蛋白质工程范文（精选9篇）
蛋白质工程 第1篇
1 蛋白质的组成和性能
20世纪70年代以来, 人类对蛋白质的分子改造开始得到成功的技术, 新型蛋白质渐渐进入人类研究的领域, 研究者通过对蛋白质分子进行突变, 得到具有新的表型和功能的蛋白质。这些新型的蛋白质的性质具有比原始蛋白相对活力更高的突变体, 这一研究成果显示对蛋白质的分子改造技术已经开始逐渐纯熟。蛋白质工程的主要技术分为理性进化和非理性进化[1], 这些研究成果已在生物技术和医药领域取得重大进展。
1.1 蛋白质组成的特点
蛋白质的分子组成主要由以下几种元素组成, 它们包括C、H、O、N元素。除此之外, 在有些蛋白质的分子组成中, 还会含有P、S、Fe、Zn、Cu、B、Mn、I、Mo等元素。它们在蛋白质分子中, 碳和氧元素所占的百分比组成较大, 其中最大的是碳, 为50%。其次是氧, 为23%。其他元素所占百分比:氮为16%, 氢为7%, 硫为0~3%。另外的元素为微量元素。
1.2 蛋白质整体结构
蛋白质的分类应归属为生物高分子物质, 它的结构是以氨基酸为基本单位, 因而也具有蛋白质物质性能的多重性。按照常规的分类方法, 蛋白质的组成可以分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构不同的构型。正是这种不同的蛋白质分子结构, 才决定了蛋白质不同的功能。其中一级结构由蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序和二硫键的位置排布来确定。第二级结构是按照蛋白质分子在局布区域内的排布决定。多肽链的结构是沿着一定的方向分布的, 它的分子构型是按照盘绕或折叠的方式来分类。第三级结构是按照蛋白质在二级结构的基础上, 主链上缠绕的小分子, 借助高分子间各种次级键或卷曲折叠成特定的球状分子结构, 构成了蛋白质的空间构象, 是蛋白质生物高分子物质性质的多样性。第四级结构是按照多亚基蛋白质分子中各个三级结构的分子构型决定的, 这些结构常常以自己独特的方式, 把形成蛋白质的三维结构展现出来。
2 蛋白质工程的研究技术
2.1 理性进化的研究过程
蛋白质工程的研究手段可以有许多方式, 其中利用理性进化的手段是一种常见的研究方向。这种研究方向, 主要是利用了蛋白质的定点诱变技术。这种诱变技术, 是通过在已知DNA序列中, 可插入反应或缺失过程来达到研究目的, 这样, 就可以利用确定长度的核苷酸的分子段, 来改变蛋白质的分子组成, 使其成为新的蛋白质分子, 其结果就达到了定点突变氨基酸残基的目的。在利用理化进展研究过程中, 通过对蛋白质工程的研究, 已有不少成功的例子改造了蛋白质的组分, 使人类获取了新型的蛋白质, 应用在现代生物技术和医药之中。通过同源性比对和定点突变技术, 在对蛋白质的研究中, 利用定点技术, 改变蛋白质的结构, 可以对胞嘧啶的亲和性增加22倍左右[2]。
2.2 非理性进化的研究过程
非理性蛋白质进化, 是研究工作者的又一成果, 又可以称为定向进化或者体外分子进化, 这一实验成果目前只是停留在实验室中模拟状态。这一研究方法虽然遵循自然进化过程, 使人类需要的蛋白质分子结构得到改变, 主要是利用分子生物学的研究分析手段, 在传统的蛋白质分子结构水平上, 通过非理性进化研究, 可以增加蛋白质分子结构的多样性。结构的改变, 使蛋白质的性能发生了改变, 然后利用高科技手段, 结合高通量的筛选技术, 来完成蛋白质的进化过程。这一进化过程, 在自然界中是需要千百万年才有可能完成的过程。这一时间的过程和成功都给研究者带来希望, 因为它不仅可以缩短变化时间, 而且可以希望在短时间内就得到理想的变异结果, 使其在现代生物技术和医药中得以应用。尤其值得提出的是, 在研究设计这类变异过程中, 利用这种方法的实验结果, 是不需要事先了解蛋白质结构、催化位点的具体位置。为了达到最后的结果, 在研究中只需要人为地为蛋白质制造进化条件, 就能够使蛋白质的体外对酶的编码基因发生改变。新的蛋白质分子出现后, 再通过定向筛选方法, 就可以获得预期特征的改良蛋白质, 使它们具有设定的性能。这种方法可以弥补当前定点诱变技术领域的不足, 因此具有很大的实际应用价值。
3 结语
通过对蛋白质工程的发展与应用的探讨, 揭示了蛋白质工程研究成果, 看到对蛋白质结构和功能改造的手段, 得到具有新的结构和性能的蛋白质, 可以增加生物蛋白质家族的种类, 更好应用到各个方面。它已经在生物技术和医疗上应用, 并得到进一步发展。相信在生物技术和制药领域, 一定会得到更大的进步和应用。
参考文献
[1]赵黎明.蛋白质工程在提高蛋白质稳定性中的应用[J].中国食品学报, 2011, (02) :158-162.
类人胶原蛋白工程菌质粒稳定性研究 第2篇
目的. 研究基因重组大肠杆菌补料分批发酵生产类人胶原蛋白过程中质粒稳定性.方法 通过平板复制法,观察质粒稳定性在不同生长周期、卡那霉素浓度和不同比生长速率中的变化.结果 质粒稳定性受生长周期、卡那霉素和比生长速率的影响.在μ为0.15、卡那霉素浓度为0.005 g/L的情况下,工程菌生产效率最理想.结论 通过控制发酵过程中的质粒稳定性可以有效地提高菌体产量和目标蛋白产量.
作 者：郑文超 范代娣 米钰 马晓轩 骆艳娥 惠俊锋 ZHENG Wen-chao FAN Dai-di MI Yu MA Xiao-xuan LUO Yan-e HUI Jun-feng 作者单位：郑文超,ZHENG Wen-chao(西北大学生命科学学院,陕西,西安,710069)
范代娣,米钰,马晓轩,骆艳娥,惠俊锋,FAN Dai-di,MI Yu,MA Xiao-xuan,LUO Yan-e,HUI Jun-feng(西北大学,化工学院,陕西,西安,710069)
蛋白质工程 第3篇
一、原蛋白质工程课程设置
由于蛋白质工程课程成立较晚以及其本身与酶工程的发展存在着密切的联系等原因, 遵义医学院珠海校区一开始把蛋白质工程和酶工程融为一体, 列为《蛋白质工程与酶工程》课程, 共计118学时, 其中, 理论66学时, 实验52学时。经多年教师课堂观察总结以及课后学生调查, 发现这种课程安排不能使学生很好地接受掌握蛋白质工程的理论与实践。
二、蛋白质工程课程改革
为了使蛋白质工程课程教学更好地适应时代的发展, 我校进行了相应的理论课与实验课教学改革, 突出教学目标, 同时, 使教学内容与教学手段更加科学合理, 便于学生更好地接受掌握, 提高教学效果。
1. 蛋白质工程理论课程设置。
蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。而酶工程则是酶的生产与应用的技术过程。两者之间虽有紧密的联系, 但侧重点不同。当然随着蛋白质工程的发展, 经蛋白质改造或全新合成的蛋白质, 会应用到酶工程, 但笼统地将两者合二为一的作法, 在教学工作中已经显示出其不合理性。因此, 鉴于蛋白质工程与酶工程本身的差别, 以及教学内容与侧重点不同, 特将《蛋白质工程》作为一门独立的学科 (36学时) 向生物工程专业的本科生传授。
2. 蛋白质工程课程教材的选择。
教学工作中, 教材的选择至关重要。由于蛋白质工程是一门新兴的课程, 并且发展速度很快, 与其他科目相比, 存在可选择范围小, 更新速度不够快等问题。我校原蛋白质工程教材选用王大成主编的《蛋白质工程 (化学工业出版社, 2002年出版) 》, 该教材出版早, 内容简洁, 对前沿技术讲解比较少, 改革后的教材选用汪世华教授主编的《蛋白质工程 (科学出版社, 2008年出版) 》, 该教材知识覆盖面较广、内容难度适中, 比较适合于本科生教学使用。但就本门课程的教材而言, 加强教材建设迫在眉睫。
3. 蛋白质工程实验课程设置。
长期以来, 我们一直将蛋白质工程与酶工程的实验放在一起, 多设计为验证型实验。限制了学生的自主性与创造性, 鉴于此种情况以及蛋白质工程实验课本身的特点和要求, 我们把蛋白质工程的实验设立为一个综合性实验, 时间为1周 (28学时) , 紧跟在理论课之后进行。为了保证实验课程教学质量, 特别进行蛋白质工程专业实验室建设, 进行仪器设备的添置及规范化管理, 保证所开设综合性、设计性实验的效果。
4. 开展形成性评价, 培养学生自主学习能力。
在蛋白质工程教学改革的实践中, 我们充分体现以学生为主体的教学思想, 通过课堂内外教学相结合的方式, 增加授课老师和学生之间的互动, 积极了解学生学习情况, 对专业知识的自我要求以及所希望的主讲老师的授课重点, 对学生的反馈积极回应, 调整授课策略, 激发同学的学习兴趣, 矫正部分同学学习的盲区。在授课中, 根据教学进程的安排, 尽可能地向同学们介绍蛋白质工程研究的最新进展和研究趋势, 并积极向同学们阐述本校相关学科的研究方向和学科优势, 开阔同学的学习视野, 鼓励同学主动学习。鼓励学生参与授课, 蛋白质工程课程授课对象是三年级的学生, 经过大一大二的学习与积累, 他们已经掌握了很好的学习方法, 具有很好的主动学习能力。因此通过内容选择, 安排学生分组, 制作多媒体课件进行授课, 教师总结, 开展课堂讨论等, 课堂气氛活泼, 大家积极发言, 进行讨论, 取得了良好的教学效果。在理论授课中, 增加由学生自主选择感兴趣的专题环节。独立完成专题论文的撰写。在这一教学环节中, 实现以学生为主、老师为辅的教学模式, 培养学生自主学习的能力, 同时可以极大地拓宽学生对有关蛋白质工程技术与应用等专业知识的理解和掌握, 把握蛋白质工程在生物技术领域的动态发展, 拓宽学习的知识面。
5. 合理利用多媒体教学。
充分利用多媒体教学, 可以使有限的课堂教学时间与丰富的教学内容相统一, 扩大了教学内容的信息量, 图文并茂、形象逼真地展示了所教授的知识点。但笔者在教学实践中也注意到, 整堂课都采用多媒体效果并不好, 而将多媒体教学与传统板书教学适当结合效果会好很多。如在教学中对于概念、原理等, 加强语言描述, 结合适当板书, 有助于学生从整体上把握课堂的知识结构和教学重点。
6. 探索双语教学模式。
蛋白质工程作为一门综合性交叉型学科, 融合了多门学科的发展成果, 要想充分理解掌握教材中相关的知识, 课本上的内容远远不够, 因此, 学生必须具备一定的专业英语阅读能力。笔者尝试在课堂上对一些专业词汇、知识点进行双语教学, 虽然目前尚处于探索阶段, 但经过两年的实践, 很多同学反映常用专业词汇量有了增加, 对相关文献的理解力有了提高。
7. 实践教学安排。
蛋白质工程是一门应用性很强的学科, 近年来, 教研室不断进行实验平台建设, 从蛋白质表达、提取、纯化、鉴定以及定性定量分析等方面, 学生们都可以自主设计实验方案, 对不同实验结果进行比较分析。当然, 前期的条件是学生必须先熟练掌握本学科基本的实验技能, 熟悉相关的仪器设备和注意事项等。具体来讲, 学生只有熟练掌握无菌操作、菌体培养、诱导表达, 蛋白纯化、SDS-PAGE及Western Blot等基本的实验技能, 才可以参加开放性实验。我们实验室尽可能地为学生提供一个自主创新的空间和平台, 这样既可以加深学生对方法的学习, 还锻炼了学生独立科研工作的能力。
8. 建立完善的课程考核标准。
提高教学效果, 加强能力培养, 除了教学内容与方法的改革, 更离不开考核内容与考核形式的改进。在蛋白质工程课程考核中, 我们将课堂表现、专题论文的写作、实验操作动手能力、综合性设计作业按一定的比例纳入最终的蛋白质工程课程的总成绩。在闭卷笔试环节中, 增加设计型考题, 考察学生对知识点综合运用的能力, 从而提高学生在今后的学习工作中能具备综合分析问题、解决问题的能力。
课程教学是一项系统工程, 课程教学的改革是教学研究永恒的主题, 如何提高教学质量, 鼓励创新精神, 培养适应时代发展的合格人才是老师永无止境的目标。两年来的教学实践活动证明, 蛋白质工程课程改革取得了较好的效果, 开拓了同学的学习视野, 调动了学生学习的积极性, 激发了学生对科研问题的关注及探索, 提高了学生的专业素养。但这些还远远不够, 在蛋白质工程教学改革体系中仍需不断探索、大胆实践、积累经验, 总结出一套适用于生物工程专业学生的教学模式, 为专业人才的培养作出积极的努力。
参考文献
[1]汪世华.蛋白质工程[M].北京:科学出版社.2008:1-8.
蛋白质工程 第4篇
蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。把原来spaces空间上的一篇蛋白质与蛋白质间相互作用研究方法转来，算是实验技巧分类目录的首篇。间相互作用的实验方法比较)
一、酵母双杂交系统
酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。
二、噬茵体展示技术
在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。
三、等离子共振技术
表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。
(另补充2：检测两种蛋白质之
四、荧光能量转移技术
荧光共振能量转移（FRET）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用;与荧光显微镜结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA 和RNA 的时空信息。随着绿色荧光蛋白（GFP）的发展，FRET 荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定量测量FRET效率以及供体与受体间距离的简单方法，仅需使用一组滤光片和测量一个比值，利用供体和受体的发射谱消除光谱间的串扰。该方法简单快速，可实时定量测量FRET 的效率和供体与受体间的距离，尤其适用于基于GFP 的供体受体对。
五、抗体与蛋白质阵列技术
蛋白芯片技术的出现给蛋白质组学研究带来新的思路。蛋白质组学研究中一个主要的内容就是研究在不同生理状态下蛋白水平的量变，微型化，集成化，高通量化的抗体芯片就是一个非常好的研究工具，他也是芯片中发展最快的芯片，而且在技术上已经日益成熟。这些抗体芯片有的已经在向临床应用上发展，比如肿瘤标志物抗体芯片等，还有很多已经应用再眼就的各个领域里。
六、免疫共沉淀技术
免疫共沉淀主要是用来研究蛋白质与蛋白质相互作用的一种技术，其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Pansobin珠上的金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)，若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPA|Pansobin”，因为SPA|Pansobin比较大，这样复合物在离心时就被分离出来。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物四组分又被分开。然后经Western blotting法，用抗体检测目的蛋白是什么，是否为预测蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内天然与兴趣蛋白结合的，符合体内实际情况，得到的蛋白可信度高。但这种方法有两个缺陷：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；二是必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
七、pull-down技术
蛋白质相互作用的类型有牢固型相互作用和暂时型相互作用两种。牢固型相互作用以多亚基蛋白复合体常见，最好通过免疫共沉淀（Co-IP）、Pull-down技术或Far-western法研究。Pull-down技术用固相化的、已标记的饵蛋白或标签蛋白（生物素-、PolyHis-或GST-），从细胞裂解液中
钓出与之相互作用的蛋白。通过Pull-down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外传路或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。
检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较
研究蛋白-蛋白相互作用是理解生命活动的基础。蛋白质—蛋白质互作网络是生物信息调控的主要实现方式，是决定细胞命运的关键因素。检测蛋白质间相互作用的实验方法有哪些？(补充：研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结1)这些检测方法各有什么优缺点？总结如下。1.生化方法
●共纯化、共沉淀，在不同基质上进行色谱层析（需要补充）
●蛋白质亲和色谱 基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），当细胞抽提液经过改基质时，可与改固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有吸附的非目标蛋白则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或者洗脱条件而回收下来。
GST pull down技术：为了更有效的利用蛋白质亲和色谱，可以将待纯话的蛋白以融合蛋白的形式表达，即将”诱饵“蛋白与一种易于纯化的配体蛋白融合。例如与GST融合的蛋白再经过GSH的色谱柱时，就可以通过GST和GSH的相互作用而被吸附。当载有细胞抽提物经过柱时，就可以得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的目标蛋白了。
Epitope-tag技术：表位附加标记技术 就是将附加的抗原融合到目的蛋白以检测目的蛋白的表达，同时还可以通过亲和层析法来纯化目的蛋白。缺点：表位附加标记可能会使融合蛋白不稳定，改变或使融合蛋白功能丧失。
以上两种方法都要共同的缺点：假阳性。实验所检测到的相互作用可能时由蛋白质所带电荷引起的，并不是生理性的相互作用；蛋白的相互作用可能并不是直接的，可是由第三者作为中介的；有时会检测到两种在细胞中不可能相遇却有极强亲和力的蛋白。因此实验结果还应经其他方法验证。
●免疫共沉淀 免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。另外灵敏度不如亲和色谱高。
●Far-Western 又叫做亲和印记。将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。缺点是转膜前需要将蛋白复性。
2.等离子表面共振技术（Surface plasmon resonance）该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射绿上升，从而导致共振角度的改变。而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用。该技术不需要标记物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。缺点：需要专门的等离子表面共振检测仪器。
3.遗传学方法 使某处发生缺损，检测对其他地方的影响。
●基因外抑制子。基因外抑制子是通过一个基因的突变来弥补原有基因的突变。比如相互作用的蛋白A和B，如果A发生了突变使两者不再相互作用，此时B如果再发生弥补性突变就可以使两者的相互作用恢复，那么B就是A的基因外抑制子。缺点：需要知道基因，要有表型，筛选抑制子比较费时。
●合成致死筛选 指两个基因同时发生突变会产生致死效应，而当每个基因单独发生突变时则无致死效应。用于分析两个具有相同重要蛋白之间的相互作用。
4.双杂交技术 原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。分别使结合域和激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达，如果两种蛋白可以发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活报告基因。缺点：自身有转录功能的蛋白会造成假阳性。融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能。不利于核外蛋白研究，会导致假隐性。
5.荧光共振能量转移技术 指两个荧光法色基团在足够近（<100埃）时，它们之间可发生能量转移的现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，也能研究分子间的相互作用。它可以在活体中检测，非常灵敏，分辩率高，能够检测大分子的构象变化，能够定性定量的检测相互作用的强度。缺点 此项技术要求发色基团的距离小于100埃。另外设备昂贵，还需要融合GFP给蛋白标记。
此外还有交联技术（cross－linKing），蛋白质探针技术，噬菌体展示技术（Phage display）以及生物信息学的方法来检测蛋白质之间相互作用
Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。然后加入特异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体），最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测。根据检测结果，从而可得知被检生物（植物）细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。
丝素蛋白在生物医药工程中的应用 第5篇
1 丝素蛋白在医疗保健中的应用
1.1 降血糖作用
中国古代已有将蚕茧煮食用于糖尿病治疗的记载。近年来,研究人员将丝素蛋白的水解产物喂食动物或作用于细胞,在糖尿病治疗方面取得了不错的效果。Hyun[3]等通过将不同制剂的丝素蛋白水解产物作用于3T3-L1细胞系,发现丝素蛋白可加速葡萄糖代谢和不依赖于胰岛素的糖原更替。此外,蚕丝蛋白调节葡萄糖转运蛋白1(GLUT),增加其在细胞表面的表达和增强GLUT4易位,从而提示糖尿病患者在丝素蛋白作用下体内高血糖症状得以改善。此外Jun Hong Park[4]等发现,由高浓度葡萄糖引起细胞死亡的胰腺β细胞(HIT-T15),在经过50 mg/mL的丝素蛋白处理后其细胞死亡有所缓解。同时,丝素蛋白处理还降低了细胞活性氧(ROS)水平,提高了增殖细胞核抗原(PCNA)的免疫反应性。通过TUNEL检测还发现丝素蛋白保护HIT-T15细胞免于葡萄糖诱导的细胞凋亡,提示丝素蛋白可能通过降低细胞的ROS水平来使细胞免于死亡。将丝素蛋白作为糖尿病或高血糖症的候选治疗剂,不仅可以降低血糖值、缓解糖尿病和其他并发症的症状,还可以避免某些糖尿病药物带来的不良反应,是具有较好生物医药前景的天然材料[5]。
1.2 抑菌作用
将丝素蛋白水解成丝素肽,置于自然环境中数小时,可观察到菌落数目比对照有不同程度地减少,表明丝素肽具有一定的抑菌作用[6]。将丝素水解液加入到辣泡菜中,发现其可明显抑制乳酸菌的生长。根据其较好的抑菌特性,可开发相应的抗菌药物加以利用[7]。
2 丝素蛋白在生物医药工程中的应用
2.1 药物缓释
由于丝素蛋白具有生物降解较缓慢、对生物体无毒害作用、生物相容性良好等特点,并且有独特的力学性能和独特的氨基酸组成,可以通过某些氨基酸的氨基或侧链的化学修饰改变蛋白的表面性能,随着药物缓释生物材料的发展与趋势,丝素蛋白已成为医用药物缓释载体研究的热点。丝素蛋白作为药物缓释载体,可以减少药物摄入体内时的暴释现象,有效放慢经皮肤吸收药物的药物释放速度,使药物在体内的作用趋于平稳,减少药物浪费,并抑制某些挥发性成分的蒸发损失,从而较大程度地提高药物效果。
以丝素蛋白作为缓释载体材料,目前主要有水凝胶、薄膜衣、微粒子、纳米粒子、通道、支架以及药片等几种物理形式,可根据药物分子量大小及释放快慢要求,制成不同规格的药物载体[8,9]。泰国的Lerdchai K[10]等将抗癌物姜黄素和DHA封装在丝素蛋白/明胶(SF/G)海绵中作为宫颈癌治疗的药物缓释系统,该SF/G海绵对正常细胞无毒性,通过SF/G海绵控制姜黄素和DHA的缓慢释放,提高了对癌细胞生长的抑制效果。
2.2 止血功能
目前医学上常用的止血材料主要包括止血纱布、止血绷带和止血纤维,在使用过程中这些材料存在止血时间较长、易造成过敏、易粘连伤口、对创口感染的抑制率较低等缺点。丝素蛋白由于具有无毒且炎症反应低的优点,近年来已有开发成新型止血材料的研究报道。许亚阳等利用[11]CaCl2-乙醇-水三元体系在48℃的温度条件下水解丝素蛋白,获得平均分子量大小为30 k D的丝素肽。通过对大鼠肝脏止血模型进行实验,发现用30k D丝素肽处理后的大鼠出血量少、止血时间较短,止血效果与临床常用的止血粉Arista相近,而丝素肽具有较好的抑菌效果,且无细胞毒性,因此在开发快速止血材料方面具有广阔的前景。
2.3 伤口愈合
丝素蛋白具有促进皮肤组织再生和伤口愈合的作用,经过丝素蛋白涂抹处理的皮肤伤口,其愈合的速度比生理盐水处理的更快速[12]。创伤的发生容易引起微生物感染,因此具有良好密封性、抗菌性以及保湿性的创面敷料对伤口的愈合起着重要的作用。丝素蛋白透气、保湿性强,形态易塑且安全无毒的特点使其成为制备皮肤创伤敷料的候选材料[13,14,15]。目前开发的丝素蛋白创伤敷料主要有丝素膜[15,16]、丝素凝胶[17]、丝素海绵[18]、丝素纳米纤维以及负载生长因子[22]、负载植物活性成分[23]的丝素创伤敷料等类型,可满足多种不同需求的创伤治疗[24]。
2.4 组织工程支架
近年来随着丝素蛋白在生物医用领域的研究成为热点,人工血管、人造软骨及骨组织、皮肤及神经组织修复相关产品陆续被开发出来,这些材料为组织修复提供了细胞生长的良好支架[25,26,27,28]。
2.4.1 人工血管
丝素蛋白能促进细胞增殖,有着良好的组织相容性及较好的机械性能,降解速率慢,是开发人工血管的候选材料[25]。朱晨辉等[29]将类人胶原蛋白与丝素蛋白以质量比7:3混合,获得类人胶原蛋白-丝素蛋白管状支架,该支架具有均匀的多孔结构,孔径为(60±5)μm,孔隙率达到85%以上;具有较理想的力学性能,应变为50%±5%,应力为(332±16)k Pa;降解速率较慢,提高了细胞的黏附与增殖,具有良好的生物相容性。陈杰等采用软印刷技术制备了4种不同微观形貌的丝素蛋白膜,研究其对人脐静脉血管内皮细胞的生长、形态、排布、增殖功能等一系列生物学行为的影响,发现丝素蛋白覆膜材料能支持血管内皮细胞的正常生长和增殖,并可以通过丝素蛋白膜表面的微观形貌影响血管内皮细胞的形态及生物学行为。
2.4.2 骨组织
近年来,将成骨种子细胞和丝素蛋白结合起来制备具有骨修复能力的丝素蛋白材料已有不少报道,材料中的丝素蛋白可为骨细胞生长、粘附和分化提供所需的空间及环境。Yashi Jin[31]报道了一种骨修复效果较好的3D类骨生物材料的制备方法,就是利用3D丝素蛋白水凝胶通过离子扩散法来调节羟磷灰石晶体的成核和生长。Bhardwaj等[32]在丝素蛋白-壳聚糖三维支架上植入牛软骨细胞,发现比例为1:1的丝素/壳聚糖复合支架最利于软骨细胞的形成。目前用于骨修复的丝素蛋白生物材料,主要有丝素膜[33]、丝素纳米纤维[34]、丝素水凝胶[31,35]和丝素支架[36,37]等几种形式[38]。这些丝素蛋白生物材料可以经过适当的化学修饰以及负载生长因子和复合无机物等,使其在体外具有促进成骨细胞增殖分化的功能,在体内具有诱导新骨形成的功能,然而丝素蛋白生物材料能否完全模拟骨组织的内部结构并在临床医学上广泛应用还有待于深入研究。
2.4.3 皮肤组织
丝素蛋白由于其保湿、美白等特点使其早已广泛应用于化妆品中。由于具有吸水性、透气性以及其他相关生物活性,丝素蛋白制备的敷料表现出加速皮肤再生的能力,使其在医学美容领域逐渐成为研究和产品开发的热门材料。Sheng[39]等制备了负载维生素E的丝素蛋白纳米纤维垫,这种纳米纤维垫防水性能优越,负载的维生素E可以稳定释放,将老鼠皮肤纤维母细胞在该纤维垫上进行体外培养,发现细胞的生长和增殖比在玻片上要好得多。Guan[27]等通过冷冻干燥法制备了丝素蛋白多孔支架(PSFSs),将PSFSs植入体内18天后便发现新组织已经在支架上形成,其组织结构几乎与正常皮肤相同,按比例分配的功能性血管也可以找到,而侵入PSFSs中的炎症细胞在7天内就消失了(常用的海绵支架在植入18天后仍可见炎症细胞和纤维包膜),从而表明丝素蛋白多孔支架能够促进受损皮肤的恢复,并表现出突出的组织相容性。
2.4.4 神经
应用丝素蛋白制备的神经导管可为神经再生提供有利的局部微环境,作为桥接结构起到引导和促进神经再生的作用,从而修复神经的缺损[40]。Lorenz Uebersax[28]等用丝素蛋白膜负载神经生长因子,控制生长因子在神经细胞生长过程中逐渐释放,从而能持续提供细胞分化所需,促进神经再生。Yun Gu[41]等制备了基于壳聚糖/丝素蛋白的细胞外基质修饰支架,用于桥接10 mm的大鼠坐骨神经间隙,血液和组织病理学分析结果证明了该支架的安全性,同时桥接后大鼠神经再生的效果良好。
3 丝素蛋白在生物医学材料中的应用
3.1 手术缝合线
长期以来医学上主要使用羊肠线作为可吸收手术缝合线,但羊肠线具有柔韧性不好、组织反应大、吸水后打结性能差等缺点。丝素蛋白具有良好的打结性能,且柔韧性好、扩张强度低,不易引起组织撕裂,适于应用到黏膜组织或擦伤区域[42]。日本蚕丝昆虫研究所在蚕丝表面覆盖有机硅后编织成软质绢丝手术缝合线,对机体组织不产生任何污染,是一种安全的医用手术缝合线[43]。近年来随着美容整容行业的兴起,美容用手术缝合线使用量大大增加,它要求缝线细、匀而结实,细纤度高级蚕丝的丝素蛋白成为了它的主要原料[44]。
3.2 固定化酶载体
丝素蛋白是天然的高分子蛋白,具有独特的分子结构、优异的机械性能、良好的吸湿、保温和抗菌性能,是制备固定化酶载体的理想材料[45]。丝素蛋白作为固定化酶载体的应用可以追溯到上世纪70年代,Grasset等通过重氮化和吸附、交联等方法将碱性磷酸酶固定在丝素纤维上。Chen[47]等将酯酶固定在平均纤维直径180 nm、厚度60μm的电纺丝素蛋白纳米纤维膜(SF NFMs)上,用于通过酯交换反应催化生产丁酸香叶酯,这种SF NFMs可以负载10.7%的酶量,相对酶活性可达到无固定化酯酶的120%。除磷酸酶和酯酶外,葡萄糖氧化酶、超氧化物酶、天冬酰胺酶、中性蛋白酶、胰岛素等多种酶以及肽均能通过生物偶联方式固定于丝素蛋白纳米颗粒上[48]。
4 结语
长期以来,我国的蚕桑业沿袭种桑养蚕、结茧缫丝的传统老路,终端产品单一,产业链受国际生丝价格波动的影响较大。传统产业链的劣势随着经济社会的发展日益凸显,传统蚕桑业规模趋于萎缩。21世纪逐渐发展起来的蚕桑多元化利用,已在食品、药用保健、化工等多方面取得突破性进展,研发出一系列产品,大大拓展了蚕、桑资源的应用领域,取得了明显的经济效益。
家蚕丝素蛋白产量大,可为医药保健、组织工程提供大量的天然蛋白原料。丝素具有优良的生物和机械性能,在生物医药领域有着广阔的应用前景,可单独或与其他材料(如丝素蛋白/多聚物材料等)相结合,开发高附加值的生物新材料和医用产品。一方面可提高居民的医疗健康水平和生活质量;另一方面,新拓展的产业链受生丝价格等因素的影响小,可保持稳定可持续的蚕茧需求,在企业获利的同时也能带动蚕农的积极性,产生显著的经济、社会效益。
摘要：丝素蛋白是蚕丝的主要组成部分,具有良好的生物相容性、降解性和力学性能,且安全无毒、原料易获得,早已成为生物医药材料制备和研究的热点。文章综述了丝素蛋白在降血糖、抑菌等方面的医疗保健作用,以及在药物缓释、止血、伤口愈合、组织工程支架等生物医药工程领域及其他生物医学材料中的应用与开发前景。
纤维蛋白胶在软组织工程中的应用 第6篇
1 纤维蛋白胶的生物学特性
纤维蛋白胶是一种可降解、无毒的生物蛋白制剂。其主要成分为纤维蛋白，在凝血和组织愈合过程中起重要作用。它的凝胶过程主要通过纤维蛋白原和凝血酶的相互作用，纤维蛋白原与凝血酶结合形成纤维蛋白单体，单体再聚合成为立体网状结构的凝胶，模拟人体自然凝血的最后过程。纤维蛋白原在聚合后释放的血小板衍生生长因子(platele derived growth factor,PDGF)和转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)具有趋化性和促有丝分裂作用，可以促进种子细胞的迁移、黏附和增殖。纤维蛋白胶是天然的细胞外基质，能在3～4周内降解细胞外部的纤维蛋白。这种降解过程可以通过调节纤维蛋白原浓度，使其降解速率与组织细胞的生长速度相适应，最终在支架材料完全降解的同时得到和原有支架大小、形态相通的新生组织[1]。纤维蛋白胶生物相容性、可塑性良好，具有一定的弹性和黏附能力，易被组织吸收，制备方便，在成型之前两种成分都是液体成分，具有可以任意塑型的特点。纤维蛋白胶具三维的孔隙结构，能使细胞自由迁移、增殖，还可为细胞提供所需营养环境;细胞在凝胶内均匀分布，不易被体液冲走、降解;并能有效地黏附多种生长因子，利于细胞的再生。目前各类商品化的异体纤维蛋白胶(Tissucol/Tisseel R、Beriplast R及QuixilTM)已被FDA批准广泛用于外科创面封闭止血、粘合。自体来源的纤维蛋白胶因消除了免疫原性而具极大的优势。分离自体来源纤维蛋白原的方法主要是冷沉淀法[2]。
2 纤维蛋白胶在软组织工程中的应用
2.1 纤维蛋白胶在肌、肌腱组织修复中的应用
纤维蛋白胶可与肌源细胞移植促进肌组织的再生修复。Beier等[3]在雄性大鼠肌肉中提取出成肌细胞并经过扩增后，将其与纤维蛋白胶同时注入同系基因型的雌性大鼠的腿部肌肉缺损处，7 d后通过检测Y染色体基因了解植入的细胞存活情况，结果显示注射部位的成肌细胞与同宿主肌纤维的整合较好。纤维蛋白胶经12周左右的时间被吸收降解。XU等[4]探讨肌源性干细胞联合纤维蛋白胶治疗雌性压力性尿失禁大鼠发现：纤维蛋白胶作为组织工程支架，可以促进移植细胞的早期存活、分化，增加新生血管的形成，促进尿道肌层的再生修复，潜在促进移植细胞提高尿道闭合功能。Huang等[5]应用纤维蛋白胶为支架包绕成肌细胞，体外构建三维组织工程骨骼肌组织，证实在一定的电刺激下，培养3周的肌组织自发收缩功能达到最大值，肌点生理检测可见长度张力和收缩力与新生大鼠的肌力相似，持续长达6周。
Hankemeier等[6]将人骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Stem Cells,BMSCs)与液态纤维蛋白胶混合注射到免疫缺陷大鼠的膝盖骨肌腱缺损处，纤维蛋白胶/细胞混合物可使形成的组织更成熟，但在功能上应用生物胶还需考虑生物力学的问题。类似研究中[7]，将纤维蛋白胶作为BMSCs的载体并沿缝线注射到兔阿氏肌腱的横断面，结果显示，在愈合的早期，纤维蛋白胶/BMSCs治疗后可使相关组织学及生物力学参数提高。
2.2 纤维蛋白胶在皮肤组织工程中的应用
临床上，纤维蛋白胶经常被作为角化上皮细胞的载体与基质。体外培养的角化上皮细胞重悬于纤维蛋白胶中可应用于动物模型及人的深层、局部、全层的表皮再植[8]。纤维蛋白胶可提高皮片移植成功率，尤其可促进较难植入位点的融合。纤维蛋白胶与角化上皮细胞、成纤维细胞构建组织工程上皮与传统皮肤移植物有相似的效果[9]。在小鼠模型中，Hojo等[10]将角化上皮细胞、成纤维细胞接种于纤维蛋白胶中可导致适合的表皮结构形成，并发现纤维蛋白胶能促进血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的分泌，促进血管内皮细胞的迁移。诱导成熟的表皮细胞在移植活体上的再生。纤维蛋白对人内皮细胞具有促有丝分裂作用，且呈剂量依赖性。与纤维结合蛋白联合还可以支持角质化细胞和成纤维细胞在体内外的生长，并作为外源性生长因子促进伤口愈合[11]。
2.3 纤维蛋白胶在其他组织形成中的应用
在心血管组织工程中，力学刺激含动脉细胞的纤维蛋白胶支架可促进细胞外基质蛋白的沉积，包括I型及III型胶原。研究表明，心脏瓣膜组织工程中应用的自体纤维蛋白胶支架需要动力环境[12]。动脉瓣重建中，纤维蛋白胶可与聚已酸内酯结合作为细胞的载体。两者都具有较好的生物相容性与耐久性，并提供良好的承载特性，有利于细胞在其内生长。由于脂肪组织具有丰富的血管，在脂肪组织工程中，细胞/纤维蛋白胶复合物能形成有效的微环境网，有利于使体内的三维植入物持续形成。在绒毛膜囊模型中，高度血管化的含有前脂肪细胞的纤维蛋白胶基质容积稳定[13]。应用预制的囊袋作为受体，纤维蛋白胶作为移植载体，有利于脂肪组织的再生，该材料安全、可靠。在神经组织再生中，Galla等[14]将小鼠面神经的颊支截断形成1 cm的缺损，断端用管状可降解的聚己内酯连接，管内分别充填雪旺细胞/纤维蛋白凝胶，4周后发现雪旺细胞/纤维蛋白胶是具有良好生物相容性及生物降解性的材料，能显著提高周围神经再生的质和量。
3 结语
蛋白质工程 第7篇
1 材料与方法
1.1 材料
鳗鲡鱼皮胶原蛋白由该实验室分离纯化所得。非转染人角膜基质 (HCS) 细胞系由该实验室自行建立。DMEM/F12培养液、胰蛋白酶和小牛血清购自Gibco公司。噻唑蓝 (MTT) 、1- (3-二甲基氨基丙基) -3-乙基碳化二亚胺 (EDC) 、N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 购自Sigma公司。其它试剂均为分析纯。
1.2 组织工程角膜载体支架的制备
将鳗鲡鱼皮胶原蛋白溶于0.5M醋酸中, 制备成50 mg/m L的胶原溶液, 注入一定的模具中, 厚度控制为400μm, 冻干成多孔胶原海绵。胶原海绵用EDC/NHS于4 ℃交联12 h, 0.1 M Na2HPO4充分清洗除去残留交联剂。
1.3 胶原支架的透明度及透光率
将胶原支架浸泡于PBS中, 用滤纸吸除表面多余水分, 放置于印有文字的打印纸上, 用数码相机在自然光下拍照。胶原支架浸入20%甘油脱水处理后平铺于96孔板板底, 用酶标仪检测300~800 nm的透光率, 每20 nm测一个。以加20%甘油的孔为空白对照。
1.4 胶原支架的组织结构
为检测胶原载体支架的组织结构, 样品在4%多聚甲醛中固定, OCT包埋。用冰冻切片机切成7~10 μm的切片贴在明胶包被的载玻片上, 37 ℃烘干12 h。全自动染色机伊红染色后, 光镜观察并拍照。
1.5 胶原支架的表面超微结构
胶原载体支架浸入2.5%戊二醛中4 ℃固定24 h。再浸入1%四氧化锇中固定2 h, 用30%~100%的丙酮梯度脱水。经过CO2临界点干燥, 离子溅射仪铂金喷溅, 用扫描电镜观察胶原支架表面超微结构并拍照。
1.6 统计学分析
数据用“平均值±标准差”表示, 用SPSS 21.0软件对数据进行统计学分析。组间差异用双尾T检验, P< 0.05时为显著性差异。
2 结果
2.1 胶原蛋白的SDS-PAGE
胶原的SDS-PAGE结果 (图1A) 显示, 提取的鳗鲡鱼皮胶原蛋白含有两条不同的α链, 即α1链和α2链, 同时可观察到其二聚体β链。该结果表明提取的鱼类胶原蛋白纯度较高, 符合I型胶原蛋白的特征, 且在提取过程中胶原蛋白并没有发生降解。
2.2 胶原支架的透明度和透光率
胶原支架的外观和透光率 (图1B) 结果表明, 支架表面平整且具有较高的透明度。胶原支架的透光率随波长的增加而增大, 胶原支架的透光率为88.95±1.28%。
2.3 胶原支架的结构观察
胶原支架冰冻切片的HE染色结果 (图2A) 表明, 经EDC/NHS交联后的胶原蛋白纤维交错成网, 胶原支架呈多孔网状结构。胶原支架内部孔隙较多且孔隙较为均匀。扫描电镜结果 (图2B) 显示了胶原支架表面的超微结构, 胶原支架表面致密, 胶原纤维紧密排列, 孔隙直径在0.1~1μm之间。
3 讨论
该文初步探索了鳗鲡鱼皮胶原蛋白作为一种支架材料, 用于角膜组织工程的可行性。以50 mg/m L的鳗鲡鱼皮胶原蛋白冻干成一定形状的胶原海绵, 通过EDC/NHS交联构建组织工程角膜载体支架, 检测胶原支架的理化性质及生物学性能。实验结果表明以该文方法构建的组织工程角膜载体支架具有良好的透明度, 透光率能达到88.95±1.28%, 与正常人角膜的透光率相近。
该文采用冻干后交联的方法制备出了胶原载体支架, HE染色和扫描电镜结果表明, 胶原蛋白相互交联形成胶原纤维束, 在支架内部相互交错排列形成多孔的网状结构, 有利于细胞的迁入。以上结果证明该文所构建的胶原支架具有良好的生物相容性, 符合组织工程角膜载体支架的要求。
4 结论
该研究以鳗鲡鱼皮胶原蛋白为材料构建了组织工程角膜载体支架, 该支架具有良好的透明度和透光率, 呈孔隙较均一多孔网状结构, 支架表面致密均一。因此, 鱼皮胶原蛋白可以作为一种新材料用于组织工程角膜的研究, 且该文构建的胶原载体支架可以进一步用于组织工程角膜体外构建的研究。
参考文献
[1]Schneider AI, Maier-Reif K, Graeve T.Constructing an in vitro cornea from cultures of the three specific corneal cell types[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim, 1999, 35 (9) :515-526.
[2]Schermer A, Galvin S, Sun TT.Differentiation-related expression of a major 64K corneal keratin in vivo and in culture suggests limbal location of corneal epithelial stem cells[J].J Cell Biol, 1986, 103 (1) :49-62.
蛋白质工程 第8篇
:植物蛋白酶抑制剂;抗虫性;基因工程
蛋白酶抑制剂 (Protease Inhibitor, PI) 广泛存在于生物体中, 是一类低分子量的多肽或蛋白质, 该基因及其编码区域较小, 一般没有内含子, 调节植物许多重要的生命活动, 对昆虫具有防卫作用[1]。蛋白酶抑制剂根据作用酶的活性位点不同, 分为4类[2,3,4], 即丝氨酸蛋白酶抑制剂、金属羧肽酶蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂 (巯基蛋白酶抑制剂) 、天冬氨酸蛋白酶抑制剂, 其中只有天冬氨酸蛋白酶抑制剂不是植物来源, 丝氨酸蛋白酶抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑制剂因为抗虫特性明显, 研究最为广泛。根据同源性, 已测定的氨基酸序列或D N A结构的植物蛋白酶抑制剂可以分为10个族[3,4,5,6,7], 即大豆kunitz型胰蛋白酶抑制剂家族、bowman-birk蛋白酶抑制剂家族、大麦胰蛋白酶抑制剂家族、马铃薯蛋白酶抑制剂PI-Ⅰ家族、马铃薯蛋白酶抑制剂PI-Ⅱ家族、南瓜蛋白酶抑制剂家族、鸭脚稗-玉米双功能蛋白酶抑制剂家族、羧肽酶蛋白酶抑制剂家族、半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族、天冬氨酰蛋白酶抑制剂家族。
1 植物蛋白酶抑制剂的优点与抗虫机制
1.1 优点
自从1987年Hilder[8]第一次将豇豆蛋白酶抑制剂转入烟草, 获得具有抗虫特性的植株以来, 植物蛋白酶抑制剂基因在抗虫基因工程方面的发展空间就不断扩大, 并取得了很大的进展, 主要原因有以下两方面。
(1) 与传统的化学防治害虫育种相比, 采用基因工程手段获得的抗虫品种育种期短, 可利用的抗虫基因不局限于植物, 最重要的是不易污染环境, 而且可以有针对性地抗虫。
(2) 与其他抗虫基因如苏云金杆菌毒蛋白基因 (B T) 、凝集素基因相比, 植物蛋白酶抑制剂基因具有抗虫谱广, 对害虫不易产生耐受性, 且生物安全性高的优点[2,3,4]。
1.2 抗虫机制
蛋白酶抑制剂基因对植食性昆虫的生长发育的抑制机制尚未达成共识, 但大多数研究认为抑制机制主要表现在以下两个方面[1,2,3,4,5]。
(1) 蛋白酶抑制剂被摄入昆虫体内后与昆虫肠道内的蛋白酶的活性部位或变构部位结合, 形成酶抑制剂复合物, 抑制酶的催化活性。昆虫取食大量含有蛋白酶抑制剂基因的植物时, 蛋白酶抑制剂基因就会发挥作用, 抑制肠道内蛋白水解酶活性, 降低了肠道对取食的蛋白质的消化能力, 使昆虫不能摄取足够营养, 导致营养不良, 生长发育受阻。
(2) 蛋白酶抑制剂可以刺激昆虫过量合成和分泌消化酶, 再通过神经反馈, 使昆虫产生厌食反应, 致使昆虫代谢过程中某些必需氨基酸 (如甲硫氨酸) 匮乏, 扰乱昆虫的正常代谢, 甚至导致发育不正常亦或死亡。
2 植物蛋白酶抑制剂抗虫基因工程研究现状与存在问题
2.1 研究现状
目前, 用于抗虫基因工程研究的蛋白酶抑制剂基因主要来源于农作物, 如豇豆、大麦、南瓜、番茄、水稻等, 通过基因工程获得的转蛋白酶抑制剂基因的植株, 经过田间试验, 表现出明显的抗虫性, 其中靶标害虫主要集中在鳞翅目和直翅目。另外, 我国林木资源丰富, 而危害林木的害虫也很多, 这些害虫对林木的损害很大, 给我国造成了很严重的经济损失, 但是利用蛋白酶抑制剂获得的转基因林木少之又少, 这与林木来源的蛋白酶抑制剂基因数量稀少和农作物来源的蛋白酶抑制剂基因不易转入林木植物有很大的关系。
2.2 存在问题
2.2.1 基因沉默现象
通过基因工程获得的含有蛋白酶抑制剂的转基因植物, 在抗虫试验中, 有一部分转基因植株的抗虫性与对照相差不大, 有个别的还低于对照, 这些转基因植株不能正常表达, 通常与基因失活有关, 而这种基因失活的现象称为基因沉默[9,10]。外源蛋白酶抑制剂基因整合到受体植物基因组后, 在植物体内的基因表达是一个很复杂的过程, 任何一个过程出错都有可能导致基因不表达, 从而影响到整个植株的抗虫效果。杨广东等[11]通过转基因获得的含有豇豆蛋白酶抑制剂基因的大白菜在抗虫实验中发现, 有近3 0%的转基因植株的抗虫效果不明显, 甚至低于对照。另外, 吴晓梅等[12]在胰蛋白酶抑制剂抗虫基因转化烟草的研究中也显示, 一些转基因烟草的染色体上虽然整合有GUS基因, 但并未检测到GUS的表达, 怀疑也是基因沉默造成。基因沉默现象的存在不利于转基因植物的新的性状的稳定表达和遗传, 因此, 在蛋白酶抑制剂抗虫基因工程中要采取必要的方法减少基因沉默现象。
2.2.2 植物自身次生代谢物质的影响
植物在代谢时会产生次生代谢产物, 其中一些会对蛋白酶抑制剂的活性产生消极影响。有些植物成株期的叶内富含酚类化合物, 当叶组织受伤后, 酚类化合物被氧化成醌类物质[6], 与蛋白酶抑制剂共价结合, 导致蛋白酶抑制剂失活。绿原醌[5], 就是植物酚氧化酶的代谢物质中的一种。酚类物质含量高的植物或组织转入蛋白酶抑制剂后, 其抗虫稳定性的问题不容忽视。
2.2.3 昆虫产生耐受性
许多研究表明, 有些昆虫摄取含有蛋白酶抑制剂的植物时, 通过调控自身的肠道蛋白酶的分泌, 分泌一些新的, 或对此蛋白酶抑制剂不敏感的蛋白酶, 有些甚至可以降解蛋白酶抑制剂, 消除蛋白酶抑制剂的抑制作用, 从而使昆虫自身对此蛋白酶抑制剂产生耐受性[1,3]。昆虫产生耐受性的问题在抗性基因工程中普遍存在, 对如何降低昆虫的耐受性的研究较多, 但是方法较单一。
2.2.4 基因表达不稳定
蛋白酶抑制剂在转基因植物中的表达效果取决于其在转基因植物中的积累水平。积累水平高, 表达效果明显, 反之, 表达效果不明显, 或者不表达。影响蛋白酶抑制剂基因在转基因植物中积累量的主要因素有2个: (1) 位置效应。近年的研究表明, 转基因植物中的蛋白酶抑制剂主要定位于细胞质中, 蛋白酶抑制剂被细胞质中蛋白酶水解而大量减少, 导致其不能高水平积累, 影响高水平表达, 最终导致抗虫效果不明显[2,11,13]。 (2) 剂量效应。蛋白酶抑制剂基因的整合拷贝数只有到达一定数量时, 成为重复序列, 达到高剂量的浓度, 才能高水平表达。转基因植株的抗虫性有时在苗期较为理想, 但却不能保证植物生长时期的抗虫性, 原因就是蛋白酶抑制剂基因的含量没有达到持续的高剂量浓度, 导致不能持续高水平表达, 造成抗虫性不稳定[2,4,5]。这方面的影响主要存在于转基因林木中, 林木植物比较特殊, 是属于多年生木本, 生长周期更长, 蛋白酶抑制剂的积累量对其的影响较其他植物更大。柳武革等[14]的研究结果显示:转豇豆胰蛋白酶抑制剂基因的水稻各器官中的蛋白酶抑制剂活性在不同生长发育时期表现出明显的差异, 其成熟期时的活性最低。这种蛋白酶抑制剂基因在转基因植物中的表达表现出的时空特性, 尤其是植物发育后期活性的急剧下降, 不仅限制了基因的总体抗虫效果, 而且对转基因植物的生产产生了很大的消极影响, 尤其是在多年生林木植物、和以果实为主要生产产品的植物中。
2.2.5 生物安全性
虽然植物蛋白酶抑制剂基因相对于B T, 凝集素基因有较高的生物安全性, 但是, 不代表蛋白酶抑制剂就完全安全。转基因植株都有可能发生遗传变异, 基因逃逸[10]等问题, 这些都有可能导致植物发生有害变异, 或者其他植物发生不必要的基因变异, 竞争力增强, 扰乱自然平衡而造成灾害。有些还会发生反目标效应[15], 即对非目标昆虫或者有益的昆虫产生了负面影响, 如果存在与目标昆虫竞争食物并且对转基因植物有抗性的其他类害虫, 这种效应导致的直接结果就是目标昆虫数量降低或者灭绝, 非目标害虫数量不断增加, 并对转基因植物产生更大的影响, 尤其对转基因林木的影响甚大。而且, 传统的农作物等种植模式简单, 种植种类单一, 一旦发生虫害等灾害时, 不利于控制, 所以有必要的采取一些措施, 来控制这种不良影响。另外, 蛋白酶抑制剂作为抗营养因子, 不仅可以降解靶昆虫消化道内的蛋白酶, 对自身的蛋白酶也会降解, 从而使自身蛋白质的含量降低, 造成可食用的营养流失。此外, SUNG-SOO PARK等对甜荞麦中两种胰蛋白酶抑制剂进行放射性变应原吸附试验时, 发现它们具有一定的致过敏性[16]。虽然尚未发现有蛋白酶抑制剂直接影响人体健康的研究报道, 但不排除人类食用含有蛋白酶抑制剂食物可能会产生过敏反应[17]。
3 植物蛋白酶抑制剂抗虫基因工程问题的解决途径
3.1 解决基因沉默的途径
造成基因沉默的因素从作用机制和水平的不同可分为3种:位置效应、转录水平上的基因沉默、转录后水平的基因沉默, 其中第3种基因沉默更为普遍, 而且3种机制相互作用, 相互影响, 共同协作调控基因沉默[9]。针对基因沉默产生的机制, 目前减少基因沉默的主要方法有以下3种[10]。
(1) 改进转基因的方法, 选择单拷贝的转基因植株, 降低设计序列与内源序列的同源性, 减少形成重复序列的机会。
(2) 解决导致基因沉默的主要诱因 (甲基化) , 降低甲基化可有效地控制基因沉默的形成, 因此, 寻找具有去甲基化的功能的序列, 整合到基因中可以有效地控制甲基化, 从而控制基因沉默。另外, 也可以选择像5-氮胞嘧啶这样具有去甲基化的试剂处理植株, 防止基因沉默[9]。
(3) 使用一些有特殊功能的序列结合到基因中, 如将具有限定D N A环大小的核基质结合序列连接到转基因侧翼上, 可以在一定程度上抑制位置效应, 从而达到降低基因沉默的效果[18]。
3.2 增强基因的抗性, 延缓昆虫的耐受性
3.2.1 多价基因的联合
大多数植物转基因工程都是导入单个抗性基因, 有时会导致昆虫对该基因产生耐受性, 从而使转基因植物的抗性逐渐失去效果, 而多价基因联合一起导入到植物, 可以有效扩大植物抗虫谱, 而且昆虫即使对其中一种基因有耐受性, 其他的基因还是会对昆虫产生抗性。另外, 还可通过多步转化法, 将杀虫机理不同的基因导入同一植株, 获得抗虫性高的转基因植株。高越峰等人[19]构建了双价植物表达载体 (大豆kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因和豌豆植物外源凝集素基因) 进行了棉花转化, 获得的抗虫植株与转单基因植株对比, 抗虫性明显增强。另外, 李科友等[20]将改造过的BT (Cry I Ac) 基因和API (慈姑蛋白酶抑制剂基因) 都导入到银腺杨基因中, 获得了同时具有BT和蛋白酶抑制剂基因的转基因银腺杨, 经过抗虫实验证明, 同时具有着两种基因的转基因银腺杨, 抗虫能力比一般的单基因转化植株高很多;A J A Y SRINIVASAN[21], Maria Luiza V.Oliva[22]也都认为多价基因的联合有利于增强转基因植物的抗虫效果, 昆虫不易产生耐受性。而且, AJAY SRINIVASAN认为, 昆虫消化道内的蛋白酶种类繁多, 单一地导入一种抗虫基因, 不能达到较理想的效果, 多个抗虫基因的联合较为理想。
3.2.2 优化基因结构
一般的植物基因工程所使用的启动子是花椰菜花叶病毒启动子 (C a M W 3 5 S) , 但在有些植物转化中, 此启动子不能满足基因表达积累量的需求, 此时我们可以通过使用强于35S的强启动子或超强启动子, 来提高基因表达量, 从而提高植物抗性能力[23]。达克东等[24]就利用超强启动子来提高基因的表达强度, 获得豇豆蛋白酶抑制剂基因的超强表达载体转基因苹果植株;此外, 改用受体植物偏爱的密码子和终止子, 使用叶绿体转化系统都可以有效提高蛋白酶抑制剂基因在受体植物中的表达量[25]。
3.2.3 修饰基因
以豇豆胰蛋白酶抑制剂[11,13]为例, 其定位于细胞质, 物质代谢活动相对活跃, 豇豆蛋白酶抑制剂就可能被大量蛋白酶降解, 积累量减少, 最终表现出转基因植物抗虫效果不理想。如果对豇豆蛋白酶抑制剂基因进行修饰, 使其定位于物质代谢相对稳定的内质网, 不会或很少被降解, 获得高积累量, 就可以达到较好的抗虫效果。另外, 在番茄蛋白酶抑制剂Ⅱ基因的c DNA编码序列tin2和相应的含有内含子的DNA序列tin2i分别转入烟草中, 抗虫实验结果显示, 含有内含子的转基因烟草的抗虫性明显高于不含内含子的转基因烟草[26]。许多研究也证明, 有些植物基因的内含子可以增强基因的表达活性, 推测内含子可能具有增强子或启动子的作用。
3.2.4 与内源抗虫基因结合
棉花次生代谢产物棉酚和丹宁, 这两种产物与大豆蛋白酶抑制剂之间协同互作, 比三者单独作用的抗虫效果更加明显[27]。一般来说, 基因表达量的高低与基因表达水平的高低密不可分, 因此, 增加基因的积累量, 提高基因的表达水平, 定会增强转基因植株的抗虫效果。
3.3 调控蛋白酶抑制剂
植物本身就存在抗虫机制, 当植物受到昆虫攻击后, 植物体通过防卫反应的信号物质诱导植物发生化学变化以提高对昆虫攻击的抵抗能力。植物防卫反应中的信号分子有茉莉素、水杨酸、乙烯、脱落酸、系统素[28]、 (z) -3-3己烯醇等。利用这些植物本身具有的抗虫因子间接对外源抗虫基因进行调控, 两者相辅相成, 可以提高转基因植物总体的抗虫能力[29]。许多实验表明, 植物、脱落酸、茉莉酮和甲基化的茉莉酮[1]能强烈地诱导蛋白酶抑制剂基因表达。Geetha Govind[30]、Da-Hai Yang[31], 都证实了茉莉素对蛋白酶抑制基因的表达起到重要的调控作用。
3.4 利用R N A干扰抗虫
RNA干扰 (RNA interference, RNAi) , 是指通过内源性或外源性双联RNA (double strand RNA, ds RNA) 的介导, 特异性降解相应序列的m RNA, 导致靶基因的表达沉默, 产生相应的功能性缺失的现象, 属于转录后水平的基因沉默 (post-transcript gene silencing, PTGS) [32,33]。RNAi现象广泛存在于真菌、植物及动物等各种生物中, 它通过降解靶m RNA, 阻抑翻译, 促使同源基因D N A甲基化或修饰染色质的结构来发挥调控作用。利用RNAi抗虫, 主要是在转基因植株中构建某种昆虫的R N A干扰载体, 并能够表达该种昆虫的ds RNA, 昆虫取食了含有ds RNA的转基因植物后, RNAi在昆虫体内发生一系列反应, 降解胞质中的同源性m RNA, 使基因因缺少m RNA而不能合成蛋白质, 最终昆虫不能正常代谢、生长、发育, 最终死亡, 从而实现转基因植株对昆虫的抗性[34]。Yadav等[35]将编码根结线虫特异联接因子和整合酶的管家基因的发夹式RNAi质粒转入烟草植株, 实验结果显示, 获得的转基因烟草对根结线虫具有很高的抗性 (92%) , 证实利用RNAi方法控制植物寄生虫是一个高效的方法。James[36]也利用RNAi对西方玉米线虫取得了有效的控制。毛颖波等[37]在转基因植物中构建了棉铃虫的R N A干扰载体, 并能够表达棉铃虫参与棉毒素 (棉酚) 解毒的P450基因的ds RNA, 棉铃虫食用转基因植物后, 干扰R N A就会渗入棉铃虫的中肠壁内发生一系列的反应, P450基因的表达量显著降低, 棉铃虫对棉酚的耐受性大大减弱, 蚕食棉花的食欲骤减, 生长发育缓慢, 甚至死亡。
3.5 生物安全性
转基因植物的生物安全性一直是植物基因工程研究的重点, 其中对生态安全性, 食用安全性的关注最为广泛。相对于化学农药等, 使用生物学手段获得的抗虫转基因植物虽然有利, 但是也不能忽略其潜在的生态安全风险。
转基因植物也是生物多样性的组成部分, 从生物群落的结构分析, 单一的生物群落不稳定, 易受到外界环境的影响, 所以, 多种转基因植物的混栽也是稳定生物群落, 增加生物多样性的表现。而对于转基因林木却不适合这种种植方式, 林木多为风媒传粉, 与近缘野生种的可交配性可能对环境安全性造成的潜在威胁。因此, 在种植时, 应尽量避免和天然林混栽, 最好远离天然林, 也可以在转基因林木外设置保护林带。或者只种植雄性不育或只有雌株的转基因林木等, 防止花粉的扩散, 降低潜在生态风险性[38]。
有害的昆虫也是生物多样性的组成部分, 不可或缺, 如果把所有的害虫都消灭掉, 势必会影响害虫种群的平衡, 最后导致生物多样性破坏, 进而影响到生态安全性, 这样得不偿失, 所以并不是转基因植物的抗虫性越高越好, 只要把害虫水平控制到生态经济危害水平之下, 不影响生态安全性即可。总之, 要合理利用转基因植物, 避免其对生态环境, 生态安全性的破坏[15]。
蛋白酶抑制剂作为一种抗营养因子, 对许多农作物的食用营养性有很大影响, 为了降低食用农作物的营养流失, 有必要采取一定措施既可以保护植物不受虫害影响, 又不会造成食用营养流失过多。有研究显示, 利用植物组织或器官特异性启动子调控基因在特定的器官或组织中表达, 可以有效降低外源基因对植物其他性状的影响, 而且还可以提高外源基因在特定组织和器官的高效表达, 增强转基因的抗性效果。如利用绿色特异性启动子诱导蛋白酶抑制剂只在茎叶部分表达, 而不在种子和果实等器官表达, 从而提高转基因作物的食用安全性和营养性[39]。另外, 茶多酚[40]络合胰蛋白酶抑制剂是一种有效的钝化胰蛋白酶抑制剂的生物失活法, 就食品的营养与安全性而言, 生物失活法相对于物理, 化学失活法又是一种较理想的失活方式。茶多酚作为一种天然的食品添加剂, 对蛋白酶抑制剂的钝化是一种有效的解决大豆食用安全营养的方法, 并且有着广泛的研究前景。
4 展望
植物蛋白酶抑制剂的抗虫基因工程的研究虽然比较广泛, 但蛋白酶抑制剂的研究不够成熟, 主要表现在以下几个方面。
(1) 蛋白酶抑制剂的抗性机理目前尚不完全清楚, 有待于深入发掘。由于蛋白酶抑制剂的种类较多, 不同植物中蛋白酶抑制剂的结构各不相同, 不同昆虫消化蛋白酶种类也不同, 导致目前蛋白酶抑制剂抗虫机理还不能下定论, 这还有待于继续深入的研究。
(2) 林木来源蛋白酶抑制剂有待于开发。目前, 植物来源的蛋白酶抑制剂主要集中在大豆, 豇豆, 番茄, 大白菜等农作物中, 林木来源的很少, 只在苹果, 杨树等林木中有研究, 而林木害虫 (尤其是柱干性害虫) 对林木的危害性很大, 被称作是“没有硝烟的战争”。将农作物来源的蛋白酶抑制剂转入到林木植物中, 其抗虫性的提高具有一定的局限性, 而且林木害虫的消化系统生理生化特性的研究较少, 没有深入准确的研究, 就不能有针对性的建立一套完善有效的抗虫体系。因此, 探索一套非林木来源蛋白酶抑制剂转林木的高效转基因体系, 和发掘林木中的蛋白酶抑制剂基因是林木抗虫基因工程的迫切需求。
(3) 开发蛋白酶抑制剂的抗病功能。蛋白酶抑制剂最主要的作用就是抑制蛋白酶的活性, 在很多蛋白酶参与的生理活动中起着重要的调控作用, 不仅昆虫的消化需要蛋白酶, 病原菌的侵染和扩展过程同样有蛋白酶的参与, 但是在蛋白酶抑制剂抗病方面的作用机理的研究还比较少, 尤其是同一蛋白酶抑制剂的抗虫抗病的双重抗性研究很少, 发掘具有双重抗性蛋白酶抑制剂对植物基因工程发展将是一次很大推动。
(4) 蛋白酶抑制剂基因与其他基因联合抗虫。不只是与抗虫基因结合, 还可以发掘更多的抗性基因, 或者能够辅助抗虫基因表达的基因, 与蛋白酶抑制剂基因相辅相成, 发挥更大的保护转基因植物的作用。针对RNAi高稳定性, 高特异性, 可以考虑与蛋白酶抑制剂联合抗虫, 或许有更好的抗虫效果。
综上所述, 虽然蛋白酶抑制剂基因从发现到发展已经有半个多世纪, 但是, 蛋白酶抑制剂的研究内容仍很广泛, 发展空间还很大, 有待于研究人员不断开发出蛋白酶抑制剂更多有利于植物的功能和作用, 更好地保护我们的生态环境。
(责任编辑:敬廷桃)
摘要：植物蛋白酶抑制剂基因作为一种抗虫基因, 具有广泛的抗虫谱, 并且与其他抗虫基因相比具有很大的优势。文章基于蛋白酶抑制剂的研究现状, 分析蛋白酶抑制剂抗虫基因工程中存在的各种问题, 提出了相应的解决方法。
蛋白质工程 第9篇
1 材料与方法
1.1 饲料
豆粕、玉米蛋白粉两种蛋白质饲料, 市售。
1.2 试验动物
选取9只体况良好、平均体重为30 kg的内蒙古苏尼特羯羊作为试验动物。
1.3 试验日粮与饲养管理
日粮能量维持需要为450 kJ/kgW0.75;蛋白质维持需要为350 mg/kgW0.75;日粮供给为1.3倍维持饲养水平。日粮配方和营养水平见表1。每日于8:00和17:00饲喂2次, 自由饮水, 按常规进行光照、驱虫等饲养管理程序。试验期内每日记录采食量。
1.4 试验方法
饲料样品经2.5 mm筛粉碎后, 贮存于磨口瓶内作为试验样品。用尼龙绢 (300目) 制成8 cm×12 cm的尼龙袋, 自来水浸泡冲洗, 在65 ℃烘箱中烘干, 冷却, 称至恒重, 备用。称取4 g饲料样品放入尼龙袋, 在早晨饲喂2 h后由瘤胃瘘管口投入, 每只羊1次放入7个尼龙袋, 分别测定2, 6, 12, 24, 36, 48, 72小时时粗蛋白的瘤胃降解率。尼龙袋取出后, 用水冲洗直至水清为止。然后将尼龙袋放入65~70 ℃烘箱, 烘到恒重 (约需48 h) , 将同一时间的残渣混合,
取样测定蛋白质。
2 蛋白含量的测定及降解率的计算
用凯氏定氮法测定蛋白质含量, 并用以下公式计算蛋白质消失率及有效降解率。
2.1 待测饲料蛋白质在瘤胃中不同时间点消失率的计算
公式:A (%) = (B-C) /B×100。
式中:A为待测饲料的干蛋白质 (或淀粉) 瘤胃消失率 (%) , B为样本中待测饲料蛋白质 (或淀粉) 量 (g) , C为残留物中待测饲料蛋白质 (或淀粉) 量 (g) 。
2.2 待测饲料蛋白质有效降解率计算
蛋白质有效降解率 (P) 根据Orskov 和McDonald提出的公式计算。
dp=a+b (1-e-Kd×t) ;P=a+ (b×Kd) / (Kd+Kp)
式中:dp为t时刻蛋白质消失率 (%) , a为快速降解速率, b为慢速降解部分 (%) , Kd为b的降解速率, t为饲料在瘤胃内培养时间 (h) , P为饲料中蛋白质有效降解率, Kp为待测饲料的瘤胃流通速率 (这里流通速率Kp=0.06/h) 。
3 结果 (见表2)
注:同列数据肩注字母相同表示差异不显著 (P>0.05) , 不同表示差异显著 (P<0.05) 。
从表2可知:豆粕蛋白质瘤胃消失率在2小时时就已经很高, 以后直线上升, 48小时时基本完全降解, 达到98.12%;而玉米蛋白粉的蛋白质消失率在48 h内一直很低, 仅为86.78%, 降解缓慢。豆粕与玉米蛋白粉在2, 6, 12, 24, 36, 48小时时间点的瘤胃降解率分别为32.42%、42.35%、54.23%、77.35%、86.28%、98.12%和15.54%、18.69%、22.78%、49.32%、75.48%、86.78%, 在各时间点均差异显著 (P<0.05) 。
4 分析与讨论
在反刍动物蛋白质新体系中, 饲料蛋白质降解率具有重要地位, 它不仅是反刍动物蛋白质需要和饲料蛋白质评定新体系的基本参数, 而且也是反刍动物饲料分类的指标。很多因素会影响饲料粗蛋白在瘤胃中的降解, 饲料粗蛋白的化学特性是最重要的影响因素。在饲料粗蛋白化学特性中有最重要的两点值得考虑:①非蛋白氮和真蛋白氮的含量;②饲料原料中真蛋白部分的物理和化学特性。一些导致在瘤胃降解速度差异的蛋白质的特性包括:蛋白质三维立体结构的差异, 分子内和分子间化学键的差异, 存在细胞壁惰性屏障和含有抗营养因子等。不同的蛋白质结构将影响瘤胃微生物与蛋白质的接触程度, 这无疑是影响蛋白质瘤胃降解速度和降解程度的最重要因素。含有大量交联键 (例如存在于白蛋白和免疫球蛋白内的二硫键或者由于热处理或化学处理产生的交联键) 的蛋白质难以与蛋白酶接近, 降解速度很慢。