制备型高效液相色谱法

制备型高效液相色谱法（精选8篇）

制备型高效液相色谱法 第1篇

关键词：制备型高效液相色谱法,马钱苷,山茱萸

山茱萸 (Cornus officinalis Sisb.Et Zucc.) 又名枣皮, 是山茱萸科山茱萸的干燥果肉, 具有降低血压、抗氧化、抗癌的功效, 可以补益肝肾, 涩精固脱, 其有效成分为马钱苷、熊果酸等[1]。山茱萸主要分布在陕西、河南、四川等地[2]。

马钱苷是一种萜苷类化合物, 在调节免疫, 预防心血管疾病方面具有有效作用[3,4]。鉴于现行2010版《中国药典》以马钱苷作为含量测定指标, 以控制山茱萸药材质量, 且目前关于提取分离马钱苷的文献报道鲜少, 制备型高效液相色谱 (Pre-HPLC) 作为一种高效的分离纯化技术, 有着分离效率高、单次分离时间短等优点。为更深层次利用山茱萸等中药材, 控制相关药品质量, 我们采用Pre-HPLC法, 运用本实验室装填的动态轴向压缩色谱柱, 从中药山茱萸中分离高纯度的马钱苷。

1 实验方法

1.1 仪器

制备型高压高效液相色谱柱 (ID63×630 mm) 、动态轴向加压液压站:聊城万合工业制造有限公司;

制备高压输液泵:GLP3250;

紫外—可见检测器:UC-3292;

Rheodyne3725i六通进样阀 (配5 m L定量环) ;

色谱工作软件及电脑。

高效液相色谱仪, 高速离心机, 旋转蒸发仪。

1.2 试剂与试药

二次重蒸水;

甲醇, 乙腈 (均为工业级, 使用前先经过整流处理再用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤) ;

薄层色谱硅胶、柱色谱硅胶、球形硅胶 (富士硅化学有限公司) ;

大孔吸附树脂;

山茱萸药材, 购自河南;

马钱苷对照品 (99%含量) 。

1.3 样品的处理

将山茱萸药材粉碎, 称取粉末4 kg, 加入6倍量的95%乙醇浸泡24 h, 回流提取2次, 每次2 h, 滤过, 合并滤液, 滤液回收乙醇, 减压浓缩至无乙醇味。浓缩液用离心机以10 000 r/min的转速离心3 min, 取上层澄清液, 即为山茱萸提取液。

1.4 大孔树脂富集苷类

取大孔吸附树脂1 kg, 乙醇浸泡3 d, 倾去上浮物, 湿法装柱。用乙醇清洗, 至流出液与水混合不呈现白色乳浊现象即可, 然后用大量蒸馏水清洗柱中乙醇, 水浸泡备用。将1.3节山茱萸提取液吸附于大孔树脂柱, 用6 000 m L蒸馏水、30%乙醇约15 000 m L依次洗脱, 将乙醇洗脱部分浓缩, 浸膏备用。

1.5 硅胶柱色谱纯化

硅胶 (100～200目) 2 kg, 湿法装柱, 取1.4节所得浸膏与等量硅胶的拌料, 上样, 柱色谱分离, 用氯仿—甲醇溶剂系统以体积比15∶1, 12∶1, 9∶1, 6∶1, 3∶1梯度洗脱, 收集氯仿—甲醇9:1的馏分, 减压浓缩后过滤, 得白色固体。

1.6 高效型液相色谱纯化

液相色谱制备条件:球形硅胶填料 (ID63×630 mm) ;流动相:甲醇—水 (体积比38∶62) ;流速:150 m L/min;检测波长:236 nm。

称取2 kg硅胶加入3 000 m L甲醇, 搅拌30 min脱气, 将搅拌好的硅胶缓慢注入柱体内, 沉降30 min, 装好柱头密封元件, 轴向加压压缩柱床至出液管无液体流出。将1.5节所得白色固体溶解于甲醇—水 (38∶62) 中, 抽取10～15 m L经针式滤膜过滤, 舍初滤液, 续滤液收集至洁净容器中备用。手动进样针进样。收集保留时间为7.5 min的组分。马钱苷的制备高效液相色谱图如图1所示。收集液干燥后得白色晶体。

2 结果测定

2.1 结构确定

马钱苷:白色晶体, 易溶于甲醇、水。13C-NMR (500 MHz, CD3SOCD3) δ:168.245 (11-C) , 150.985 (3-C) , 112.856 (4-C) , 97.526 (1’-C) , 96.459 (1-C) , 75.896 (5’-C) , 75.125 (3’-C) , 73.985 (7-C) , 72.563 (2’-C) , 69.103 (4’-C) , 60.142 (6’-C) , 51.871 (12-C) , 44.328 (9-C) , 39.523 (6-C) , 39.103 (8-C) , 29.623 (5-C) , 10.985 (10-C) , NMR数据与文献报道[5]一致, 结构确定为马钱苷。

2.2 定性测定

将所得的马钱苷在硅胶板上点样, 马钱苷对照品溶液作对照, 氯仿—甲醇为展开剂, 晾干, 硫酸溶液为显色剂, 吹风机吹干, 马钱素样品为与对照溶液相同的紫红色斑点, Rf值为0.52。马钱苷薄层色谱对照图如图2所示。

2.3 定量测定

将马钱苷对照品准确称取5 mg, 用甲醇配制成0.05 mg/m L的溶液100 m L, 作为对照品溶液。

精密称取制得的马钱苷单体25 mg, 加甲醇—水盐酸 (体积比30∶70) 混合液25 m L, 转移至50 m L量瓶中, 用甲醇稀释至刻度, 用微孔滤膜 (0.5μm) 滤过待用。

高效液相色谱分析条件:C18 (ID4.6×250 mm) ;流动相:甲醇—水 (体积比30∶70) ;流速:1.0 m L/min;检测波长:236 nm。在此色谱条件下, 马钱苷对照品为一个主峰, 归一化面积百分比达98%以上, 马钱苷对照品的高效液相色谱图如图3所示。

3 结语

现代研究表明, 马钱苷为山茱萸中的主要活性成分, 为药典[2]中控制其药材质量以及相关中成药质量的指标成分。用上述制备方法进行提取、分离、纯化, 操作方便, 重现性好, 符合对照品的纯度要求, 因而可作为对照品使用。

根据山茱萸中主要活性成分———马钱苷的理化性质, 在提取纯化工艺中, 采用大孔吸附树脂精制苷类, 大大提高了马钱苷的富集量, 除去大量杂质。富集后的样品通过硅胶柱色谱进一步分离纯化, 可得到马钱苷粗品。粗品通过制备型高效液相色谱再次处理纯化, 从核磁共振谱图、薄层色谱、分析型高效液相色谱图, 可确定样品结构, 纯度符合标准, 可作为对照品。

参考文献

[1]国家中医药管理局中华本草编辑委员会.中华本草, 1999

[2]国家药典委员会编.中华人民共和国药典 (1部) .北京:化学工业出版社, 2010

[3]谢宗万.全国中草药汇编 (上册) .北京:人民卫生出版社, 1975

[4]孙文基, 谢世昌主编.天然药物成分定量分析.北京:中国医药科技出版社, 2003, 1

高效液相色谱法测定烟草上的噻森铜 第2篇

关键词：噻森铜；高效液相色谱；烟草

中图分类号： O657.7+2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0284-03

收稿日期：2014-03-07

基金项目：贵州省重大科技专项（编号：20136024）；贵州省农业攻关项目（编号：20083053）。

作者简介：李智宁（1987—），男，河南开封人，硕士研究生，从事农药残留分析与环境毒理研究。E-mail：aning072@126.com。

通信作者：胡德禹，研究员，硕士生导师。Tel：（0851）8292170；E-mail：gzu_dyhu@126.com。噻森铜[N，N′-甲撑-双（2-氨基-5-巯基-1，3，4-噻二唑）铜]是我国自主创制的噻二唑类有机铜杀菌剂，是农业部全国农技中心重点推荐农药品种之一。其结构式见图1。其熔点300 ℃（分解），20 ℃时不溶于水，不溶于一般的有机溶剂，只微溶于吡啶、二甲基甲酰胺，遇强碱分解，在酸性条件下稳定。由于其结构由噻唑基与铜离子2 个基本基团组成，故有着特殊的作用机制 [1]。因此，噻森铜防治作物细菌性病害和真菌性病害具有高效广谱，低毒安全、环保无公害，不易产生抗性及持效期长等优点[2]

目前国内外对噻森铜的研究主要集中在田间药效[3-4]及杀菌活性[5]，对其残留分析的研究未见报道，为此查阅了一些与其结构相似的噻二唑类杀菌剂（噻菌铜/噻枯唑[6-11]）的残留分析方法，如采用硫化钠溶液水解，XAD-7树脂富集提取，柱层析纯化，液相色谱检测[6-7]；硫化钠溶液和甲醇提取，乙酸乙酯净化，液相色谱检测[8-9]；乙酸乙酯和二甲基甲酰胺混合液振荡提取，离心净化，液相色谱检测[11]。采用硫化钠衍生易产生对环境危害的副产物，且柱层析净化耗时较长，成本较高。鉴于此，建立新颖的，对环境友好的噻森铜残留检测方法十分必要。故本研究拟建立高效液相色谱法检测噻森铜在烟草中的残留，旨在为噻森铜在烟草上及其他农作物上安全使用提供参考。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

1.1.1主要仪器Agilent 1100 高效液相色谱仪（配DAD检测器）；涡旋混合仪（QL-901，其林贝尔仪器制造公司生产）；旋转蒸发仪（RE-2000/2000A，上海亚荣生化仪器厂生产）；氮吹仪（N-EVAPTM，上海安谱科学仪器有限公司生产）；水浴恒温振荡器（SHZ-A，上海博讯实业有限公司生产）；循环水式多用真空泵（SHB-Ⅲ，郑州长城科工贸易有限公司生产）。

1.1.2试剂甲醇（分析纯、色谱纯），乙腈（色谱纯），乙酸乙酯、二甲基甲酰胺、冰乙酸、盐酸、氢氧化钠、硫代硫酸钠、碳酸钾和硫化钠均为分析纯；超纯水，硅藻土Celite545，无水硫酸钠（450 ℃ 烘烤4 h，于干燥器中保存）；噻森铜标准品（纯度95.6%，浙江东风化工有限公司提供）；2-氨基-5-硫基-1，3，4-噻二唑（AMT）标准品（纯度98.0%，购于北京百灵威有限公司）。

1.2试验方法

1.2.1样品的提取和净化衍生和提取：称取10.0 g烟叶样品置于150 mL锥形瓶中，然后加入50 mL 0.5 mol/L硫代硫酸钠溶液，在60 ℃ 恒温水浴中，衍生反应振荡提取2 h，取出冷却至室温，准确量取40 mL提取液于50 mL离心管中，待净化。

净化：在上述离心管中加入6 g NaCl，以及2.0 mol/L NaOH使得溶液pH至12～13，待絮状物杂质析出，并于 6 000 r/min 离心5 min，将上清液转入125 mL分液漏斗中，再用40 mL含2%乙醇的三氯乙烯溶液预萃取1次，弃去下层有机相，上层用1.0 mol/L HCl调节pH至3～4，用50、40 mL 乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，过无水硫酸钠，浓缩至近干，N2吹干，甲醇定容至1 mL，过0.45 μm滤膜，待HPLC检测。

1.2.2色谱检测条件分别对色谱柱A：Eclipse XDB-C18，ZORBAX SB-C18，Phenomenex kinetex XB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm） 和色谱柱B：Phenomenex C18/NH2，Lichrospher C18/CN/C8 （250 mm×4.6 mm，5 μm ）进行筛选，同时改变流动相乙腈与0.1%乙酸水的体积比，确定最佳流动相。

2结果与分析

2.1色谱条件的选择

2.1.1检测波长的选择采用DAD检测器对噻森铜衍生化产物标准溶液（AMT，125 μg/mL）进行全波长扫描（扫描范围210～400 nm），从而得到AMT的吸收波长和响应值之间的紫外吸收光谱图（图2），可见AMT的最大吸收峰出现在312～314 nm处。因此，确定AMT的最佳检测波长是313 nm。

2.1.2色谱柱的选择由图3可知，色谱柱A色谱柱短，响应值较大，出峰时间早，分析时间快，但是烟草基质复杂，会有杂质影响。图4显示，色谱柱B（Phenomenex C18 色谱柱）响应值较大，出峰时间合适，峰形尖锐，对称性好，与杂质峰分离效果较好。故本研究最终选择 Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm ） 色谱柱。

nlc202309040105

2.1.3流动相的选择AMT分子巯基上的质子可以电离，并测得其电离常数Ka=1.8×10-7，其溶液呈微酸性[12-13]；在水中的溶解度较小，但随温度的增加而增加，AMT水溶液的pH=3.9，AMT乙醇溶液的pH=4.6[14]；故本研究选择乙腈与乙酸水溶液作为流动相的组成溶剂，使流动相呈现一定的酸性，在实验中多次改变乙腈与乙酸水溶液的比例，最终确定了流动相为乙腈-0.1%乙酸水（17.5 ∶82.5，体积比），此时获得的峰形较好。

2.2噻森铜标准曲线

用电子天平称取0.026 1 g 噻森铜标准品于100 mL容量瓶中配制为250 mg/L的标准样品溶液备用。将250 mg/L的噻森铜标准样品溶液用甲醇稀释配得1.0、2.5、5.0、10.0、

25.0、50.0 mg/L系列标准溶液，按照“1.2.2”节中样品前处理步骤进行噻森铜标样衍生化，每个浓度重复3次，以噻森铜标准溶液浓度（x）与色谱峰面积（y）作标准曲线，浓度在2.5～50 mg/L线性范围内，线性方程为：y=31.812 0x-35.122 0，相关系数（r）=0.999 8。

2.3方法的准确度与精密度

取空白烟叶样品，添加不同浓度噻森铜标样，每个浓度设5次重复，按照“1.2.2”节的测定步骤进行添加回收率试验，另设空白对照。测定结果见表1，结果表明噻森铜在烟叶样品添加水平为0.5～50.0 mg/kg时，回收率分别为75.92%～107.40%，RSD为0.94%～7.55%。试验结果均符合农药残留分析要求。表1噻森铜在烟叶中的添加回收率（n=5）

噻森铜添加水平

（mg/kg）添加回收率（%）ⅠⅡⅢⅣⅤ平均RSD

（%）0.575.9280.5088.0784.8587.6183.396.172.578.8880.4080.0078.6779.8479.550.945.099.3296.98107.4093.5993.5198.165.8250.085.32102.9089.1790.8387.8091.227.55

2.4最低检出限和最低检测限

在建立的色谱分析条件下，外标法定量，以3 倍信噪比（S/N=3）确定仪器的最低检出限，结果表明，本研究建立的检测方法，噻森铜的最低检出限为1.8 ng。噻森铜在烟草样品中的最低检测限为0.5 mg/kg。烟叶空白样品（CK）、添加样品（TJ）和标准样品（BY）谱图如图5所示。

3结论

试验结果表明，采用高效液相色谱和紫外检测器建立的烟草中噻森铜残留分析方法，噻森铜最低检出限为1.8 ng，噻森铜在烟草样品中的最低检测限为0.5 mg/kg，满足国家标准或行业标准的检测要求，同时该方法经济、安全，有机溶剂用量较小，操作简单，杂质干扰较少，准确度高，重现性好，能保证检测分析数据的可靠性。

参考文献：

[1]陈春雨. 农药新品种——噻森铜 二氰·锰锌[J]. 新农业，2011（7）：47-47.

[2]张纯标，梁帝允，王体祥，等. 新颖杀菌剂——噻森铜[J]. 世界农药，2007，29（2）：53-54.

[3]章瑶，王梅，张勇，等. 20%噻森铜悬浮剂对水稻细菌性病害的田间药效研究[J]. 现代农业科技，2006（19）：67.

[4]何荣林，邢家华，张纯标，等. 20%噻森铜悬浮剂防治水稻白叶枯病田间试验[J]. 现代农药，2007，6（2）：44-45.

[5]邢家华，何荣林. 噻森铜对水稻白叶枯病和细菌性条斑病室内杀菌活性[J]. 农药研究与应用，2007，11（4）：31-32.

[6]赵善仓，邓立刚，赵领军，等. 反相高效液相色谱法测定冬枣中噻菌铜的农药残留[J]. 农药，2007，46（8）：555-556.

[7]毛江胜，邓立刚，李增梅，等. 高效液相色谱法测定西瓜中残留的噻菌铜[J]. 分析测试學报，2007，26（5）：752-753.

[8]傅新文，陈红梅，张滨. 噻菌铜在土壤中消解动态研究[J]. 网络财富，2010（11）：192-193.

[9]胡秀卿，李振，郭钤，等. 烟草中噻菌铜残留量检测[J]. 浙江农业科学，2010（6）：1389-1390.

[10]蒙缔亚，任立伟，覃章兰. 高效液相色谱法测定20%增效噻枯唑可溶性粉剂中噻枯唑含量[J]. 分析科学学报，2001，17（2）：131-134.

[11]王志新，鹿泽启，徐维华，等. 叶枯唑在桃和土壤中的残留分析[J]. 安徽农业科学，2012，40（14）：8116-8117，8142.

[12]Domaglina L，Przyborowski. Uber die verwendbarkeit von 2-amino-1，3，4-thiadiazol-5-thiol in der analyse[J]. Zeitschriftfür Analytische Chemie，1965，207：411-414.

[13]Joshi S R，Gupta C B，Tandon S N. 2-Amino-5-mercapto-1，3，4-thiadiazole as an analytical reagent for the gravimetric determination and extraction of mercury（Ⅱ）[J]. Acta Chimica Academiae Scientiarum Hungaricae，1973，37：2429-2434.

[14]武海顺，许小红，马文瑾，等. AMT异构体互变机理的理论研究[J]. 物理化学学报，2003，19（5）：408-413.

制备型高效液相色谱法 第3篇

石杉碱甲治疗指数很高[7,8,9], 但在天然产物中的含量很低。传统的提取工艺是将生药通过溶剂萃取, 上柱层析分离, 重结晶等工序, 所要求的技术含量高, 要经过多次层析, 反复重结晶, 才能达到较高纯度, 产量低, 条件不易控制, 周期长, 成本高。本文采用制备型高效液相色谱分离了石杉碱甲, 分离工艺简单, 提取率高, 所得石杉碱甲质量分数较高 (90%以上) , 为进一步利用制备型高效液相色谱法工业规模生产石杉碱甲提供了实验依据。

1 实验部分

1.1 仪器

高效液相色谱仪含GLP3250泵, 可更换泵头2个 (250 m L) , GLP色谱工作软件, UC-3292检测器;超声清洗机, p H测定仪。

1.2 试剂与试药

氯仿, 甲醇, 氨水, 硫酸, 氢氧化钠, 纯水 (均为分析纯) ;石杉碱甲对照品 (99.1%含量) ;千层塔来源于重庆, 经鉴定符合中华人们共和国药典 (2010版) 的规定。

1.3 色谱条件

分析条件:色谱柱 (ID4.6×250 mm, C18, 粒径5μm) ;流动相:甲醇—水 (85∶15) ;流速:1 m L/min;检测波长:231.3 nm;进样体积10μL。

制备条件:色谱柱 (ID63×700 mm, Diamonsil C18, 粒径25~40μm) ;流动相:氯仿—甲醇—氨水 (840∶24∶1.2) ;流速:40 m L/min;检测波长:311 nm;进样体积5 m L。

1.4 样品的处理

取药材粉碎, 过20目筛, 取干燥的千层塔粗粉1.6 kg, 加入10倍体积的p H为1的硫酸溶液, 浸泡12 h, 超生浸提几分钟, 提取几次, 合并酸液;加氢氧化钠溶液调p H至9, 再加氯仿反复提取, 并浓缩至膏。

1.5 石杉碱甲的制备

将按照1.4节方法制备的石杉碱甲固体提取物用制备色谱的流动相配制成体积为10 m L的溶液, 用孔径为0.45μm的滤膜过滤, 作为制备液。在1.3节制备色谱条件下开机, 待基线稳定后进样, 收集相应馏分, 经蒸发浓缩, 结晶即可, 得石杉碱甲晶体。

1.6 制备样品的质量分数测定

精密称取按照1.5节制得的石杉碱甲2 mg, 用分析色谱流动相定容于10 m L容量瓶中。按照石杉碱甲含量测定方法[10]对所制得的样品进行石杉碱甲纯度检测, 符合质量要求。

2 结果与讨论

2.1 流速对分离石杉碱甲的影响

将分析型液相色谱按比例扩大为制备型液相色谱时, 尽可能使制备柱的固定相类型、溶剂组分等方面与分析柱保持一致, 通常柱长保持大体相同, 以增加柱径来达到更大的柱容量, 这样, 只考虑流速问题, 可以从下面关系近似得到最大流速:

根据石杉碱甲制备条件中流速大小[11], 结合上式, 计算得出大流速为79.38 m L/min。

称取粉碎干燥的千层塔粗粉1.6 kg (共7份) , 按照1.4和1.5节操作, 以氯仿—甲醇—氨水 (840∶24∶1.2) 为流动相, 考察不同流速对石杉碱甲分离效果的影响, 结果如表1。

由表1可知:随着流速的增大, 石杉碱甲的保留时间逐渐减小, 分离度降低, 柱压升高;随着流速减小, 保留时间延长, 分离度增大。但流速太小时, 保留时间过长, 且色谱峰变宽。流速的变化对石杉碱甲纯度的影响不是很大, 所以为了缩短分离时间, 且保持良好的分离度, 选择流动相的流速为40 m L/min。

2.2 进样质量浓度对分离石杉碱甲的影响

分别称取粉碎、过筛、干燥的千层塔粗粉1 000、1 200、1 400、1 600、1 800 g, 按1.4和1.5节操作, 考察进样质量浓度对分离石杉碱甲的影响, 结果如表2。

由表2可知:随着进样质量浓度增大, 保留时间逐渐增大, 分离度降低, 洗脱时间延长, 所得石杉碱甲的质量分数降低;进样质量浓度低时分离度较高, 洗脱时间较短, 所得石杉碱甲的质量分数较高, 但生产效率下降。为保证所制石杉碱甲既有较高的质量分数, 又有较高的生产效率, 选择进样质量浓度为160 g (生药材) /m L。

2.3 进样量体积对分离石杉碱甲的影响

称取粉碎、过筛、干燥的千层塔粗粉1 600 g (共6份) , 按1.4节操作, 得6份石杉碱甲固体提取物, 分别用制备色谱条件中的流动相配置成体积为2、3、4、5、6、7 m L的制备样品溶液, 用孔径为0.45μm的滤膜过滤, 得制备液。按1.3节条件进行纯化分离, 考察了进样质量体积对分离石杉碱甲的影响, 结果如表3。

由表3可知:随着进样体积增大, 石杉碱甲质量分数先增大又减小, 分离度先增大后减小, 保留时间逐渐增大, 当进样体积>7 m L后, 色谱分辨率降低, 洗脱时间延长, 所得冬凌草甲素的质量分数降低。进样体积不能太小, 否则色谱分辨率太低, 冬凌草甲素的质量分数降低。综合考虑, 要分离制得质量分数高的产品, 进样体积为5 m L较好。

2.4 石杉碱甲质量分数测量结果

按照上述2.1~2.3确定的条件分离制备了8批石杉碱甲样品, 按照1.6节条件测定其质量分数, 结果见表4, 表中数据均为3次测定结果的算术平均值。

由表4可知, 采用制备型高效液相色谱法所制得的石杉碱甲的质量分数较高, 均能达到Huperzine A的纯度>90%的技术要求。

3 结语

用制备型高效液相色谱法制备分离石杉碱甲, 1.6 kg千层塔可以得到近320 mg的Huperzine A, 重复性好, 产品纯度达到了技术要求。本方法成本低, 可为工业化生产工艺提供参考。

参考文献

[1]WANG YE, YUE DX, TANG XC.Anti-cholinesterase activity0f huperzine A[J].Acta Pharmacol Sin.1986, 7 (2) :110～113

[2]Eladia M, Pena-Mendez.Huperzine A:prospective prophylactic antidote against organopHospHate nerve agenta.Capillary Elec-trop Horesis determination.Rocnikb Lxxii, 2003, 1:5

[3]王月娥, 岳冬贤, 唐希灿.石杉碱甲的抗胆碱酯酶的作用[J].中国药理学报, 1986, 7 (2) :110

[4]程源深.石杉碱甲治疗重症肌无力症侯28例[J].新药与临床, 1986, 5:197

[5]朱晓东, 唐希灿.石杉碱甲和乙促进小鼠的空间辨别学习和记忆[J].药学学报, 1987, 22 (11) :812

[6]马其云, 金人慈, 王小琴.石松目植物主要元素含量变化与分类群关系的研究[J].军事医学科学院院刊, 1991, 2 (15) :107

[7]查胜华, 李秀男, 孙海虹.Ultrasonic extraction of huperzine A and Huperzine B from Huperzia serrata.天然产物研究与开发, 2005, 17:7～10

[8]唐希灿.石杉碱甲对离体小鼠神经肌肉接头递质传递的易化作用.中国药理学学报, 1996, 17:481～484

[9]陈执中.老年痴呆症防治新药研究进展[J].中国药学杂志, 1997, 32:260～263

[10]杨明, 姚志伟, 赵毅民.HPLC法测定石杉科植物中石杉碱甲 (Huperzine A) 的含量[J].军事医学科学院院刊, 2000, 2 (24) :123

高效液相色谱法测定茶叶中多酚 第4篇

云南文山地区发现一种野生茶树,为探明其利用价值,本文取8种云南不同产地的茶叶与其对比实验测定其中茶多酚含量。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

Agilent 1100液相色谱包括:紫外二极管阵列检测器色谱工作站自动进样器,四元梯度泵,Milli-Q 50高纯水处理器(美国Millipore公司)。儿茶素(C)、表没食子酸儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)、表没食子基儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、绿原酸(Chlorogenicacid)、芸香苷(Rutin)标准品均购自Sigma和Fluka公司,纯度高于99%。甲醇、乙酸均为色谱纯试剂,实验用水为高纯水。

1.2 色谱条件

色谱柱:AgilentZORBAX SB-C 18液相色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)。流动相为甲醇(B),0.5%醋酸(D)水溶液,按0min(B 18%+D 82%),4min(B 18%+D 82%),15min(B 30%+D70%),20min(B 80%+D 20%),28min(B 80%+D 20%),30min(B 20%+D 80%)梯度条件(均为体积分数),流速为1mL/min,进样体积为20μL,上述色谱条件下选择的检测波长为278nm。

1.3 实验方法

本实验采用了两种前处理方法进行比较。

1.3.1 索氏提取法

茶叶样品粉碎过180μm(80目筛),称取0.2000g,加入70%乙醇40mL,于80℃水浴条件下蒸馏1h,过滤并定容到50mL。用0.45μm针头过滤器过滤,进样20μL分析。

1.3.2 超声提取法

茶叶样品粉碎过180μm(80目筛),称取0.2000g,加入70%乙醇40mL,保持30℃恒温提取24h,分别在0h,6h和24h时间点上超声20min,过滤并定容到50mL。用0.45μm针头过滤器过滤,进样20μL分析。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线、相关系数及检测限

分别配制质量浓度为100.0、50.0、25.0、5.0、1.0mg/L标准溶液,进样后根据浓度和峰面积,计算出回归方程。根据信噪比S/N=3,测得各组分的检出限,结果见表1。

注:A为峰面积(peakarea);C为质量浓度(concentration),mg/L

2.2 回收率实验及精密度

准确称取文山野生茶2份,其中1份加入已知量的多酚标样。将两份样品在相同条件下测定5次,通过加入多酚的测出量计算回收率,并计算其RSD,结果见表2。

2.3 样品分析结果

茶叶样品按以上中的样品前处理过程处理进样分析,索式提取结果见表3,超声提取结果见表4。

%

注:“-”指在该样品中未检出

%

注:“-”指在该样品中未检出

3 结论

采用索氏提取法及超声提取法两种方法对茶叶中多酚进行提取,结果表明,超声提取法对绿原酸、EGCG、EC、ECG等的提取率比索氏提取法要高。在比较9种茶叶样品的多酚含量时得出如下结论,七子青饼中茶多酚总的含量相对较高,逸神越陈越香中茶多酚总的含量相对较低。文山野生茶中绿原酸的含量相对较高。

参考文献

[1]魏泱,丁明玉.茶多酚的色谱分析法[J].色谱,2001,18(1):35-38.

[2]姚林,王广增.茶多酚的抗肿瘤研究[J].肿瘤防治研究,1995,22:123-126.

高效液相色谱法测定水中莠去津 第5篇

1 材料方法

1.1 仪器与试剂

waters 600型高效液相色谱仪,KD浓缩器;莠去津标准溶液(100μg/ml,农业部环境保护科研监测所);甲醇为色谱纯;二氯甲烷、无水硫酸钠为优级纯;超纯水、乙醚、石油醚、氯化钠均为分析纯。

1.2 色谱条件

改进后方法检测波长:254nm;柱箱温度:40℃;流动相配比:甲醇∶水=5∶1;流动相流速:1.2ml/min;进样量:10μl。原方法:检测波长:254nm;柱箱温度:40℃;流动相配比:甲醇∶水=5∶1;流动相流速:0.9ml/min;进样量:10μl。

1.3 莠去津标准系列

分别取100μg/ml的莠去津标准储备溶液0.0、0.05、0.1、0.5、1.0、3.0、5.0ml于100ml容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配成浓度分别为0.0、0.05、0.1、0.5、1.0、3.0、5.0μg/ml的标准系列,过0.45μm滤膜。

1.4 样品处理

取100ml水样于250ml分液漏斗中,加入5g氯化钠,溶解后加人20ml二氯甲烷分两次萃取,转移出有机相,合并。萃取液经过无水硫酸钠脱水后,于KD浓缩器浓缩至近干,再用高纯氮气将其刚好吹干,用甲醇定容至1ml,过0.45μm滤膜,供色谱分析用。

1.5 样品测定

按1.2色谱条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 流动相流速的优化

本实验以GB/T 5750-2006为基础,但应用于waters 600型高效液相色谱仪,色谱峰出现拖尾现象,通过反复摸索性实验,最终确定流动相流速在1.2ml/min时,样品中莠去津分离效果最佳,且峰型良好(见图1、图2),重复性良好。

2.2 标准曲线

以流速为1.2ml/min时,分别测定不同浓度的莠去津标准溶液。以测得峰面积做曲线(图3),进行回归计算。结果显示,莠去津浓度在0.05～5.0μg/ml范围内,线性良好(r=0.999 3)。

2.3 精密度、回收率的确定

经过6次测定,结果相对标准偏差为1.41%。水样加标后,以此方法测定6次,平均回收率为95.3%,见表1。

2.4 方法重现性

连续2d测定系列浓度莠去津标准溶液,对测定结果进行统计学处理,标准偏差在0.002～0.3ng/ml之间,改进方法重现性好。

2.5 比对试验

使用本改进方法对5批水样进行测定,同时按照国标(GB/T 5750.9-2006)方法对上述样品进行对比分析[4]。经检验分析,测定结果差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

采用高效液相色谱法对生活饮用水中的莠去津含量进行测定,该方法在莠去津浓度0.05～5.00μg/ml范围内,测定线性良好(r=0.999 3),RSD为1.41%。平均回收率为95.3%。经上述试验证明该方法能达到快速准确的测定饮用水中莠去津。

摘要：目的 研究水中莠去津含量的测定方法。方法 采用高效液相色谱法,检测波长254 nm;柱箱温度-40℃;流动相配比:甲醇∶水=5∶1;流动相流速为1.2 m l/m in;进样量:10μl。结果 该方法测定RSD为1.41%,线性回归良好(r=0.999 3),平均回收率为95.3%。结论 该方法可以快速准确测定饮用水中莠去津。

关键词：莠去津,高效液相色谱,测定

参考文献

[1]李小平,姚浔平,范建中.固相萃取HPLC法测定水中莠去津及其降解物的研究〔J〕.中国卫生检验杂志.2009,19(6):1242-1244.

[2]李竺,陈玲,郜洪文,等.固相萃取-高效液相色谱法测定环境水样中的三嗪类化合物〔J〕.色谱,2006,24(3):267-270.

[3]谢文明,范志先,张玲金,等.固相萃取-高效液相色谱法快速测定土壤及水中莠去津〔J〕.岩矿测试,2003,22(2):93-94.

高效液相色谱法测定AMPS的纯度 第6篇

目前AMPS作为有效的改性单体已经渗入油田化学品各个领域的聚合物改性, 很好解决了采油聚合物中抗盐性、抗高温性、抗剪切三大棘手问题。中国AMPS最大市场是油田三次采油, 作为钻井液、完井液和压裂液等。目前中原油田等已经将AMPS聚合物作为油田三次采油的化学品立项, 预计仅此一项2005年国内将至少消耗1万吨。

目前全球约1/3的AMPS单体用于水处理工业。AMPS的均聚物或与丙烯酰胺、丙烯酸等单体的共聚物, 可作为污水净化过程中的淤泥脱水剂;在封闭水循环系统中用作铁、锌、铝、铜以及合金的防腐剂;还可用于加热器、冷却塔、空气净化剂和气体净化剂的除垢剂、阻垢剂等。国外大量使用表明, 以AMPS作为处理剂用量少, 效果优于现有聚丙烯酰胺类水处理剂。目前国内一些大中城市污水处理已经开始使用AMPS, 其中华东年消耗约300吨, 华南年消耗约150吨, 京津唐年消耗200吨, 年总消耗量约650吨, 预计2005年将达到1000吨。

目前AMPS已成为国内引人瞩目的热点有机化工原料, 部分科研机构的合成技术也较成熟, 尤其是中国许多油田处于三次采油期, 国内水处理领域用量巨大, 都对AMPS质量和数量提出了更高更多要求。因此, 国内在加快建设AMPS装置的同时, 应加大应用研究力度, 以促进AMPS工业健康快速发展。

AMPS单体的纯度对其后续的加工有着很大的影响, 本文建立了一种快速分析AMPS单体纯度的方法。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与药品

HP1100高效液相色谱仪 (美国Agilent) , 包括G1311A四元梯度泵、G1315A二极管阵列检测器和G1329A自动进样器;Milli-Q超纯水仪 (美国Milli-Pore公司) ;磷酸、磷酸二氢钾均购自北京分析试剂厂, 均为分析纯;甲醇为Fisher试剂公司色谱纯;水为超纯水。

1.2 溶液配制

流动相的配制:以甲醇体积含量为5%的超纯水溶液为溶剂, 配制0.01mol/L KH2PO4磷酸盐缓冲液, 并以5%磷酸调节溶液p H为2.3, 经0.45μm水系滤膜过滤后备用。

1.3 色谱条件

色谱柱:ZORBAX SB-AQ柱 (5μm, 4.6×150mm, Agilent) ;流动相:0.01mol/L KH2PO4溶液 (用5%H3PO4调节p H为2.3) -甲醇 (体积比为95∶5) ;检测波长:210nm;流速:1.0m L﹒min-1;柱温:20℃;进样量:5μL。

1.4 标准曲线的制备

因实验室没有AMPS的标品, 所以使用日本的7号样品作为标准来测定其他样品的相对纯度。

根据前述实验步骤和条件, 按表一将混合标准溶液 (M溶液) 逐级稀释, 得不同浓度的标准溶液, 经0.45μm水系滤膜过滤后, 以进样5μL进行色谱分析, 以对照品浓度 (X) 对峰面积 (Y) 进行线性回归, 得工作曲线:

1.5 样品的测定

将样品按照1.4的方法配制, 以5ul进样量进入色谱分析, 结果见表2。

1.6 讨论

以上分析六种AMPS单体的纯度, 从测定结果 (图1) 可以看出, 样品在色谱柱中的保留时间完全吻合, 具有很高的精确度。在实际的AMPS聚合工作中, 同等条件下2号样合成效果最好, 3号样聚合效果最差, 与色谱分析的纯度结果一致, 说明这种方法是可行的。所建立的分析方法不仅用于单体纯度的测定, 而且还可应用于聚合物开发、生产过程中单体转化率的测定。

由于实验室缺少AMPS的标品采用了日本产7号样作为相对标准, 在以后的检测工作中应使用AMPS的标品作为标准物, 以取得准确的数据。

2 结论

本文建立了高效液相色谱法测定AMPS单体的方法, 该方法准确、简便、快速, 不仅适用于单体纯度的测定, 而且还可应用于聚合物开发、生产过程中单体转化率的测定。该方法可用于目前市场上一些油田化学原料的检测分析, 便于区分不同批次样品纯度, 方法简便易操作。

摘要：本文建立了分析油田化学常用原料AMPS的高效液相色谱 (紫外检测器) 的方法。色谱柱为ZORBAX SB-AQ柱 (5μm, 4.6×150mm, Agilent) ;流动相采用0.01mol/L KH2PO4溶液 (用5%H3PO4调节pH为2.3) -甲醇 (体积比为95∶5) ;检测波长:210nm;流速:1.0mL﹒min-1;柱温:20℃;进样量:5μL。采用该方法可以应用该法对不同来源AMPS单体原料进行了成功分析检测, 分析过程简便、结果可靠, 可用于固井水泥外加剂合成原料的纯度分析。

关键词：液相色谱,纯度分析,油田化学品原料

参考文献

[1]刘约权.现代仪器分析.2版[M].高等教育出版社, 2006, 5.

[2]于世林.高效液相色谱方法及应用.2版[M].北京:化学工业出版社, 2005, 6.

[3]张玉奎, 张维冰, 邹汉法.液相色谱分析.2版[M].北京:化学工业出版社, 2000.12.

[4]杨根元.实用仪器分析.3版[M].北京大学出版社, 2006, 2.

[5]谢音, 屈小英, 主编.食品分析[M].科学技术文献出版社.

[6]杨松成.第十届全国有机质谱学学术会议[Z].1999.

[7]S Strohschein, M Putsch, K Albert.J Pharm Biomed Anal, 1999, 21:669[Z].

[8]刘珍.化验员读本《仪器分析》 (下册) .4版[M].北京:化学工业出版社, 2004:4112 426.

[9]李海生, 白海娇.高效液相色谱应用中的若干问题与方法[J].天津药学, 2006 (4) :6.

[10]王俊德, 商振华.高效液相色谱法[M].北京:中国石化出版社, 1992:133.

制备型高效液相色谱法 第7篇

1 材料与方法

1.1 仪器

高效液相色谱仪,美国Agilent公司生产,二极管阵列检测器,配有自动进样器;试管、旋涡混合器、针头式过滤器、微孔滤膜(孔径0.45 μm)等实验室常规设备。

1.2 试剂

1.2.1 尼古丁

纯度为98%(比重1.012),乙醚、氢氧化钠为分析纯。

1.2.2 尼古丁标准溶液配制

取8.0 μl尼古丁,用0.025 mol/L H2SO4溶液稀释至100 ml,配成80 μg/ml尼古丁标准液。

1.3 实验步骤

1.3.1 尿样的采集

用聚乙烯塑料瓶,采集吸烟者尿样,4 ℃冰箱贮存,1周内分析。

1.3.2 尿样的处理

于10 ml具塞磨口试管中加入4 ml尿液和0.8 ml 13 mol/L的NaOH溶液,充分混匀后,加入1 ml尼古丁提取液乙醚,在旋涡混合器上振动2 min,3000/min(离心半径=15 cm)离心5 min。取上层有机相,针头式过滤器过滤(滤膜孔径0.45 μm),滤液放入自动进样器小瓶,待分析用。

1.3.3 色谱分析条件

见表1。

1.3.4 尿肌酐的测定

取1 ml尿样子小试管中,测定尿肌酐含量[3]。

1.3.5 计算

按下式计算尿中尼古丁的浓度。

undefined

式中:C—尿中尼古丁的浓度,μg/g肌酐;C0—由标准曲线查得的尼古丁的浓度,μg/L;C肌酐—尿样肌酐浓度,g/L。

1.3.6 空白实验

取4 ml非接触者混合尿于试管中,与样品同时进行测定。

1.3.7 标准曲线绘制

取6支试管,以尼古丁标准溶液配制0、20、80、160、320、800 ng/ml标准液。标准系列按尿样处理步骤操作,取待测液100 μl,进高效液相色谱仪测定,每个浓度重复进样6次,以被测物含量为横坐标,被测物峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。

1.3.8 样品测定

取样品待测液100 μl,进高效液相色谱仪测定,同时测定样品空白,以保留时间定性,峰面积定量。

2 结果与分析

2.1 流动相的选择

通过参考相关文献查到检测尼古丁的色谱条件[2],并通过调整各实验条件,最终确定了检测尿中尼古丁的最佳条件,得到高效液相色谱检测尿中尼古丁含量的色谱图,图1表明,尿中尼古丁的标准峰(5.630 min)与尿样杂质峰之间有效分离。

2.2 样品的处理方法

如尿样较浑浊,尿中蛋白含量较高,影响分析效果,需将尿样过滤。

2.3 标准曲线、检出限

标准曲线的测定点包括6个浓度,每个浓度测定6次,以6次测定值的平均值与相应的浓度绘制标准曲线。以3倍信噪比作为检出限,结果见表2。

2.4 尿样加标回收率及精密度试验

取尿样6份,测定本底值,相互调配混合,配制成高中低3种浓度的混合尿,分别加入不同浓度的尼古丁,按上述步骤分析,结果见表3。

由上表可以看出,高、中、低3种浓度加标回收率大于91.5%,变异系数小于6.0%。

2.5 尿样保存时间试验

取尿样6份混合,配制成混合尿。将混合尿分成4组,每组6份。普通冰箱(4 ℃)保存。分别在当天、第3天、第7天、第14天各分析1组,以当天测定均值为100%,其余各组均值与其相比,计算相对偏差,结果见表4。

由表4数据可以看出,尿样在普通冰箱中4 ℃保存,1周之内相对偏差小于9.03%。

2.6 干扰试验

尿中肌酐及有机酸如SCN-等对尼古丁无干扰。

3 小结

本法测定尿样中的尼古丁的含量,在0～800 mg/L范围内呈线性关系,最低检测限为0.35 ng,加标回收率大于91.5%,相对标准差<6.0%。上述各项指标均符合分析要求。方法灵敏,快速,样品处理简单,干扰因素少。分析结果可反映人群暴露于环境烟草烟雾中的水平,可为流行病学研究提供实验室定量依据。

参考文献

[1]胡俊峰,陈自强.卷烟生产女工尿中尼古丁排泄的动态研究.卫生毒理学杂志,1994,8(2):69-71.

[2]Tyrpien K,Wielkoszynski T,Janoszka B,et al.Application of liqUid separation techniques to the determination of the main utinary nicotine metabolites.J Chromatogr,2000,870:29-38.

制备型高效液相色谱法 第8篇

1 仪器与试药

Dianex高效液相色谱仪(Dionex Ultimate 3000,DAD检测器);对照品芦丁由中国药品生物制品检定所提供。甲醇(色谱级,Thermo-Fisher Scientific公司),磷酸(分析纯,天津化学试剂有限公司),水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Dikma Diamonsil C18(250mm×4.6mm,5μg);流动相:甲醇-0.4%磷酸(45:55);检测波长:360nm;流速:1.0mL/min;柱温:30°C;进样量:10μL。此色谱条件下,对照品芦丁和供试品的高效液相色谱见图1。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取样品细粉10g,置圆底烧瓶中,加100mL甲醇回流2次,提取时间依次为2h、1h,合并提取液,蒸干,残渣加适量甲醇溶解,转移至25mL容量瓶中,补加甲醇至刻度,摇匀,即得。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的芦丁对照品2.5mg,置50mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得浓度为50μg/mL芦丁对照品溶液。

2.4 线性关系考察

精密吸取芦丁对照品溶液1.0mL,置于10mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀。分别精密吸取上述溶液2.0μL,4.0μL,6.0μL,8.0μL,10μL,注入高效液相色谱仪,按前述色谱条件测定峰面积。以进样量为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。经计算得色谱峰面积与进样量之间的回归方程为:Y=0.0007X-0.0029,r=0.9997。结果表明,芦丁在0.025~0.125μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

精确吸取对照品溶液10μL,注入高效液相色谱仪中,重复6次测定,结果显示峰面积的RSD为1.2%,表明本试验方法精密度高。

2.6 重复性试验

平行制备5份同一批号供试品溶液,按样品测定方法测定芦丁的含量,5次测定的平均值为0.0018%,RSD为0.25%,该结果表明本法具有很好的重复性。

2.7 稳定性试验

取同一批号供试品溶液,分别在0,1,2,4,8,12,24h分别进样测定,结果芦丁峰面积的RSD为1.3%,表明供试品溶液在24h内基本稳定。

2.8 回收率试验

精密称取5份已知含量的供试品5.0mg,分别加入芦丁的对照品2.0mg,按供试品溶液制备方法制备各供试品溶液,精密吸取上述溶液各10μL,注入高效液相色谱仪。计算平均回收率为99.58%,RSD为1.32%,表明本方法分析误差小,操作过程损失少,回收率高,方法可靠。

2.9 含量测定

精密称取燕麦麸皮样品3批,制备成供试品溶液,进样,记录峰面积,按外标法计算芦丁的含量,见表1。

(n=3)

3 讨论

(1)将一定浓度的芦丁对照品溶液在波长200~400nm范围内进行紫外光谱的扫描,结果显示芦丁在212、260和360nm处均有最大吸收,考虑到其它波长下芦丁的分离度,故本方法选择360nm为检测波长。

(2)本研究首次研究发现燕麦麸皮中含有黄酮类化合物芦丁,并且优化了样品中芦丁的高效液相色谱分析定量方法,故采用测量芦丁的含量对燕麦麸皮进行质量控制是恰当和准确的。

摘要：目的:建立燕麦麸皮中芦丁的含量测定方法。方法:燕麦麸皮经甲醇提取,提取物用甲醇溶解,定容,HPLC分析条件为流动相甲醇-0.4%磷酸(45:55),流速1.0mL/min,柱温30°C,360nm波长下检测样品芦丁的含量。结果:线性方程为Y=0.0007X-0.0029,r=0.9997,线性范围0.025～0.125μg,平均回收率99.58%,RSD为1.32%。结论:本方法简单、快捷,重复性良好,可用于燕麦麸皮中芦丁含量的质量控制。

关键词：燕麦,燕麦麸皮,芦丁

参考文献

[1]中国科学院.中国植物志[M].第9卷.北京:科学出版社,1997:167,173.

[2]涟漪.燕麦麸皮[J].国外医药.植物药分册,2006,21(2):87-88.