转基因克隆动物（精选9篇）
转基因克隆动物 第1篇
1转基因克隆动物的基本内容
所谓转基因克隆动物就是融合转基因与克隆动物这两种技术所获得的产物。其基本原理是依靠基因工程技术在受体细胞中导入指定外源基因, 且对受体染色体加以稳定与整合, 之后将这些受体细胞当作核供体, 实现动物克隆。目前, 转基因克隆动物的整个发展历经了3个阶段, 即:转基因动物阶段、胚胎/体细胞克隆动物阶段、转基因克隆动物阶段。尽管转基因克隆动物问世的时间还不长, 但是由于其已存在着诸多实用性发展, 具备着高效生产率、制备时间短、投入费用少以及后代性别极易鉴定等特点, 因此其已被广泛应用于医药领域、农业、畜牧业领域以及其它领域。
当前, 用于制备转基因克隆动物的方法大致包含6种: (1) 显微注射注, (2) 逆转录病毒介导法, (3) 胚胎干细胞介导法, (4) 原始生殖细胞介导法, (5) 精子介导法, (6) 核移植介导法, 6种方法各有其优势及不足, 不过对比6种方法, 核移植介导法要远远优于其它5种方法。
2转基因克隆动物研究的相关情况
转基因克隆动物的发展并非一蹴而就, 而是历经了3大阶段:
2.1转基因动物阶段
也就是在胚胎中导入外源基因, 使其随机重组, 最终获取转基因动物。转基因动物最早问世是在1980年, 也就是Gurdon J W等所研究成功的转基因小鼠, 之后Palmiter R D在此基础上成功实现了获得了表型出现变化的超级小鼠, 在这以后, 各种转基因动物相继问世, 比如:转基因兔、转基因羊以及转基因鱼等等。
2.2胚胎/体细胞克隆阶段
在这一阶段里最引人注目的事件发生在1997年的英国, 也就是全球首只克隆绵羊“多莉”的出世, 这一事件明确了哺乳动物的体细胞在一定前提下所具有的全能能力, 这对于生物领域而言可谓是掀起了惊涛骇浪, 极具科学意义与应用价值。
2.3转基因克隆动物阶段
由于体细胞克隆技术的迅速发展, 促进了体细胞克隆技术与转基因技术的快速融合, 至此转基因克隆动物技术诞生。标志着转基因克隆动物技术成功运用的事件是Schnieke A E等与Wilmut于1997年成功克隆的转基因绵羊, 在这之后, 美国科学家们又成功借助克隆鼠克隆出了第三代, 也就是借助克隆鼠克隆出了克隆鼠。
在转基因克隆动物技术上, 我国研究的时间还不长, 不过发展速度却势不可挡, 比如:2006年, 我国成功克隆出了全球第一例有利于抵御疯牛病的转基因克隆牛。
3转基因克隆动物存在的问题
虽然转基因克隆动物在全球的发展速度很快, 不过当前仍旧存在着一些亟需我们不断努力去加以解决的问题, 具体如下:
3.1由于在转基因克隆动物技术中所使用的外源基因具备着过低的成活率, 这就使得转基因克隆动物技术的发展存在着极大的局限性。
3.2体细胞克隆相关技术的成熟度亟待加强, 而且某些技术对动物的身体健康还会形成一定危害。
3.3外源基因进入宿主基因组以后, 其行为难以管控, 而且外源基因的导入, 极易损毁宿主基因组的内源基因, 在某些情形下还会将原本处于关闭状态的基因给激活, 比如癌基因等, 如此一来, 将造成动物产生异常情况。
3.4在使用转基因克隆动物技术的过程里, 对于相关的精细理论以及具体过程都极其不明确。比方:重组的复制数、重组原理、宿主染色体间的关联作用以及种系差异情形下同一基因的表达控制元件是否存在不同等等, 这些情况我们都不甚明了。
3.5虽然转基因克隆动物的出现为人类造就了许多好处, 可是与此同时, 有关其安全性的讨论在世界范围内引发了众多争议, 关于其安全性的讨论大致包含两类:一类是食品安全性, 由于外源基因导入染色体中时具备着不同的位点, 如此一来, 其基因变化也就不尽相同, 将导致非预期效应的产生, 而且转基因克隆动物还会提升人畜同时罹患某一种疾病的可能性, 另外, 少数转基因克隆动物还会造成人类过敏性反应的产生。所以, 针对转基因克隆动物、转基因食品必须实施严苛的安全性审查。一类是环境安全性, 由于转基因克隆动物有可能与血缘相近的野生动物进行杂交, 导致转基因出现漂移形式, 如此一来对环境安全将造成具大影响。
由于转基因克隆动物技术的发展极其迅速, 日后转基因克隆动物将呈现出极其庞大的规模, 一旦未形成良好的跟踪、评价管理体系, 那么必然会使当前有序的、可控的状态转变为无序的、难以控制的状态, 由此可知, 在世界范围内建立起一整套健全、完善的转基因克隆动物跟踪、检测与评价体系刻不容缓。
人朊蛋白基因的克隆与原核表达 第2篇
以人血液中提取的总DNA为模板,克隆朊蛋白(prion protein, PrP)基因Prnp的.开放阅读框(ORF),与pMD-18T载体连接后转入E.coli JM109,用Blast软件比较重组质粒序列,结果表明获得的人Prnp的ORF与Genbank登录的相应核苷酸序列最高同源性为99.6 %,推导的氨基酸序列同源性为99.8 %.将编码人成熟PrP的基因定向克隆到pET-30a(+)表达载体,将重组质粒pET-homPrP转化E.coli BL21(DE3),在37 ℃下用1.0 mmol/L IPTG诱导,重组融合蛋白获得高效表达,SDS-PAGE显示表达产物以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的20 %～25 %.用Ni-NTA树脂亲和层析纯化了表达产物.Western-blotting分析表明,融合蛋白被抗PrP的单克隆抗体特异识别.因此,在大肠杆菌中表达的人成熟PrP融合蛋白可以作为制备PrP抗体的免疫原.
作 者：姜海霞 刘永生 杨孝朴 陈豪泰 朱小玲 张杰 谢庆阁 JIANG Hai-xia LIU Yong-sheng YANG Xiao-pu CHEN Hao-tai ZHU Xiao-ling ZHANG Jie XIE Qing-ge 作者单位：姜海霞,朱小玲,JIANG Hai-xia,ZHU Xiao-ling(甘肃农业大学动物医学院,甘肃,兰州,730070;中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,甘肃,兰州,730046)
刘永生,陈豪泰,张杰,谢庆阁,LIU Yong-sheng,CHEN Hao-tai,ZHANG Jie,XIE Qing-ge(中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,甘肃,兰州,730046)
杨孝朴,YANG Xiao-pu(甘肃农业大学动物医学院,甘肃,兰州,730070)
转基因克隆动物 第3篇
关键词：抑制性消减杂交,水生动物,差异表达基因,功能基因
随着分子生物学技术的迅猛发展, 以及人类对多种生物基因组全序列测定的完成, 寻找功能基因逐渐成为研究热点, 因此相关的基因克隆及筛选技术也应运而生。在众多方法中, 抑制性消减杂交 (SSH) 以其具有假阳率低、灵敏度高、特异性强、操作简便等优点而广受关注, 并应用于各种生物新功能基因的筛选中, 逐渐成为最具应用前景的研究方法之一。
1 抑制性消减杂交技术的基本原理
抑制性消减杂交技术是Diathenko L等[1]于1996年建立的寻找差异基因的方法, 该技术以抑制PCR为基础, 并结合标准化和消减杂交技术。抑制PCR是利用链内退火优先于链间退火, 使非目标序列片段两端的长反向重复序列在退火时产生“锅柄样”结构, 无法与引物配对, 从而选择性地抑制非目标序列扩增, 达到抑制非目的片段、选择性扩增目的片段。在标准化步骤均等的目的基因群中cDNA单链丰度, 即低丰度表达基因不会丢失, 高丰度差异表达基因不会被过量分离。消减杂交去除了目的基因群和驱赶基因群之间的共有序列, 使不同序列得以扩增[2,3]。
2 抑制性消减杂交技术的操作流程
2.1 cDNA的合成与酶切
提取试验组 (检测子tester) 和对照组 (驱赶子driver) mRNA反转录为cDNA, 将2组cDNA分别用同一种识别4碱基序列的限制性内切酶 (RsaⅠ) 消化成最大平均长度为600 bp的平末端片段。
2.2 接头连接
将检测子均分为2份, 一份与接头1连接, 另一份与接头2连接, 接头长链的5′-末端无磷酸化基因, 因此保证了接头以唯一方向与检测子cDNA片段连接。
2.3 消减杂交
2份检测子与过量的驱赶子分别杂交, 杂交完毕形成4种产物, 第2轮杂交将第1轮的2份杂交产物在新鲜变性驱赶子cDNA存在的条件下同时混合杂交, 并去除共有序列, 杂交完毕产物中形成一种特殊类型的e型分子, 它是对差异表达基因片段进行指数扩增的模板。
2.4 2轮PCR扩增消减cDNA片段
第1轮PCR基于抑制反应, 是用接头外侧序列作为引物扩增, 只有两端接有不同接头的双链cDNA片段才能进行指数扩增, 而其他分子不能扩增或线性扩增;第2轮PCR实质上是巢式PCR, 使用两接头的内侧序列作为引物扩增, 极大地提高了扩增的特异性。
3 抑制性消减杂交技术的优缺点
3.1 优点
与其他消减杂交技术相比, 抑制性消减杂交技术的优点主要体现在:①具有高灵敏性。2组cDNA均由限制性内切酶酶切后产生1个以上的片段, 保证了低丰度mRNA的检出。②具有高特异性。抑制性消减杂交克服了不同mRNA分子拷贝数目不同对杂交结果的影响, 从而提高了消减的灵敏度。③假阳性低。抑制性消减杂交技术的最大优点就是其克隆有94%的真阳性。④操作简单。对仪器设备要求不高, 一般的分子生物学实验室即可完成。⑤快速高效。应用抑制性消减杂交只需3～4 d即可同时分离到几十甚至几百个差异基因。
3.2 缺点
抑制性消减杂交主要不足之处在于:①起始材料要求高, 样品的差异不宜太大;②mRNA要求较高的纯度, 需要量达到几微克;③消减文库中得到的只是差异表达基因的片段, 不能直接获得全长cDNA;④筛选出来的基因仍存在部分假阳性;⑤接头连接过程会有cDNA的损失。
4 抑制性消减杂交技术在水生动物研究中的应用
4.1 与生殖和发育相关基因的研究
在胚胎发育的每个阶段, 都相应地分化产生不同的组织与器官, 这显然与不同的基因调控有关。因此, 发育分子生物学的一个重要内容就是分离和鉴定这些基因。在研究对虾的卵子发生过程起调控作用的基因时, Zhang Z等[4]用抑制性消减杂交富集探针法构建了日本囊对虾卵巢的cDNA文库, 并发现核糖体蛋白L24 (srpL24) 在其卵巢和精子的表达量上存在差异, 通过RT-PCR分析, 核糖体蛋白 mRNA在卵巢的含量远大于睾丸、眼肌、肌肉、肝脏和胰腺中的表达量。马长艳等[5]应用抑制性消减杂交技术构建了中华绒螯蟹卵巢2个发育期的消减cDNA文库, 获得的正反向消减文库分别含有863个和360个重组子, 为河蟹卵巢发育新基因的发现及后续工作奠定了基础。刘晓慧等[6]以文昌鱼性腺cDNA为材料, 应用抑制性消减杂交技术构建了文昌鱼雌雄性腺的消减cDNA文库, 其正反文库分别有459个和243个重组子, 并用RT-PCR对文库质量进行了验证。陈金平等[7]对施氏鲟的性腺组织特异性表达基因进行了研究, 并应用抑制性消减杂交技术构建了精巢和卵巢的cDNA消减文库, 发现精巢中大量表达的主要为脂肪酸连接蛋白和延长因子等与精子生成发育有关的基因, 卵巢主要为组蛋白、同期蛋白等与卵细胞发育成熟相关的基因。Shi Y H等[8]用抑制性消减杂交技术建立了银鲫尾芽期和心跳起始期的特异性质粒文库, 筛选了2个阶段的特异性基因, 与美国国立生物技术信息中心数据库比较, 169个尾芽期点杂交的阳性克隆中有129个可能是未知基因, 而心跳起始期主要是已知基因, 为银鲫发育的分子机理研究奠定了基础。
4.2 免疫相关基因的研究
对于外来病原的入侵, 水生动物个体自身会通过多种防卫机制进行抵御, 包括物理屏障、吞噬细胞、体液中多种因子的作用。而免疫相关基因的分离与克隆则为揭示水生动物抗病机理、抗病药物的研发、抗病育种理论奠定了基础, 抑制性消减杂交技术的运用为水生动物免疫基因的筛选提供了技术支持。
Wang Z L等[9]用溶藻弧菌感染珍珠贝, 构建了血液细胞的消减文库, 并从中克隆了热休克蛋白-70 (PFHsp70) , 该基因cDNA全长为2 376 bp, 5′-非翻译区89 bp, 3′非翻译区328 bp, 开放阅读框1 959 bp, 编码652氨基酸, 理论分子质量为71.42 ku, 通过RT-PCR检测溶藻弧菌攻击珍珠贝后热休克蛋白-70的时间分布规律证明, 热休克蛋白-70也是可诱导的免疫相关蛋白。Wang K J等[10]以雌性杂色鲍为对象, 用5种细菌混合液作为攻毒菌, 利用抑制性消减杂交技术构建了细菌攻毒的杂色鲍血液淋巴细胞抑制性消减杂交cDNA文库, 鉴别了可上调基因435个, 其中大部分为首次在杂色鲍中发现, 为杂色鲍的分子免疫奠定了基础。
为研究中国对虾感染白斑综合征病毒 (WSSV) 时基因的变化, Wang B等[11]构建了感染期与非感染期的消减文库, 结果发现免疫相关蛋白热休克蛋白、泛素C、海藻糖磷酸合成酶在感染白斑综合征病毒时表达上调, 而肌动蛋白等管家蛋白表达不稳定, 因此研究者选用磷酸丙糖异构酶作为理想的候选内参基因, 为对虾管家基因的合理选择提供了理论依据。Zhao Z Y等则研究了对虾抗白斑综合征病毒基因, 并利用抑制性消减杂交技术构建了对虾抗白斑综合征病毒的消减文库, 在抗白斑综合征病毒上筛选了漆酶、羧肽酶B、Acyl-ConA结合蛋白、H+转运ATP合成酶和皮质颗粒蛋白LDL受体等5个上调基因, 为对虾抗病基因的研究奠定了基础。
文昌鱼介于无脊椎动物和脊椎动物之间, 在进化上占有特殊地位。刘辉等采用金黄色葡萄球菌感染文昌鱼, 应用抑制性消减杂交技术构建了消减文库, 共获得588个表达序列标签 (ESTs) , 通过生物信息学分析得到免疫上调基因和非免疫相关基因, 许多基因在文昌鱼中首次报道, 这有助于深入了解免疫系统的起源与进化机制。
在鱼类免疫基因的研究中, Tsutsui S等[12]以脂多糖 (LPS) 诱导海鳗, 建立了巨噬细胞的消减文库, 并从中克隆白介素-1β (IL-1β) 基因, 这是首次从鳗鲡目中分离得到白介素-1β, 丰富了白介素的理论研究及种属分布。Lin B等[13]以杀鲑气单胞菌和金黄色葡萄球菌感染斑马鱼, 构建2个消减文库并分别得到536个和358个差减表达序列标签, 经生物信息学分析发现, 许多基因与哺乳动物的外援凝集素基因、Toll样受体基因、补体基因、抗菌肽基因高度同源, 并同时鉴定出一种急性期蛋白基因, 该基因首次在斑马鱼中报道。
抑制性消减杂交技术应用于爬行动物免疫基因的筛选也有报道, 周秀霞等以嗜水气单胞菌感染中华鳖, 并构建了主要器官的消减cDNA文库, 从中鉴定克隆了中华鳖免疫相关基因, 如ISG12、SAA、IL-8、CD9、CD59等, 为探讨中华鳖抗感染的分子免疫机制奠定了基础。
4.3 其他方面的研究
抑制性消减杂交技术不仅可以用于对免疫及生殖相关基因的比较筛选, 而且还可用于水生动物其他方面的基因表达的比较。
刘晶等[14]为了克隆维生素E缺乏时皱纹盘鲍外套膜差异性表达的基因, 通过抑制性消减杂交技术构建了维生素E缺乏组和正常组外套膜组织差异表达的cDNA消减文库, 从文库中随机抽取48个克隆测序, 结果表明有16个新基因、7种抗氧化酶基因及一些与贝壳生物矿化相关的差异表达基因。在研究外界因素对斑节对虾的分子机制影响时, Vega E等以高温、低氧等外因, 通过抑制性消减杂交技术构建了斑节对虾血液细胞相应的消减文库, 发现258个克隆的测序结果中有176个不同序列, 其中58个与公认序列有同源性。Griffitt R J等[15]以氟虫氰作用对虾, 通过抑制性消减杂交技术建立了氟虫氰作用组和对照组的消减文库, 此文库通过克隆测序发现上调基因42个, 下调基因48个, 其中组蛋白酶B对氟虫氰有强烈的反应性。钟雪萍等应用抑制性消减杂交技术构建了低氧处理鲫鱼囊胚细胞后差异表达基因的cDNA消减文库, 并挑取含有插入片段的1 300个克隆进行测序, 通过生物信息学分析获得了267个基因序列, 为进一步探讨鱼类抗低氧的分子机制提供了相应的理论依据。刘豪等为了解瓯江彩鲤鱼红、白2种体色差异的分子机制, 应用抑制性消减杂交技术对全红体色和粉玉体色的差异表达基因进行初步研究, 结果发现有4条序列可能与体色有关, 为进一步筛选鲤鱼体色调控相关功能基因奠定了基础。
5 结语
转基因克隆动物 第4篇
鸡痘病毒ORF073基因克隆及原核表达
根据已经发表的鸡痘病毒(FPV)美国致病株的ORF073基因序列,设计1对引物,分别以282E4FPV、LP株FPV、102E6FPV为模板,扩增出目的片段,将其克隆到pGEM-TEasy载体中,经酶切鉴定证实,并进行序列测定.目的片段包含了大小为522 bp的ORF073基因,与GenBank上的AF198100(FPVUS)和AJ581527(FP9)序列进行序列比较分析表明:3种病毒株的`ORF073基因与鸡痘病毒美国致病株(FPVUS)和英国弱毒株(FP9)完全一致.克隆的ORF073基因与原核表达载体pET-28a构建重组表达载体,经IPTG诱导,在BL21(DE3)细菌中表达了分子质量约32 ku的蛋白.
作 者：王彦红 马怀良 胡顺林 仇旭升 刘秀梵 WANG Yan-hong MA Huai-liang HU Shun-ling QIU Xu-shen LIU Xiu-fan 作者单位：扬州大学,农业部畜禽传染病学重点开放实验室,江苏,扬州,225009刊 名：扬州大学学报(农业与生命科学版) ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF YANGZHOU UNIVERSITY(AGRICULTURAL AND LIFE SCIENCE EDITION)年，卷(期)：200627(4)分类号：Q786 S852.65+9.1关键词：鸡痘病毒 ORF073 基因克隆 原核表达
世界首例转基因手工克隆绵羊诞生 第5篇
1 首只手工克隆绵羊取名“鹏鹏”
据深圳华大基因研究院相关负责人介绍, 手工克隆绵羊研究可实现优良性状个体快速繁殖, 大大缩短育种周期, 对提高产奶量、改善肉质等方面将产生重大影响。“羊群中有性状好的个体, 有的羊一天可以产10多升奶, 但这毕竟是少数, 如果我们将这种优质个体进行克隆, 复制成成百上千的优质羊群, 产业化前景将会非常好。”
此次手工克隆绵羊品种为美利奴羊。研发团队的技术人员于2009年9月提取供体细胞, 并建立转基因细胞系;2010年5月开展手工克隆实验;2011年10月稳定获得囊胚, 手工克隆技术体系建立。
深圳华大基因研究院相关负责人说:“经过研发人员的努力, 3月26日12时16分, 剖腹产成功产下第一只转基因手工克隆绵羊, 初生羊体重达5.74公斤, 目前各项生命体征正常。”
华大基因研究院杜玉涛博士说:“我们还给这只手工克隆绵羊取了一个具有深圳特色的名字, 叫鹏鹏。”
2 接下来将手工克隆牛
据深圳华大基因研究院相关工作人员介绍, 手工克隆技术看似简单, 其实每一步风险都很大, 每一步操作起来难度也很大, 目前全世界克隆成功率较低, 仅为5%～10%。此项转基因克隆绵羊项目从2009年开始一直面临着种种考验。
其实, 绵羊并不是手工克隆的首件“杰作”。据杜玉涛介绍, 早在2006年, 世界首批“手工克隆”猪在丹麦诞生, 是深圳华大基因研究院团队与丹麦科学家联手奋斗的科研成果。而在2008年, 国内首批8只手工克隆猪也在深圳市种猪场顺利诞生。
“目前这些克隆猪生长情况非常好, 我们还建立了实验基地, 每年都要手工克隆几百头猪。”杜玉涛博士说, “也正是因为效果很好, 我们才考虑把手工克隆技术扩大到绵羊。”
杜玉涛博士透露, 接下来, 他们还将手工克隆牛, “估计今年底或明年初有望问世。”
转基因克隆动物 第6篇
关键词：ApoB100,基因克隆,多克隆抗体
载脂蛋白由脂类、脂蛋白组成, 调控脂蛋白代谢。载脂蛋白B (Apo B) 被认为是包含载脂蛋白的脂蛋白[如乳糜微粒、中密度脂蛋白 (MDL) 、低密度脂蛋白 (LDL) 、极低密度脂蛋白 (VLDL) ]的显著标记, 原因是Apo B为这些脂蛋白结构的限制因素[1]。牛Apo B有2个亚型, 即载脂蛋白B100 (Apo B100) 和载脂蛋白B48 (Apo B48) , 前者通过肝脏合成和分泌, 后者在肠道合成和分泌。Apo B100是三酰甘油的结构蛋白, 其作用是输送肝脏中的三酰甘油到肝外组织 (如乳腺) , 输送胆固醇到内分泌组织 (如卵巢、肾上腺皮质) [2]。血清中Apo B100水平不正常是肝脏脂肪沉积过多 (脂肪肝) 的显著因素[2]。
本试验通过PCR技术扩增Apo B100部分基因片段, 构建了p ET-28a-Apo B100原核表达载体, 诱导表达融合蛋白并制备多克隆抗体, 为进一步研究Apo B100在诊断、治疗和预防奶牛脂肪肝、酮病等脂代谢紊乱性疾病奠定前期的临床基础。
1 材料
Eco RⅠ内切酶、Bam HⅠ内切酶、T4 DNA连接酶、p GM-T载体、DH5α和Rosetta (DE3) 大肠杆菌、DNA回收试剂盒、Anti-His抗体、HRP标记的山羊抗小鼠二抗HRP标记的山羊抗兔Ig G酶标二抗、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、酵母提取物、蛋白胨、标准分子质量蛋白、包涵体蛋白提取试剂盒、His亲和层析柱、蛋白分析试剂盒、化学发光检测试剂盒及相关试剂, 均购自宝泰克生物工程公司;p ET-28a表达载体, 由吉林农业大学寄生虫实验室提供;3月龄白兔, 购自长春白求恩医科大学。
2 方法
2.1 克隆载体的构建与鉴定
根据Gen Bank中收录的相关奶牛Apo B100基因序列设计引物, 序列为上游引物5'-CGCG-GATCCTTCTCAGGTGATGGGTCTCT-3', 下游引物5'-CGGAATTCCTAGCTCCAGCACTAGGGGATTATA-3', 并在引物5'端设计酶切位点 (下画线部分为酶切位点) , 由华大中天生物技术有限公司合成。以奶牛肝脏c DNA为模板进行PCR扩增, PCR反应程序:94℃预变性10 min;94℃30 s, 60℃45 s, 72℃60 s, 共30个循环;72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后, 按照胶回收试剂盒说明书回收目的基因片段, 将已回收的目的片段于16℃条件下与p GM-T载体连接过夜;然后转化至DH5α大肠杆菌中, 将转化产物涂布到含50 mg/L氨苄西林 (Amp) 的LB琼脂平板上, 37℃培养过夜;从平板上筛选阳性菌落, 接种于含Amp的LB液体培养基中, 37℃振荡过夜;提取质粒, 并测序鉴定。
2.2 表达载体的构建与鉴定
分别将回收、纯化的重组质粒和p ET-28a质粒用Bam HⅠ和Eco RⅠ内切酶于37℃酶解3 h;将回收的目的DNA片段和p ET-28a基因片段连接, 转化到DH5α大肠杆菌中;将转化的受体菌涂布到含30 mg/L卡那霉素的LB琼脂平板上, 挑选阳性菌, 提取质粒转化到Rosetta (DE3) 大肠杆菌中;将转化的Rosetta (DE3) 大肠杆菌涂布到含30 mg/L卡那霉素和25 mg/L氯霉素的LB琼脂平板上, 37℃培养过夜;从平板上筛选阳性菌落, 接种于LB液体培养基中, 37℃振荡过夜;提取质粒, 双酶切鉴定。
2.3 Apo B100融合蛋白的诱导表达及表达条件优化
取酶切鉴定为阳性的p ET-28a-Apo B100的Rosetta (DE3) 菌体用IPTG诱导, 分别用0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/m L IPTG诱导3 h;然后进行SDS-PAGE电泳分析, 确定最佳浓度;再用最佳浓度的IPTG分别诱导1, 2, 3, 4, 5 h;然后进行SDS-PAGE电泳分析, 确定最合适的诱导时间, 从而确定最终的诱导表达条件。
2.4 Western-blot技术鉴定重组表达蛋白
对溶解蛋白进行10%SDS-PAGE电泳, 采用半干转膜法将凝胶转至PVDF膜上, 用5%脱脂奶粉室温封闭4 h, Anti-His抗体 (1∶500稀释) 孵育过夜, HRP标记的山羊抗小鼠二抗 (按1∶5 000稀释) 孵育1 h, 最后采用增强化学发光法 (ECL) 在暗室内进行显影, 扫描成像。
2.5 融合蛋白的复性和纯化
按照2.3中的优化表达条件培养500 m L菌液, 离心后收集菌体沉淀, 按照包涵体蛋白提取试剂盒说明书提取蛋白;然后进行透析复性, 再经His亲和层析柱纯化, 得到高纯度的融合蛋白;用蛋白分析试剂盒测定纯化融合蛋白浓度。
2.6 多克隆抗体的制备
选取3月龄白兔2只, 免疫前第3天耳缘静脉取血, 分离血清作为阴性对照。将纯化后的目的蛋白与等量完全弗氏佐剂充分乳化, 背部皮下多点注射 (0.5 mg/只) 。之后每2周进行加强免疫1次, 加强免疫时目的蛋白与等量不完全弗氏佐剂充分乳化, 剂量与一免相同。第3次加强免疫后1周经心脏采血, 4℃静置过夜;3 000 r/min离心15 min, 制备血清;-20℃保存, 备用。
2.7 间接ELISA法测定效价
以包被液稀释、纯化的目的蛋白Apo B100 (终浓度为1μg/m L) 作为抗原包被ELISA板, 每孔100μL, 4℃过夜;用PBST洗涤3次, 3 min/次;加入10%兔血清封闭液于37℃封闭1 h;PBST洗涤3次, 3 min/次;加入1∶100, 1∶200, 1∶400, 1∶800, 1∶1 600, 1∶3 200倍稀释的Apo B100多克隆抗体, 对照组用阴性血清按1∶200比例稀释, 各加入200μL, 37℃温育1 h;PBST洗涤3次, 3 min/次;分别加入100μL以1∶5 000倍稀释的HRP标记的山羊抗兔Ig G酶标二抗, 37℃温育1 h;PBST洗涤3次, 3 min/次;每孔加100μL新鲜的TMB使用液, 37℃暗反应10 min;最后, 每孔加入50μL 0.5 mol/L H2SO4终止反应。将酶标板放入酶标检测仪中, 测定波长为450 nm处的吸光度值。
3 结果与分析
3.1 重组表达载体的构建和鉴定
将回收的PCR扩增片段与p GM-T载体连接、转化后, 对质粒进行测序, 测序结果经Blast比对表明, 与Gen Bank中牛Apo B100序列同源性为100%。
同时用引物进行菌液PCR鉴定, 结果表明, 该片段已正确插到p GM-T载体中, 见图1。
1.菌液PCR扩增条带;M.DL-2 000 Marker。
将p GM-T-Apo B100和p ET-28a用Bam HⅠ和Eco RⅠ内切酶酶切, 连接并转化到DH5α大肠杆菌中, 获得阳性克隆菌并提取质粒。重组的质粒经Bam HⅠ和Eco RⅠ内切酶双酶切后, 均可见大小约为747 bp的目的片段和p ET-28a表达载体片段, 与预期结果一致, 见图2。试验结果表明, 该片段已正确插到p ET-28a表达载体中。
1.Bam HⅠ和Eco RⅠ双酶切的p ET-28a表达载体;M.DL-6 000 Marker。
3.2 融合蛋白的诱导表达及纯化
SDS-PAGE电泳结果表明, 用0.4 mg/m L IPTG诱导表达3 h后蛋白的表达量最大, 并且蛋白以包涵体形式存在, 分子质量约为35.0 ku, 其大小与所推测的融合蛋白的分子质量一致, 见图3~5。提取的蛋白经His亲和层析柱纯化后获得了高纯度的融合蛋白, 经蛋白分析试剂盒测定, 融合蛋白浓度为1 mg/m L。
1.未诱导;2~6.0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/m L IPTG诱导的电泳结果。
M.蛋白质分子质量标准;1~5.诱导1, 2, 3, 4, 5 h。
3.3 目的蛋白的Western-blot分析
纯化的Apo B100蛋白用Anti-His抗体进行Western-blot检测, 结果表明对应位置有明显条带, 说明目的融合蛋白表达成功, 见图6。
M.蛋白质分子质量标准;1.重组菌体裂解沉淀;2.重组菌体裂解上清液。
3.4 间接ELISA法测定效价
用纯化的Apo B100蛋白免疫白兔后分离、收集血清, 经间接ELISA法测定, 抗体效价达到1∶1 600, 表明所表达的蛋白具有良好的免疫学活性。
4 讨论
围产期奶牛的能量代谢特点是干物质 (DMI) 摄入减少而营养需求增加, 导致能量负平衡 (NEB) 。围产期奶牛需要动员大量体脂以满足能量需求, 会使血浆中非酯化脂肪酸 (NEFA) 浓度迅速升高进而被肝脏摄取, 同时肝脏酯化生成的三酰甘油增多。三酰甘油被转运到肝外组织利用[3], 在能量或蛋白质缺乏时, 非酯化脂肪酸则以三酰甘油的脂肪小颗粒形式在肝脏中沉积, 而此时肝脏缺乏极低密度脂蛋白, 不能将脂肪转运出肝脏, 从而逐渐使肝细胞发生脂肪变性, 发生脂肪变性的肝脏就称为脂肪肝, 其代谢功能大大降低, 继续发展将引起酮病等一系列代谢障碍性疾病。A.Mazur等[4]报道, Apo B100合成障碍降低肝脏脂蛋白的合成率, 进而导致三酰甘油在肝脏的蓄积。
Apo B100作为极低密度脂蛋白的结构蛋白和主要的载脂蛋白, 对于极低密度脂蛋白颗粒的稳定性是至关重要的, 主要功能是参与极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白的组装和分泌, 以配体的形式作为脂蛋白与特异性受体的连接物[5]。Apo B100是形成极低密度脂蛋白颗粒结构框架的多肽, 没有Apo B100肝脏分泌三酰甘油是不可能的。对鼠的研究表明, 肝脏极低密度脂蛋白的组装与分泌取决于Apo B100的合成。增加极低密度脂蛋白颗粒的组装和分泌, 可以减少肝脂沉积, 有效防制脂肪肝的发生[6]。
p ET-28a是一个表达效率高的融合表达载体, 本试验以p ET-28a为载体, 提高了Apo B100基因片段在大肠杆菌中的表达, 经诱导、纯化得到高纯度的融合蛋白。Western-blot分析显示, 该融合蛋白能被带His标签的单克隆抗体特异性识别, 表明在Rosetta (DE3) 大肠杆菌中表达的p ET-28a-Apo B100重组蛋白为目的蛋白, 目的蛋白复性后免疫白兔, 用间接ELISA法检出高效价多克隆抗体, 这为后续试验研究提供了重要前提, 也为进一步研究Apo B在肝脏脂肪代谢中的功能奠定了基础。
参考文献
[1]UCHIDE T, TOHYA Y, ONDA K, et al.Apolipoprotein B (apoB) concentrations in lipoproteins in cows[J].Vet Med Sci, 1997, 59 (8) :711-714.
[2]ITOH H, TAMURA K, MOTOI Y, et al.Serum apolipoprotein B-100 concentrations in healthy and diseased cattle[J].Vet Med Sci, 1997, 59 (7) :587-591.
[3]夏成.奶牛酮病、脂肪肝糖异生和脂肪动员的神经内分泌调控机制[D].长春:吉林大学, 2005.
[4]MAZUR A, AYRAULT-JARRIER M, CHILLIARD Y, et al.Lipoprotein metabolism in fatty liver dairy cows[J].Diabete Metab, 1992, 18 (Pt 12) :145-149.
[5]孙玉成.围产期奶牛肝VLDL组装与分泌主要相关蛋白基因表达的调控[D].长春:吉林大学, 2006.
首批转基因克隆牛成功繁育后代 第7篇
日前, 2012年出生的首批含有脂肪性脂肪连接蛋白基因的体细胞转基因克隆牛“妞妞”成功繁育后代, 第二代“转基因小牛”出生后各项体征正常, 身体健康.这意味着我国应用体细胞克隆技术培育自主品牌的肉牛新品种迈出了关健一步, 国人有望早曰吃上国产“雪花牛肉”·国家转基因重大专项课题“优质高效转基因肉牛新品种培育”负责人.北京农学院教授倪和民说, 这头第二代转基因小牛来之不&, 其母亲“妞妞”于2012年8月1日诞生, 刚出生时无法主动进食, 后经团队人员悉心照顾, “妞妞”达到性成熟并可以繁值后代92014年11月2日, 团队为“妞妞”准备了由全国畜牧总站种质资源保护中心提供的秦川牛冷冻精液, 并对其进行了人工输精, 完成配种。终于在今年8月2 8日产下第二代“转基因小牛”。截至9月丨2曰, 小牛各项体征正常, 身体健康。倪和民表示, 这证明我国此項技术已取得三大突破:一是通过体细胞转基因先隆技术获得的转基因牛具有正常繁育功能;二是通过对小牛的检测, 含有脂肪性脂肪连接蛋白基因的基因已在其身上进行繁衍, 并稳定整合, 表明该基因能够一代代传承:三是未发现转基因牛对周围坏境有不良影响。这说明体细胞转基因克隆技术生产体系可用于转基因动物的安全生产.该项目成功制备了携带脂肪性脂肪酸结合蛋白基因的转基因克隆牛, 促进了我国五大黄牛之一的秦川牛品种改良, 为培育优质高档肉牛奠定了基础。 (来源:中国科学报)
香猪SRY基因的克隆及序列分析 第8篇
香猪为我国西南地区特有的微型猪种,以肉嫩味鲜而闻名。由于饮食习惯的原因,人们更加偏爱食用阉割后的公香猪,导致香猪公母比例失调,因此开展香猪性别决定机制方面的研究,对于提高该品种的生产效率、服务人们生活具有重要意义。本研究克隆了贵州香猪SRY基因,分析了香猪SRY基因与其他物种SRY基因的序列变异,为香猪性别决定机制的研究奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
公母香猪样品由贵州大学香猪养殖场提供,耳静脉抽取血样5 ml,EDTA抗凝,-20 ℃保存。
1.2 方法
试验于2008年7月至2008年12月在贵州大学生命科学学院生物技术专业实验室进行。
1.2.1 香猪基因组DNA
的提取 按常规酚、氯仿抽提法提取基因组DNA[7]。
1.2.2 香猪SRY
基因的PCR 扩增 采用比较基因组学方法,根据人SRY 基因序列(GenBank登录号NM_003140)设计引物,引物由上海生物工程公司合成。引物序列为:5′-GGTGGTACTGGGGGCGGAGAAAT-3′;5′-TAAACCACGGTGAAAAGGCAAGTC-3′。PCR反应体系如下:0.2 mmol/L dNTPs,2 mmol/L MgCl2 ,0.5μmol/L上、下游引物, 500~800 ng 模板DNA,2U Taq聚合酶。PCR扩增程序为,94 ℃预变性4 min,94 ℃变性30 s,50 ℃退火40 s,72 ℃延伸80 s,共35个循环。
1.2.3 香猪SRY
基因的克隆及测序 按Boehringer Manneheim公司生产的PCR 产物纯化试剂盒(产品号1732676) 的说明书纯化PCR 产物,再按Promega公司生产的PCR 产物直接克隆试剂盒(产品号A1360)的说明书进行“T 载体”连接反应。将连接好的重组质粒pGEM- T通过电击法(条件为:2.5 kV,25 μFD,脉冲时间4~5 ms) 转化大肠杆菌DH5α,将转化菌涂布于含氨苄青霉素的X-gal和IPTG的LB 平板上,于37 ℃培养16~18 h,可见平板上出现约70%的白色和少量的蓝色菌落。挑取单个白色菌落进行亚克隆,再挑取单个白色亚克隆菌于40 μl无菌水中煮沸10 min 使菌体裂解,离心后取上清作为模板,按1.2.2方法进行PCR 扩增。取上述PCR 扩增证实为阳性克隆的质粒,送往大连宝生物工程公司进行测序。
1.2.4 香猪SRY
基因的序列分析 根据香猪SRY 基因的序列,运用DNASTAR软件进行核苷酸差异、序列相似性分析,并在此基础上使用邻接法( neighbor-joining method,NJ)构建系统树[8]。用自举检验( bootstrap test )估计系统树各分支节点的置信度, 共1 000 次循环[9]。
2 结果
2.1 香猪
SRY基因的分子克隆和测序 从图1电泳结果中可以看出,利用设计的SRY基因引物对公香猪基因组PCR 扩增能够得到一条约800 bp明显目的带,而母香猪及空白对照均只有引物二聚体,无该带。对所扩增片段进行回收克隆测序后,通过与Genbank上检索到的其它物种的SRY基因序列比对,去掉PCR扩增的多余序列,推导出香猪SRY基因的开放读码框以及HMG-box编码的氨基酸序列(图2)。开放阅读框全长627 bp, 编码226 个氨基酸。起始密码子位于1~3 bp 处, 终止密码子位于625~627 bp处。其中HMG-box 区域包含79个氨基酸(D52~E130)。
注:扩增产物约为800 bp
2.2 与部分动物
SRY 基因序列的同源性分析 用香猪的SRY基因同GenBank中获取的白鲸、人、牛、绵羊(登录号分别为AB108518、NM_003140、U15569、Z30265)的SRY基因序列进行同源性分析,在分析的5种动物中共存在238个核苷酸多态位点。表1为5种动物SRY基因序列相似度和歧异度百分比。其中香猪和白鲸的同源性最高,达到82.1%;香猪和人同源性最低,为69.4%。在HMG-box区域,除了一定的核苷酸变异外,香猪与人相比缺失3个核苷酸,与白鲸相比缺失1个核苷酸。
基于5个动物个体SRY基因部分序列差异,对其彼此间的距离进行分析,采用NJ法以人为外群构建聚类进化树(见图3),从聚类图中可以看到,香猪与白鲸聚为一类进化分支,牛和绵羊聚为一类进化分支,而这4种动物都与人的进化分支最远。
注:阴影部分为HMG-box
注:枝长代表分歧度,数值为bootstrap 1 000次重复抽样检验得到的支持率
3 讨论
对公、母香猪DNA体外扩增的结果表明,公猪显示出一条600 bp左右的目的带,而母猪没有特异性条带,这与前人的研究结果一致[1,2,3],再次证明了SRY基因只存在于雄性动物中,因此用SRY基因来进行猪的性别鉴定具有很高的可靠性,这对于建立猪胚胎性别鉴定技术有着重要的意义。
鲸类和偶蹄类在传统上被认为是两个特征明确的支系, 但近年来分子系统学和古老鲸类化石的研究表明,鲸类与偶蹄类具有很近的亲缘关系[10,11]。在我们的研究结果中,无论是序列相似性还是聚类图分支都表明,在所分析的5种动物中香猪与白鲸有较近的亲缘关系,这些结果也支持以白鲸为代表的鲸目和以香猪为代表的偶蹄目有亲缘关系的观点。同时,聚类图中绵羊和牛聚为一类进化分支,这也符合现在普遍公认的牛和羊同属于牛科下的两个不同属(分别为牛属和羊属),而猪科则是与牛科并列的一个独立科的观点[12,13]。在SRY基因的核心HMG-box区域,5个物种均有一定的核苷酸变异,甚至还有少量的核苷酸的缺失,这种由于物种不同所产生的核苷酸变异或缺失会进一步导致氨基酸的变异或缺失。这些变异或缺失对该段核心序列编码蛋白质的空间结构和功能等是否有影响,是否表现在不同物种的进化规律上,还有待进一步研究。
摘要：试验参照猪SRY基因保守序列设计了1对引物,对香猪基因组DNA进行PCR扩增。将扩增产物通过T-A互补法克隆到质粒pGEM-T载体中,筛选阳性克隆进行DNA测序。测序结果显示,香猪SRY基因开放阅读框全长627 bp,编码227个氨基酸。其中核心区域HMG-box长237 bp,并且编码79个氨基酸。与白鲸、人、牛、绵羊4种哺乳动物的SRY基因序列相比较,香猪和白鲸的SRY序列具有较高的相似性,相似度达82.1%。序列相似性和邻接法聚类树的结果均显示,在SRY基因中香猪和白鲸有着较近的亲缘关系,表明以白鲸为代表的鲸目和以香猪为代表的偶蹄目有较近的亲缘关系。
玉米APRT基因的克隆及特征分析 第9篇
在生物体内ATP的动态平衡有赖于2条合成途径, 即从头合成途径和补救途径, 在补救途径中, 同样存在2种腺嘌呤转变为AMP的方式: (1) 腺嘌呤磷酸核糖基转移酶 (APRT, EC2.4.2.7) 催化的一步反应方式; (2) 连续由核苷磷酸化酶、腺苷酸激酶催化的方式。体内标记试验证明:植物体内一步催化方式是补救途径的重要方式, APRT是补救途径中的1个关键酶。从拟南芥、水稻、小麦、大麦、番茄和蔷薇中都分离克隆了该酶的编码基因[3]。
有研究表明拟南芥中APRT基因突变导致APRT酶活性降低, 细胞分裂素水平下降, 突变体呈明显的雄性不育[4,5], 并显示APRT参与细胞分裂素的代谢[6]。该研究利用RACE技术扩增全基因的优点和丰富的EST数据资源, 结合生物信息学的方法首次报道了玉米APRT基因的克隆和序列分析。
1 材料与方法
1.1 供试材料
玉米种子齐319由山东农业大学陈翠霞教授提供, 种子催芽后, 播种在湿的砂土中, 2周后取幼苗叶片, 用于玉米APRT基因的克隆。
1.2 APRT保守区域的引物设计
通过美国国家生物技术信息中心 (NCBI) 数据库网站搜索得到拟南芥 (A.thaliana) 、小麦 (Triticum aestivum) 、大豆 (Glycine max) 、大麦 (Hordeum vulgare) 、水稻 (Oryza sativa) (Genbank登录号分别为X96866、U22442、AI522952、AB012046、AY238894) 的APRT基因的c DNA序列, 运用DNAMAN软件进行多序列的同源比对, 得到该基因的保守区域, 并根据此保守区设计一对引物:MAP1 5′ATCATGTTC AACGACATCACGG 3′;MAP2:5′ACTTAGGAAGGCCAATGA GG 3′。由上海Sangon生物工程公司合成该引物。
1.3 玉米总RNA的提取和m RNA的纯化
取2 g玉米幼苗叶片, 经液氮研磨成粉状, 玉米总RNA的提取参照张劲松等[7]的方法进行, m RNA的纯化用Promega公司的Poly Atract systemⅢ试剂盒。
1.4 c DNA的合成及核心序列扩增
取5μg经DNase I处理的m RNA样品, 用Super ScriptTM II RNase H-Reverse Transcriptase (Invitrogen公司) 进行逆转录, 获取第1链c DNA。用设计的引物MAP1和MAP2进行PCR扩增, 反应程序如下:94℃预变性4 min;94℃, 1min, 59℃, 1 min, 72℃, 1 min, 32个循环;最后在72℃, 保持10 min。回收扩增产物并送上海博亚公司测序。
1.5 3′和5′RACE扩增
根据玉米APRT核心测序结果分别设计基因特异性RACE引物, 引物序列为3GSP:5′-CGTCGCAGGCATTGAAG CTAGAGGATTC-3′;3NGSP:5′-GGGAGCGCGTAGTGGTTGT CGATG-3′;5GSP:5′-AATGAGGCATGCACACTCAACCACGT T-3′;5NGSP:5′-GCTCCTATGGCTAGCGCAATGGCTGG-3′;amplification kit说明书进行。其中第一轮PCR反应循环参数为94℃, 30 s, 68℃, 30 s, 72℃, 2 min, 30个循环。第二轮巢式扩增循环参数为94℃, 30 s, 68℃, 30 s, 72℃, 2 min, 5个循环;94℃, 30 s, 65℃, 30 s, 72℃, 2 min, 30个循环。扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳分析。
1.6 DNA片段回收及克隆
在紫外灯下切下含目的片断的凝胶块, 用宝生物 (大连) 回收试剂盒回收DNA, 回收片断克隆到p MD18-T载体上。
1.7 序列分析
序列测定由上海博亚生物技术公司在ABI3700型测序仪上进行, 用DNAMAN和DNASTAR软件进行序列拼接, 相似性比较和聚类分析。
2 结果与分析
2.1 玉米APRT基因的克隆
根据Gen Bank中拟南芥、水稻、小麦、大豆、大麦等植物的APRT基因保守序列设计的引物MAP1和MAP2, 以反转录得到的c DNA为模板, 进行RT-PCR得到一个406 bp的扩增片段 (图1a) , 测序结果 (图2中下划线部分) 输入NCBI数据库中进行BLAST, 发现它和这些植物的APRT基因有很高的序列同源性。
以3GSP和UPM作为引物, 进行3′端的第一轮扩增, 再把第一轮扩增产物稀释40倍作为模板, 3NGSP和NUP为引物做巢式扩增, 最后获得1条带有poly A尾巴的577 bp片断 (图1b-2) 。同样5′端分别以5GSP和UPM, 5NGSP和NUP进行第一轮和巢式扩增, 得到1个509 bp的条带 (图1b-4) 。序列测定及分析表明, 扣除引物设计的重复序列, 3′, 5′端RACE反应分别延伸了452、344 bp, 拼接获得的玉米APRT基因c DNA序列总长为1 202 bp, Gen Bank登录号为AY485263。该c DNA包含1个642 bp的开放阅读框 (ORF) , 编码214个氨基酸。翻译起始于第169个碱基, 终止于第814个碱基, 3′端389 bp非编码区含有27个poly A。初步证明我们已经克隆了玉米APRT基因的全长c DNA。
将玉米APRT基因的c DNA序列在Maize GDB (美国玉米遗传与基因组数据库) 中BLAST, 搜索到6个ESTs有很高的序列相似性, E-value值为0。它们分别是3529_1_122_1_H11.y_1, 1117022F09.y1, 1000052F06.x2, 3529_1_122_1_H11.x_1, 707008C07.x3, 946168F01.y1 (Gen Bank登录号分别是CD527756、CA831697、BF727777、CD572916、AW289078、BU572174) 。分析表明:3529_1_122_1_H11.y_1, 1117022F09.y1在玉米APRT基因序列5′端58-680的位置, 而1000052F06.x2, 3529_1_122_1_H11.x_1, 707008C07.x3, 946168F01.y1则覆盖了玉米APRT基因序列3′端488~1 041的位置。这5个ESTs重叠区域覆盖了这个基因序列58~1 041的位置, 进一步证实我们已获得这个基因的全序列。说明利用ESTs设计全长引物的常规电子克隆难以获得完整3′端、5′端序列, 结合RACE技术则可以解决这个问题。
2.2 玉米APRT基因的氨基酸序列分析
将根据玉米APRT基因推测的氨基酸序列在NCBI中进RPS-BLAST (reverse position specific BLAST) 保守域查询, 发现它具有腺嘌呤磷酸核糖基转移酶 (APRT) 的保守域 (97.8%aligned, Score=250, Expect=1e-67) 。再将推测的氨基酸序列在Gen Bank数据库进行氨基酸相似性比对 (BLAST分析) , 结果表明它与水稻2型、小麦1型、小麦2型、大麦、拟南芥1型、拟南芥2型的APRT蛋白一致率分别为79%、56%、75%、56%、52%、56%, 并且它们都含有嘌呤结合域和磷酸核糖焦磷酸结合域 (图3) 。该结果证明克隆到的玉米APRT基因是APRT基因家族的一个成员。比较发现玉米APRT蛋白与水稻、小麦、拟南芥的2型同源性都比它们对应的1型高, 故可认为克隆的玉米APRT基因应该属于2型, 因此将其命名为Zm APT2。
注:a:核心片断RT-PCR的扩增产物 (箭头所示) ;b:泳道1、2分别是3′RACE第一轮和巢式PCR扩增产物, 3、4分别是5′RACE第一轮和巢式扩增产物。M为DNA分子标记DL2000。
注:下划线序列为RT-PCR扩增的核心区域, 黑斜体序列为起始密码子和终止密码子。
在BLAST分析的基础上, 选择10种具有代表性APRT蛋白与Zm APT2蛋白用UPGMA方法进行聚类分析 (图4) 。10种APRT蛋白被分为5个大分支, 所有植物的APRT蛋白组成1个分支, 其中玉米的Zm APT2与水稻2型同源性最高, 而来自动物和细菌的APRT蛋白分别组成了另外4个分支。可见在植物中APRT具有高度的保守性, 属持家基因家族表达的酶。
注:图中APRT缩写:ZM2:玉米APRT 2型 (Zm APT2, Gen Bank登录号AY485263) ;OS2:水稻APRT 2型 (Os APT2, Gen Bank登录号AY238894) ;TA1、TA2:小麦APRT 1型、2型 (Ta APT1、Ta APT2, Gen Bank登录号分别为U22442, AY255503) ;AT1、AT2:拟南芥APRT 1型、2型 (At APT1、At APT2, Gen Bank登录号分别为X58640, X96866) ;HV:大麦APRT (Gen Bank登录号AB012046) 。
3 讨论
尽管各类生物体千差万别, 分子水平上的进化变异也很大, 但不同生物体内功能相同的基因在结构及序列上有很大的保守性, 这是生物体保持其相对稳定、生存和发展的根本。在植物抗病基因克隆中同源序列扩增法分离基因已展示了其应用价值。目前已成功地从12种单子叶和双子叶植物中分离了NBS-LRR基因。但同源序列扩增法较多用于筛选c DNA文库或基因组文库, 近来电子克隆技术因具有投入低、速度快、技术要求低和针对性强等优点, 受到高度重视, 并开始得到了初步的应用。如O′Brien et al[8]以EST数据库为基础电子克隆了5个人类新基因C11orf1-C11orf5。张德礼等[9]采用生物信息学方法克隆了人类SR蛋白新基因, 并结合RT-PCR进行了验证。黄冀等[10]也用此法克隆了水稻的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因Os G6PDH。生物信息学数据库和生物分析软件的飞速发展, 大大提高了分离克隆基因的速度, 全长c DNA克隆是新基因功能研究及生物产品开发的前提, 有助于了解基因在转录后复杂的变异形式。一些作物如小麦、玉米的基因组庞大, 重复序列多, 用常规的图位克隆法难以克隆基因, 现在也可以借助丰富的EST序列资源与RACE结合的电子克隆方法快速获得目的基因全长c DNA。
该研究中运用同源序列设计引物再结合RACE技术克隆了玉米腺嘌呤磷酸核糖基转移酶 (APRT) 基因, 最后通过EST数据库进行验证。这不仅发展了常规的电子克隆方法, 也是一种更为准确、有效的全长c DNA克隆方法。
目前在植物中对拟南芥腺嘌呤磷酸核糖基转移酶 (APRT) 的研究较多, 已经从拟南芥中克隆了3种形式APRT的c DNA, 其中APRT2对细胞分裂素有更高的亲合力, 有明显的花芽表达专一性[11,12]。一些腺嘌呤类似物在APRT催化后产生有毒性的核苷酸, 这已经被用来分离APRT缺失的突变体。在拟南芥中运用这种方法鉴定了2, 6-二氨基嘌呤抗性突变体, 这些突变体APRT酶活性还达不到其野生型活性的1%, 而且它不能转变细胞分裂素苄基腺嘌呤为核苷酸, 说明APRT也参与了这个转变过程, 突变体长的矮小而且缺少活力, 表现雄性不育[6]。Gaillard et al[5]进一步证实在拟南芥不育突变体BM3中, 细胞分裂素代谢变弱, APRT活性下降。细胞分裂素降低也是不育花粉中的一种较普遍现象, Shukla et al[13]等发现在油菜中雄性不育的叶片中表达的腺嘌呤还不到其野生型叶片的50%, 并认为细胞分裂素氧化酶 (CKOs) 和APRT参与了细胞分裂素的代谢途径。因此, 极有可能植物体的雄性不育性与该代谢途径的变化有关, 如果能测定在生殖器官中APRT活性变化, 结果将比叶片的结果更有说服力。张建奎等[14]研究发现小麦育性转换与幼穗中APRT基因转录水平有一定关系。LI et al[15]的研究表明, 水稻温敏核不育系“安农S-1”在高温下Os APT2活性在根、茎、叶中变化不大, 而在小穗中APRT活性下降5倍。高温导致在幼穗中Os APT2下调表达, 而对根、茎、叶中的Os APT2表达无明显影响, 结果有力地表明Os APT2可能与水稻“安农S-1”的温敏雄性不育有关。