国产雷帕霉素范文（精选7篇）
国产雷帕霉素 第1篇
1 资料与方法
1.1 临床资料
选择我院2006年4月—2007年11月急性心肌梗死患者41例, 发病时间<12 h, 行急诊PCI术置入国产雷帕霉素药物洗脱支架。急性心肌梗死诊断标准:持续胸痛>30 min和心电图至少2个相邻胸前导联或导联中2个导联ST段抬高>1 mm, 同时血清心肌酶超过正常参考值2倍。入选41例AMI患者中, 男24例, 女17例, 年龄51岁～79岁 (66.1岁±8.2岁) 。其中前壁心肌梗死18例, 下壁心肌梗死21例, 高侧壁心肌梗死2例。发病到就诊的时间为 (6.4±2.7) h;入院到第一次球囊扩张时间为 (80.4±11.8) min。
1.2 治疗方法
经右侧或左侧股动脉 (6F或7F鞘管) 入路。对伴缓慢性心律失常者预先穿刺股静脉或左锁骨下静脉插入临时起搏电极, 对严重血流动力学不稳定者行主动脉内球囊反搏 (IABP) 。急诊常规冠状动脉造影明确梗死相关冠状动脉 (IRA) , 若IRA病变残余狭窄>70%和心肌梗死溶栓试验 (TIMI) 血流<2级, 术者根据具体情况选择合适的指引导管、导丝通过病变, 根据病变选择球囊扩张或置入支架。所有患者术前均嚼服阿司匹林300 mg, 口服氯吡格雷600 mg (年龄<75岁) , 300 mg (年龄>75岁) , 术后服用阿司匹林75 mg/d～150 mg/d、氯吡格雷75 mg/d, 维持至少12个月。术中肝素100 U/kg, 以维持术中活化凝血时间 (ACT) >300 s。术后4 h～6 h根据ACT值拔除动脉鞘, 使用低分子肝素3 d～7 d。成功标准:梗死相关动脉 (IRA) 前向血流TIMI 3级, 残余狭窄<20%, 未发生与PCI有关的并发症。
1.3 观察指标
患者住院期间记录院内死亡、再发急性心肌梗死和再次靶血管/靶病变重建等主要不良心血管事件 (MACE) 发生率, 出院后定期进行门诊和电话随访, 记录用药、一般情况及MACE, (6～12) 个月时复查冠状动脉造影。分析12个月的病死率、MACE发生率、靶血管/靶病变重建率、支架内再狭窄率、支架内血栓发生率。
2 结 果
2.1 冠状动脉造影结果
前降支病变17例, 回旋支病变8例, 右冠脉病变15例, 对角支病变1例;血管病变100%闭塞34例, >95%狭窄7例;TIMI血流0级35例, 1级～2级4例, 3级2例。
2.2 急诊PCI治疗情况
41例直接PCI患者中38例行支架置入, 其中30例直接置入支架, 8例球囊扩张后置入支架, 共置入46枚国产雷帕霉素药物洗脱支架, 3例行单纯球囊扩张术。置入支架直径 (2.87±0.45) mm, 支架长度 (26.42±7.20) mm, 扩张压力 (15.89±3.47) atm, 手术操作时间 (32.14±6.32) min, 手术均获得成功。
2.3 随访情况
住院期间1例患者于支架置入第5天因输液反应诱发支架内亚急性血栓形成死亡, 其余无死亡及再发心肌梗死发生, 无再发心肌缺血临床表现。随访12个月, 有1例患者术后8个月因再发心绞痛药物治疗无效, 外院冠脉造影显示支架内再狭窄, 行冠脉搭桥手术。26例12个月时复查冠状动脉造影, 1例发生支架内再狭窄, 狭窄程度80%, 因临床无明显缺血症状, 未给予再次血运重建处理。
3 讨 论
急性心肌梗死治疗的关键在于及时、完全的开通闭塞血管, 挽救濒死的心肌细胞, 心肌的再灌注治疗包括药物溶栓和经皮冠状动脉介入治疗两种再灌注治疗手段。相对于药物溶栓, 直接PCI具有以下优势:IRA开通率高达95%以上, 而药物溶栓只有50%～60%;再闭塞率低, 复发缺血事件少;病死率低, 30 d病死率3%左右;出血发生率低;适应证范围广, 适用于90%以上的急性心肌梗死, 而药物溶栓只有1/3的急性心肌梗死患者适合[3]。正是由于上述优势, 所以现在急诊直接PCI已作为急性心肌梗死的首选再灌注治疗手段。
雷帕霉素药物洗脱支架由于其明显的降低支架内再狭窄率, 被广泛用于稳定冠心病的介入治疗中[4], 但由于担心其相对于裸支架较高的支架内血栓事件, 在急诊PCI中的应用仍然存在争议[5,6]。近年来相继国外的一些研究证实了其在急性心肌梗死中应用的安全性和有效性。TYPHOON试验[7]入选了发病在6 h之内的712例STEMI患者, 行急诊PCI, 随机分成雷帕霉素药物支架组和普通支架组, 1年随访结果提示, 和普通支架组比较, 药物支架组有较低的支架内再狭窄率和较少的MACE发生率 (3.5% vs 20.3%;5.9% vs 14.6%, P<0.01) 。近年国产雷帕霉素药物洗脱支架应用于临床极大地降低了手术的费用, 在非急性心肌梗死冠心病患者中的应用也验证了其有效性和安全性[8,9]。本研究在此基础上将国产雷帕霉素药物洗脱支架应用于急性心肌梗死急诊PCI中, 并进行了12个月的随访, 探讨其安全性和有效性。12个月随访结果显示:病死率2.4%, MACE发生率4.8%。
本研究入选的患者1例于支架置入后5 d因输液反应诱发再发心肌梗死, 急诊冠脉造影显示支架内血栓形成, 考虑为支架内亚急性血栓形成, 分析其原因考虑与以下因素有关:患者年龄大, 合并有糖尿病, 慢性肾功能不全等易致血栓形成的高危因素, 输液反应时冠状动脉血管痉挛、血压下降致冠脉灌注减少、上述因素引起冠脉血流急剧减少、支架内血栓形成致急性心肌梗死发生。其余患者随访12个月未发现支架内血栓形成。通过本研究显示注重高危患者, 术前和术后辅以充分的抗凝、抗血小板治疗, 国产药物洗脱支架在急诊PCI中的应用不会产生更多的血栓形成发生。
本研究12个月随访结果显示, 支架内再狭窄率4.8%, 同国外报道相似[10], 国产雷帕霉素药物洗脱支架在降低支架内再狭窄方面效果显著。通过本研究显示, 国产雷帕霉素药物洗脱支架在急诊PCI中的应用具有较好的安全性和有效性。
摘要：目的探讨国产雷帕霉素药物洗脱支架在急性心肌梗死患者急诊经皮冠状动脉介入治疗 (PCI) 中应用的安全性和有效性。方法对41例急性心肌梗死患者罪犯血管行急诊PCI, 共置入了46枚国产雷帕霉素药物洗脱支架。其中前壁心肌梗死18例, 下壁心肌梗死21例, 高侧壁心肌梗死2例。结果41例急诊PCI均获成功, 38例置入支架, 3例仅行单纯球囊扩张, 未发生与PCI相关的并发症, 住院期间1例因输液反应导致支架内亚急性血栓形成死亡, 其余未发生主要不良心血管事件。随访12个月, 有1例术后8个月再次行冠状动脉血运重建术, 其余未发生主要不良心血管事件。结论国产雷帕霉素药物洗脱支架在急诊PCI应用中有较高的安全性和有效性。
关键词：急性心肌梗死,雷帕霉素药物洗脱支架,冠状动脉介入术
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国产雷帕霉素 第2篇
注:LAD左前降支、LCX-左回旋支、RCA-右冠脉
1 对象与方法
1.1 研究对象
自2008年1月至2010年1月, 接受Partner支架治疗的ISR病变患者共24例, 患者平均年龄 (59.75±12.87) 岁 (30～80岁) , 其中男性20例 (83.3%) 。
1.2 支架内再狭窄 (ISR) 定义
支架内及支架治疗段 (支架边缘5mm以内) 造影行QCA测定管腔径狭窄程度≥50%定义为支架内再狭窄。
1.3 手术方法及器械选择
患者均经右桡动脉穿刺, 使用7F Judkins导引导管或6F Judkins导引导管。26例患者共有ISR病变26处, 植入Partner支架28枚 (直径2.5～3.5mm, 长度15～36mm) , 9处病变实行直接支架术, 余19处病变均使用直径1.5～2.5mm球囊预扩张 (8～12大气压) 后再植入支架 (12～20大气压) , 支架串联重叠部分长度为3～4mm重叠部分进行球囊后扩张 (14～16atm) 。
1.4 随访观察
住院期间手术成功率、严重并发症。术后随访采用1年内定期每个月门诊或电话随访, 术后6～9个月再次行冠状动脉造影复查。
2 结果
2.1 临床及影象学病变特点
本组患者共包括稳定型心绞痛10例 (25%) , 急性冠脉综合征16例 (包括急性ST段抬高型心肌梗死5例, 不稳定型心绞痛11例) 。合并病史, 见表1。
2.2 患者病变特点
从表2中可看出:LAD发生ISR病变的比例最高;支架内弥漫病变占50%以上。
2.3 手术结果 (表3)
从表3中可看出术后所有病变无任何残余狭窄, 常需要高压释放支架 (平均支架释放压力为14.8atm;支架/病变直径比例为1∶1) 。
2.4 手术近、远期效果:
手术即刻成功率100%, 住院期间的心绞痛复发率、病死率、非致死性心肌梗死率及急诊再次血运重建率 (再次PCI或CABG) 均为0%。平均随访9个月, 无死亡病例, 临床心绞痛复发率、非致死性心梗发生率、再次血运重建率均为0%, 13例患者术后6～9个月行冠脉造影复查, 原ISR植入Partner支架处均未见明显狭窄。
3 讨论
现已公认支架内再狭窄 (ISR) 发生的主要原因是支架植入局部的血管内膜组织过度增生, 血管壁的重构也参与其中, 而支架本身的形状改变 (支架弹性回缩) 似乎与ISR关系不大。支架内再狭窄目前常应用再次支架植入术进行治疗, 通过抑制血管内膜组织过度增生而起到降低再狭窄发生率的作用。其适应证为:管腔残余狭窄>50%, 球囊扩张后出现较大的夹层。在2003年欧洲心脏病学年会 (ESC) 上, Philippe Commeau等报道了23例患者, 共有34处ISR病变接受了雷帕霉素支架治疗, 1个月内有2例发生非Q波心梗, 1例与靶病变无关, 1例为术后5d发生亚急性血栓;8个月的造影随访正在进行中。最近公布的ISAR-DESIRE试验结果比较了裸支架与药物支架治疗ISR病变的疗效, 发现9个月临床随访TVR在2组为8%和19%, 提示药物洗脱支架疗效明显优于裸支架。
本组24例患者26处ISR病变中应用Partner支架结果, 即刻手术成功率100%, 住院期间无不良心性事件发生, 平均随访9个月, 无一例死亡, 无一例心绞痛/心梗发生, 提示Partner支架在ISR病变中的应用是安全的、有效的, 符合目前国外临床研究的资料结果。其中13例患者在6～9个月后复查冠造, 均未发生再狭窄。
雷帕霉素洗脱支架释放雷帕霉素, 然后进入细胞内, 并与特异性细胞内受体FKBP12结合形成雷帕霉素/FKBP12复合体, 高度特异性抑制mTOR (哺乳动物雷帕霉素作用靶点) , 使TOR失活, 阻断细胞周期进程, 抑制细胞增殖。雷帕霉素通过抑制VSMC增生、减少VSMC迁移、上调p27表达、抑制RHoA的活性、抑制细胞大小、影响细胞外基质的合成、抑制损伤后血管内炎症等作用有效抑制新生内皮形成, 从而降低再狭窄。如果这种效果得到大规模、长期随访资料的证实, 国产药物洗脱支架将为ISR病变的治疗提供一新的途径。
摘要：目的 评价国产雷帕霉素洗脱支架 (LEPU MEDICAL公司, Partner支架) 在支架内再狭窄病变 (ISR) 中应用的安全性及近期疗效。方法 分析24例植入Partner支架的ISR病人的一般临床资料、手术操作技巧、手术前后影像学结果、住院期间主要不良心性事件 (MACEs, 死亡、非致死性心梗、心绞痛复发等) 发生、出院后随访等结果。结果 该组患者中75%表现为急性冠脉综合征;70%以上的患者病变位于LAD;病变平均内径由术前0.40mm增加到了术后3.14mm;所有患者住院期间无MACEs发生;平均随访 (9.5±3.23) 个月 (1～11个月) , 无死亡病例, MACEs事件为0%, 2例患者术后7个月复查冠脉造影, 原支架内未见明显狭窄。结论 Partner支架在ISR病变中的应用近期内是安全、有效的。
关键词：雷帕霉素,洗脱支架
参考文献
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雷帕霉素的研究进展及临床应用 第3篇
雷帕霉素 (rapamycin, RAPA) 是一种新型大环内酯类免疫抑制剂。最新研究表明:RAPA通过不同的细胞因子受体阻断信号传导, 阻断T淋巴细胞及其他细胞由G1期至S期的进程, 从而发挥免疫抑制效应。RAPA已通过美国食品和药品管理局 (FDA) 认证, 临床上表现出强大的免疫抑制作用, 可代替已有30多年临床史的环孢素;而且与环孢素相比, RAPA口服液的剂量更小, 抗排异作用更强, 不良反应更少。因此, 自RAPA上市后, 迅速成为世界各地器官移植者的常用口服免疫抑制剂。现就RAPA的临床研究进展做一综述。
1 RAPA的作用机制
RAPA是一种新型免疫抑制剂, 进入细胞后能与FK-结合蛋白12 (FK-BP12) 结合形成复合物, 该复合物能与哺乳动物雷帕霉素靶分子 (mammalian target of rapamycin, mTOR) 结合, 阻止细胞周期G1期向S期的转化, 抑制蛋白质翻译的启动, 从而实现抗增殖作用[1]。目前, RAPA作为一种免疫抑制剂主要用于器官移植后的患者, 包括肾移植术后。近年来还发现RAPA对慢性肾脏疾病 (CKD) 患者的肾脏具有保护作用。
2 RAPA的试验研究进展
糖尿病肾病作为糖尿病的常见并发症之一, 已成为终末期肾脏病的主要原因之一。肾小球肥大、肾小球基膜 (glomerular basement-membrane, GBM) 增厚、足细胞损伤和系膜基质增生是糖尿病肾病主要的病理学特征。GBM增厚是糖尿病肾病典型的病理学表现, 而GBM成分的改变, 如Ⅳ型胶原的堆积是主要原因之一[2]。RAPA是mTOR的特异性抑制剂。最近研究表明, PI3-K/Akt/mTOR/eIF4E (PI3-K:磷脂酰肌醇-3激酶、Akt:蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶、eIF4E:真核细胞起始因子4E) 途径在糖尿病肾病中起着重要的作用。RAPA与mTOR的FK-BP12结构域结合后, 能够抑制mTOR的作用, 延缓糖尿病肾病的进展。研究显示, 高糖可引起足细胞Ⅳ型胶原表达升高。在成纤维细胞中的研究[3]显示, Ⅰ～Ⅲ型胶原表达的升高与PI3-K/Akt/mTOR有关。也有研究表明, RAPA能够抑制高糖刺激引起的足细胞Ⅳ型胶原α3和α5链表达上调, 提示mTOR蛋白表达改变可能与足细胞Ⅳ型胶原表达改变有关。还有研究提示, 调节mTOR信号通路可能为糖尿病肾病的治疗提供了一条新途径。
多种动物模型研究发现, RAPA具有减少蛋白尿、减轻肾小管间质纤维化等作用。Bonegio等[4]在HN大鼠中应用RAPA也证实了其减少蛋白尿的作用。RAPA治疗使蛋白尿明显减少, 小管间质炎性反应和纤维化明显减轻, 还完全抑制了由于蛋白尿和肾组织减少引起的肾小球和肾脏肥大, 说明单用RAPA即可有效地抑制疾病的进展。2007年西班牙学者所进行的2项研究提示, RAPA对狼疮性肾炎具有预防及治疗作用。其中1项研究发现, RAPA能减少狼疮鼠 (NZBxNZW) F1雌性小鼠蛋白尿水平, 降低血清抗DNA 抗体量, 并几乎逆转了所有的组织学损伤, 包括系膜扩张、毛细血管内增生、肾小球沉积物、毛细血管外增生、间质浸润、小管萎缩和间质纤维化[5]。而在另一项研究中, RAPA抑制了狼疮鼠 (NZBxNZW) F1雌性小鼠自身抗体的产生、免疫球蛋白在肾小球的沉积及蛋白尿的产生, 小鼠的存活期也得到了延长[6], 说明RAPA能阻止狼疮鼠 (NZBxNZW) F1雌性小鼠发展成狼疮病。
3 RAPA的临床研究进展
RAPA具有很好的抗排斥作用, 且与环孢霉素A (Cyclosporin A, CsA) 和他克莫司 (FK506) 等免疫抑制剂具有良好的协同作用, 是一种疗效好、低毒、无肾毒性的新型免疫抑制剂。Hricik等在44例肾移植患者中应用RAPA、FK506、皮质类固醇治疗, 但未应用抗体诱导, 允许术后3个月撤掉泼尼松, 以后的急性排斥率很低, 与激素治疗相关的高血压恢复。
mTOR是一个289KD的高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶, 属于PI3K相关激酶家族, 对细胞的代谢、生长、增殖、生存和细胞骨架运动等生物过程的调节起着重要的调控作用。研究发现, mTOR信号通路参与了肿瘤的形成、血管新生、胰岛素抵抗、T淋巴细胞激活等过程[7]。冠心病是威胁人类健康的主要杀手之一, RAPA涂层支架的出现和应用显著改善了冠状动脉再狭窄事件的发生率。但RAPA作为mTOR抑制剂在抑制血管平滑肌增殖、迁移的同时, 也显著抑制了血管内皮细胞的增殖迁移, 由此引起的“支架内皮化不全—支架内血栓形成—冠状动脉再狭窄”临床事件仍有发生, 这已经成为目前心血管届关注的焦点之一。尽管支架内再狭窄是由多因素参与的复杂的病变过程, 但内皮细胞迁移抑制是其中重要的因素之一。张慧敏等[8]研究发现, 在体外培养的内皮细胞中, 添加RAPA可显著抑制内皮细胞的迁移, RAPA对内皮细胞迁移的抑制不完全是浓度依赖性的, 并由此提出:如果RAPA涂层支架植入冠状动脉后, 能使RAPA在血液中的释放浓度保持在100nM左右, 既能有效地抑制平滑肌细胞的增殖和迁移, 又能最大程度地减轻RAPA对内皮细胞增殖和迁移的抑制, 这样有助于减轻支架表面再内皮化障碍, 从而减少支架内血栓形成所致的冠状动脉再狭窄的发生率。但此设想有待于临床试验证实。
有临床试验提示, RAPA对治疗原发性和某些继发性肾脏疾病可能有益, 但目前关于RAPA在CKD患者中应用的临床研究很少, 在有限的研究中, 得出的结论也比较矛盾。Tum lin等进行了一项前瞻、开放的RAPA治疗非免疫因素引起的局灶节段性肾小球硬化 (FSGS) 的临床研究, 提示RAPA通过改善肾小球的超滤和滤过选择性而减少蛋白尿。Cho等[9]的研究发现, RAPA治疗FSGS患者会出现严重的肾脏毒性。由于以上研究所纳入的患者数目均较少, 患者的入选标准也不一致, 因此目前尚不能得出一个明确的结论, 还需要大规模的临床试验来验证RAPA在CKD治疗中的作用。
总之, RAPA具有提高移植生存率、降低急性排斥反应发生率、降低感染率及不良反应较少等特点。目前, RAPA、FK506与CsA均是器官移植中最重要、最基础的免疫抑制剂。RAPA是未来治疗CKD一种较有潜力的药物, 但其不良反应也不容忽视。在应用该药物时, 应仔细评估个体患者病情, 权衡利弊, 并密切监测。需要再次指出的是, 目前以RAPA为基础方案治疗CKD的研究甚少, 其带来的益处及危险尚须进一步的研究来证实, 特别是大型的前瞻性随机临床试验。
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国产雷帕霉素 第4篇
关键词：心肌缺血再灌注损伤,雷帕霉素,肌酸激酶,乳酸脱氢酶,超氧化物歧化酶,丙二醛
心肌缺血再灌注(myocardial ischemia/reperfusion,MI/R)损伤是一个复杂的病理生理过程,其损伤程度可决定缺血性心脏病的治疗和预后[1[1],目前对于MI/R损伤的防治尚无突破性研究进展。雷帕霉素(rapamycin,RPM)是一种新型大环内酯类抗生素,具有较强的免疫抑制作用,临床上常用于自身免疫性疾病和器官移植后排斥反应的治疗[2[2]。近年研究证实,RPM对缺血再灌注动物的肝、肾、脑等器官损伤具有一定的保护效应[3-5[3,4,5]。本研究应用MI/R损伤大鼠模型,探讨RPM的心肌保护作用及其可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
SD大鼠,雌雄各半,体重200g±20g,由河北医科大学实验动物中心提供,许可证号:SCXK(冀)2008-1-003。
1.2 药品和试剂
RPM购自Sigma公司,用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配成所需浓度。氯化硝基四氮唑蓝(nitrotetrazolium blue chloride,NBT)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)试剂盒、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)试剂盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。其他试剂均为国产分析纯。
1.3 实验方法
1.3.1 建立MI/R损伤模型
采用冠脉结扎法建立MI/R损伤模型[6[6]。取大鼠,术前12h禁食不禁水,戊巴比妥钠35mg/kg腹腔注射麻醉后,仰位固定,四肢连接ECG-1350P型十二导联心电图机。颈部分离气管,插入气管插管,连接DW-3000型动物人工呼吸机(呼吸频率60次/min,潮气量2 mL/100g)。顺肋间隙方向于胸骨左旁第3、4肋间开胸,分别在第3、4肋上环绕1根0号手术线,牵拉手术线使肋骨撑开,暴露心脏,沿左心耳下缘冠脉前降支起始部3 mm~4mm处用4-0带线缝合针穿过,进针深度控制在0.1cm左右,将一小段直径1.5mm的乳胶管置于结扎线下,收紧结扎线以造成心肌缺血,约30min后(冠脉结扎成功的标志:心电图ST段明显抬高或T波高耸),松开结扎线再灌注120 min(再灌注成功的标志:抬高的ST段下降50%以上或高耸的T波下降)。结扎前心电图不正常者,未到观察终点而死亡者及造模不成功者剔除。
1.3.2 分组与给药方法
将成模大鼠随机分为模型组和RPM组,每组10只。另取10只大鼠,开胸但不结扎冠脉,作为假手术组。各组于术前3d开始灌胃给药,每天1次,RPM组剂量按5mg/kg,假手术组和模型组给予等体积0.5%CMC-Na。
1.3.3 血清指标的测定
再灌注结束后,各组动物由股动脉采血,3 500r/min离心10min得血清,采用比色法测定CK活力和LDH活性,羟胺法测定SOD活性,硫代巴比妥酸法测定MDA含量,操作按试剂盒说明书进行。
1.3.4 心肌梗死面积测定
取血后处死大鼠,迅速摘取心脏,用PBS缓冲液冲洗干净,滤纸拭干,去除心房、血管及脂肪组织,在冠脉结扎线下,从心尖起将心室平行切成厚度相等的5片,放入0.1%NBT溶液中,37℃染色15 min。梗死心肌呈灰白色,正常心肌则呈蓝色,用数码相机进行图像采集,导入电脑,通过图像分析软件ImagePro Plus 7.0测算梗死区面积和心室总面积,计算心肌梗死面积(%)[7[7]。
1.4 统计学处理
采用SPSS 18.0软件进行统计处理,计量资料以均数±标准差( ±s)表示,多组间比较行单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 3组心肌梗死面积比较
模型组大鼠心肌梗死面积31.65%,RPM可使心肌梗死面积缩小至26.00%,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。
与模型组比较,1)P<0.05。
2.2 3组血清CK活力和LDH活性比较
心肌缺血30min再灌注120 min后,模型组大鼠血清CK活力和LDH活性比假手术组明显升高,组间差异均有统计学意义(P<0.01);RPM组可显著降低血清CK活力和LDH活性,与模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。详见表2。
与假手术组比较,1)P<0.01;与模型组比较,2)P<0.05,3)P<0.01。
2.3 3组血清SOD活性和MDA含量比较
心肌缺血30min再灌注120 min后,模型组大鼠血清SOD活性比假手术组显著降低,MDA含量则比假手术组明显升高(P<0.01)。RPM组血清SOD活性显著升高,而MDA含量显著降低,与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。详见表3。
与假手术组比较,1)P<0.01;与模型组比较,2)P<0.01。
3 讨论
药物预处理可通过促使机体释放生物活性物质或直接激活保护机制而增强心脏对缺血、缺氧的耐受,实现对缺血再灌注所致心肌损伤的保护作用[8[8]。本研究采用缺血前给药的方式观察RPM预处理对MI/R损伤的保护作用,结果显示RPM能显著缩小心肌梗死面积,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.0 5)。MI/R发生时心肌酶如CK、LDH等的释放量增加,其释放入血的多少被认为与心肌坏死程度呈正相关[9[9],因此,测定血清心肌酶活性可作为MI/R损伤程度的诊断标准之一。本研究结果表明:RPM预处理可显著抑制血清CK活力和LDH活性(P<0.05或P<0.01),进一步说明RPM的心肌保护作用。
国产雷帕霉素 第5篇
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取2010年1月 -2013年7月在郑州人民医院肝胆胰外科诊断PLC肝移植术后肿瘤复发的患者27例,临床和病理确诊为晚期肝细胞癌患者(2001年第八届全国肝癌会议标准)[2]。雷帕霉素作为免疫抑制剂在肿瘤复发后继续使用,其中接受索拉菲尼联合雷帕霉素治疗的患者12例;接受雷帕霉素单药治疗的患者15例。所有患者均为初次肝移植;肿瘤复发时检测HBV-DNA均为阴性,未出现乙型肝炎病毒再感染;均无手术指征,不能或不愿意接受介入栓塞化疗(TACE);预计生存期≥3个月。患者的临床资料见表1,两组患者的基本情况比较差异均无统计学意义。
1.2 治疗方法
本研究应用由德国拜耳医疗保健公司生产的甲基磺酸索拉菲尼片剂(商品名为多吉美),雷帕霉素为美国Wyeth公司产品。按治疗方案不同分为联合治疗组,共12例患者接受索拉菲尼联合雷帕霉素治疗;单药治疗组,共15例患者接受雷帕霉素治疗。
单药治疗组:口服雷帕霉素,1次 /d,将雷帕霉素的血药浓度控制在4~8 ng/ml。联合治疗组:在同样口服雷帕霉素基础上再口服索拉菲尼400 mg/次,2次 /d,直至病情进展或患者死亡。
1.3 随访
两组患者均按本院肝脏外科中心的随访计划随访≥1次 / 月,全面评价病情。随访内容包括:血尿常规、肝肾功能、甲胎蛋白、雷帕霉素血药浓度、凝血时间、增强CT或MRI(每2个月1次)、排斥反应及药物不良反应等情况。
1.4 疗效评价
根据世界卫生组织的实体肿瘤疗效评估标准(RECIST)[3]进行疗效评估,分为完全缓解(complete remission,CR):全部病灶消失,无新病灶出现,肿瘤标志物降至正常,并维持≥4周;部分缓解(partial remission,PR):肿瘤最大径之和缩小≥30%,并维持≥4周;疾病稳定(stable disease,SD):肿瘤最大径之和缩小未达PR,或增大未达PD;疾病进展(disease progression,PD):最大径增大≥20%,或出现新病灶,但原病灶分裂不应算在内。药物不良反应的评价采用美国国家癌症研究所常见毒性反应标准(NCI-CTC)2.0版[4],对两组患者的不良反应进行评价和分级。
对联合治疗组和单药治疗组患者的临床疗效,包括发生肿瘤进展例数、死亡例数、肿瘤中位进展时间(95%CI)、中位总生存时间(95%CI)、中位肿瘤无进展生存时间(95%CI)、6个月总生存率、6个月肿瘤无进展生存率、12个月总生存率、12个月肿瘤无进展生存率等,及两组患者的不良反应等情况进行比较分析。
1.5 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析,计量资料用t检验,计数用χ2检验,P <0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 临床疗效
所有患者均获完整随访,最长随访时间25个月,中位时间9.6个月。两组患者的临床疗效比较,差异均有统计学意义,见表2。
参照RECIST标准,联合治疗组PR 1例,SD 3例,PD 8例;单药治疗组SD 2例,PD 13例。联合治疗组和单药治疗组患者的疾病控制率(CR+PR+SD)分别为33.3%和13.3%,差异有统计学意义(P <0.05)。
2.2 不良反应
两组患者的不良反应均较轻,为NCI-CTC 1、2级。联合治疗组患者常见的不良反应包括白细胞减少、手足皮肤反应、高脂血症、皮疹、腹泻、恶心、呕吐、腹痛、乏力等,经对症处理后患者均能耐受,无患者因药物不良反应而终止治疗;单药治疗组患者常见的不良反应有白细胞减少及高脂血症。两组患者在随访期间均无急性排斥反发生应。两组患者的不良反应发生率比较,差异均无统计学意义(P >0.05)。见表3。
3 讨论
索拉菲尼是第一种对PLC有治疗效果的多激酶抑制剂[5],LIOVET等[6]报道索拉非尼治疗肝癌的Ⅲ期临床试验,结果显示索拉菲尼是第1个可以显著延长晚期PLC患者总体生存时间的药物,并且耐受性良好。索拉菲尼的应用开创PLC分子靶向治疗的新时代,国际抗癌协会于2008年正式推荐索拉菲尼作为不能手术切除的肝细胞癌的一线治疗用药。
近年来有越来越多的研究发现[7],雷帕霉素在发挥免疫抑制效应的同时,还具有抗肿瘤作用。TOSO等[8]报道了一组大样本的临床研究,2 491例PLC肝移植患者接受不同的免疫抑制剂治疗,研究者发现以雷帕霉素为主的免疫抑制方案,能明显提高患者的生存率。与非雷帕霉素组相比,雷帕霉素组患者5年生存率提高了14.4%,差异有统计学意义,而雷帕霉素却不能提高非PLC肝移植患者的5年生存率,说明雷帕霉素具有一定的抗肿瘤作用,并且能明显提高患者的生存率。CHINNAKOTLA等[9]对符合米兰标准的227例PLC肝移植患者进行一项回顾性病例对照研究,两组患者中,106例使用他克莫司及霉酚酸酯,121例使用雷帕霉素。结果显示雷帕霉素组患者的无瘤生存率明显高于他克莫司组患者,雷帕霉素组1、3和5年生存率分别为94%、66%和59%,差异有统计学意义,而两组的不良反应发生率比较差异均无统计学意义。提示PLC肝移植术后患者使用雷帕霉素可以抑制肿瘤复发,提高无瘤生存时间及总生存时间,并且不增加不良反应发生率。
本研究通过回顾性分析索拉菲尼联合雷帕霉素治疗的12例和雷帕霉素治疗的15例PLC肝移植术后肿瘤复发的晚期患者的资料,进行对照评估。可以看出,相对于单药治疗组联合治疗组具有更长的中位肿瘤进展时间、总生存时间和肿瘤无进展生存时间,而且联合治疗组患者的中位肿瘤进展时间和总生存时间也优于既往报道的索拉菲尼单药治疗组[6,10]。另外,两组药物的不良反应相当,不影响治疗,亦不增加排斥反应发生率。初步说明索拉菲尼联合雷帕霉素治疗PLC肝移植术后复发的晚期肿瘤患者可能具有一定的协同作用,但本研究病例数量有限,索拉菲尼联合雷帕霉素对PLC肝移植术后肿瘤复发的晚期患者预后的影响,还需临床大样本研究资料进一步证实。
摘要：目的 探讨索拉菲尼联合雷帕霉素治疗原发性肝癌(PLC)肝移植术后肿瘤复发患者的疗效及不良反应。方法 回顾性分析2010年1月-2013年7月在郑州人民医院肝胆胰外科接受索拉菲尼联合雷帕霉素治疗的联合治疗组(12例)和接受雷帕霉素治疗的单药治疗组(15例)PLC肝移植术后肿瘤复发患者的临床资料,进行对照评估、疗效判定及不良反应分析。结果 相对于单药治疗组,联合治疗组有更长的中位肿瘤进展时间、总生存时间和肿瘤无进展生存时间;参照实体肿瘤疗效评估标准(RECIS T),联合治疗组和单药治疗组患者的疾病控制率分别为33.3%和13.3%(P<0.05);两组药物的不良反应相当,不影响治疗。结论 初步说明索拉菲尼联合雷帕霉素治疗PLC肝移植术后晚期肿瘤复发可能具有一定的协同作用。
国产雷帕霉素 第6篇
1 m TOR的生理特点
m TOR是一种十分保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶, 是磷脂酰肌醇激酶相关激酶 (phosphatidylinasitol kinaserelated kinase, PIKK) 蛋白家族成员。其由2549个氨基酸组成, 分子量为289 k D, 广泛存在于各种生物细胞中[6]。m TORC1 (m TOR complex 1) 和m TORC2 (m TOR complex 2) 是m TOR在细胞内的两种蛋白复合物。其中m TORC1包含m TOR和Raptor (regulatory associated protein of m TOR) , 而m TORC2也包含m TOR和Rictor (rapamycin-insensitive companion of m TOR) 。m TORC1活性受雷帕霉素 (RAPA) 抑制, 主要调控细胞内蛋白质翻译、细胞凋亡等生理活动;相反m TORC2对RAPA耐受, 其主要参与细胞极性的调节[7], 并可调控蛋白激酶B (protein kinase B, PKB) 的活化, 而PKB又可以作用于m TORC1, 因此, 我们可以认为m TORC1和m TORC2之间相互作用的联接点就是PKB[8]。
2 m TOR信号传导通路
2.1 m TOR的上游信号通路
PKB是调节细胞存活、增殖、生长的一类核心信号分子。m TOR是PKB的重要底物之一。而PKB又能激活m TOR和其下游的信号通路。胰岛素样生长因子 (insulinlike growth factors, IGFs) 与胰岛素样生长因子受体 (insulin-like growth factor-I receptor, IGF-IR) 结合后可形成配基受体复合物[9], 在此复合物形成后, IGF-IR残基通过自磷酸化的方式被激活, 而被激活后的IGF-IR又能活化胰岛素受体底物1 (insulin receptor substrate-1, IRS-1) , 激活后的IRS-1又能磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶 (phosphoinositol 3-kinase, PI3K) 使之激活[8], 活化后的PI3K可使下游靶蛋白PKB磷酸化, 而磷酸化后的PKB有能促使初步激活的m TORC2发生磷酸化, 使其完全活化, 从而进一步促进了蛋白质的合成以及细胞的生长[10]。
2.2 m TOR的下游信号通路
m TOR的下游分子主要有4E结合蛋白1 (e IF-4E binding protein 1, 4E-BP1) 和p70核糖体S6蛋白激酶 (p70 ribosomal S6 protein kinase, p70S6K) , 它们同为m TOR下游分子中最经典的两个底物, 并且是m RNA的翻译与转录的关键调节因子。
真核起始因子4E (eukaryotic initiation factor 4E, e IF-4E) 是一种帽结合蛋白, 4E-BP1可与之结合, 从而来调节蛋白质的翻译, 同时4E-BP1又对e IF-4E有一定的抑制作用。m TOR可以使4E-BP1发生磷酸化, 低磷酸化的4E-BP1具有较高的亲和能力, 而高磷酸化的4E-BP1可以很容易的被e IF-4E所释放, 从而降低了其对e IF-4E的抑制作用, e IF-4 E即可与其他翻译起始因子组成复合物, 启动m RNA的翻译[11]。
p70S6K是m TOR信号传导通路中的重要因子, 它在调节细胞生长和增殖的过程中起到重要的作用。被m TOR磷酸化活化的p70S6K能促使40S核糖体亚单位S6蛋白发生磷酸化, 使其参与核糖体翻译, 从而促进m RNA的翻译[12]。
2.3 m TOR信号通路的传导
m TOR信号通路的活化起始于生长因子、营养因子、胰岛素等信号对受体酪氨酸激酶 (receptor tyrosine kinase, RTKs) 的活化, RTKs被活化后主要通过PI3K/PKB/m TOR和细胞外调节蛋白激酶 (extracellular regulated protein kinases, ERK) /m TOR两条通路传导信号, 而这两条信号传导通路最终都以调节m TOR活性的方式来干扰蛋白质表达的高低。因此认为, m TOR信号传导通路可能是PI3K与ERK两条通路交汇的通路[12]。m TOR具有调节细胞生长、增殖的功能, 此特性与其位于通路交汇点, 具有多位点调节、多层次调节方式相对应。
PKB在PI3K/PKB/m TOR信号传导通路中有重要意义, 其对此通路的活化起着重要的作用, PKB被磷酸化可以正调控m TOR信号通路。而m TOR信号传导通路的激活又对PKB的活性起到一定的负反馈抑制作用。PKB活化后直接作用于肿瘤抑制基因TSC2 (tuberous sclerosis complex 2, TSC2) 使其磷酸化失活, TSC2可通过负向调节m TOR信号通路控制细胞的生长, 从而使细胞通过G1期。同时复合物m TORC2能够磷酸化PKB碳末端的丝氨酸残基, 所以认为m TOR对PKB的负反馈调节, 则可能是PKB的活化引起复合物m TORC1的组装, 两种m TOR复合物的平衡被打破, m TORC2的活性降低, 从而抑制PKB的活性[13]。另外PKB还可不通过TSC2直接磷酸化PRAS40 (proline-rich Akt substrate 40 k Da) 来活化m TORC1[14]。
3 m TOR与阿尔茨海默病的联系
3.1 m TOR与记忆功能
人类大脑记忆功能有瞬时记忆、短时记忆、长时记忆 (又称永久记忆) 三个阶段, 在短时记忆转变为永久记忆的过程中需要新的蛋白质参与, 而m TOR恰恰是一种调控蛋白质翻译起始阶段的蛋白激酶, 因此m TOR在整个过程中起到相当重要的作用[15]。有研究表明, m TOR的拮抗剂在记忆的行为学任务中, 可以影响永久记忆的形成, 在依赖于海马组织的空间记忆、依赖于杏仁体的线索条件恐惧记忆、依赖于前额叶皮层的痕迹性条件恐惧记忆、依赖于味觉皮层的味觉厌恶等不同的行为学任务中, m TOR都能影响永久记忆, 而对短时记忆则没有任何影响[16,17,18,19]。由上可知, 如m TOR的活性被抑制, 将会损伤永久记忆功能, 那么增强m TOR的活性后, 是否可以提高大脑的记忆功能呢?
近年研究表明, 增强m TOR-Raptor的功能可以提高脑永久记忆能力, 但是, 如m TOR-Raptor过度的升高, 不单不能提高记忆能力, 反而会损伤记忆功能, 影响记忆能力[20]。而此时, 如能少量的应用雷帕霉素, 反而可以逆转受到影响的记忆能力, 因此认为m TOR-Raptor的激活在短时记忆变为永久记忆的过程中起到重要作用, 但m TOR-Raptor的异常改变, 不管是升高还是降低, 对永久记忆功能都是有害的[21]。
3.2 m TOR与阿尔茨海默病
m TOR-Raptor不仅在正常的永久记忆形成的过程中起着关键作用, 而且在疾病状态下对脑记忆功能也有一定的影响。在对AD小鼠模型的研究中发现, 雷帕霉素可以改善AD小鼠的记忆能力, 但同样剂量的雷帕霉素对正常小鼠的记忆能力却没有影响[22], 同时有研究发现, 在一些类似阿尔茨海默病的神经退行性疾病的病程中, m TOR信号传导通路也存在异常变化。这些疾病有一个共同点:大脑中特定的区域有大量的神经元丢失, 这可能是由于m TOR信号传导通路的异常变化导致的退变[22,23,24,25]。
通过对AD小鼠海马细胞及动物模型的研究可以看出, 高表达的m TOR在病理学上和Aβ呈时间和空间上的平行相关性。在AD模型小鼠中发现, RAPA通过阻断m TOR降低了神经元内Aβ的沉积, 脑内致病Aβ的表达水平相应减少[26]。与此相反, 有研究发现, 将小鼠神经瘤母细胞暴露于Aβ1-42中可导致m TOR/p70S6K通路的持续下调, 另外, 在对APP-PS1双转基因AD模型小鼠的研究中发现, 小鼠脑内海马组织和大脑皮层细胞中, 同样存在m TOR/p70S6K通路下调的现象, 这进一步说明AD的发病与m TOR的下调有关[27]。此外, 近年研究表明, 基础量m TOR的表达对学习和认知等生理功能来说是必须的, 但m TOR信号传导通路的过度活化反而会导致认知功能障碍。上述两方面的研究出现了m TOR活性上调和下调的两种不同研究结果, 但更多的是倾向AD患者体内m TOR的活性下调。尤其是2010年初Caccamo等[28]发现, 喂养AD小鼠含有m TOR特异性拮抗剂雷帕霉素的食物, 可以缓解其已出现的记忆障碍症状, 更加有力的支持了AD患者体内m TOR活性下调的观点。
综上所述, 我们可以发现, m TOR及其信号传导通路在AD的发生、发展过程中起到了重要的作用。调控m TOR的活性, 可以影响AD小鼠认知功能、记忆功能以及脑神经元的缺失, 所以我们可以通过这一方法来预防和治疗AD的发生和发展。但在AD的发病过程中m TOR信号传导通路如何调控Aβ的表达水平?其具体的分子机制是怎样的?m TOR信号传导通路与其他通路之间存在何种相互作用的关系?这些问题都需要进一步的研究。相信上述问题的研究, 对进一步阐明m TOR信号传导通路在AD病程中的分子机制, 以及寻找到特异性靶点和临床治疗AD, 均具有重要的现实意义。
摘要：阿尔茨海默病 (Alzheimerdisease, AD) 是一种神经退行性疾病, 其病理特征包括大脑局部, 尤其是海马和皮层神经元退行性病变、细胞内神经原纤维缠结和细胞外老年斑沉淀, 老年斑的主要成分是β-淀粉样蛋白 (β-amyloid protein, Aβ) 的42肽段形式 (Aβ1-42) , 研究显示, Aβ的沉积可以增强哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin, mTOR) 信号传导, 同时, mTOR信号通路异常与AD的发病机制又有着密切关系, 调控这一通路有可能成为防治AD的新思路。本文对近年来mTOR与AD发病机制相关的研究作一综述。
国产雷帕霉素 第7篇
1 材料与方法
1.1 细胞株及培养
人淋巴瘤细胞株Raji细胞由河北省医科大学第四医院科研中心提供。 将细胞于含10%的胎牛血清( FBS) 、100 IU/ml青霉素和100 IU/ml链霉素RPMI 1640 培养基中,37℃饱和湿度和5%二氧化碳浓度条件下培养。
1.2 实验药物和主要试剂
雷帕霉素( 宜欣可) 由华北制药集团新药研究开发有限责任公司惠赠( 批号060801) 。 胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司,RPMI 1640 培养基:美国GIBCO公司,HRP羊抗兔Ig G、四甲基偶氮唑盐( MTT) 、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、二硫苏糖醇、过硫酸铵、十二烷基磺酸钠、四甲基乙二胺均使用Sigma公司产品,Beclin1 抗体购自美国Santa Cruz公司,RIPA细胞裂解液购自北京Solarbio生物技术公司,PVDF膜购自美国Millipore公司,化学增强发光试剂盒( Western blot Chemiluminescence Reagent Kit) 使用美国Santa Cruz公司产品。
1.3 MTT法分析细胞增殖
取处于对数生长期的Raji细胞,加入96 孔板,每孔200μl,加入不同浓度的雷帕霉素( 终浓度分别为1、5、10、20、40、50 及100 nmol/L),同时设对照组。分别于37℃培养24、48 及72 h,在实验结束前,于每孔加入20μl 5 mg/ml的MTT,培养4 h,1 000 r/min离心5 min去上清液后每孔加入150μl DMSO,震荡溶解,用酶联免疫检测仪测定每孔吸光度,测定波长570 nm,参考波长620 nm。 抑制率( %)=( 1- 实验组光吸收值/ 对照组光吸收值)×100%。 以细胞抑制率对剂量的对数作图,通过线性回归拟合法可求出雷帕霉素对Raji细胞的IC50值。
1.4 流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡
收集经不同浓度、不同时间雷帕霉素处理后的具有活性的Raji细胞,70%冰乙醇4℃固定12 h,PBS洗涤、离心,加Binding Buffer液重悬,加入Annexin V- FITC,室温染色15 min后加入碘化丙啶( PI) 染液,4℃避光染色30 min。 流式细胞仪( Coulter EPICSXL Ⅱ型) 测定细胞周期和细胞凋亡。 用Muticycle AV分析软件对DNA细胞周期进行拟合分析。 计算出G0/G1、S、G2/M各期细胞的分布百分比,以S期细胞百分比来表示细胞群体的增殖状态和DNA合成速度。
1.5 Western blot免疫印迹法检测自噬目的蛋白Beclin1 的表达分析
将处于对数生长期的Raji细胞置于培养瓶中,分别加入不同浓度雷帕霉素( 终浓度分别为0、1、10及100 nmol/L) 的培养液进行培养,于72 h时终止培养,提取细胞总蛋白,Bradford法蛋白定量,行SDSPAGE电泳分离,电转移法将凝胶中的蛋白质转入PVDF膜,PBS洗膜后, 室温下5%脱脂奶粉溶液封闭4 h。 加入一抗,4℃反应过夜,TBST洗膜3 次,加入二抗,室温反应1 h,TBST洗膜3 次,采用化学发光试剂检测。 配置新鲜发光液均匀涂布于PVDF膜上,室温下孵育1 min,将PVDF膜与X光片一同放入暗盒内曝光5~10 min后,X光片显影后清水漂洗定影。
1.6 透射电镜形态学观察
收集细胞,以PBS洗涤2 次,1 000 r/min离心,沿管壁逐滴加入3%戊二醛固定,包埋切片后,定位观察并照相。
1.7 统计学方法
采用SPSS 13.0 统计学软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(±s) 表示,两组比较用t检验,3 组及3 组以上的两两比较用单因素方差分析。 描述样本在不同时间点上某指标的变化情况用重复测量设计方差分析( Repeated Measurement Design ANOVA) ,P <0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 雷帕霉素对Raji细胞生长的影响
MTT结果显示,5 nmol/L以上浓度的雷帕霉素能明显抑制Raji细胞增殖( P <0.01 或P <0.05) ,且随着药物浓度的增加及作用时间延长抑制作用逐渐增强。 雷帕霉素作用24、48 及72h对Raji细胞的IC50值分别为( 440.2 ±3.7)nmol/L、( 218.1 ±1.2)nmol/L、( 24.5±1.4) nmol/L( 见图1) 。
2.2 雷帕霉素可导致Raji细胞周期停滞,但不诱导细胞凋亡
雷帕霉素作用于Raji细胞48 h后,可明显抑制细胞周期发展( P <0.01 或P <0.05) ,随着药物浓度逐渐增加,S期细胞比例从55.7%逐渐降至29.3%,同时G0/G1期细胞比例从33.8%逐渐增加至67.6%。提示细胞进入增殖期的减少,DNA合成速度减慢,细胞被阻滞于G0/G1期( 见图2) 。 Annexin V- FITC/PI双染色流式细胞术分析检测显示,雷帕霉素处理组raji细胞48 h后,细胞凋亡率并不随rapa浓度的升高而增加,与对照组比较差异无统计学意义( P >0.05)( 见图3) 。
A:对照组;B:5 nmol/L rapa;C:10 nmol/L rapa;D:20 nmol/L rapa;E:40 nmol/L rapa;F:50 nmol/L rapa;G:100 nmol/L rapa
2.3 雷帕霉素对Raji细胞Beclin1 自噬蛋白的影响
不同浓度雷帕霉素作用于Raji细胞72 h后,Beclin1 蛋白的表达量随雷帕霉素浓度增高显著升高,呈浓度依赖性( P <0.05) 。 见图4。
2.4 细胞超微结构的电镜观察
雷帕霉素作用Raji细胞72h后,电镜下可观察到细胞胞质内有呈圆形、新月形的自噬小体,呈双层膜液泡结构,有包绕胞浆成分的趋势:有多个溶酶体和自噬溶酶体。 见图5。
雷帕霉素浓度:A:0 nmol/L;B:1 nmol/L;C:10 nmol/L;D:100nmol/L
A:未经雷帕霉素处理时;B:经雷帕霉素处理后
3 讨论
哺乳动物m TOR是P13K/Akt信号通路下游的效应分子,在人类肿瘤中起普遍调节作用,与细胞增殖、DNA损伤修复等密切相关[4],许多肿瘤的发生与m TOR信号通路的异常激活有关。 m TOR是凋亡和自噬的共同信号通路之一,当细胞面临压力刺激时,压力刺激所产生的信号传导可通过激活m TOR抑制自噬触发凋亡;而当凋亡途径的关键蛋白被剔除或功能受抑而解除自噬的抑制,或将凋亡缺陷的细胞转向自噬状态;自噬可保护细胞免于死亡,但也可通过大量自噬破坏大部分的胞浆和细胞器引起细胞死亡,或自噬过程激活凋亡信号引起细胞发生凋亡[5]。
雷帕霉素是m TOR的特异性抑制剂, 通过与m TOR分子结合抑制其功能。 Eum等发现[6]雷帕霉素能抑制m TOR诱发自噬而具有抗肿瘤作用。 其可能的机制包括: 诱导肿瘤细胞凋亡或自噬性细胞死亡;诱导细胞周期阻滞;抑制肿瘤侵袭和肿瘤血管生成等[7]。
本研究结果显示,不同浓度雷帕霉素作用于Raji细胞后其活力降低,并出现明显的G0/G1期停滞,虽然抑制了Raji细胞的增殖,但并没有引起明显的细胞凋亡。 在某些血液肿瘤细胞株的研究中也发现类似的情况[8],有人认为这可能与激活细胞的自噬作用相关[9]。 本研究通过透射电子显微镜观察到自噬体的形成,并运用免疫印迹分析检测自噬蛋白Beclin1的表达,发现随雷帕霉素浓度的增大,自噬的发生逐渐增多,呈浓度依赖性,该结果提示在Raji细胞中雷帕霉素可以激活自噬并藉此发挥抗肿瘤作用。
以往多项研究表明,自噬活性的改变存在于多种恶性肿瘤中,且对肿瘤的作用是一把“ 双刃剑”[10,11]:一方面,肿瘤细胞可以通过提高自噬活性来增强对代谢应激的耐受能力,从而维持其生存;另一方面,自噬通过吞噬受损的细胞器或者胞质蛋白,从而降低畸变细胞器对细胞癌变的刺激,且细胞可能会因为过度自噬而导致死亡[12]。
在白血病和肝癌的研究中均发现雷帕霉素诱导肿瘤细胞自噬,进而通过相关机制提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性促进凋亡的发生。 自噬究竟在肿瘤细胞的转归中扮演怎样的角色可能与肿瘤细胞的种类和生物学特性相关。 自噬在肿瘤中的作用和具体的机制未完全明了,但越来越多的证据表明自噬与肿瘤发生、进展及对抗癌治疗的反应中有着直接或间接地联系。
综上所述,雷帕霉素可引起Raji细胞的自噬机制启动,但不会导致其发生凋亡。在其他肿瘤细胞株中发现了雷帕霉素对化疗药物的增敏作用,这为联合用药后降低化疗药物的剂量、减轻毒副作用提供了线索。 笔者将进一步在淋巴瘤细胞株中研究雷帕霉素与化疗药物联合应用的情况,为其在淋巴瘤治疗中的应用提供证据。
摘要：目的 探讨雷帕霉素(宜欣可)对人淋巴瘤细胞株Raji细胞体外生长影响及诱导自噬的发生,并探讨可能的分子机制。方法 MTT法检测不同浓度(0、1、5、10、20、40、50及100 nmol/L)雷帕霉素作用不同时间(24、48及72 h)对R aji细胞增殖的影响。流式细胞仪测定雷帕霉素对R aji细胞周期分布和凋亡的影响。透射电镜观察Raji细胞形态学变化。Western blot方法检测雷帕霉素处理前后对Raji细胞自噬蛋白Beclin1的影响。结果 雷帕霉素对Raji细胞增殖有明显的抑制作用(P<0.01或P<0.05)。呈现明显的剂量-效应和时间-效应依赖关系。雷帕霉素明显抑制R aji细胞周期发展(P<0.05),但没有发生明显的凋亡(P>0.05)。透射电镜观察到经100 nmol/L雷帕霉处理72 h后的Raji细胞胞质内有大量自噬体和自噬溶酶体。Western blot方法检测到0、1、10及100 nmol/L雷帕霉处理72 h后Beclin1蛋白表达逐渐上升,且呈浓度依赖性。结论 雷帕霉素通过阻滞细胞周期发展抑制Raji细胞增殖,诱导Raji细胞发生自噬但不能诱导其凋亡。
关键词：雷帕霉素,淋巴瘤,细胞增殖,自噬
参考文献
[1]Ramalingam SS,Harvey RD,Saba N,et al.Phase 1 and pharmacokinetic study of evemlimus,a mammalian target of rapamycin inhibitor,in combination with docetaxel for recurrent/refractory nonsmall cell lung cancer[J].Cancer,2010,116(16):3903-3909.