金线莲中富含氨基酸、抗衰老活性微量元素, 药效价值较高, 被视为珍惜名贵药材, 备受青睐。但受自身生长特点等因素影响, 金线莲在自然条件下萌发率和繁殖率较低, 在药品市场一直供不应求[1]。基于这一现状, 利用植物培养技术来提高金线莲繁殖速度, 加大人工培养规模, 对保护金线莲和稳定市场供应, 均具有重要的现实意义。现将有关实验结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
无菌繁殖体系建立为江西金线莲野生种源, 采集植株茎段, 外植体以含顶芽茎段为主。
1.2 方法
1.2.1 一步成苗
1.2.1. 1 无菌繁殖
取植株, 去叶, 先放入水中漂洗, 再用流水冲洗, 时间分别为5、30 min;以75%酒精浸湿, 放入0.1%氯化汞溶液中, 12 min后取出, 用蒸馏水冲洗, 取茎上段 (即具茎尖) 、中段和下段 (即匍匐茎段) , 各1.5 cm, 均带有节间, 并分别接种于备好的培养基上。
1.2.1. 2 最佳培养基配方
MS培养基+IBA (吲哚乙酸) , 用量为10 m L/L, 香蕉100 g/L, 活性炭2 g/L, 白砂糖30 g/L, 琼脂4.2 g/L, p H值5.8;培养条件为:温度 (25±2) ℃, 光照时间和强度分别为12 h/d、1 800 lx左右[2]。
1.2.2 分步出瓶
1.2.2. 1 不定芽诱导
通过单因素实验考察基本培养基对不定芽诱导的影响, 大量元素减半 (1/2MS) , 其他成分不变, 各加入6-BA和NAA, 用量分别为4.0 mg/L、1.0 mg/L;选取无菌健壮植株, 做前期处理, 接10个茎节, 均重复3次, 以MS为培养基, 梯级加入细胞分裂素和生长素, 培养期间定时观察不定芽生长情况, 统计不定芽数, 分析生长调节剂对不定芽诱导的影响;繁殖最适培养基为:MS培养基+TDE, 用量为0.1 m L/L, 土豆汁100 g/L, 白砂糖30 g/L, 琼脂6 g/L, p H值5.8。
1.2.2. 2 壮苗培养
以1/2MS为基本培养基, 6-BA和NAA分别进行梯级处理, 前者设1~5 mg/L, 后者设0.5~1.5 mg/L, 共计15个处理, 分析生长调节剂对幼苗生长和发根的影响;另加6-BA (0.5 mg/L) 和NAA (2.0 mg/L) , 考察天然有机物与活性炭对幼苗生长的影响;生根最适合培养基为:MS培养基+6-BA, 用量为0.1 m L/L, IBA (吲哚乙酸) 5m L/L, 香蕉提取液50 g/L, 活性炭2 g/L, 白砂糖30 g/L, 琼脂4.2 g/L, p H值5.8;接入将增殖培养无根幼苗, 高为3 cm左右, 具在3~4节间, 有1~2片, 接种无根幼苗10株, 重复3次, 定期观察生长情况。
1.2.2. 3 移栽
选苗, 高为7 cm左右, 茎基直径2 mm左右, 丛生根2~3条, 炼苗后洗净培养基, 移入装有不同基质土盆中;移栽前, 基质均用45%多菌灵可湿性粉剂, 均以800倍溶液浇透消毒, 具体条件为:阴棚遮阴度为80%, 空气相对湿度为85%左右;移栽3个月后, 记录成活株数[3]。
2 结果与分析
2.1 无菌繁殖体系建立和不定芽诱导影响分析
外植体茎段分化程度会影响到诱导结果, 金线莲茎段外植体不定芽诱导显示, 外植体上段的接种数共75段, 萌动率为100.0%, 不定芽数为47个, 平均芽增值率为0.60倍, 芽体生长势旺且芽数少;外植体中段的接种数共166段, 萌动率为100.0%, 不定芽数为680个, 平均芽增值率为4.03倍, 芽体芽数较多且发育良好;外植体下段的接种数共94段, 萌动率为85.2%, 不定芽数为138个, 平均芽增值率为1.71倍, 芽体芽数较少且生长缓慢。基本培养基能够萌发出不定芽体, 但对诱导产生的影响较大, 结果显示, MS培养基芽体生长状况最佳, 其次1/2MS, 与1/3MS比较差异较为明显, 表明MS和1/2MS培养基适合作为金线莲经段不定芽诱导的基本培养基, 详见表1。
本次实验所用生长调节剂为6-BA、KT和NAA, 处理结果显示:6-BA用量为1.0 mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L和6.0 mg/L, 平均芽增长率分别为2.72倍、3.28倍、4.02倍、3.22倍;芽体生长变化趋势为色嫩绿且芽较弱转为色较率且芽较壮;KT用量为2.0 mg/L和4.0 mg/L, 平均芽增长率分别为2.25倍、2.58倍, 芽体生长状况为色黄白且芽较弱;以6-BA 4.0 mg/L为准, 加NAA, 用量为0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L, 平均芽增长率分别为5.36倍、4.58倍、4.16倍, 芽体生长状况为色浓绿且芽粗壮。从中能够得出, 生长调节剂添加量对金线莲不定芽增殖的影响较大, 且不同生长调节剂所产生的影响存在差异, 在相同添加量下, 6-BA的增值率明显高于KT, 表明6-BA更适合金线莲茎节不定芽的诱导, 添加适宜量为4.0 mg/L;NAA对金线莲不定芽的诱导具有一定的促进作用, 6-BA (4.0 mg/L) +NAA (0.5 mg/L) , 芽体生长状况即能够达到改善。
2.2 壮苗生根培养和移载成活影响分析
在金线壮苗生根培养中, 6-BA和NAA添加量不同, 壮苗净增叶、发根数和鲜质量净增量也存在一定差异。多次处理结果显示, 6-BA (0.5 mg/L) +NAA (1.0 mg/L) , 平均净增叶为1.8片, 发根数为2.2条, 鲜质量净增量为539.5 mg;6-BA (1.0 mg/L) +NAA (1.0 mg/L) , 平均净增叶为1.3片, 发根数为2.2条, 鲜质量净增量为525.8 mg;6-BA (1.5 mg/L) +NAA (1.0 mg/L) , 平均净增叶为1.1片, 发根数为1.4条, 鲜质量净增量为450.2mg;6-BA (0.5 mg/L) +NAA (2.0 mg/L) , 平均净增叶为3.2片, 发根数为2.6条, 鲜质量净增量为588.2 mg;6-BA (1.0 mg/L) +NAA (2.0 mg/L) , 平均净增叶为2.1片, 发根数为2.8条, 鲜质量净增量为583.4 mg;6-BA (1.5 mg/L) +NAA (2.0 mg/L) , 平均净增叶为1.6片, 发根数为1.7条, 鲜质量净增量为466.2 mg;6-BA (0.5mg/L) +NAA (3.0 mg/L) , 平均净增叶为4.3片, 发根数为3.7条, 鲜质量净增量为700.6 mg;6-BA (1.0 mg/L) +NAA (3.0mg/L) , 平均净增叶为3.3片, 发根数为3.0条, 鲜质量净增量为622.8 mg;6-BA (3.0 mg/L) +NAA (1.5 mg/L) , 平均净增叶为3.0片, 发根数为2.2条, 鲜质量净增量为524.6 mg;6-BA (0.5 mg/L) +NAA (4.0mg/L) , 平均净增叶为3.7片, 发根数为3.3条, 鲜质量净增量为662.8 mg;6-BA (1.0 mg/L) +NAA (4.0 mg/L) , 平均净增叶为2.6片, 发根数为2.6条, 鲜质量净增量为584.8 mg;6-BA (1.5 mg/L) +NAA (4.0 mg/L) , 平均净增叶为2.3片, 发根数为2.4条, 鲜质量净增量为535.8mg。综合比较来看, 在金线壮苗培养中, 6-BA适宜添加量为0~0.5 mg/L, NAA适宜添加量为3.0~4.0 mg/L。
不同添加物你对金线莲幼苗生长的影响存在一定的差异, 结果显示, 香蕉对促进幼苗生长有利, 土豆汁对促进幼苗生长不利, 活性炭具有一定的促进作用, 详见表2。本次实验种植基质以丹麦泥炭土为基质, 试管苗移载成活率达到96%。
3 讨论
金线莲茎段不同部位、培养基、生长调节剂和添加物对不定芽增殖、幼苗生长均会产生一定的影响, 有必要建立无菌繁殖体系, 确定金线莲幼苗快速繁殖的条件[4]。本次实验结果显示, 外植体以中间段茎节 (不含顶芽和长根) 为宜, 一步成苗最佳培养基配方为MS培养基+IBA (吲哚乙酸) , 用量为10 m L/L, 香蕉100g/L, 活性炭2g/L, 白砂糖30 g/L, 琼脂4.2 g/L, p H值5.8;不定芽增殖最佳培养基为MS, 生长调节剂添加适宜量为6-BA (4.0mg/L) +NAA (0.5 mg/L) ;壮苗生根最佳培养基为1/2MS, 生长调节剂添加适宜量为6-BA (0~0.5 mg/L) +NAA (3.0~4.0 mg/L) , 香蕉 (20.0%) 对促进幼苗生长有利, 活性炭 (0.3%) 具有一定的促进作用;试管苗移载适宜基质为丹麦泥炭土, 成活率可达到96%。组织培养所获得的金线莲植株与野生金线莲生长环境不同, 在药用成分和药理活性方面可能存在一定的差异, 这一问题还有待进一步研究。
摘要：目的:建立金线莲无菌繁殖体系。方法:以金线莲植株茎段为外植体, 分析茎段不同位置、培养基、生长调节剂和添加物对不定芽增殖和幼苗生长的影响。结果:外植体以中间段茎节 (不含顶芽和长根) 为宜, 一步成苗最佳培养基配方为MS培养基+IBA (吲哚乙酸) , 用量为10mL/L, 香蕉100g/L, 活性炭2g/L, 白砂糖30g/L, 琼脂4.2g/L, pH值5.8;不定芽增殖最佳培养基为MS培养基+TDE, 用量为0.1mL/L, 土豆汁100g/L, 白砂糖30g/L, 琼脂6g/L, pH值5.8;壮苗生根最佳培养基为1/2MS, 生长调节剂添加适宜量为6-BA (00.5mg/L) +NAA (3.04.0mg/L) , 香蕉 (20.0%) 对促进幼苗生长有利, 活性炭 (0.3%) 具有一定的促进作用;试管苗移载适宜基质为丹麦泥炭土, 成活率可达到96%。结论:合理利用金线莲组培快繁技术, 建立无菌繁殖体系, 能够实现金线莲幼苗的快速繁殖。
关键词：金线莲,不定芽诱导,壮苗培养
参考文献
[1] 周锐, 孔琼, 薛春丽, 等.屏边野生金线莲组培快繁技术研究[J].云南农业科技, 2014, 10 (4) :7-10.
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[3] 袁小铃, 王建栋, 王思雨, 等.金线莲组培快繁体系优化及多糖含量测定[J].浙江农业科学, 2015, 12 (7) :983-985.
[4] 魏翠华, 秦建彬, 谢宇, 等.应用正交设计法优选台湾金线莲快繁培养基[J].中国农学通报, 2013, 10 (4) :114-117.