论文题目：东南景天促生菌提高植物萃取镉效率及其机理研究
摘要：通过植物根系吸收和在地上部超量积累重金属,从而以收获植物地上部的方式清除或降低环境中重金属含量的植物萃取修复是一种有效、安全、环境友好的土壤修复技术。植物促生菌是指从根际土壤或植物体内分离的,具有多种促生特性的有益微生物。由于某些具有重金属耐性的植物促生菌能够促进植物对重金属的吸收、提高植物对重金属的耐性和植物萃取效率而引起了国内外的广泛关注。然而,植物促生菌对不同植物系统中重金属萃取效率的影响和机理仍不清楚。本文以我国原生镉（Cd）超积累植物东南景天和镉超富集植物油菜为研究材料,通过盆栽试验、溶液培养试验,综合利用植物生理学、基因组学、蛋白组学等分析方法,采用高通量测序、Real-Time PCR （RT-PCR）荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH）、绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）标记、同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ）等技术,探究植物促生细菌促进植物生长、提高植物对镉的吸收及积累的作用及其调控机理。取得的主要研究结果如下：1)采用盆栽试验,结合高通量测序分析技术,研究了不同镉水平人工污染的我国4种代表性土壤中,东南景天生长和内生菌群落结构的变化。结果发现：土壤性质和镉污染水平均显著影响东南景天的生长和内生菌群落结构。在pH较低的酸性红壤中,东南景天生长较差、镉积累浓度较高,微生物群落结构趋向简单,以不动杆菌、柄杆菌为主。而在碱性黑土中,东南景天生长较好、生物量大、镉积累浓度相对较低、微生物群落结构较复杂,以假单胞菌、不动杆菌占优。同一土壤不同镉处理下,内生菌的菌落结构也不同。在黑土与潮土中,低Cd处理下内生细菌的丰富度更高,而在水稻土与红壤中,高Cd处理下内生细菌菌落具有更高的丰富度。表明土壤性质和重金属浓度对超积累植物内生菌群落结构均有较强的选择性。2)分离鉴定了东南景天根际土壤和植物体内的促生菌,通过盆栽试验,比较了2种根际促生菌与2种内生促生菌对镉富集植物油菜生长和镉提取效率的影响。通过FISH和GFP技术,证明东南景天内生菌可以成功定殖到非宿主植物油菜中。接种上述促生菌,均能促进油菜的生长和对Cd的吸收,提高油菜Cd提取修复效率；然而内生菌的作用效果要优于根际菌,且不同种类内生菌的作用效应存在明显差异。本研究中,内生菌SaMR12不仅显著提高油菜对Cd的积累量（提高42.2%）,而且不会增加种子中Cd的含量,降低了Cd通过油菜籽进入食物链的风险,因此被选为后续研究的重要菌株。3)采用盆栽试验,研究了东南景天-油菜轮作系统与SaMR12对黑土、水稻土、潮土中镉萃取修复的影响。结果发现,东南景天-油菜对镉的萃取量为63.4-477.6 μg,以水稻土最高（477.6μg）；接种SaMR12可进一步提高植物对镉的积累量和修复效率（提高6-55%）,以黑土提高效果最优（提高55%）,并且显著提高了东南景天根际细菌群落多样性,而对油菜根际土壤细菌群落结构的影响不显著。说明植物促生菌是东南景天/油菜轮作系统萃取修复的有效调控手段。4)通过溶液培养试验,研究了在不同Cd浓度处理下,SaMR12对东南景天根系抗氧化系统的影响。结果发现,与未接菌的对照相比,SaMR12能够显著提高Cd胁迫下东南景天对Cd的积累量,但对根系抗氧化酶（SOD、CAT、POD）活性没有显著影响,这可能与东南景天抗氧化酶的活性对Cd水平的变化不敏感有关。然而,Cd处理水平和SaMR12能够显著影响根部MDA、ROS、GSH浓度和PER1、ATPS、GS和GSH1等相关基因的表达。表明SaMR12通过增加GSH浓度和相关基因表达,降低H202的浓度和根部损伤,缓解植物氧化胁迫,从而提高植物对Cd的吸收和积累。5)通过溶液培养试验,研究了在不同浓度Cd处理下,SaMR12对东南景天金属离子吸收和三种相关转运蛋白家族基因表达的影响。结果表明,在低浓度的Cd处理时,SaMR12能够增加植物地上部Fe、Zn和Cd的含量,提高SaIRT1、 SaHMA2和SaNRAMP3在地上部的表达水平,提高SaHMA2, SaNARMP1在根部的表达水平；在高浓度Cd处理下,SaMR12能够增加叶片叶绿素的浓度和地上部Fe、Mg的含量,提高SalRT1、SaZIP3、SaHMA2、SaHMA3和SaNRAMP6在地上部的表达水平,以及SaIRT1、SaZIP3、SaHMA3、SaNARMP6在根部的表达水平。说明在无Cd胁迫的条件下,SaMR12能够提高一些转运基因的表达从而增加植物对必需元素和Cd的吸收；而当植物处于Cd胁迫时,SaMR12可通过促进植物吸收Fe和Mg,调控金属转运基因的表达来促进植物生长,提高植物对Cd的吸收积累。6)通过盆栽实验,利用iTRAQ技术研究了促生菌剂对东南景天地上部蛋白质组的变化。在对照和接种促生菌剂组筛选到67个差异蛋白,其中上调40个,下调27个；在对照与原生态东南景天组筛选到230个差异蛋白,其中上调113个,下调117个,两组共同的上调蛋白15个,下调蛋白13个。差异蛋白主要参与核糖体途径、光合作用、氧化磷酸化、谷胱甘肽代谢等过程,说明促生菌能够影响植物体内一系列相关的代谢过程。以上结果表明,促生菌对植物重金属提取的促进作用不仅是这些代谢过程相互作用的结果,而且可能是东南景天长期适应重金属胁迫、产生超量积累重金属的原因之一。
关键词：重金属;促生菌;植物萃取;轮作;群落结构;氧化胁迫;转运蛋白;蛋白表达
学科专业：植物营养学
致谢
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1 植物萃取修复土壤重金属研究现状
1.1 植物萃取修复技术的兴起
1.2 植物萃取修复的限制因素
1.3 促进植物修复的措施
2 促生菌-植物互作在土壤重金属修复中的应用
2.1 植物促生细菌的研究
2.2 促生菌促进植物修复的机理
2.3 植物促生菌群落结构研究
3 组学技术在促生菌-植物联合修复中的应用
3.1 基因组学
3.2 转录组学
3.3 蛋白质组学
4 本研究的意义、内容和技术路线
4.1 研究意义
4.2 主要研究内容
4.3 研究技术路线
第二章 不同土壤类型对超积累东南景天内生菌群落结构的影响
1 引言
2 材料与方法
2.1 土壤
2.2 植物材料
2.3 土培实验
2.4 植物收获与样品分析
2.5 东南景天内生细菌群落结构分析
2.6 数据统计分析
3 结果与分析
3.1 不同土壤类型对东南景天生物量的影响
3.2 不同土壤类型对东南景天Cd含量与积累量的影响
3.3 植物内生细菌群落结构分析
4 讨论
5 结论
第三章 不同促生菌对油菜生长与镉吸收积累的影响
1 引言
2 材料与方法
2.1 重金属耐性植物促生菌的分离
2.2 促生菌的分子鉴定
2.3 测定促生菌的促生特性
2.4 促生菌的重金属耐性和抗生素耐性
2.5 镉污染土壤的准备
2.6 盆栽试验
2.7 细菌定殖检测(FISH)
2.8 细菌定殖检测(GFP)
2.9 重金属转运系数,生物富集系数
2.10 数据分析
3 结果
3.1 促生菌的分离
3.2 促生菌的分子鉴定
3.3 促生菌的促生特性、重金属和抗生素耐性
3.4 促生菌对油菜开花期生长和镉吸收的影响
3.5 促生菌对油菜成熟期生长和镉吸收的影响
3.6 叶片SPAD值
3.7 促生菌定殖测定
3.8 促生菌对镉TF及BAF的影响
4 讨论
5 结论
第四章 促生菌对典型土壤镉污染下油菜/东南景天萃取修复效率的影响
1 引言
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.2 实验设计
2.3 植物收获与生物量测定
2.4 土壤重金属有效性及总量测定
2.5 植物氮磷钾含量测定
2.6 植物重金属含量测定
2.7 根际土壤DNA提取及高通量测序
2.8 数据统计分析
3 结果与分析
3.1 不同土壤中有效性重金属及总量的变化
3.2 不同处理对植物生物量的影响
3.3 不同处理对植物氮磷钾含量的变化
3.4 不同处理对植物重金属含量及积累量的影响
3.5 不同处理对根际土壤微生物群落结构的影响
4 讨论
4.1 不同土壤对镉生物有效性的影响
4.2 内生菌SaMR12对植物生长及氮磷钾吸收的影响
4.3 内生菌SaMR12及轮作对镉植物修复的影响
4.4 内生菌SaMR12对植物根际细菌群落结构的影响
5 结论
第五章 促生菌通过减轻氧化胁迫提商东南景天的镉积累
1 引言
2 材料和方法
2.1 植物收集和培养
2.2 实验设计
2.3 镉含量测定
2.4 质膜完整性与丙二醛浓度的测定
2.5 ROS含量的测定
2.6 抗氧化酶的测定
2.7 GSH的测定
2.8 GFP定位
2.9 基因表达水平分析
2.10 数据分析
3 结果
3.1 内生菌SaMR12在根部的定殖
3.2 东南景天Cd浓度与积累量
3.3 质膜完整性的测定和MDA含量
3.4 Cd和SaMR12处理对ROS的影响
3.5 抗氧化酶(SOD、CAT、POD)和GSH
3.6 抗氧化物与GSH相关基因表达水平
4 讨论
5 结论
第六章 促生菌通过调节转运蛋白基因表达增强金属离子吸收
1 引言
2 材料和方法
2.1 实验设计
2.2 细菌定殖的测定
2.3 金属浓度的测定
2.4 转运因子测算
2.5 光合色素的测定
2.6 RNA提取和cDNA合成
2.7 转运蛋白基因转录水平分析
2.8 数据统计
3 结果
3.1 SaMR12在东南景天根部的定殖
3.2 东南景天的Cd浓度、积累及转运系数
3.3 Cd和SaMR12对植物金属离子浓度的影响
3.4 Cd和SaMR12对叶绿素浓度的影响
3.5 Cd和SaMR12对金属转运蛋白基因转录水平的影响
4 讨论
5 结论
第七章 促生菌对重金属污染下东南景天蛋白表达的影响
1 引言
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.2 实验设计
2.3 生物量测定
2.4 重金属含量测定
2.5 蛋白质提取
2.6 iTRAQ实验
3 结果与分析
3.1 接种处理对东南景天生物量的影响
3.2 接种处理对东南景天重金属含量的影响
3.3 蛋白质组数据分析
4 讨论
4.1 促生菌对东南景天生物量及重金属含量的影响
4.2 促生菌对东南景天蛋白表达的影响
5 结论
第八章 综合结论、创新点与研究展望
1 综合结论
2 主要创新点
3 研究展望
参考文献(REFERENCES)