进行一次集中免疫,每月定期补免;对调出县境的种用或非屠宰猪,在调运前2周进行一次强化免疫。

6. 猪瘟

繁殖障碍性猪瘟又称非典型猪瘟或温和型猪瘟,是由温和型猪瘟病毒株或低毒力株引起的慢性感染,为国内近年来新的表现类型。特点是病势缓和、病程较长、病状及病变局限且不典型,发病和死亡均较低,以小猪死亡为多,大猪常可耐过;有些母猪出现流产、早产,按时分娩的有很多死胎、木乃伊胎和弱仔。因病变局限且不典型,难以剖检诊断,则须经实验室检验诊断。

免疫程序:规模养殖的,25～35日龄初免,60～70日龄加强免疫1次;种猪(孕猪禁免)以后每4～6个月免疫1次。散养猪每年春、秋两季集中免疫,每月定期补免。此外,按猪场的综合防疫措施加强预防。发生疫情时对疫区和受威胁地区所有猪进行1次强化免疫。免疫一般使用活疫苗,传代细胞源疫苗可在广东、广西、四川、河南、山东、江苏、辽宁、福建等省份试用。

病毒的繁殖教学设计 第4篇

云南农业大学动物科学技术学院李富祥等用Marc145细胞从云南某猪场分离到两株猪繁殖与呼吸综合征病毒。PCR方法对NSP2基因进行扩增结果表明, 分离株缺失了90个核苷酸。对分离株ORF5基因序列进行扩增和测序, 进行同源性及遗传特性分析, 结果表明, 分离到的两株PRRSV位于进化树的同一个小分支上, 其核苷酸同源性为99.5%, 与山东株JN-HS、河南株Henan-1及越南株347-T-KSA位于同一个小分支上, 其遗传距离较近, 核苷酸同源性高达99.2%～99.8%, 与国内经典毒株Ch-1a和VR-2332的核苷酸同源性仅为94.4%～94.5%, 与国内其它强毒株的核苷酸同源性高达98%～99%, 均属于强毒株。

病毒的繁殖教学设计 第5篇

摘 要：为了解猪繁殖与呼吸道综合征在新疆的流行现状，以及病毒毒株的分子生物学特征，对疑似该病病料进行地方毒株的分离，并对其进行鉴定。采集新疆乌鲁木齐市七道湾某猪场疑似PRRS病死的猪只肺脏及淋巴结等组织病料，将其处理后接种到Marc-145细胞上，并盲传3代；对分离株进行毒力测定（TCID50），应用RT-PCR方法对出现CPE的细胞培养物进行分子检测。结果显示，分离到的新疆病毒株可发生细胞病变，在Marc-145细胞上的TCID50为10-5·mL-1。RT-PCR检测结果用琼脂糖凝胶电泳鉴定基因序列，将测序结果与GenBank已发表的PRRSV毒株基因序列进行对比分析。研究证明所分离到的病毒为PRRSV，命名为XJ-Q。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；分离；鉴定

中图分类号：S852.651 文献标识码： A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.11.008

猪繁殖与呼吸道综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）俗称蓝耳病，是猪群发生以繁殖障碍和呼吸系统症状为特征的一种急性、高度传染的病毒性传染病。其临床特征是仔猪出现不同程度的呼吸道病症及待产母猪的繁殖障碍，如木乃伊胎、弱仔、死胎或流产，死亡率高[1]。该病于20世纪80年代末、90年代初在美国报道，而后迅速传遍世界各个养猪国家，在猪群密集、流动频繁的地区更易流行，常造成严重经济损失[2]，严重影响了养猪业的生产安全。1987年PRRS首先发现于美国，1991年，Wensvoort等首次利用猪肺泡巨噬细胞（PAM）从中分离出了PRRS病原（Lelystad）[2]。中国于1996年由郭宝清等[3-6]首次从流产胎儿中分离到猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV），从而证实我国也存在猪繁殖与呼吸综合征，之后迅速蔓延至全国各地区[7-8]。为了解该病在新疆的流行现状，及PRRSV抗体依赖性和高变异性增强等特点，进一步丰富 PRRSV毒株基因组的信息数据，笔者对采自新疆乌鲁木齐七道湾地区的病料组织处理后经Marc-145细胞培养后得到的培养物进行毒力测定、RT-PCR鉴定及测序鉴定，得到新疆地方毒株，为进一步了解该病的流行现状及其生物学特性提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 病料采集 在新疆乌鲁木齐市某养猪场无菌采集疑似猪蓝耳病死猪的肺脏、淋巴结等组织病料，-70 ℃保存备用。

1.1.2 细胞及血清 Marc-145细胞系，由畜牧科学院兽医研究所传染病实验室提供；胎牛血清（FBS）为生工生物产品。

1.1.3 主要试剂及试剂盒 胰蛋白酶和青链霉素实验室保存，DMEM培养基、Trizol试剂为生工生物产品；TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）、DNA Marker DL2000购自TaKaRa公司。

1.2 方 法

1.2.1 病料处理 青链霉素清洗病料数次，剪碎、研磨，加入适量的DMEM培养液将其稀释至1∶3，反复冻融3次，分装至1.5 mL无菌离心管中，3 000 r·min-1离心10 min后留上清液，0.22 μm过滤膜除菌，保留滤液为待分离病毒液，保存在-70 ℃备用。

1.2.2 细胞培养 复苏Marc-145细胞：从液氮罐中取出细胞冻存管，瞬时放于37 ℃水浴恒温锅内，同时用镊子轻轻摇晃冻存管2 min将管内物质完全融化后，在生物安全柜内用移液器取出Marc-145细胞移入离心管中，加入无FBS DMEM至4.5 mL，1 000 r·min-1离心5 min。倒掉上清液，补加细胞生长液至7 mL，用吸管慢慢吹打混匀，移入培养瓶中，在倒置显微镜下观察细胞是否吹打散开，放入37 ℃的CO2培养箱中，左右摇晃，拧上培养瓶瓶盖（不可拧紧，稍有空隙，保证CO2能进入瓶内）。隔夜后，弃去旧培养液，用无FBS DMEM培养液洗1次瓶内细胞，再加入7 mL生长液（含10%胎牛血清FBS），酒精棉球擦拭瓶盖及培养瓶上半身，放入培养箱内，如此传至第3代进行病毒分离。

1.2.3 病毒分离 将1.2.1处理后的病料上清液经0.22 μm过滤除菌，取1 mL过滤菌液接种于单层的Marc-145细胞，37 ℃温箱中吸附60～90 min，期间每30 min摇晃1次，使病毒液均匀接触细胞层，而后加入维持液（含2%胎牛血清）至7 mL，放于5% CO2 37 ℃培养箱培养3～5 d。盲传3代，观察细胞病变（CPE）。

1.2.4 病毒的电镜观察 取致细胞病变的细胞培养物，反复冻融3次，1 000 r·min-1离心15 min，浓缩后加0.8%甲醛灭活，2%磷钨酸负染，透射电镜观察。

1.2.5 病毒TCID50滴定 将长成单层的Marc-145细胞消化后移入96孔培养板内，每孔细胞单层生长大约80%密度，用于接种病毒，步骤如下。

待测病毒液稀释：将病毒液置于灭菌后的EP管中，采用维持液培养基进行10倍递增稀释，取10-3～10-7稀释度，每个稀释度5个孔，每孔加入病毒液100 μL，同时设置2列对照孔（用维持液代替病毒液）。置于37 ℃ 5% CO2培养箱中吸附1 h，之后弃去病毒液，用无血清的DMEM洗涤后，加入100 μL维持液培养48 h后逐日观察，直至第5天记录出现CPE的孔数，计算CPE比率。

按Reed-Muench两式法计算TCID50。

1.2.6 病毒RNA的提取及RT-PCR 病毒RNA的提取：取750 μL病毒液，按照生工生物公司Trizol剂盒的操作步骤提取病毒总RNA。

RT-PCR反应。按照TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）试剂盒，利用自行设计的特异性引物，在PCR反应管中加以下溶液及试剂：RNA模板0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol·（LdNTPs 2.5 μL）-1，引物（上、下游引物）1 μL，MgCl2 5 μL，RNase Inhibitor（4 μ·μL-1） 0.5 μL，AMVRTase 0.5 μL，AMV-Optimized Tap 0.5 μL，用无RNA酶水补足25 μL。PCR反应条件：预变性温度50 ℃，时间30 min；预变性94 ℃，时间2 min；变性温度94 ℃，时间30 s；退火温度56 ℃，时间30 s；延伸温度72 ℃，时间1 min，循环次数30；延伸温度72 ℃，时间10 min。

电泳：取PCR扩增产物5 μL用0.8%琼脂糖凝胶（含0.5 μg·mL-1EB）电泳，100 V电压40 min进行电泳检测。

2 结果与分析

2.1 病毒分离结果

2.2 病毒的电镜观察

2.3 PRRSV分离株TCID50测定结果

统计接种病毒的96孔细胞培养板，在5 d后出现CPE的情况，并用Reed-Muench法计算距离比得出TCID50结果为10-5·（100μL-1），即PRRSV分离株在Marc-145细胞上的增殖毒价为TCID50105·mL-1。

2.4 RT-PCR鉴定结果

琼脂糖凝胶电泳结果表明，利用RT-PCR方法扩增出大小与预计结果一致的片段434 bp（图3）。将测得的序列与Gen Bank 数据库中已知序列进行比对及相似性分析，结果表明，此分离病毒为PRRSV。

3 结论与讨论

细胞分离、鉴定时PRRSV是最常用、也是最准确的诊断方法之一。PRRSV分离主要使用低成本的传代细胞如Marc-145细胞、猪肺泡巨噬细胞PAM[2]、CL2621细胞[9]。根据PRRSV分离株不同细胞嗜性也不同[10-11]。PRRSV更偏爱在PAM上复制，且亲嗜性最高，但是PAM制备技术难度较大，CL2621细胞是专利细胞。目前对PRRSV既敏感又方便的细胞为Marc-145和从Marc-145中克隆出的HS2H细胞。有实验证明，PRRSV新疆分离株适宜在Marc-145细胞上生长[12]，并从中分离到病毒，故本研究采用Marc-145细胞进行PRRSV的分离培养，同时也证实了新疆地区分离株在Marc-145细胞上培养有很好的增殖并能产生典型的CPE。

对PRRSV的检测方法很多，包括血清中和试验（SN）、核酸探针杂交技术、间接免疫荧光抗体试验（IFA）、过氧化酶单层试验（IPMA）、胶体金抗体检测技术（GIA）、乳胶凝集试验（LAT）、RT-PCR及重组蛋白分子诊断技术[13-14]等。实验室检测方法有：病毒的分离（VI），间接免疫荧光（IFA），血清中和试验（SVN），ELISA，RT-PCR等。猪繁殖与呼吸综合征的检测方法众多，各有优点，其中病毒的分离、免疫荧光抗体染色法和免疫过氧化物酶染色法等均需细胞培养才行，因工作量大、周期长，故不利于在基层推广应用。而过氧化物酶单层试验需要大量猪肺泡巨噬细胞，同间接免疫荧光试验一样，在检测时会因为操作活毒而产生实验室安全隐患，并且过氧化物酶单层试验与间接免疫荧光试验不适合大范围检测，RT-PCR方法则相对快速、简便、特异性强。ELISA和IFA在众多检测PRRSV的方法中，步骤较为繁琐，不适合快速诊断，而RT-PCR可快速鉴别诊断PRRSV，故本试验采用RT-PCR方法进行分离病毒的检测。

本研究分离国内新疆毒株，选用Marc-145细胞进行分离培养，连续传代，盲传3代即产生明显的细胞病变。根据分离病毒毒株致Marc-145的CPE、毒价滴定、RT-PCR反应以及与GenBank上登陆的基因序列对比，证实所分离的病毒为PRRSV，与有关文献报道一致[15]，成功地从组织病料中分离得到猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），将其命名为PRRSV新疆株（XJ-Q）。细胞出现CPE后取其感染物，从中提取RNA并通过PCR法鉴定，结果与预期相符，从而实现了对所获得分离培养物进行快速、确切的鉴定。成功分离获得的新疆分离株将为新疆PRRSV基因遗传变异分析的研究奠定基础。

参考文献：

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