骨髓单个核细胞的提取、分离、标记和体外培养

骨髓单个核细胞的提取、分离、标记和体外培养（精选3篇）

骨髓单个核细胞的提取、分离、标记和体外培养 第1篇

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养表型鉴定与标记

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离培养、表型鉴定和标记的方法,为临床进行细胞移植治疗心、肝、脑等器官急性衰竭提供种子细胞.方法无菌条件下取大鼠股骨、胫骨和腓骨,用冲洗法冲出骨髓,用直接贴壁法分离纯化MSCs,体外扩增,用免疫细胞化学法及流式细胞仪分别对培养的MSCs进行鉴定,并检测第3代MSCs的.细胞周期.结果体外培养的原代MSCs 72 h内可见有少量贴壁细胞,7 d左右达到汇合.免疫细胞化学示,MSCs CD29、CD44、CD73、CD105、CD166表达阳性,而CD14、CD34、CD45表达阴性.流式细胞仪示,CD14阳性率为0.19%、CD29为64.36%、CD34为0.17%、CD44为86.73%、CD45为0.18%、CD73为90.21%、CD105为74.25%、CD166为54.60%.细胞周期显示,第3代MSCs约有90%的细胞处于G0/G1期.结论MSCs在体外很容易分离培养和扩增,DAPI标记MSCs敏感性好,标记效率高,可作为标记细胞的一种有效手段,MSCs体外培养成功为细胞移植治疗急危重症器官衰竭提供新的治疗途径.

作 者：何忠杰 马俊勋 方驰华 杨丽萍 作者单位：何忠杰,马俊勋(南方医科大学附属珠江医院普通外科,广东,广州,510280)

方驰华(中国人民解放军总医院304急救部,北京,100037)

杨丽萍(中国人民解放军总医院304烧伤研究所,北京,100037)

刊 名：中国急救医学 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF CRITICAL CARE MEDICINE年，卷(期)：25(12)分类号：Q503 Q813.1+1关键词：骨髓间充质干细胞 分离培养 表型 细胞周期 大鼠 流式细胞仪

骨髓单个核细胞的提取、分离、标记和体外培养 第2篇

体外成功分离培养BMSCs是实验研究和临床应用的重要前提。该实验应用全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠BMSCs, 并观察其生物学特性及成骨和成脂的分化潜能, 为BMSCs的体内外研究应用奠定基础, 现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

4~6周龄SPF级SD大鼠, 雌雄不限, 体重100~150 g, 购自中山大学中山医学院实验动物中心。

1.2 实验试剂

L-DMEM培养基、H-DMEM培养基均购自美国GIBCO BRL公司;胎牛血清 (FCS) 、胰蛋白酶均购自Hyclone公司;Vitamin C、地塞米松、牛胰岛素均购自Sigma公司;β-甘油磷酸钠购自Calbiochem公司。兔抗大鼠单克隆抗体CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-PE-Cy5购自BD phamingen公司。

1.3 大鼠BMSCs的体外分离、培养与纯化

取SPF级3~4周龄SD大鼠, 断颈处死, 75%酒精浸泡5 min。无菌条件下分离大鼠双侧股骨, 并彻底清除附着其上的肌肉组织, 去除两端骨骺, 用含10%胎牛血清的L-DMEM间质干细胞培养液反复冲洗骨髓腔, 收集细胞, 1 100 r/min离心5 min, 弃去上清及脂肪层。以2×105 cells/cm2的密度接种于培养瓶中, 置于培养箱中培养。培养48 h后首次换液, 以后每3 d换液1次, 每天观察细胞的形态及生长情况。

1.4 流式细胞仪检测细胞表面标记

收集第3代细胞, 调整细胞密度为1.0×106个/m L, 装入1.5 m L的EP管中, 每管1 m L, 1100 r/min离心4 min, 弃上清。每管加入100μL PBS, 混匀, 分别加入CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-PE-Cy5兔抗大鼠单克隆抗体1μL (0.5~1μg/106细胞) , 混匀。37℃避光孵育20 min后, 每管加入1 m L PBS, 1100 r/min离心4 min, 弃上清, 再重复洗2遍, 以除去未结合抗体。0.5 m L PBS重悬细胞, 流式细胞仪进行检测分析。同时每管样品设立同型阴性对照。

1.5 体外诱导大鼠BMSCs成骨和成脂分化

1.5.1 成脂分化及油红O染色鉴定

取第3代的大鼠BMSCs接种于六孔板, 加入含1 umol/L的地塞米松, 0.5 mmol/L的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤, 10 mg/L的牛胰岛素, 100 mmol/L的消炎痛 (indomethncin) , 10%FCS的H-DMEM诱导3 d, 再用含10 mg/L的牛胰岛素, 10%FCS的H-DMEM处理1 d, 镜下观察细胞形态的变化和生长情况。成脂诱导后的细胞用PBS洗涤3次, 10%多聚甲醛固定10 min, 油红O染色5~10 min, 60%异丙醇稍洗去多余染液, 蒸馏水洗, Mayer氏苏木素浅染核, 1%盐酸水稍分化, 水漂洗10 min。于倒置相差显微镜下观察。

1.5.2 成骨分化及茜素红S染色

取第3代的大鼠BMSCs接种于六孔板, 加入成骨细胞诱导液 (含10~7 mol/L地塞米松, 10mmol/Lβ-甘油磷酸钠, 50 g/m LVitamin C) 2 m L, 置培养箱中培养。诱导分化18 d后, 吸去成骨细胞诱导液, 用PBS洗涤3次, 然后加入适量的茜素红-S染液染10~15 min, 显微镜下观察结果。

2 结果

2.1 BMSCs的形态学观察

原代培养时, 骨髓细胞接种于培养瓶后, 细胞呈圆型, 悬浮于培养液中。培养24 h后即有细胞贴壁, 换液后可见短梭形、星形细胞分散贴壁生长, 第4~5 d可形成分散的细胞集落, 细胞形态不一, 梭形细胞为主, 见图1A。第8~9 d细胞呈集落生长, 细胞间相互紧密贴附生长, 沿胞体长轴有序排列, 呈螺旋状或漩涡状, 可达80%~90%融合, 见图1B。消化传代后, 传代细胞12 h完全贴壁生长, 3~4 d可传代1次。传代至第3代的细胞形态均一, 呈梭形生长, 见图1C。

A:原代培养第5 d的细胞B:原代培养第9 d的细胞C:传代培养至第3代的细胞

2.2 BMSCs表面标记物的表达

流式细胞仪检测结果显示, 培养的第3代大鼠BMSCs CD29、CD44表达阳性, 而CD45呈阴性, 见图2。

A:CD29流式检测结果B:CD44流式检测结果C:CD45流式检测结果

2.3 BMSCs成脂成骨诱导分化及鉴定

BMSCs加入脂肪诱导液诱导2周后, 细胞中有大小不等的脂肪滴出现, 细胞逐渐由原来的梭形变为圆形或多角形, 经油红O染色, 苏木素复染核, 镜下观察可见脂滴为橙红色, 胞核为蓝色, 见图3A。BMSCs经成骨诱导液诱导2周后, 细胞转变为多角形细胞, 呈多层重叠生长, 可观察到较大的细胞结节, 有明显的钙沉积, 茜素红S染色后镜下可见散在大量橘红色的钙结节, 为茜素红与钙盐形成的橘红色的复合物, 见图3B。

A:成脂油红O染色 (×200) B:成骨茜素红S染色 (×100)

3 讨论

骨髓间质干细胞是骨髓内除造血干细胞之外的另一类干细胞, 是骨髓造血微环境的重要组成部分。BMSCs在全骨髓中比例很低, 只占骨髓有核细胞总数的0.001%~0.01%[9]。目前已经建立了多种体外分离培养BMSCs的方法, 主要有全骨髓贴壁培养法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法和免疫磁珠分选法, 不同的方法具有不同的优缺点[1,10]。全骨髓贴壁培养法基于BMSCs的粘附特性, 是获得这种细胞的最简单方法。本实验采用的是全骨髓贴壁培养法, 用L-DMEM+10%FBS作为基本培养基, 通过反复、多次换液去除未贴壁的造血干细胞, 获得贴壁生长的BM-SCs, 通过传代进行纯化和扩增培养。研究显示, 体外培养的BMSCs, 在形态上呈纺锤形成纤维细胞状, 能贴壁生长, 呈螺旋状或漩涡状[11]。该研究也证实了上述观察结果。

BMSCs的多向分化潜能受到多种因素的影响, 研究表明, Micro RNA-9-1可增加BMSCs向神经细胞的分化比率[12], 熟地含药血清能够促进BMSCs向神经细胞的分化[13]。王贞等[14]研究发现, 人血小板裂解液可以促进BMSCs成骨分化, 抑制其成脂分化, 朱小虎等[15]证实硝酸甘油也可促进BMSCs向成骨分化。BM-SCs的疾病治疗方面也得到广泛的研究, 并取得较好的实验结果, BMSCs经BMP-2预诱导后移植治疗大鼠再灌注后心肌梗死, 对心肌梗死再灌注损伤有一定治疗作用[16]。BMSCs联合脑源性神经营养因子用于大鼠脑出血的实验研究发现[17], 移植后可促进大鼠脑出血损伤部位结构和功能的修复。

骨髓单个核细胞的提取、分离、标记和体外培养 第3篇

尽管MDS作为一种血液系统疾病已被医学界认可多年,但其发生的病理机制及疾病进展的分子基础仍不清楚,其中,细胞凋亡失调在MDS发生发展中发挥一定作用[4]。 而MDS/MPN作为一种兼有病态造血和细胞增殖性质的髓系肿瘤,其病理机制目前更是知之甚少[5], 细胞凋亡在MDS/MPN患者中的作用鲜有报道。 作为两种异质性疾病,患者骨髓细胞凋亡情况如何,尚需进一步研究确定。

为比较中高危MDS及MDS/MPN患者中的细胞凋亡发生情况, 本研究以中高危MDS患者及MDS/MPN患者的骨髓单个核细胞(BMNCs) 为研究材料,分别采用细胞形态学凋亡细胞观察、Caspase-3 活性检测方法比较两组患者细胞凋亡情况;同时观察了患者的临床及实验室检查特征,对其细胞凋亡和临床表型的关系进行了研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究收集2013 年7 月~2015 年7 月在湖南师范大学附属长沙医院血液科就诊的8 例中高危MDS及5 例MDS/MPN患者资料,所有病例均为初治,获得患者知情同意。患者临床特点见表1。8 例MDS患者,依据患者临床特征、外周血象、骨髓细胞形态学、骨髓组织病理学、细胞及分子遗传学分析,诊断依据2006 年维也纳诊断标准[6],分型依据2008 WHO标准[7],危险度分组按照最新修订的IPSS-R标准[8]。 其中,难治性贫血伴原始细胞增多-1 型(RAEB-1)3 例,难治性贫血伴原始细胞增多-2 型(RAEB-2)5 例;中危组2 例,高危组3 例,极高危组3 例。 5 例MDS/MPN患者,诊断分型依据2008 WHO标准[3],其中,CMML 2 例,MDS/MPN-U 3 例。

1.2 方法

采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法对肝素抗凝骨髓标本进行分离,分离出的骨髓单个核细胞制成细胞悬液后分别用于细胞凋亡检测及Caspase-3 凋亡蛋白酶活性检测。

1.2.1吖啶橙(AO)/溴化乙锭(EB)荧光染料双重染色法检测细胞凋亡

在荧光显微镜下,正常细胞核染色质着绿色,结构正常;早期凋亡细胞核染色质着绿色,但核呈固缩或串珠状;晚期凋亡细胞核染色质着橘红色,呈固缩状或斑块状;坏死细胞为核染色质呈红色,核结构正常[9]。镜下每个样本计数200个细胞,计算凋亡百分率。凋亡百分率=(凋亡细胞数/200)×100%。

1.2.2 Caspase-3活性检测

根据R&D公司提供的Caspase-3活性检测试剂盒说明书进行。收集细胞,加入裂解液,冰上裂解10~20 min,4℃12 000 r/min离心1 min,取5μL上清用Bradford法进行蛋白定量,即采用分光光度计测定OD595光密度值。另外45μL加50μL 2×反应缓冲液及5μL Caspase-3反应底物,于96孔板中37℃避光孵育1~2 h,采用酶标仪测定OD405光密度值。按下述公式计算:Caspase-3相对活性=OD405/OD595。

注:“-”代表此项未进行检测或评估;MDS:骨髓增生异常综合征;MPN:骨髓增殖性肿瘤;RAEB:难治性贫血伴原始细胞增多;CMML:慢性粒单核细胞白血病;MDS/MPN-U:MDS/MPN无法分类

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0 统计学软件进行数据分析, 计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用t检验;若方差不齐,则用Mann-Whitney U非参数检验进行统计学分析; 数值变量的相关性分析采用Spearman相关分析。 选择双向检验,以P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 中高危MDS与MDS/MPN患者BMNCs凋亡水平比较

中高危MDS组BMNCs凋亡率为(10.25±1.77)%,MDS/MPN组为(6.90±1.66)%,中高危MDS组BMNCs凋亡率高于MDS/MPN组(P =0.032)。 见图1。

2.2 中高危MDS与MDS/MPN患者BMNCs中Caspase-3 活性比较

MDS组BMNCs中Caspase-3 相对活性为(0.18±0.04)% ,MDS/MPN组Caspase-3 相对活性为(0.07±0.02)%,MDS组BMNCs中Caspase-3 相对活性高于MDS/MPN组(P =0.028)。 见图2。

2.3 细胞凋亡与患者临床特征的相关性分析

中高危MDS患者BMNCs凋亡率与骨髓原始细胞比例呈负相关(r = -0.81,P =0.015)(图3A),而MDS/MPN患者BMNCs凋亡率与骨髓原始细胞比例呈正相关(r = 0.90,P=0.037)(图3B)。 但未发现患者骨髓细胞凋亡与其染色体核型异常、外周血细胞减少程度指标相关。

A:MDS患者;B:MDS/MPN患者

3 讨论

染色体异常为MDS重要特点之一[10],本研究MDS病例中也发现-7、+8、5q-核型异常;并且在MDS/MPN患者中也发现-7、+8、+9 核型异常, 但具体哪些基因发挥关键作用尚不明确,这些基因异常是疾病的始因还是伴随表现也尚不清楚。 尽管MDS和MDS/MPN被认为是独立疾病,但患者表现出重叠的染色体异常[11],提示两种疾病可能存在一部分共有的发病机制。

作为一种具有增殖性质的血液系统疾病,虽有研究发现在MDS/MPN中有部分CMML和MDS/MPN-U患者存在JAK2 突变[3], 但与MPN不同的是, 大多数MDS/MPN的增殖与RAS/MAPK信号通路相关。 本研究收集的5 例MDS/MPN中,发现1 例患者出现JAK2突变阳性。

目前发现细胞凋亡失调、造血微环境异常、免疫失调、表观调节异常、染色体改变等因素参与MDS的发生发展[12,13,14],其中,低危MDS表现为骨髓祖细胞凋亡的增加、进展期MDS骨髓细胞凋亡减少而增殖增加[15],提示随着疾病进展,克隆细胞获得逃避凋亡信号的能力。因MDS/MPN患者整体预后较差[16],作为比较本研究选取中高危MDS患者,通过凋亡研究发现其凋亡率约10.25%,符合大宗研究趋势[17],并且在中高危MDS患者中随着骨髓原始细胞比例的增加,细胞凋亡减少。

Caspase-3 在细胞凋亡中发挥重要作用, 是外源性(死亡受体)和内源性(线粒体和内质网)凋亡通路的共同凋亡蛋白酶[18],激活后通过抑制多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的活性,进而活化核酸内切酶,裂解核小体间的DNA,导致细胞凋亡[19]。 本研究从形态学观察和凋亡蛋白酶生物活性研究两方面发现MDS患者骨髓单个核细胞凋亡发生率高于MDS/MPN患者,提示MDS/MPN是不同于MDS的另外一种血液系统克隆性疾病。

同时通过分析患者骨髓单个核细胞凋亡与患者临床特征的关系发现,MDS患者中骨髓单个核细胞凋亡率与骨髓原始细胞比例呈反比,但MDS/MPN患者中BMNCs凋亡率却与骨髓原始细胞比例呈正相关,考虑可能与以下因素相关:1MDS/MPN是独立于MDS的一种髓系恶性肿瘤, 细胞生物学活性不同于MDS克隆;2本研究病例数有限,尚需进一步进行临床病例收集及研究。 但本研究未发现患者细胞凋亡与其染色体核型异常、外周血细胞减少程度相关。