1.引言
蓝藻水华污染所带来的主要危害是在有毒蓝藻细胞破裂后向水体中释放多种不同类型的藻毒素[1],世界上25%-70%的蓝藻水华污染可产生藻毒素[2]。淡水水体中常见的铜绿微囊藻、水华鱼腥藻、颤藻可产生一种或多种毒素。在已发现的各种不同藻毒素中,微囊藻毒素是一种在蓝藻水华污染中出现频率最高、产生量最大和造成危害最严重的藻毒素种类。另据调查发现,饮用水中MC的存在与人群中原发性肝癌和大肠癌的发病率有很大的相关性[3,4,5]。微囊藻毒素的测定方法有生物分析法、细胞毒性检测法、酶联免疫吸附法(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法(CE)、蛋白磷酸酶抑制法等多种方法,本实验室采用标准方法固相萃取-高效液相色谱法对微囊藻毒素进行定量测定,由于固相萃取法前处理步骤繁杂,有时存在回收率不理想、不稳定的情况,本研究在以往工作的基础上,试验优化各项因素以提高检测回收率,获得了满意结果。
2.实验部分
(1)仪器和试剂
Waters2695高效液相色谱仪紫外检测器,固相萃取仪,氮吹浓缩仪,C18固相萃取小柱,甲醇,乙醇,乙腈均为色谱纯。
(2)液相色谱仪条件
色谱柱:SymmetryC18(5um*3.9mm*150mm);
柱温:35℃±1℃;
样品温度室温,进样体积20uL。
流动相:乙腈+水+三氟乙酸=36+64+0.04(使用流动相前用抽滤泵抽滤);
流动相流速:0.70mL/min;
检测波长:238nm;
采集时间:10min;
固萃小柱活化:20mL甲醇和20mL20%甲醇活化固相萃取小柱,活化流速:2mL/min。
(3)优化参数
本研究对固相萃取上样体积、上样速度、水样温度、浓缩体积、浓缩温度、氮吹流量等各个因素影响微囊藻毒素测定的情况进行分别测试,分析每一因素时,在改变单因素影响的同时,保证其他条件不变。各因素不同测试值为:不同样品温度(4℃、16℃、40℃),不同上样体积(250mL、500mL、1000mL、1500mL),不同上样速度(8mL/min、10mL/min),氮吹浓缩不同温度(35℃,45℃,55℃),不同氮吹流量(6-9mL/min,8-13mL/min,11-14mL/min),不同洗脱溶剂(100%甲醇,80%甲醇,80%甲醇+0.05%三氟乙酸),不同定容体积(0.5mL、1.0mL),定容方式(1mL, 0.5mL+0.5mL)。
3.结果与讨论
(1)不同样品温度对测定结果的影响
固相萃取前取样品250mL温度控制为4℃、16℃、40℃,每个体积水样中加入相同量的微囊藻毒素(400ng)。按照上样速度10mL/min,氮吹浓缩温度45℃,氮吹流量8-13mL/min,洗脱溶剂80%甲醇条件处理。
当样品温度为4℃和16℃回收率相当,当样品温度为40℃时,回收率为85.1%,明显高于4℃和16℃的回收率。分析原因,在水中40℃时有机物溶解性强,更容易通过固相萃取富集,有利于准确定量。
(2)不同固相萃取上样体积对测定结果的影响
固相萃取不同上样体积选择250mL、500mL、1000mL、 1500mL,每个体积水样中加入相同量的微囊藻毒素(400ng)。按照上样速度10mL/min,氮吹浓缩温度45℃,氮吹流量8-13mL/min,洗脱溶剂80%甲醇条件处理,比较不同上样体积的富集情况见图1。结果表明上样体积为1000mL时回收率为最高,为84.6%。
该测试显示水样体积小于1000mL时,回收率反而会偏低,分析可能为开始上样时,由于固萃小柱与水样之间需要一定时间产生平衡,因此前面一段时间上样过程中,样品损失率较高,当上样体积小时,单位体积内的目标物质质量高,损失多。为进一步确认,在此基础上增加了一个500mL进样测试,上样前先用100mL纯水平衡小柱,结果表明用100mL纯水平衡小柱再上样500mL,回收率达到85.7%,与1000mL上样量测试的回收率相当。
因此,在实际检测中,选用上样体积不宜过小,1000mL比较合理,或者增加上样前期用纯水平衡的步骤,以获得较好的回收率。
(3)不同固相萃取上样速度对测定结果的影响
固相萃取不同上样速度选择8mL/min、10mL/min,上样量为250mL,其他处理条件同3.2,比较不同上样速度的富集情况。结果表明上样速度分别为8mL/min、10mL/min时,回收率基本相当,因此,为提高检测效率,可适当的提高上样速度。
(4)不同浓缩温度对测定结果的影响
浓缩温度选择35℃,45℃,55℃,在10mL浓缩管中直接加入400ng微囊藻毒素进行浓缩比较不同浓缩温度的富集情况。结果表明浓缩温度45℃时回收率最高(104%),当温度为55℃时略有下降,而温度为30℃时回收率显著下降,浓缩温度设置为45℃比较合理。
(5)不同氮吹流量对测定结果的影响
氮吹流量选择6-9mL/min,8-13mL/min,11-14mL/min,在10mL浓缩管中直接加入400ng微囊藻毒素进行浓缩,比较不同流量下的富集情况。结果表明氮吹流量为6-9mL/min, 8-13mL/min回收率均为103%。根据实验结果,流量控制在6-13mL/min之间为合理区间,流量超过14mL/min时,目标物将会造成较大损失。
(6)氮吹浓缩后采用不同溶剂洗脱对测定结果的影响
洗脱溶剂选择100%甲醇,80%甲醇,80%甲醇(+0.05%三氟乙酸),比较不同洗脱溶剂对浓缩管中已浓缩目标物的洗脱情况。结果表明80%甲醇回收率为最高95.5%,明显高于其它2种洗脱溶剂。
(7)氮吹浓缩后洗脱溶剂的不同用量对测定结果的影响
在10mL浓缩管中直接加入400ng微囊藻毒素进行浓缩,对浓缩后的目标物,用100%甲醇选择不同的洗脱体积(0.5mL、1.0mL)进行洗脱,按照总质量计算回收率。洗脱体积为1.0mL的回收率为81.3%,而洗脱体积为0.5mL的回收率大幅下降,该情况表明,对浓缩管中已浓缩的目标物进行洗脱时,洗脱溶剂的用量不能过少,须达到1mL左右才能有效的将浓缩管中的目标物基本洗脱下来。由此可见,在日常检测中,欲采用减少洗脱溶剂用量来获得较大富集倍数的方法是不可取的。
(8)氮吹浓缩后不同洗脱方式对测定结果的影响
氮吹浓缩后,用1mL80%甲醇,选择不同的洗脱方式进行洗脱,分别为:直接1mL80%甲醇沿着浓缩管壁冲洗、分2次每次0.5mL80%甲醇沿着浓缩管壁冲洗。结果分2次每次0.5mL80%甲醇洗脱的回收率较高为95.2%,分2次冲洗能更有效的把管壁上的目标物质洗脱下来,回收率更高。
根据以上实验得出优化条件:样品温度40℃,固相萃取上样体积1000mL,上样速度10mL/min,浓缩温度45℃,氮吹浓缩流量控制在6-13mL/min之间,采用80%甲醇溶液每次0.5mL分2次洗脱。在此组合条件下,微囊藻毒素测定可获得良好、稳定的回收率,确保检测结果的准确性。
摘要：通过对前处理过程中关键环节进行单因素不同水平比较,选择出固相萃取样品温度、上样体积、上样速度、浓缩体积、浓缩温度、氮吹流量等因素的最优实验方案,建立了一种简单有效省时及回收率较佳的前处理流程。研究获得各因素优化值分别为固相萃取上样温度40℃,上样体积1000mL,上样速度10mL/min,浓缩温度45℃,氮吹浓缩流量控制在6-13mL之间,采用80%甲醇溶液每次0.5mL分两次洗脱。
关键词：微囊藻毒素,高效液相色谱,固相萃取
参考文献
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