论文题目：空间非相干环形斜照明显微术
摘要：虽然目前已发展出诸如超分辨等许多先进的光学显微成像技术,但由于传统明场光学显微成像技术设备相对简单、操作相对方便,仍然广泛使用在医院病理诊断等生命科学的许多领域。而且在明场显微镜下进行病理诊断,依然是许多疾病例如恶性肿瘤判断的金标准。因此,不断提升明场显微镜的成像性能,以满足生命科学应用领域不断增长的需求,仍旧是显微镜学家的研究目标之一。为了改善明场显微镜的横向和轴向分辨率,实现明场光切片和三维成像,本论文提出了一种空间非相干环形斜照明显微术,有望为医学临床病理诊断及其他生命科学的应用,提供更多的有用信息。首先,本文在理论上研究了空间非相干环形斜照明显微成像的分辨率和对比度特性。根据傅里叶光学角谱成像理论,利用模拟仿真实验,对空间非相干环形斜照明与柯勒照明显微成像的横向分辨率及对比度特性进行对比分析,研究表明相对于柯勒照明,空间非相干环形斜照明显微图像具有更高的横向可视化分辨率。然后,使用几何光学建立多层厚样品模型,对空间非相干环形斜照明显微成像的轴向分辨率特性进行分析。研究表明相对柯勒照明,空间非相干环形斜照明可提供更高的轴向分辨率,也就是具有更好的光切片和三维成像能力。最后,通过爱德华球理论,对空间非相干环形斜照明成像的三维分辨率进行分析,同样证明了空间非相干环形斜照明可以同时提高明场显微成像的横向和轴向分辨率。为了从实验上验证理论分析的结果,评价空间非相干环形斜照明显微成像的光切片和三维成像能力,本文设计并制作完成了多款不同性能的发光二极管（LED）环形斜照明光源,分别从硬件和软件方面,设计并搭建了LED环形斜照明显微成像系统。利用搭建的LED环形斜照明显微成像系统,我们进行了LED环形斜照明成像特性的实验研究。以USAF标准分辨率板作为样品,当使用波长525 nm照明光源和大数值孔径物镜（NA=1.25,100倍）时,提出方法可以分辨分辨率板第11组第5个条形图案（条形或空隙宽度为154 nm）。证明了提出方法的横向分辨率和轴向分辨率,比使用柯勒照明的传统明场显微术有明显提高。为了进一步评估提出方法的光切片能力,我们还给出了一些组织学和病理学样品的单色及彩色光切片实验结果,并利用光切片图像实现了洋葱根尖细胞有丝分裂中染色体的三维重建。仿照荧光超分辨显微术中的分子定位方法,提出了中心定位轴向超分辨技术,对具有先验知识（例如稀疏性、强散射性）的样品——纳米线,实现了轴向超分辨三维成像,轴向分辨率接近100 nm。免染色透明生物样品成像在生命科学研究中具有重要的意义。为了实现对免染色弱吸收透明样品的成像,我们在LED环形斜照明显微成像系统的基础上,提出了一种用于免染色弱吸收透明样品的三维显微成像技术。通过三维梯度运算去除带有离焦像的背景,得到只含有样品边缘信息的暗背景光切片图像,利用这些切片图像,重建了弱吸收透明样品边缘轮廓骨架的三维图像。此外,还利用LED环形斜照明光源大照明数值孔径特点,使用小数值孔径物镜,实现了对弱吸收透明样品的暗场成像。由于空间非相干环形斜照明的横向可视化分辨率,仍不能达到单个斜照明沿照明方向的最大分辨率。因此我们在LED环形斜照明显微成像系统基础上,根据傅里叶切片定理,提出了基于强度约束迭代的综合孔径显微成像技术。利用LED对称斜照明,去除图像的相位对比度,获取多幅不同照明角度对称斜照明下的图像,再使用强度约束迭代的梯度下降优化图像重建算法,将多幅对称斜照明图像综合成一幅可视化分辨率各向同性的并具有单个斜照明最大分辨率的图像。实验表明使用大数值孔径物镜（NA=1.25,100倍）和照明波长520 nm的光源,提出方法可以分辨USAF标准分辨率测试板第11组第6个条形图案（条形或空隙宽度为137 nm）,比同等条件柯勒照明下的图像（可分辨分辨率板条形图案的条形或空隙宽度为218 nm）的分辨率有明显提升。此外,为了提高成像速度,在基于强度约束迭代的综合孔径技术的基础上,还提出了一种基于去卷积的快速分辨率增强技术,通过预先获取显微成像光学系统的卷积核函数,可以在LED环形斜照明下拍摄一幅图像,就可以通过去卷积获得一幅分辨率增强的图像。提出的综合孔径显微术,由于不涉及传统综合孔径成像需要的相位恢复,具有较强的鲁棒性,为明场显微分辨率增强提供了新思路。提出的空间非相干环形斜照明显微术,具有装置简单,操作简便等优点,且与广泛使用的柯勒照明显微镜具有很好的兼容性,便于大规模推广使用,有望在病理诊断等生物、医学领域获得广泛应用,具有重要意义。
关键词：明场显微镜;显微术;光切片;三维成像;分辨率增强
学科专业：生物医学物理与生物医学信息技术
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 光学显微术的发展现状
1.2 研究目的和意义
1.3 本文各章节主要内容
第二章 空间非相干环形斜照明显微成像特性的理论研究
2.1 横向分辨率和对比度特性分析
2.2 轴向分辨率特性分析
2.3 三维成像特性分析
2.4 本章小结
第三章 空间非相干环形斜照明显微镜光源与系统设计及搭建
3.1 LED环形斜照明光源设计
3.2 LED环形斜照明显微成像系统设计与搭建
3.3 本章小结
第四章 基于LED环形斜照明的明场显微光切片技术
4.1 LED环形斜照明显微成像特性的实验研究
4.2 生物样品单色显微光切片实验
4.3 生物样品彩色显微光切片实验
4.4 基于光切片的中心定位轴向超分辨技术
4.5 本章小结
第五章 基于LED环形斜照明的免染色透明样品显微成像技术
5.1 免染色透明样品的三维显微成像技术
5.2 免染色透明样品的暗场显微成像技术
5.3 本章小结
第六章 基于LED环形斜照明的综合孔径显微成像技术
6.1 LED对称斜照明显微成像特性研究
6.2 基于强度迭代的综合孔径图像重建算法
6.3 LED环形斜照明综合孔径显微成像实验
6.4 快速LED环形斜照明显微图像分辨率增强技术
6.5 本章小结
第七章 结论与展望
7.1 论文的主要内容及研究成果
7.2 论文的主要创新之处
7.3 研究展望
参考文献
致谢