细胞质胸苷激酶

细胞质胸苷激酶（精选7篇）

细胞质胸苷激酶 第1篇

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和质粒

舌癌细胞系Tca8113由上海交通大学口腔医学院惠赠,针对FAK的siRNA表达载体由上海吉凯基因有限公司合成并扩增。

1.1.2 主要试剂

RPMI1640 培养基、G418(Gibco,美国),新生牛血清(杭州四季青),LipofectamineTM2000转染试剂(Invitrogen,美国),羊抗人β-actin单克隆抗体、鼠抗人FAK抗体、HRP标IgG二抗(中杉金桥,北京),蛋白显色试剂盒(Pierce, 美国)。

1.2 方法

1.2.1 siRNA 序列设计及合成

在NCBI 数据库中查找FAK 的mRNA 全序列,从FAK 编码区中寻找符合设计原则的靶序列,通过BLAST 软件确定与其他非相关基因无同源性,按照pGCSilencerTM-U6/Neo 载体的要求设计能编码siRNA 的寡核苷酸链。寡核苷酸序列两端包含酶切位点,能直接与经相同酶切的pGCSilencerTM-U6/Neo载体连接。设计的siRNA 寡核苷酸序列如下:FAK1(干扰组1),其正义链为5′-GCATGTGGCCTGCTATGGA- 3′,反义链为5′-TCCATAGCAGGCCACATGC-3′;FAK2(干扰组2),其正义链为5′-GCTAGTGACGTATGGATGT-3′,反义链为5-ACATCCATACGTCACTAGC-3′;同时合成与FAK基因序列无关的siRNA作为阴性对照(NON-siRNA),GAPDH si RNA为阳性对照。然后将以上siRNA分别连接到pGCSilencerTM-U6/Neo载体上,分别命名为:pGCSilencer-FAK1、pGCSilencer-FAK2 、NON-siRNA和GAPDH。

1.2.2 细胞培养及转染条件的优化

转染前24 h取指数增殖期细胞,制成细胞悬液,接种于24 孔板,细胞密度为 5×108个/L。24 h后,取4 μl转染试剂与不含血清的RPMI 1640培养液室温下混合至体积100 μl,孵育 5 min,然后分别取 0.4、0.8、1.6、2.0、3.2 μl(浓度为1 g/L)的pGCSilencer-FAK1(或pGCSilencer-FAK2)与不含血清RPMI 1640培养液室温下混合至终体积各为100 μl。10 min内将上述pGCSilencer-FAK1 (或pGCSilencer-FAK2)与转染试剂混匀 (体积 200 μl),孵育10 min。细胞用不加血清及抗生素的RPMI 1640洗2 次,加入上述混合液,再加RPMI 1640至体积为2 ml。24孔板十字交叉轻摇,置CO2 培养箱中8 h后共聚焦显微镜下观察,红色荧光蛋白表达细胞计数,计算转染效率,实验重复3次,以GAPDH为对照。

1.2.3 细胞转染及单克隆细胞株的筛选

Tca8113 细胞用RPMI 1640 (含100 ml/L新生牛血清),在37 ℃, 50 ml/L CO2 条件下培养。将对数生长期细胞于转染前24 h接种于6 孔板,取pGCSilencer-FAK1、pGCSilencer-FAK2、GAPDH和non-siRNA重组体质粒DNA分别转染Tca8113细胞,转染方法参照LipofectamineTM2000转染试剂操作说明进行,转染48 h后用G418 (浓度0.4 g/L) 筛选,2 周后挑取阳性克隆细胞株,扩增培养,分别建立稳定表达pSilencer-FAK1、pSilencer-FAK2和Control的单克隆Tca8113细胞株,依次命名为Tca-FAK1、Tca-FAK2、Tca-NON和Tca-GAPDH。下述Western blot和免疫细胞化学的检测均采用筛选出的稳定细胞株。

1.2.4 Western blot检测

收获培养细胞,提取蛋白。配制100 g/L分离胶聚丙烯酰胺凝胶,每个加样孔中依次加20 μl待测样品,SDS-PAGE (100 g/L浓缩胶、80 g/L分离胶) 电泳12 mA 、2 h, 300 mA 2 h转膜,100 g/L脱脂奶封闭;1∶200一抗 4 ℃孵育 24 h, PBS洗10 min,重复洗3 次,加辣根过氧化物酶偶联的二抗,37 ℃下杂交1 h,PBS洗10 min,重复6 次,按化学发光法显影、定影并检测膜上印迹。

1.2.5 免疫细胞化学检测

将1 ml密度为5 ×108/L的细胞悬液滴于处理过的无菌盖玻片上,37 ℃、50 ml/L CO2 条件下孵育24 h,40 g/L甲醛固定,H2O2、正常羊血清处理后加入鼠抗人KAK单抗,4 ℃ 24 h后加入生物素化兔抗鼠IgG及SABC复合物,各步间均PBS(pH:7.14)充分振洗,DAB显色、脱水、透明、封片。以PBS代替一抗做为对照。

2 结 果

2.1 重组质粒酶切鉴定

将重组质粒pSilencer-FAK进行SacⅠ和SacⅡ酶切,RT-PCR及测序结果均证明靶向FAK基因siRNA重组质粒表达载体构建成功(图 1)。

2.2 转染条件的优化及效率测定

激光共聚焦显微镜下观察发现转染4 h后即有GFP标记的GAPDH和RFP标记的pSilencer-FAK转入细胞内,8 h达最高峰。转染效率以质粒2.0 μl、转染试剂4 μl组最高,pSilencer-FAK1和pSilencer-FAK2均达21%的转染效率。

2.3 激光共聚焦观察细胞形态

将重组质粒转染Tca8113, 经G418筛选2 周后,挑取阳性克隆团扩大培养。激光共聚焦显微镜下观察,Tca-FAK1、Tca-FAK2中可见红色荧光蛋白的表达(图 2);Tca-NON和Tca-GAPDH组可见绿色荧光蛋白的表达(图 3),证实目的基因被成功转染。此外,实验中发现,转染外源性质粒后细胞形态发生变化,细胞皱缩,细胞碎片增多。

2.4 免疫细胞化学

对照组及未转染组中细胞胞质呈棕黄色,FAK广泛表达于细胞质中(图 4)。实验组细胞质中FAK表达明显减少(图 5)。

2.5 Western-blot

各组间β-actin 的蛋白水平表达无明显差异,说明各组蛋白总的点样量基本一致。Tca-FAK1、Tca-FAK 2组FAK蛋白条带较Tca-NON和Tca-GAPDH组及未转染组蛋白条带明显减弱(图6)。

3 讨 论

根据肿瘤生物学特征,结合传统治疗方法设计新型生物治疗策略逐渐成为国内外广为关注的热点。FAK定位于人的8q24,cDNA 全长4 285 bp,编码1 052 个氨基酸,对其结构已清楚。学者们通过FAK单克隆抗体、受体阻断、寡核苷酸等抑制手段初步明确其分子生物学效应,但皆因抑制的暂时性难以应用于临床抗癌治疗[3]。由双链RNA引发转录后基因沉默机制的RNA干扰技术的建立,特别是在哺乳动物细胞应用小干扰RNA成功介导RNAi,以及RNAi的体内成功应用,为基因功能的研究提供了强大的武器,也为肿瘤的分子生物治疗开辟了新的途径[4,5]。

siRNA或其相应表达载体的转染效率,是影响RNA干涉效果的一个关键因素。由于传统的脂质体介导方法对很多细胞的转染效率都不高,若需要稳定转染提高基因沉默效果,必须要挑选单个细胞克隆。本实验中应用Invitrogen公司的LipofectamineTM2000转染细胞,虽然部分细胞瞬时转染的效率可达到40%～50%,但Tca8113细胞瞬时转染效率则不到20%。转染效率的差异可能与细胞种类、转染技术及条件有关。此外,不同siRNA稳定转染后的细胞对FAK基因的封闭效果不一样,这可能与序列的空间结构和质粒在基因组中的随机整合有关,从而影响了siRNA的表达。因此,我们首先对转染条件进行了优化,确定最佳转染条件。在检测FAK基因沉默效果时,本实验采用的是转染后稳定筛选的单克隆细胞株,通过应用免疫细胞化学及Western-blot检测,显示FAK基因在蛋白翻译水平受到明显抑制。

黏着斑激酶主要通过其多个位点的酪氨酸、丝氨酸等的磷酸化与含有SH2 或SH3 结构域的蛋白质接合,通过整合素、FAK/Src/p130CAS/JNK、FAK/ PI3激酶、FAK-ROCK/RhoA 等多条信号通路广泛参与细胞的多种生物学过程[4,6]。临床病理学研究表明,FAK在乳腺癌、肠癌等多种实体癌瘤中高表达,并参与肿瘤的发生、发展、侵袭与转移[2,7,8,9]。我们的前期研究也证实,FAK在口腔癌中高表达,与MMP2表达正相关,主要表达于口腔癌生长前沿区细胞及转移灶癌细胞,与颈淋巴结转移密切相关[2]。

本实验成功构建并筛选出能特异性干扰Tca8113细胞中FAK的siRNA,并建立FAK基因沉默后的Tca8113稳定细胞株,为系统观察口腔癌细胞的失巢凋亡效应,及进一步运用FAK 分子抑制手段治疗口腔癌奠定理论和技术基础。

摘要：目的:构建靶向黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)基因的小干涉RNA(small interfering RNA,siRNA)质粒表达载体,转染人舌癌细胞Tca8113后观察其对FAK表达的抑制作用。方法:根据siRNA的设计原则,在人FAK mRNA序列中,设计并合成2条特异性靶序列寡核苷酸及2条无关对照序列,经退火成互补双链,再克隆到pGC-SilencerTM-U6/Neo真核表达载体中,构建重组体pSilencer-FAK并进行酶切鉴定;转染重组质粒至Tca8113细胞中,经G418抗性筛选,获得稳定转染细胞系;运用免疫细胞化学和Western-blot鉴定FAK的沉默效应。结果:质粒酶切证实目的寡核苷酸片段已被克隆到pGC-SilencerTM-U6/Neo载体中;pSi-lencer-FAK转染细胞后,FAK基因的表达受到明显抑制。结论:成功构建了针对人FAK的siRNA表达载体,通过转染Tca8113细胞可有效地抑制细胞中FAK的表达。

关键词：黏着斑激酶,舌癌细胞,RNA干扰

参考文献

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[2]江宏兵,田卫东,李声伟,等.口腔鳞癌黏着斑激酶表达与颈淋巴结转移的关系[J].实用口腔医学杂志,2003,19(3):199-201.

[3]Kurenova E,Xu LH,Yang X,et al.Focal adhesion kinase suppresses apoptosis by binding to the death domain of re-ceptor interacting protein[J].Mol Cell Biol,2004,24(10):4361-4371.

[4]孙莉萍,翁建,张秀明,等.siRNA的化学修饰和临床应用[J].生命化学,2005,21(4):339-342.

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[6]Jiang X,Sinnett-Smith J,Rozengurt E.Differential FAK phosphorylation at Ser-910,Ser-843and Tyr-397induced by angiotensin II,LPA and EGF in intestinal epithelial cells[J].Cell Signal,2007,19(5):1000-1010.

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细胞质胸苷激酶 第2篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

本组20例, 男15例, 女5例;年龄17～82岁, 平均59岁。依据血液病诊断及疗效标准[1], 确诊为慢性粒细胞白血病且BCR-ABL融合基因阳性、Ph染色体阳性。其中慢性期12例, 加速期6例, 急性变期2例。

1.2 方法

患者口服甲磺酸伊马替尼治疗, 其中慢性期患者剂量为300～400 mg/d, 急变期和加速期患者为600 mg/d。餐中顿服。6例加速期和急性变期患者经甲磺酸伊马替尼600 mg/d治疗90天后5例无效者改用尼洛替尼400mg、每天2次, 饭后口服, 服药后嘱饮水500 ml以上。

1.3 不良反应的观察

采用电话随访或患者来院复诊时, 请家属或患者详细记录每次服药后的不良反应, 观察患者服药后1 w、1个月以及以后1～3个月的症状、体征、体重等情况。8例加速期和急性变期患者为住院病人。

2 结果

患者服药情况服药时间3～50个月, 平均9.3个月, 中位18个月, 超过1年者11例。6例加速期和急性变期患者经甲磺酸伊马替尼600 mg/d治疗90天后无效者改用尼洛替尼。本组治疗后, 完全缓解12例, 白血病症状消失6例。治疗期间患者均有出现白细胞下降。服药14d后, 5例发生WBC下降<2.0×109/L, 均为急变期和加速期患者。服药14 d, 全组WBC均下降, 4例血小板下降。服药21 d, 10例均出现WBC下降, 5例血小板下降<50×109/L, 1例血红蛋白下降。发生恶心、呕吐4例, 颜面部浮肿、体重增加6例, 肝功异常3例。服药2周后出现皮炎3例, 其中剥脱性皮炎1例, 停药1个月后, 伊马替尼又从小剂量200 mg/d开始口服治疗逐渐加量至400 mg/d, 皮炎未继续出现。蛛网膜下腔出血1例, 查血小板30×109/L, 予输注血小板, 并给予甘露醇降颅压治疗, 蛛网膜下腔出血治愈。1例心动过速, 2例肌肉痛, 2例脱发。

3 护理

3.3.1 观察记录病情 服药期间观察病情, 建立不良反应记录表, 每周监测血常规2次, 每3周查肝、肾功能1次, 每3个月查骨髓象1次, 记录服药后不良反应发生情况。

3.3.2 胃肠道反应的护理 本组有4例发生恶心、腹胀、呕吐, 嘱患者:①进食易消化、高蛋白食物和补充足够液体。②减少进食对消化道有刺激的食物。③早餐中顿服格列卫化疗药物, 多饮水, 促进毒素排出体外。

3.3.3 出血的预防及护理 当血小板、白细胞下降到参考值以下时, 要嘱患者卧床休息, 减少活动。应指导患者避免外伤引起出血, 防摔碰损伤。禁用抑制血小板功能的药物, 密切观察血象的变化。血小板<10·0 g/L需停药。:本组出现蛛网膜下腔出血1例。观察患者头昏头痛、恶心呕吐症状, 随时观察神志、瞳孔变化, 监测血压、脉搏变化, 遵医嘱给予甘露醇降颅压治疗, 嘱患者绝对卧床休息, 一切生活护理均由护理工作者完成。

3.3.4 水钠潴留的护理 (1) 每周测体重1次, 观察尿量、尿色, 准确记录24 h出入量。注意有无脱水、电解质紊乱等。

3.3.5 剥脱性皮炎型药疹的护理 认真观察皮炎出现时间和范围, 严格遵医嘱给予小剂量强的松口服治疗。1例患者全身广泛皮疹、水疱, 于严格执行隔离消毒制度, 做好保护性隔离'防止继发感染, 引导其保持积极的心理状态, 积极配合治疗, 促进康复。

4 讨论

甲磺酸伊马替尼可在细胞水平上抑制酪氨酸激酶, 治疗慢性粒细胞白血病有较好的疗效, 总有效率可达95%[2]。在治疗CML时, 常见的不良反应有骨髓抑制、水肿、恶心呕吐、腹泻、纳差、口腔溃疡、肝功异常、肌痛、肌痉挛等[3]。本组最常见的不良反应有轻恶心、呕吐, 腹泻、皮疹、肌痛及肌痉挛, 这些不良反应经处理均有效控制。不良反应中的骨髓抑制, 以粒细胞减少、血小板减少常见。本组浮肿和水、钠潴留, 发生率为30.0%。大多数患者的浮肿表现为下肢浮肿和眶周, 午后明显、体重迅速增加;治疗期间应作详细观察, 必要时用利尿剂治疗能很快控制。本组有3例在服药2周后出现皮炎, 予小剂量强的松15mg/日, 口服, 2例消失, 1例患者逐渐出现剥脱性皮炎, 该不良反应罕见, 需引起临床护理工作者重视。CML患者采取规范治疗时, 罕见出血报道。本

组发现1例蛛网膜下腔出血, 这与患者治疗期间血小板减少有关。慢性粒细胞白血病患者治疗期间, 一旦血小板减少在20×109/L以下时, 就应高度警惕患者内脏出血危险, 要严密观察病情, 及时治疗处理, 必要时停药。尼洛替尼是一种新型的、高选择性的BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂, 作用强于伊马替尼。现已应用在伊马替尼耐药或者不耐受的加速期和急变期患者中。本组患者结果证实了尼洛替尼在治疗伊马替尼耐药或者不能耐受的患者时, 可以更快速起效并能获得更持久的缓解。其不良反应与伊马替尼类似, 以骨髓抑制, 水潴留为主。非血液学副作用不很常见且多为1～2级, 如皮疹、乏力、瘙痒、头疼、恶心、肌肉痉挛和胃肠功能紊乱。尼洛替尼较少出现伊马替尼常见的体液潴留、水肿等不良反应。文献有心电图Q-T延长的报导, 本组病例未发现, 有待积累病例观察。

关键词：慢性粒细胞白血病,甲磺酸伊马替尼,不良反应,护理

参考文献

[1]张之南, 沈悌.血液病诊断及疗效标准[M].天津:天津科学出版社, 1991:193-195.

[2]金正明, 吴德沛, 孙爱宁.伊马替尼治疗ph阳性慢性髓细胞白血病及急性淋巴细胞白血病39例[J].实用临床医药杂志, 2005, 9 (8) :53.

细胞质胸苷激酶 第3篇

1 材料和方法

1.1 质粒构建

HKⅡ基因靶序列 (GCAGAAGGTTGACCAG-TAT) 来自Gene Bank (NM_000189) 。质粒构建的基本步骤如下:shRNA双链退火;载体质粒p Yr1.1的酶切, 电泳, 回收DNA;稀释退火片段与线性化p Yr1.1质粒表达载体的连接;转化感受态细胞DH5a, 扩增、提取质粒、酶切鉴定后测序分析。构建好的质粒表示为p Yr1.1/HKⅡ;无关对照双链RNA的靶序列为:GACTTCATAAGGCGCATGC, 所构建的质粒表示为p Yr1.1/UC。

1.2 细胞培养及转染

结肠癌细胞系HT29细胞 (中国科学院细胞所) 培养采用DMEM (10%FBS) , 选取对数生长期细胞进行实验。应用Lipofectamine TM 2000脂质体载体将p Yr1.1/HKⅡ和p Yr1.1/UC质粒分别转染HT29细胞。

1.3 实时定量RT-PCR

转染72 h后收集细胞, 提取总RNA进行实时定量RT-PCR, 检测基因表达。扩增条件:95℃1 min;94℃15 s, 58℃20 s, 72℃20 s, 40个循环, 72℃5min。各引物序列如下:HKⅡ:5’-AGCCACCACTCACCCTACTGC-3’ (正义链) , 5’-CTGGAGCCCATTGTCCGTTAC-3’ (反义链) ;β-actin:5’-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3’ (正义链) , 5’-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3’ (反义链) 。比较各组细胞的HKⅡ基因表达量。

1.4 细胞侵袭实验 (Transwell法)

将BD matrigel和DMEM培养基以1∶3的比例稀释, 吸取100μL加入transwell的上室中, 无菌放置、室温干燥。将细胞消化制成105个/m L悬液, 分别取1 m L细胞悬液于1 500 rpm离心5 min, 弃上清。加入200μL无血清培养基, 吹打均匀后分别放入3个transwell小室中。Transwell板中加入500μL含10%FBS的DMEM完全培养基, 将小室放入板中。37℃, 5%CO2培养箱中培养24 h。将小室取出, PBS洗去培养基, 0.1%结晶紫染液染色10 min;自来水冲洗, 将上室中的细胞擦除干净, 于倒置显微镜下对非细胞接种侧拍照, 在高倍镜下任意取10个视野, 计算每组细胞的平均值, 比较两组细胞的数量。

1.5 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。对各组资料应用独立样本的t检验进行分析。采以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 shRNA对HT29细胞HKⅡ表达的影响

转染shRNA后HT29细胞 (实验组) 中HKⅡmRNA表达很弱, 几乎看不到条带, 而质粒对照组和空白对照组HT29细胞中可见HKⅡmRNA强表达, 组间比较, 差异具有统计学意义 (P<0.05) , 见图1。

(1:质粒对照组;2:空白对照组;3:实验组)

2.2 shRNA对HT29细胞侵袭能力的影响

实验组HT29细胞数量较质粒对照组和空白对照组细胞明显减少 (P<0.05) , 说明转染HKⅡ的shRNA后, HT29细胞的侵袭能力明显减弱, 见图2。

(A:空白对照组;B:空质粒对照组;C:实验组)

3 讨论

恶性肿瘤中不但存在基因异常, 而且存在代谢异常, 尤其是能量代谢异常。在2006年美国癌症研究协会年会上, 研究学者预言能量代谢异常即将成为癌细胞的第七个标志[1]。近来发现, 恶性肿瘤细胞中普遍存在糖酵解途径的增强。可以推测, 如果能阻断肿瘤细胞中糖酵解途径, 即可减少肿瘤细胞中大部分能量的生成, 可能会阻滞肿瘤细胞的生长和增殖。

己糖激酶 (HK) 是糖酵解途径中第1个反应的限速酶, 研究发现, HKⅡ与恶性肿瘤关系最密切, 在一些糖酵解途径增强的肿瘤组织中, HKⅡ的表达明显增强, 而在相应的正常组织中HKⅡ的表达很弱或不表达, 推测HKⅡ在肿瘤的发生、发展及转移中可能起重要作用。前期的研究利用RNA干扰技术特异性沉默转酮酶样基因1 (transketolase-like protein 1, TKTL1) 的表达来阻断磷酸戊糖途径, 进而抑制肿瘤细胞中核酸的合成, 在结肠癌细胞系中有效地抑制了癌细胞的生长增殖[2]。

本研究利用RNA干扰技术在结肠癌细胞系HT29细胞中沉默了HKⅡ的表达, 有效阻滞了癌细胞的生长及增殖, 验证了肿瘤细胞中糖代谢异常的理论, 并使HKⅡ成为调控恶性肿瘤细胞的生新的研究靶点。

摘要：目的:探讨己糖激酶Ⅱ (hexokinaseⅡ, HKⅡ) 在结肠癌HT29细胞生长增殖中的作用。方法:构建HKⅡshRNA质粒, 转染结肠癌细胞系HT29细胞, 实时定量PCR检测HKⅡ的表达, 用划痕法和Transwell法检测细胞增殖侵袭能力的变化。结果:shRNA质粒转染HT29细胞后, HKⅡ表达明显减弱, 细胞的增殖侵袭能力明显减弱 (P<0.05) 。结论:HKⅡ可能在结肠癌细胞的增殖侵袭中起重要作用。

关键词：己糖激酶Ⅱ,结肠癌,HT29细胞系

参考文献

[1]Garber K.Energy deregulation:licensing tumors to grow[J].Science, 2006, 312 (5777) :1158-1159.

细胞质胸苷激酶 第4篇

1 PI3K/Akt/NF-κB信号通路

PI3K是一种位于细胞内的磷脂酰肌醇激酶, 是细胞内重要的信号转导分子, 是由P110催化亚单位和P85调节亚单位构成的异源二聚体。激活的PI3K在质膜上产生第二信使3, 4, 5-三磷酸磷脂酰肌醇 (PIP3) , PIP3与细胞内含有PH结构域的信号蛋白Akt及磷酸肌醇依赖激酶 (PDK) 结合, 促使Akt蛋白激酶在发生磷酸化而激活[2,3]。

Akt即蛋白激酶B (PKB) , 位于多条信号传导通路的交叉点, 是一种分子量为60 k Da的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶, 在哺乳动物中有Akt1、Akt2、Akt3三个亚型, Akt通过磷酸化作用活化, 进一步激活或抑制其下游的靶蛋白, 发挥调节有核细胞内的生物信号的传导作用[4]。

作为PI3K/Akt信号通路下游蛋白的核转录因子-κB (NF-κB) 是细胞内的一种由P65和P50组成的双亚基二聚体蛋白。静息状态下细胞中的NF-κB与其抑制蛋白IκB结合, 以无活性的结合体存在于胞浆中。当细胞外受到某种刺激 (如缺血再灌注损伤) 时, 会通过生物信号传导途径激活IκB蛋白激酶, 与NF-κB结合的IκB发生磷酸化从而解离出来, 同时NF-κB迅速易位至细胞核中与相应的靶基因结合从而激发生理活性。

2 PI3K/Akt/NF-κB信号通路与细胞凋亡

细胞凋亡作为机体细胞一种程序性死亡过程, 在维持组织稳定、平衡细胞增殖起着重要作用。细胞凋亡不足或细胞凋亡过度均可引起机体发生相应的病理生理变化, 细胞凋亡过度会导致过多的组织细胞坏死及相应组织器官的功能障碍。PI3K/Akt/NF-κB信号通路影响细胞凋亡可能与下列机制有关: (1) 直接磷酸化促凋亡蛋白Bad, 抑制其促凋亡活性。 (2) 磷酸化促凋亡相关因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 (Caspase) 。 (3) NF-κB自身的生物活性影响细胞凋亡。

2.1 Akt与细胞凋亡

2.1.1 Akt在肿瘤细胞凋亡的研究

肿瘤细胞是在致瘤因素作用下细胞失去正常调控导致的异常增殖, 其中细胞凋亡的异常是产生肿瘤细胞的重要因素。肿瘤细胞的有丝分裂需要细胞周期蛋白依赖性激酶 (CDKs) 的调节, 肿瘤细胞增殖过程中几乎都存在CDKs翻译的增强。Akt可通过调控细胞周期相关蛋白影响肿瘤细胞有丝分裂。PI3K/Akt信号通路在诸多恶性肿瘤如卵巢癌、乳癌、消化道肿瘤、神经母细胞瘤中的表达异常。在通过右美托咪定处理的大鼠神经胶质瘤C6细胞中, Akt的活化减少了Caspase-3的表达, 上调缺氧诱导因子 (HIF) -1α和内皮生长因子 (VEGF) 的表达减轻肿瘤细胞凋亡[5]。抑癌基因P53是机体重要的促细胞凋亡蛋白, 在肿瘤的发生发展起着重要作用, 其负性调节蛋白泛素蛋白连接酶 (MDM2) 能结合P53使其失去转录活性。Akt激活能磷酸化MDM2的Ser166和Ser186结合位点, 激活MDM2活性, 抑制P53促凋亡活性, 使肿瘤细胞凋亡减少[6]。消旋体布洛芬通过抑制Akt磷酸化增加P53的活性表达, 促进神经母细胞瘤的凋亡[7]。在低剂量氢化氯喹处理的心梗大鼠模型中, Akt磷酸化可抑制P53的表达活性, 减轻细胞凋亡, 减少梗死面积[8]。Crowder等[9]研究表明PI3K/Akt信号通路与乳腺癌的发生关系密切, 在增殖侵袭的癌细胞中p-Akt呈高表达状态。

2.1.2 Akt与缺血再灌注损伤

缺血再灌注损伤 (IRI) 是临床上常见并发症, 常见于心肌梗塞溶栓治疗、体外循环后等。组织器官缺血再灌注损伤后功能受损的主要原因是组织细胞的坏死以及细胞凋亡的增加。其中缺血再灌注是始动因素, 细胞凋亡增加是重要因素。缺血组织细胞凋亡发生的主要因素有: (1) 细胞内Ca2+聚集引起线粒体内促凋亡因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9 (Caspase-9) 的激活; (2) 大量的氧自由基直接损伤DNA诱导细胞凋亡; (3) 产生的细胞因子如TNF、IL-1, 6, 8等诱导血管内皮细胞发生凋亡等。

临床上心肌细胞的缺血再灌注损伤极为常见, 由此引起的细胞功能代谢障碍和结构破坏是造成心脏功能损害的主要原因。心肌细胞过度凋亡是产生缺血再灌注损伤的主要因素之一。心梗患者中细胞凋亡不仅参与了梗死的病理过程, 而且直接影响梗死灶的面积, 促进心脏重构。参与心肌细胞凋亡过程中Bcl-2家族起着重要作用, Bad是其中的重要促凋亡蛋白, 启动凋亡级联反应。Akt的激活可以直接使促凋亡蛋白Bad的Ser136位点磷酸化丧失活性[10], 稳定细胞线粒体膜电位, 减少细胞色素C的释放, 抑制细胞凋亡, 减轻组织IRI[11]。二氧化硫预处理可显著调高磷酸化Akt表达, 抑制Caspase-3、9的活性, 减轻大鼠心肌心肌缺血再灌注损伤, 减小心梗面积[12]。吴志等[13]研究证明七氟醚预处理能激活Akt抑制大鼠心肌细胞凋亡减轻IRI。

体外循环肺缺血再灌注损伤 (LIRI) 导致肺内中性粒细胞凋亡延迟, 引起肺泡毛细血管基底膜损伤, 通透性增加, 产生肺水肿, 影响气体交换[14]。肺缺血时细胞内钠泵失活, 恢复再灌注时细胞内钙超载是LIRI的主要机制。Akt活化能上调大鼠肺泡上皮钠泵的活性, 清除肺内多余水肿液, 减轻肺损伤[15]。在油酸导致的肺损伤实验模型中, Akt的增强可显著减轻肺泡上皮细胞核内皮细胞的损伤程度, 提高生存率[16]。Bac-2蛋白作为抗凋亡家族一员, 其活性增加可明显抑制细胞凋亡, 高伟忠等[17]研究证实丙泊酚可激活PI3K/Akt信号通路, 上调Bac-2蛋白表达, 显著减轻大鼠肝缺血引起的肺损伤。脑组织中, PI3K/Akt信号通路的激活可抑制大鼠神经元的凋亡, 对大鼠的神经元起到保护作用[18]。

2.2 NF-κB与细胞凋亡

NF-κB广泛存在于各种细胞中, 正常组织中NF-κB呈现低水平表达, 当组织内环境平衡打破后NF-κB表达大量增加。研究发现NF-κB在细胞凋亡中起着双重作用。

2.2.1 NF-κB的抗凋亡作用

NF-κB抗凋亡作用可能的机制: (1) NF-κB可上调抗凋亡基因的表达, 抗凋亡蛋白bcl-x L基因启动子中含有两个NF-κB结合位点, 激活bcl-x L抗凋亡作用。 (2) NF-κB活化可提高转化生长因子TGF-β表达, 抑制细胞凋亡, 在缺血再灌注组织起到保护作用。 (3) NF-κB通过阻断半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8从源头抑制细胞凋亡。Irving等[19]实验夹闭大鼠大脑中动脉3h后, NF-κB大量激活, 但夹闭6-8h后NF-κB表达活性反而下降, 提示一定病理状态下NF-κB活性的下降能加剧细胞凋亡。覃琴等[20]应用氯化三苯四氮唑染色法检测心肌IRI小鼠心梗面积时发现应用NF-κB阻断剂小白菊内酯 (PTN) 组心梗面积明显增大, 七氟醚预处理的心肌保护作用减弱, 其结果证明了NF-κB的抗凋亡作用。

2.2.2 NF-κB的促凋亡作用

也有观点认为NF-κB在不同病理状态下, 不同组织细胞中介导细胞的保护反应表现为促凋亡的作用。传统观念认为参与缺血再灌注损伤的细胞因子如TNF、IL-6, 8都受NF-κB的调控。体外循环引起的缺血再灌注损伤中NF-κB激活诱发TNF-α和IL-1大量释放, 进而加剧心肌细胞的凋亡, 诱发心衰[21]。脑组织IRI后, 细胞内Ca2+超载直接损伤神经细胞, Han等[22]研究证明头部降温可降低脑组织中NF-κB的表达, 减轻脑IRI从而产生脑保护的作用。镁离子是钙离子的拮抗剂, IRI组织中镁离子普遍降低, 低镁可激活NF-κB促进细胞凋亡, 进一步加剧IRI。

2.3 Akt与NF-κB相关联系

Akt作为PI3K/Akt信号通路的中心环节, 活化的Akt通过影响下游一系列效应蛋白在细胞内发挥抗凋亡、促增殖的生物学效应。NF-κB作为其下游蛋白, 参与调控多种细胞因子, 调节细胞内的基因转录, 影响细胞凋亡。 (1) Akt磷酸化后激活IKKs, IKKs使IκB磷酸化并降解, 结合的NF-κB从胞质中释放出来迅速易位到细胞核中激活相应靶基因, 发挥生物活性。徐春林等[23]实验表明通过卵泡刺激素 (FSH) 处理过的卵巢癌细胞SKOV3、3AO后, 细胞内磷酸化的Akt蛋白表达增加, NF-κB在细胞核中也表达增加, PI3K/Akt/NF-κB信号通路的激活抑制了细胞凋亡, 促进了癌细胞的增殖与侵袭;而PI3K特异性抑制剂LY294002则能逆转FSH作用, 抑制Akt磷酸化, 使细胞核中NF-κB表达减少, 细胞凋亡增加, 从而减弱肿瘤细胞的增殖。 (2) 对已易位于细胞核中的NF-κB, Akt可直接磷酸化其p65亚单位, 使其转录活性明显增强, 同时游离的NF-κB水平升高, 可刺激产生它的抑制因子IκB, 反馈抑制NF-κB的活性[24]。武建毅等[25]研究证实汉防己碱抗乳腺癌细胞增殖、侵袭的机制是通过抑制Akt的磷酸化使其活性降低并直接影响NF-κB的活性表达, 导致肿瘤细胞凋亡增加, 减弱癌细胞增殖。 (3) 在不同的病理生理条件下Akt与NF-κB的表达相关性也不尽相同。胰腺癌有关的糖尿病患者中, Akt都处于高表达水平, 但在侵袭性小的癌细胞中, NF-κB处于高表达水平, 而在侵袭性大的癌细胞中NF-κB的表达水平远低于侵袭性小者[26]。

3 小结与展望

PI3K/Akt/NF-κB信号通路是把双刃剑。PI3K/Akt/NF-κB作为细胞内经典的通路, 与诸多信号途径相互交叉, 它表达平衡的稳定性在肿瘤发生发展、细胞凋亡、炎性反应等发挥着扳机点的作用。恶性肿瘤是导致我国居民死亡的主要原因之一, 对于恶性肿瘤的治疗主要是传统的手术、化疗及放疗等, 治疗效果良莠不齐。深入研究PI3K/Akt/NF-κB信号通路在肿瘤细胞中的作用机制, 是治疗恶性肿瘤优选的出发点, 为发明新型抗肿瘤药物提供重要指导方向。其次PI3K/Akt/NF-κB信号通路在缺血再灌注损伤中的研究多局限于心肌组织, 对肝肾肺等重要器官研究甚少。随着心胸外科手术的不断进步, 手术所造成的肺、肾、肝等缺血再灌注损伤引起的并发症逐日增多, 因此深入研究PI3K/Akt/NF-κB信号通路与细胞凋亡机制是降低术后并发症、提高生存质量的重要手段。

摘要：磷脂酰肌醇3激酶 (PI3K) /蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶 (Akt) /核转录因子κB (NF-κB) 信号通路是有核细胞内重要的传导通路之一, 在调节细胞增殖、凋亡中起着重要作用。大量研究证明PI3K/Akt/NF-κB信号通路的激活可以影响细胞凋亡。本文就PI3K/Akt/NF-κB信号通路对细胞凋亡影响作用进行综述。

细胞质胸苷激酶 第5篇

1 材料与方法

1.1 试剂

DMEM/F12购于Gibco公司;胎牛血清购于杭州四季青公司;鼠抗人α-SMA抗体、兔抗人Tubulin抗体和兔抗人PKC-epsilon抗体购于Abcam公司;亚细胞蛋白组分提取试剂盒和PKC-ε抑制剂购于Merck Biosciences公司;辣根过氧化物酶标记羊抗兔Ig G和辣根过氧化物酶标记羊抗鼠Ig G购于Beyotime公司,PKC-ε激动剂购于上海科肽生物科技有限公司;ECL试剂盒购于Amersham Biosiences公司;ELISA试剂盒购于武汉博士德生物技术公司。

1.2 FSGS患者尿蛋白的提取及质量分析

提取无感染且未使用肾上腺皮质激素和免疫抑制剂治疗的6例原发性肾病综合症(确诊FSGS)患者尿蛋白,行蛋白电泳分析及测蛋白浓度,并行肌酐和内毒素检测,排除小分子物质和内毒素污染。然后将提取的合格尿蛋白混合用于本研究。

1.3 人肾脏近曲小管上皮细胞株(HK-2)培养

HK-2由上海交通大学附属瑞金医院陈楠教授馈赠。HK-2置于含15%胎牛血清、2.0 mmol/L L-glutamine、100 U/m L青霉素、100μg/m L链霉素的DMEM/F12培养液中,在37℃、5%二氧化碳的条件培养,用0.125%胰蛋白酶及0.02%EDTA混合消化液进行传代。待细胞贴壁生长至70%~80%融合状态时,换用无血清DMEM/F12培养液同步24 h开始实验。实验分组:对照组、尿蛋白组(4 mg/m L),激动剂组(10μmol/L PKC-ε激动剂+4 mg/m L尿蛋白)及抑制剂组(10μmol/L PKC-ε抑制剂+4 mg/m L尿蛋白)。各组细胞分别处理48 h后收集细胞和培养上清进行指标检测,所有实验均重复3次。

1.4 MTT法检测用不同浓度PKC-ε激动剂和抑制剂对HK-2细胞增殖的影响

接种于96孔板的HK-2细胞,分别加入不同浓度PKC-ε激动剂和抑制剂(0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L)孵育48 h,然后每孔加入20μL(5mg/m L)MTT溶液,置二氧化碳培养箱中孵育4.5 h,弃上清后每孔加入二甲基亚砜150μL,振荡10min,溶解形成的结晶。波长490 nm以空白对照孔调零,用酶标仪检测各孔的光吸收值即MTT值,用细胞增殖的相对量=(各浓度组MTT值-空白组MTT值)表示PKC-ε激动剂和抑制剂处理后细胞的增殖变化。

1.5 Western Blotting法检测PKC-ε活性和α-SMA的表达

常规方法应用细胞裂解液裂解细胞提取总蛋白。取部分细胞蛋白提取液严格按照Calbiochem公司的Subcellular Proteome Extraction试剂盒步骤操作分离胞浆成分及胞膜成分以检测PKC-ε活性,余下细胞蛋白提取液用于检测α-SMA的表达量。按常规方法进行SDS-PAGE电泳,电泳分离后将蛋白转移到PVDF膜上,5%脱脂奶粉室温封闭2 h,分别加入相应的一抗(α-SMA 1∶500,PKC-ε1∶500,Tubulin 1∶500),4℃孵育过夜。然后加入辣根过氧化物酶标记的对应二抗(均为1∶1 000)孵育2h。用ECL化学发光试剂显影,X线胶片曝光。图像经扫描仪扫描后,用图像分析软件Quantity One-4.6.2进行积分光密度积分值分析。以Tubulin为内参。

1.6 ELISA方法检测培养上清中FN、TGF-β的表达

各组HK-2细胞处理结束后,收集上清用双抗体夹心ELISA法检测FN和TGF-β水平。所有标准孔和样品孔均行复孔检测,酶标仪读取数据。建立标准曲线计算其浓度。

1.7 乳酸脱氢酶(LDH)释放试验检测细胞毒性

各组HK-2经上述处理后,先收集上清,然后用2%Triton X-100 1 m L裂解孔中细胞,吸取细胞裂解液于Ep管中12 000 g离心3 min,取上清,酶动力学法检测上清及细胞内LDH活性,计算LDH释放率[LDH释放率(%)=上清液LDH值/(细胞内LDH值十上清液LDH值)×100%]。

1.8 统计学分析

使用SPSS 16.0统计软件进行统计分析。计量资料数据以均数±标准差表示。多个样本均数的比较采用单因素方差分析(One-Way ANO-VA),多个样本均数间每两个均数的比较用方差齐性检验(Homogeneity-of-Variance),当总体方差齐时,选择Bonferroni法;当方差不齐时,选择Tamhane’s T2法。P<0.05表示差异有显著性。

2 结果

2.1 所抽提的尿蛋白质量分析

提取6例FSGS患者尿蛋白,测得各尿蛋白溶液的肌酐水平均低于人体正常范围的下限,鲎实验确定内毒素浓度亦低于人体正常范围的下限。尿蛋白电泳示尿蛋白成分为白蛋白、转铁蛋白、Ig G。

2.2 PKC-ε激动剂和抑制剂对HK-2细胞增殖的影响

MTT结果显示,PKC-ε激动剂和抑制剂在10μmol/L及其以下时,不影响HK-2细胞增殖,说明其本身对细胞没有直接毒性作用。见图1。

2.3 尿蛋白对HK-2细胞PKC-ε活性的影响

尿蛋白组PKC-ε的活性(胞膜/胞浆)比对照组减弱(P<0.01)。与尿蛋白组比较,抑制剂组PKC-ε的活性减弱(P<0.05),而激动剂组PKC-ε的活性有所增强,但差异无显著性(P>0.05)。见图2。

1)与正常组比较,P<0.01;2)与尿蛋白组比较,P<0.05

2.4 PKC-ε对尿蛋白诱导HK-2细胞α-SMA蛋白表达的影响

对照组的HK-2细胞基本不表达α-SMA,尿蛋白显著上调其表达(P<0.05)。与尿蛋白组比较,抑制剂组α-SMA表达显著升高(P<0.05),而激动剂组α-SMA表达虽有回降趋势,但与正常组比较差异无显著性(P>0.05),见图3。

1)与正常组比较,P<0.05;2)与尿蛋白组比较,P<0.05

2.5 PKC-ε对尿蛋白诱导的HK-2细胞FN、TGF-β分泌的影响

对照组的HK-2细胞表达基础量FN、TGF-β,尿蛋白显著上调其表达(P<0.01)。与尿蛋白组比较,抑制组FN、TGF-β表达显著增多(P<0.05);激动剂组TGF-β表达明显减少(P<0.01),FN表达减少但差异无显著性(P>0.05),见图4。

1)与正常组比较,P<0.01;2)与尿蛋白组比较,P<0.05;3)与尿蛋白组比较,P<0.01

2.6 PKC-ε对尿蛋白所致HK-2细胞活力的影响

尿蛋白组LDH释放率比对照组升高(P<0.01)。与尿蛋白组比较,抑制剂组LDH释放率增加(P<0.05),而激动剂组对LDH释放率影响差异无显著性(P>0.05),见图5。

1)与正常组比较,P<0.05;2)与尿蛋白组比较,P<0.05

3 讨论

在各种原因所致的慢性肾脏疾病中,RIF程度是反映肾功能下降严重程度和判断预后最重要的指标之一,尿蛋白损伤RTECs是导致RIF进展的重要的因素。近二十多年大量临床试验、动物实验和体外研究证实了蛋白尿可促进RTECs异常凋亡[7]、细胞表形转化[8]、细胞外基质(extracellular matrixc,ECM)异常分泌[9,10]和生长因子异常分泌[11]等RIF的病理生理过程。

PKC是多种不同结构不同生物活性的同工酶组成的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族。PKC是肌醇磷脂信号转导通路的中心环节,参与RTECs的诸多功能,例如生物素的摄取[12]、3Na+/H+交换酶(NHE3)的活性[13]、细胞增殖[14]等。更为重要的是,RTECs内吞白蛋白后可触发一系列的病理生理过程,例如氧自由基的产生、趋化因子的分泌、核因子(NF-κB)的活化、丝裂原激活蛋白激酶活化等,而这些病理生理过程均属PKC依赖的[15,16]。PKC主要存在于细胞浆,接受刺激后,转移至细胞膜结构中,依赖磷脂酰丝氨酸和二脂酰甘油而活化发挥作用。目前在哺乳动物中发现的PKC至少含10种同工酶,根据它们的活化条件不同而分为三大类:经典型(classical)PKC、新型(novel)PKC和非典型(atypical)PKC。不同的细胞有不同的同工酶表达谱。近来笔者对4种经典型PKC同工酶在尿蛋白所致RTECs转分化中的作用进行研究,结果发现PKC-α和PKC-βI活化参与尿蛋白所诱导的RTECs转分化过程,而另外两种经典PKC(PKC-βⅡ和PKC-γ)则与RTECs转分化无关[4]。因此笼统的阻断总PKC酶活性是不可行的,靶向特定的PKC同工酶是更可取的方法。PKC-ε属新型PKC同工酶。文献报道PKC-ε可以抑制心肌细胞凋亡并改善心肌缺血从而起到保护心脏的作用[17],过表达活化的PKC-ε可增强心肌细胞对缺血再灌注损伤的耐受[18,19],说明PKC-ε潜在的细胞保护作用。研究证实有特异性的作用于PKC-ε的激动剂和抑制剂可以调节其活性,并且已经应用于对心脏方面的研究[20]。本研究中,笔者应用Western Blotting方法检测HK-2细胞PKC-ε的活性,通过每组胞膜与胞浆的比值变化反映其活性。

出乎意料,本研究结果发现,静息状态下,HK-2细胞PKC-ε处于高度活化状态,尿蛋白作用后PKC-ε的活性明显受到抑制,推测PKC-ε高活性是维持RTECs正常功能的基础,而尿蛋白对RTECs的损伤部分是通过抑制PKC-ε活性引起的。本研究所采用的PKC-ε抑制剂可使PKC-ε活性进一步减弱,而激动剂能从一定程度上恢复尿蛋白对PKC-ε的活性抑制,但作用较弱。

RTECs转分化为肌成纤维细胞不但导致肾小管上皮细胞丢失而引起肾小管萎缩,而且还参与肾间质纤维化,在RIF的发生发展中起重要作用。α-SMA表达上调是RTECs转分化的特征标志之一,TGF-β过度产生并通过自分泌或旁分泌途径诱导RTECs转分化[21]。本研究显示尿蛋白诱导HK-2细胞α-SMA表达及培养上清TGF-β分泌增加,而PKC-ε抑制剂能进一步增加α-SMA表达及TGF-β分泌,提示尿蛋白诱导RTECs转分化的作用可能与抑制PKC-ε活性有关。但本研究发现,PKC-ε激动剂能明显减少TGF-β的分泌而不影响α-SMA表达水平,推测PKC-ε激动剂可能对TGF-β的表达有直接的抑制作用,并非仅通过PKC-ε途径。ECM过度产生在肾间质纤维化的过程发挥重要的作用。本研究还显示尿蛋白诱导HK-2细胞培养上清FN的分泌增加,而PKC-ε抑制剂能进一步增加FN分泌,提示尿蛋白诱导ECM异常分泌的作用可能与抑制PKC-ε活性有关。此外,尿蛋白所致RTECs活力下降也可导致肾小管修复能力减弱。本研究通过检测细胞LDH的释放率来表示细胞活力。结果发现,尿蛋白可诱导HK-2细胞LDH释放率增加,而PKC-ε抑制剂能进一步增加HK-2细胞LDH释放率,提示尿蛋白所致HK-2细胞毒性的作用可能与抑制PKC-ε活性有关。总之,以上结果提示,尿蛋白诱导肾小管上皮细胞转分化、ECM异常分泌和活力下降至少部分是通过抑制PKC-ε活性起作用的。Meier等也曾报道PKC-ε基因敲除小鼠发生肾小管间质严重纤维化[22],PKC-ε可通过下调TGF-β1及其信号途径起抗纤维化作用[23]。这些结果均说明了PKC-ε活性正常是维持RTECs正常形态和功能的基础。

综上所述,PKC-ε高活性是维持RTECs正常形态和功能的基础,尿蛋白通过抑制RTECs正常PKC-ε高活性而对其造成损伤,寻找有效措施减轻尿蛋白对PKC-ε活性的抑制可能作为防治尿蛋白所致RIF潜在治疗方法。

摘要：目的 探讨蛋白激酶Cε(PKC-ε)在尿蛋白所致肾小管上皮细胞(RTECs)损伤中的作用。方法将体外培养的人肾小管上皮细胞株(HK-2细胞)分为对照组、尿蛋白组(4 mg/mL),激动剂组(10μmol/LPKC-ε激动剂+4 mg/mL尿蛋白)及抑制剂组(10μmol/L PKC-ε抑制剂+4 mg/mL尿蛋白)分别处理48 h,用Western Blotting法检测PKC-ε活性和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达;用ELISA方法检测培养上清人纤维连蛋白(FN)、转化生长因子β(TGF-β)的分泌水平;用全自动生化分析仪检测细胞LDH释放率。结果 尿蛋白明显抑制HK-2细胞PKC-ε的活化(P<0.01),增加HK-2细胞α-SMA表达(P<0.05)、上清液FN和TGF-β分泌(P<0.01)以及LDH释放率(P<0.01);PKC-ε激动剂减轻尿蛋白所致HK-2细胞培养上清液TGF-β分泌(P<0.01),而不影响α-SMA表达、FN分泌以及LDH释放率;PKC-ε抑制剂进一步增加尿蛋白所致HK-2细胞α-SMA表达、FN和TGF-β分泌以及LDH释放率(均P<0.05)。结论 PKC-ε高活性是维持RTECs正常形态和功能的基础,尿蛋白抑制RTECs正常PKC-ε高活性,减轻尿蛋白对PKC-ε活性的抑制可能有利于维持RTECs正常的形态和功能。

细胞质胸苷激酶 第6篇

Flavopiridol是以从印度植物中分离得到的rohitukine为先导化合物经结构修饰后得到的一个黄酮类衍生物。大量的体内外实验证实,Flavopiridol作为第一个进入临床试验的CDKs抑制剂[3,4,5],对多种肿瘤都有强烈的抑制作用,目前已经进入临床Ⅱ期试验。本文以Flavopiridol作为参照,设计合成了其8个查尔酮类似物,对这8个化合物作了结构确证,并测定了它们对CDK1的抑制活性以及对HCT116和A549的体外抗肿瘤活性。

1 材料与方法

1.1 仪器

RY-1熔点测定仪(温度计未经校正);VERTEX 70 Brucker红外光谱仪;API 4000型质谱仪;Advance Brucker 400型核磁共振仪,所使用的溶剂为氘代试剂,以TMS为内标。

1.2 目标化合物的合成

合成路线见图1。

R:分别为H;2-Cl;2-NO2;2,3-OCH3;3-CH3;3-OCH3;3-Cl;3-NO2

1.2.1化合物2、3、4的合成

方法与研究[6,7]相同。

1.2.2(E)-1-[2-羟基-4,6-二甲氧基-3-(1-甲基-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)苯基]-丙-2-烯-1-酮(化合物5a)的合成

氢氧化钾10.0 g(0.18 mol)溶于80 m L乙醇和20 m L水的混合液中,再投入6.2 g(0.02 mol)化合物4和3 m L(0.03 mol)苯甲醛,室温搅拌2 h。用2 N盐酸溶液调p H至8～9,析出大量固体,抽滤,固体用水洗至中性,干燥得6.7 g黄色固体,硅胶柱层析,洗脱剂为石油醚∶丙酮∶三乙胺(20∶20∶1),收率为89%。

1.2.3化合物5b～5h的合成

方法同化合物5a的合成。

1.3目标化合物的结构确证

目标化合物结构分别用IR、1H-NMR、ESI-MS确证。

1.4目标化合物的活性测定

1.4.1目标化合物对CDK1的抑制活性

测定方法与研究[8]相同。

1.4.2目标化合物对HCT116的体外抑制作用

采用MTT法,由美国佐治亚州立大学化学系完成。

1.4.3目标化合物对A549的体外抑制作用

采用MTT法测定。

2 结果与讨论

本研究合成了8个化合物,经过IR、1H-NMR、ESI-MS证实,所合成的化合物与预期结构一致,详见表1。对合成的8个化合物进行活性测定的结果表明,化合物5b对CDK1的抑制活性与Flavopiridol接近;所有化合物对HCT116的体外抑制活性都低于Flavopiridol,但IC50值也都在微摩尔数量级,其中5g的IC50值为3.24 μM,显示出较强的抑制活性。在上述活性测定工作的基础上,选取化合物5c～5g测定其对A549的体外抑制活性,结果显示化合物5c与5f对A549的体外抑制活性高于对照Flavopiridol。活性测定结果详见表2。本实验结果表明flavopiridol被结构类似的查尔酮代替后,有可能得到活性更好的类黄酮。这样既提供了合成方法较flavopiridol简单的目标化合物的来源,又为我们今后继续寻找此类CDKs抑制剂提供了实验参考。

参考文献

[1]Hunter T,Pines J.Cyclins&cancerⅡ:cyclin D and CDKinhibitors come of age[J].Cell,1994,79(4):573.

[2]Garrett MD,Fattaey A.CDK inhibition and cancer therapy[J].Curr Opin Genet Dev,1999,9(1):104-111.

[3]Arguello F,Alexander M,Sterry JA,et al.Flavopiridol in-duces apoptosis of normal lymphoid cells,causes immuno-suppression,and has potent antitumor activity In vivo a-gainst human leukemia and lymphoma xenografts[J].Blood,1998,91(7):2482-2490.

[4]Kaur G,Stetler-Stevenson M,Sebers S,et al.Growth inhibi-tion with reversible cell cycle arrest of carcinoma cells byflavone L86-8275[J].Natl Cancer Inst,1992,84(22):1736-1740.

[5]Senderowicz AM.Flavopiridol:the first cyclin-dependentkinase inhibitor in human clinical trials[J].Invest NewDrugs,1999,17(3):313-320.

[6]Gulati KC,Seth SR,Venkataraman K.Phloroacetophenone[J].Org Synth,1943,2:522.

[7]Juntend KYT,Junte TST.Anti-ulcerous Agent ContainingChalcone Derivatives as Effective ingredient and Novel Chal-cone Derivatives[P].Japan,A1,292576,1988-11-30.

细胞质胸苷激酶 第7篇

关键词：阿尔茨海默病,糖原合酶激酶-3,甲状腺素

AD为老年人群中最常见及高发的痴呆疾病。研究证实,AD患者存在垂体-甲状腺轴激素分泌紊乱,血清促甲状腺素水平降低是AD发病的独立危险因素,促甲状腺素释放激素的排空促使GSK-3β活性升高及tau蛋白磷酸化水平异常增加[1],GSK-3β是tau蛋白磷酸化调节的重要激酶,甲状腺素对于外周淋巴细胞GSK-3活性有何影响,目前尚不清楚,因此,本研究AD患者甲状腺素治疗,观察治疗前后AD患者甲状腺功能及GSK-3活性的变化。

1 资料和方法

1.1 病例的选择和分组

1.1.1 对照组

为健康老年志愿者,共22例,男13例,女9例,平均年龄(73.2±7.4)岁,平均受教育(6.7±3.5)年。入组标准:年龄60岁以上,无严重躯体疾病,认知功能,远近记忆力,生活能力及社交能力等检查无明显异常,简明智力状态检查(Minimental state examination,MMSE)(27.8±2.6),Hachinski缺血指数(1.9±0.9),临床痴呆评定量表(Clinical dementia rating Rating Scale,CDR)为0。

1.1.2 AD组

收集2007年1月～2008年8月的患者,共40例,男24例,女16例,平均年龄(75.4±6.7)岁,平均受教育程度(6.4±2.7)年。符合美国国立神经病学、语言机能障碍和脑卒中研究所(NIHCDS-ADRDA)规定的“很可能AD”诊断标准,美国精神疾病专断和统计手册第4次修订版(DSM-IVR)中的AD诊断标准,MMSE(16±4.2),Hachinski缺血指数(2.2±0.4),ADL(30.2±5.2),CDR(1.5±0.3),GDS3级以上。

1.1.3 排除标准

以上入组者均排除心、肝、肾、肺疾病,无脑外伤,脑卒中、脑部感染疾病,及精神病史,年龄和受教育程度差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 实验方法

1.2.1 甲状腺功能检测

所有病例及对照组血清标本都于清晨空腹采取静脉血4ml,在4℃下2 500g离心10min,取血清在-30℃低温保存,采用放射免疫法测定三碘甲状腺原氨酸(T3)、T4甲状腺素(T4)、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、FT4游离甲状腺素(FT4)、促甲状腺激素(TSH)。阿尔茨海默病随机分为两个亚组:阿尔茨海默病组(20),甲状腺素组(20)。甲状腺素组:给予甲状腺素口服,0.05mg,1次/d,疗程均为4个月,于治疗前后分别检测T3,T4,FT3,FT4,TSH及GSK-3活性的变化。

1.2.2 糖原合酶激酶-3活性的测定

用肝素抗凝管采取不同组别的静脉血6ml,用PBS等量稀释,将6ml稀释的血细胞液加入15ml离心管,然后将3ml淋巴细胞分离液(LympholyteH)沿管壁加入离心管。在室温下800g离心20min,用细吸管从界面上小心吸取淋巴细胞,并转移到另一离心管。用PBS稀释细胞,800g离心10min,弃上清。将沉淀用PBS冲洗3次,再将细胞用PBS稀释成4-10X 106的悬液。加入100μl细胞裂解液(细胞裂解液为三去污剂:50mmol Tris-C1 PH8.0,150mmol NaCl,0.1%SDS,1%NP-40,0.5%DOC,0.02%NaN3,1 00ug/mlPMSF,1μg/ml Aprotinin,PMSF和Aprotininl临用时加入),再进行超声破碎(10sec,3次),12000g离心10min,取上清,采用二喹啉甲酸蛋白测定法(BCA)测定蛋白质浓度,-70℃冰箱保存。将7.5μg在-70℃冰箱保存的样本蛋白加入总量为25μl,pH=7.4的包含有30mmol Tris、10mmol MgCl2、10mmol NaF、1mmol Na3VO4、2mmol EGTA、10mmolβ-ME、200μmol[γ-32P]ATP(其中ATP浓度为1 500 cpm/pmol)及20μmol phospho-GS底物的缓冲液中,振荡混匀,30℃孵育30min,用25μl 300mmol/L(H3PO4反应液终止反应。各反应体系分别取25μl滴在磷酸纤维膜上,以75mmol/L H3PO4定时冲洗抽滤,滤膜晒干并置入液闪瓶中,加二甲苯闪烁液,隔夜以液体闪烁仪计数。酶活性用各样本计数/对照组计数所得相对活性表示。.

1.3 统计学处理

所有数据均采用(),采用SPSS统计软件进行一元因素方差分析。P<0.05为差异具有显著意义。

2 结果

2.1 治疗前后甲状腺功能的变化

如表1所示:AD组患者及甲状腺素组治疗前患者T3的含量存在明显降低(0.53±0.10)μg/L,(0.51±0.14)μg/L与对照组(0.72±0.15)μg/L比较有显著性差别(P<0.01,P<0.01);此两组患者的FT3水平也有明显降低(1.58±0.36)pmol/L,(1.61±0.36)pmol/L)(P<0.01,P<0.01),AD组未给予治疗的患者4个月后T3(0.58±0.13)μg/L及FT3(1.54±0.32)μg/L水平的含量也在低水平(P<0.01,P<0.01)。与对照组(2.88±2.24)mU/L比较AD患者,甲状腺素治疗前的AD患者TSH水平明显降低(1.51±0.76)mU/L,(1.61±0.88)mU/L(P<0.01,P<0.01),AD患者未给予甲状腺素治疗的4个月后TSH仍低明显降低(1.56±0.82)mU/L,给予甲状腺素治疗4个月后T3(0.79±0.11)μg/L及FT3(2.12±0.52)μg/L水平的含量明显恢复,TSH含量(2.74±0.96)mU/L也明显升高,与对照组比较无明显差别(P>0.05),与AD组及甲状腺素治疗前比较有明显差别(P<0.01,P<0.01,P<0.01),无论是T4还是FT4在各组间无显著变化(P>0.05)。

注:T3三碘甲状腺原氨酸,T4甲状腺素,FT3游离三碘甲状腺原氨酸,FT4游离甲状腺素,TSH:促甲状腺激素,*P<0.01与对照组比较,#P<0.01与甲状腺治疗4个月比较

2.2治疗前后GSK-3的活性的变化

如表2所示:AD组,甲状腺素治疗前GSK-3的活性[(1.32±0.11,1.29±0.09)]明显升高,与对照组比较有明显差别(P<0.01),AD组甲状腺素未治疗组的GSK-3的活性仍维持在较高水平(1.29±0.09),给予甲状腺素治疗后,GSK-3的活性(1.16±0.96)明显降低,与AD组及甲状腺素治疗前有明显差别(P<0.01,P<0.01,P<0.01),与对照组无明显差别(P>0.05)。

注:*P<0.01与对照组比较,#P<0.05与甲状腺素治疗4个月比较

3讨论

AD是老年人群中最常见及高发的痴呆疾病,其发病机制仍不明确,神经元外老年斑(senile plaque,SP)沉积和神经元内神经原纤维缠结(NET)是AD两大主要病理学特征。NFT主要是由异常、过度磷酸化的tau蛋白组成。蛋白激酶及蛋白磷酸酯酶活性失调是导致tau蛋白异常过度磷酸化,进一步形成NFT的主要原因[2]。研究证实:GSK-3不仅参与tau蛋白过度磷酸化,而且也与β淀粉样蛋白(amyloid beta peptide,Aβ)的产生和聚积密切相关[3]。动物实验也证实GSK-3β的过度活化与tau蛋白过度磷酸化以及动物的空间记忆损伤正相关[4]。并且,Hye等报道在AD患者的外周白细胞中与AD发病密切相关的GSK-3的活性异常升高[5],因此,我们检测AD患者外周淋巴细胞GSK-3活性的变化,研究结果证实:在AD患者的外周淋巴细胞,存在GSK-3活性异常升高。另外,研究证实[6]:甲状腺激素水平与痴呆有关,血清促甲状腺素水平降低是AD发病的独立危险因素,甲状腺激素与认知水平呈正相关,且TSH与情节记忆及继发性记忆相关[7]。本研究结果显示:AD患者血清T3及FT3含量明显降低,TSH也明显降低,提示AD患者存在甲状腺功能的异常。国外在体外培养的大鼠海马神经细胞发现:促甲状腺素释放激素的排空促使GSK-3β活性升高及tau蛋白磷酸化水平异常增加,而给予促甲状腺素释放激素后,GSK-3β活性降低及tau蛋白磷酸化水平降低[1]。本研究给予AD患者补充甲状腺素,4个月后患者血清T3及FT3含量明显回升,TSH水平升高,与对照组无明显差别。同时,外周淋巴细胞GSK-3明显降低,此结果提示:给予AD患者甲状腺素治疗后,在恢复AD甲状腺功能的时,GSK-3的活性也降低,说明甲状腺素可能影响GSK-3的活性,对AD患者起一定治疗作用,但是,是直接影响GSK-3的活性,还是通过调节TSH及促甲状腺素释放激素影响GSK-3活性,尚需要进一步研究。

本研究结果提示AD患者存在甲状腺功能的降低,且伴有外周淋巴细胞GSK-3活性的升高,甲状腺激素治疗后提示AD患者存在甲状腺功能恢复,GSK-3活性降低,提示甲状腺素可能对AD有一定的治疗作用。

参考文献

[1] Luo L,Stopa EG.Thyrotropin releasing hormone inhibits tau phosphorylation by dual signaling pathways in hippocampal neurons[J].J Alzheimers Dis,2004;6(5):527-536

[2] Wang JZ,Grundke-Iqbal Uqbal K.Kinases and phosphatases and tau sites involved in Alzheimer neurofibrillary degeneration[J].Eur J Neurosci,2007;25(1):59-68

[3] Phiel CJ,Wilson CA,Lee VM.et al.Gsk-3 a regulates production of Alzheimer' s disease amyloid-βpeptides[J].Nature,2003;423(6938):435-438

[4] Wang Y,Zhang JX,Du XX,et al.Temporal correlation of the memory deficit with Alzheimer-like lesions induced by activation of glycogen synthase kinase-3[J].J Neurochem,2008;106(6):2364-2374

[5] Hye A,Kerr F,Archer N,et al.GIycogen synthase kinase-3 is increased in white cells early in Alzheimer' s diseas[J].Neurosci Lert,2005;373(l):l-4

[6] Kapaki E,Ilias l.Paraskevas GP,et al.Thyroid function in patients with Alzheimer's disease treated with cholinesterase inhibitors,2003;63(4):389-392