论文题目：基于宏基因组学（Metagenomics）分析的发酵床微生物多样性与功能研究
摘要：发酵床养殖技术（Fermentation bed culture technology）是当前畜牧养殖业中应用广泛的一种生态养殖技术,其核心是应用有益微生物菌群持续有效地将家禽粪污转变为有机物,实现无污染零排放。发酵床中微生物菌群是发酵床的核心。当前,由于环境气候、微生物栖息环境的差异,及抗生素滥用造成了一系列问题。陕北部分地区发酵床出现“死床”现象和新生猪仔死亡率高。抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes,ARGs）的累积,造成环境污染、微生物耐药及家禽疾病。本文立足于这些问题,综合运用样本文库构建、宏基因组测序、生物信息学分析、菌株分离筛选和分类鉴定等实验技术,探究陕北部分养殖场发酵床中微生物和功能基因的组成和多样性,碳氮代谢及抗性基因的分布。旨在为发酵床养殖技术的发展及家禽健康养殖提供更完善的理论基础。具体结论如下:1、发酵床富含种类丰富的微生物资源,不同年限发酵床垫料微生物组成和功能基因地丰度及结构不同。研究获得微生物隶属于4界、40门、98纲、209目、460科、1821属和5813种。拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和放线菌门物种为主要的微生物,其中变形菌门假单胞菌属（Pseudomonas）在三个不同年限垫料中含量最高。同时少量异常球菌-栖热菌门和紫单胞菌科细菌行使降解功能。发酵床垫料中蕴育丰富的功能基因。功能基因丰度较高的是新陈代谢（71.77%～72.87%）中氨基酸（11.92%～12.62%）和碳水化合物（7.96%～11.58%）。K03088、K02946和K02518基因在年限1、年限2和年限3垫料中分别具有较高丰度。其功能微生物主要有假单胞菌属（Pseudomonas）、节杆菌属（Arthrobacter）、假黄色单胞菌属（Pseudoxanthomonas）、副球菌属（Paracoccus）、短状杆菌属（Brachybacterium）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）和Galbibacter。致病菌丰度经分析发现,发酵床可以降低病原菌的产生并抵抗病原菌生存。其中葡萄球菌属（Staphylococcus）、肠球菌属（Enterococcus）和埃希氏杆菌属（Escherichia）丰度明显降低,且志贺氏菌属（Shigella）在三个年限中仅占有0.000%~0.002%。2、不同年限发酵床垫料中ARGs种类及丰度有差异,且不同于对照组。年限1、年限2及年限3中丰度最高的ARGs分别为ARO:3000205（7.25%）、ARO:3000412（8.15%）及ARO:3000498（7.43%）。随着发酵床的使用,ARGs丰度和种类下降,即发酵床养殖对新型污染物ARGs的控制是有用的。同时发酵床中主要的碳代谢、氮代谢基因分别有Kor B基因和nar H基因。其主要功能微生物除上述以外,还包含甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）。3、发酵床垫料中存在丰富的可培养微生物。研究共筛选分离得到264株可培养物,系统分类为45属,其中放线菌门和变形菌门丰度最高,其次为厚壁菌门。在属分类中,假单胞菌属（Pseudomonas）、副球菌属（Paracoccus）、假黄单胞菌属（Pseudoxanthomonas）、链霉菌属（Streptomyces）及芽孢杆菌属（Bacillus）含量最高。新种分类鉴定发现各新物种具有不同的生长特性,其最适生长温度范围均在30°C左右。菌株对Na Cl的耐受性普遍较低,生长p H均大于7.0,且具有不同范围的碳氮源。菌株耐药抗性有差异,其中H13-6菌株表现出较强的耐药性。同时随着垫料的使用,垫料中硝态氮、速效磷、p H及速效钾含量显著升高,氨态氮和有机质含量逐渐降低。4、组合六土著菌剂作用效果较好,其发酵温度稳定,在30 cm处温度达到45°C。其对有机质降解及氨态氮降解效果良好,且对于致病菌可有效抑制。组合六中埃希氏杆菌属-志贺氏菌属（Escherichia-Shigella,0.04%）与对照组相比下降7.00倍。沙雷氏菌属（Serratia,0.01%）和肠杆菌属（Enterococcus,0.00%）同样在组合六中占比最小。这对减少猪仔致病率,提高猪仔存活率具有积极作用。
关键词：发酵床垫料;宏基因组;微生物多样性;耐药抗性基因;土著菌剂
学科专业：微生物学
摘要
abstract
第一章 绪论
1.1 畜禽养殖污染及处理现状
1.1.1 畜禽养殖废物污染现状
1.1.2 国内外畜禽粪污处理方法研究现状
1.2 微生物发酵床技术的的研究现状
1.2.1 微生物发酵床技术概念及特点
1.2.2 影响发酵床效果的因素
1.2.3 国内外发酵床技术应用现状
1.3 发酵床研究进展
1.3.1 发酵床微生物多样性研究现状
1.3.2 发酵床垫料耐药抗性基因研究进展
1.3.3 发酵床垫料碳氮循环研究进展
1.4 发酵床复合菌剂研究现状
1.5 微生物研究方法
1.5.1 传统可培养法
1.5.2 非传统方法
1.6 研究内容、技术路线及意义
1.6.1 研究内容
1.6.2 技术路线
1.6.3 研究目的与意义
第二章 不同发酵年限垫料微生物多样性与功能研究
2.1 材料与方法
2.1.1 主要仪器及试剂
2.1.2 研究区概况
2.1.3 样品采集与处理
2.1.4 不同年限发酵床垫料理化性质测定
2.1.5 样品总DNA的提取与检测
2.1.6 样本文库构建及测序
2.1.7 微生物组测序数据质控
2.1.8 数据分析
2.2 结果与分析
2.2.1 宏基因组测序质控
2.2.2 不同年限发酵垫料微生物组成分析
2.2.3 不同年限发酵床垫料微生物组成差异分析
2.2.4 不同年限带垫料致病菌及益生菌丰度分析
2.2.5 βeta多样性分析
2.2.6 发酵床垫料不同层级功能基因分析
2.2.7 eggNOG、EC酶库及CAZy数据库 功能基因分析
2.2.8 发酵床垫料理化性质关联分析
2.3 讨论与小结
2.3.1 讨论
2.3.2 小结
第三章 不同年限发酵垫料微生物抗性基因及碳氮循环研究
3.1 材料与方法
3.1.1 材料来源及处理
3.1.2 样品总DNA提取、测序和质控
3.1.3 抗性基因注释及多样性分析
3.1.4 ARO抗性基因相关性分析
3.1.5 碳氮循环基因分析
3.2 结果与分析
3.2.1 发酵床垫料抗性基因多样性分析
3.2.2 发酵床垫料抗性基因差异性分析
3.2.3 发酵床垫料抗性基因关联分析
3.2.4 发酵床垫料微生物群落碳固定途径
3.2.5 发酵床垫料微生物与氮循环
3.3 讨论与小结
3.3.1 讨论
3.3.2 小结
第四章 基于传统方法研究发酵床微生物多样性及新种分类鉴定
4.1 材料与方法
4.1.1 主要仪器及试剂
4.1.2 主要培养基
4.1.3 样品来源及表观特征分析
4.1.4 不同年限发酵床垫料理化性质测定
4.1.5 不同年限发酵床微生物分离与纯化
4.1.6 菌株鉴定及保藏
4.1.7 生理生化特性研究
4.1.8 菌株药敏试验
4.1.9 磷脂提取及检测
4.2 结果与分析
4.2.1 样品采集及表观分析
4.2.2 发酵床微生物分离与鉴定
4.2.3 新物种形态学观察
4.2.4 不同年限发酵床垫料微生物多样性分析
4.2.5 发酵床功能微生物及理化性质关联分析
4.2.6 生理生化特性分析
4.2.7 菌株药敏试验
4.2.8 极性脂化学成分分析
4.3 讨论与小结
4.3.1 讨论
4.3.2 小结
第五章 土著菌剂研制及发酵床垫料细菌多样性分析
5.1 材料与方法
5.1.1 主要仪器和试剂
5.1.2 培养基
5.1.3 试验材料
5.1.4 发酵床功能菌的筛选
5.1.5 功能菌性能研究
5.1.6 发酵床功能菌及试验设计
5.1.7 发酵床菌剂的垫料发酵试验
5.1.8 样品采集与测试分析
5.1.9 不同组合菌剂垫料细菌群落差异分析
5.2 结果与分析
5.2.1 发酵床功能菌筛选
5.2.2 抑菌试验
5.2.3 拮抗作用及抗热研究
5.2.4 猪场试验及垫料温度变化检测
5.2.5 垫料理化性质分析
5.2.6 发酵床垫料测序深度及Alpha多样性分析
5.2.7 不同组合菌剂样本βeta多样性
5.2.8 发酵床垫料功能预测分析
5.3 讨论与小结
5.3.1 讨论
5.3.2 小结
第六章 结论与展望
6.1 结论
6.2 创新点
6.3 展望
参考文献
致谢