脐血移植临床应用研究

脐血移植临床应用研究（精选6篇）

脐血移植临床应用研究 第1篇

关键词：造血干细胞,脐血血浆,脐血移植

20世纪70年代初,美国印第安州立大学的生物学家Bromeyer等证明新鲜和冰冻脐血均含有丰富的造血祖细胞。80年代初Boyse等提出脐血移植(Cord blood transplantation,CBT)代替骨髓移植的可能性。1989年Gluckman和Bromeyer等为首的美法专家共同协作,首次用脐血干细胞移植治疗Faconis贫血获得成功[1]。新的造血干细胞移植研究应用已成为当今国内外血液学研究的热点。

人类脐血含有大量的造血干细胞/祖细胞(Hemopoietic stem cell/hematopoietic progenitor cell,HSC/HPC),并且富含与骨髓间质干细胞相同的多向分化潜能干细胞,即脐血间质干细胞,可在一定条件下分化为多种间质来源细胞。作为骨髓(Bone marrow,BM)的替代物,脐血干细胞已应用于血液系统恶性肿瘤、再生障碍性贫血、部分遗传性疾病等的治疗。CBT在临床上的应用,主要依赖于对脐血造血细胞的基础研究工作,包括脐血的生物学活性、采集、保存和输注等。近年来,单份和多份CBT、体外扩增后CBT、非清髓CBT、脐血血浆输注等多方面的应用研究已经取得了长足的进步。

1 脐血造血活性的研究

1974年Kundtzon等首先用琼脂培养技术比较了脐血、成人骨髓、周血粒细胞集落形成单位的特点,脐血中含有自原始造血干细胞至定向祖细胞不同分化阶段的造血细胞,含量丰富,增殖能力强,对造血调控因子如促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)等反应敏感,脐血中含有不依赖EPO即可生长的内源性红系形成细胞(Endogenous erythroid colony,EEC)[2]。Tchemia等证明脐血中含造血相关的其它因子如白细胞介素1(IL-1)、干扰素(IFN)和肿瘤坏死因子(TNF),但比成年人低[3]。最近的报道是应用各种体外培养方法扩增,脐血中造血干细胞明显增加,其中以低氧培养效果尤佳,其原因是低氧提供类似于人体骨髓的微环境,加强细胞间相互联系,分泌细胞因子,从而使祖细胞集落生成增多[4]。

对于脐血造血干细胞的研究已日趋成熟,造血重建的原始细胞是此类细胞增殖分化的主要方向,但对于脐血间质干细胞的研究目前还处于起步阶段。间质干细胞不同于典型的造血基质细胞,它具有多向分化潜能,同时它也是骨髓基质细胞、骨骼、软骨、肌肉和结缔组织的前体细胞。因此,人们推测脐血间质干细胞是胚胎时期组织器官发育的重要来源[5]。探讨脐血干细胞采集、培养、扩增及其分化诱导的调控机制,对于了解人体组织器官的发育、疾病发生和组织器官损伤修复具有重要意义。体外细胞培养方法测定脐血中HSC/HPC,脐血除了含有粒-单集落形成单位(Colony forming unit-granulocyte macrophage,CFU-GM)外,还含有红系爆炸集落单位(Burst forming unit-ereuth,BFU-E)、淋巴系集落单位(Colonyformingunit-lymphoid,CFU-L)、巨核系集落形成单位(Colony forming unit-megakaryocyte,CFU-Meg)和混合集落形成单位(Colony forming unit-mixture,CFU-Mix)[6]。体外培养研究表明其单位体积的含量为成人外周血的12~16倍,相当于或超过成人骨髓。脐血来源的单核细胞在含有胎牛血清的培养基中可以生成贴壁细胞,其中27%的脐血集落产生一层建立完好的成纤维样细胞贴壁细胞层,表达多种间质干细胞相关抗原,如SH2、SH3、SH4、ASAM1470、CD13、CD29、CD49和CD54。脐血来源的间质样祖细胞在受到适当刺激时可以向其它间质细胞系转化,如破骨细胞、脂肪细胞等。由此可见,无论在免疫表型和功能特性上,这些细胞都与骨髓来源的间质干细胞极为相似。

然而,近期研究表明,脐血间质样细胞的免疫表型与骨髓来源间质干细胞抗原表达有较大的不同,如CD45、CD14、CD34抗原在骨髓间质干细胞中呈阴性,而在脐血间质样细胞中CD45,CD14,CD31则呈阳性,CD34、CD10、CD80为阴性[7]。目前,对于脐血间质干细胞相关特异性标志物的研究还处于起步阶段,有待于进一步探索和发现。

2 脐血输注的优点

脐血材料来源丰富,较骨髓移植更易找到HLA相合的无关供者,含有高浓度的造血干细胞,造血细胞抗原表达弱,淋巴细胞的细胞毒性低,收集方法简单,可做到完全无菌,耐冰冻,可长期保存。其优点:(1)脐血不仅富含HSC/HPC,且其增殖与分化能力、体外集落形成能力、刺激后由静止期进入细胞周期的速度以及自泌生长因子的能力均强于BM及外周血(Peripheral blood,PB)HSC/HPC,因此移植后的成功率会更高;(2)脐血HSC/HPC的端粒及端粒酶活性均长于和高于BM及PB HSC/HPC,并且低表达甚或不表达细胞凋亡分子CDR/Fas,因此移植后脐血HSC/HPC将会有更长的生命力;(3)脐血HSC/HPC对各种造血生长因子刺激的反应能力要远强于BM及PB HSC/HPC,因此在体外短期扩增就能获得大量HSC,用于成人的移植;(4)脐血T淋巴细胞较原始且又缺乏T淋巴细胞活化/生长因子,抗原表达既弱又不充分,NK细胞活性较弱而且还存在着抑制性淋巴细胞,因此淋巴细胞的细胞毒反应较低,移植后所引起的移植物抗宿主病(Graft versus host disease,GVHD)和宿主抗移植物病(Host versus graft disease,HVGD)的发生率及程度都比BM及PB要低;(5)由于脐血免疫系统的原始性,从而可以进行HLA1~3个位点不合的同胞间及无关供者间的移植,使更多的患者及时得到脐血造血干细胞移植(Cord blood stem cell transplantation,CBSCT);(6)脐血HSC/HPC来源极其广泛,储存能耐冷冻,长期保存,因此较异体BM及PB HSCT更易找到HLA相匹配的供者;(7)CBSCT的适应证要广于BM及PBHSCT。且单份脐血所含的HSC量不仅可满足96%的儿童患者需求,而且还能满足49%的体重较轻的成人患者移植的需要;(8)脐血受胎盘屏障的保护,HSC被病毒、细菌污染的机率低;(9)脐血采集过程简单,对新生儿及产妇均无任何痛苦及不良作用,易于接受;(10)CBSCT不涉及社会、伦理及法律方面的更多争论。收集的脐血不仅可做异基因移植的供体,而且还可将CBSC低温保存数十年,用于自体移植治疗相关疾病和防衰老之用。

3 脐血的采集、保存和移植

3.1 脐血的采集

采集时间为新生儿娩出后即刻采血,即在胎盘尚未娩出时,采血完毕时间不超过分娩后5min。采集方法为在距新生儿脐部5~7cm处,用两把血管钳夹住脐带,在两钳中间断脐,包扎处理新生儿脐带后,以采血袋针穿刺胎盘侧脐带较粗脐静脉,脐血随产妇子宫收缩,直接流入采血袋中,轻轻摇匀,在胎盘剥离前轻压宫底,胎盘娩出后轻轻挤压胎盘及脐带,以使残存血液流入袋内,以增加采集血,直至脐血不流为止。每只胎盘的脐血作为一个包装单位,血量一般为100~200ml。

3.2 脐血的保存

4℃24h保存,脐血细胞活力变化不大;液氮(-196℃)保存1~9个月,复温后脐血细胞仍有较高活力。据报道,采血袋中脐血4℃保存备用,脐血粒-单核祖细胞(CFU-GM)、红系祖细胞(CFU-E)和多能干细胞(CFU-GEMM)至少3天内保持着活性,但在37℃可较快丧失活性。另外也有人认为脐血血库冷藏10年仍有效[8]。

3.3 CBT

原则上同常规输血,故CBT也称脐血输注。交叉配血,输注前每单位脐血中加入地塞米松2mg,庆大霉素4万U以防感染和输血反应。每次输注1单位,每周1~2次,重症患者每周2~3次,连续或间断输5~13次为1个疗程。

4 脐血输注的临床应用

4.1 单份CBT

Ooi等[1]报道了18例成人复发急性髓细胞白血病(Acute myeloid leukemia,AML)接受无关供体(Unrelated donor,URD)CBT的结果,此结果进一步强调了为获得CBT理想结果,单位体重植入细胞数量的重要性,提示最低剂量为NC 1.5×107/kg;另一份报告[1]则指出输入NC平均应达到1.08×107/kg,然而许多脐血单位达不到这一指标。总的来说,受到单份脐血细胞数量的限制,成人CBT应用不足,血细胞恢复慢,疗效有限。

4.2 扩增后CBT

为克服单份脐血NCs少和植入延迟的缺点,许多课题组已经或正在致力于扩增CBT的研究工作。在对25例成人和12例儿童恶性血液病和乳腺癌患者的研究中,Kobari等[10]分选每例脐血供者的CD+34造血细胞进行体外扩增后,与未经扩增的剩余脐血同时回输给患者,发现扩增恰恰是增加了单份脐血的CD+34细胞数,总NCs轻度减少;故推测CD+34分选和体外扩增可能是富聚了高增生能力的细胞群,进而改善了移植物中造血细胞的质量而非数量,前者是促进快速和稳定植入的重要因素。另一份报告认为回输扩增脐血是可行和安全的,但脐血扩增对粒系和血小板植入无显著影响,正在进行的Ⅱ期临床试验将评估扩增CBT的利弊。

4.3 多份CBT

有报道[11]证明同时移植两份及以上脐血是可行的,不仅可获得稳定的造血重建、持久植入,弥补单份脐血细胞数不足的缺点,而且未增加GVHD的发生率和严重程度,进一步扩大了CBT的适用人群,可使更多需要异基因造血干细胞移植治疗的血液肿瘤患者从中受益,尤其对体重较大的成人患者。另外,多份CBT时,扩增后回输是可以临床尝试的又一克服单份CBT造血干细胞数量少的方法。

4.4 非清髓CBT

Rizzieri等[12]报道以脐血为干细胞来源应用非清髓方案(氟达拉滨/CTX/ATG)对2例成人患者成功进行移植后,国内外陆续有非清髓CBT的报道,但多数报道只有数例患者。Barker等[13]对43例成人非清髓无关供者的CBT进行了分析,所有患者均为高危或进展期的恶性血液病患者,作者认为:(1)0~2个位点不合的脐血可以满足成人非清髓移植的需要,且具有较低的严重GVHD发生率;(2)CBT的一个缺点是复发后不能行供者淋巴细胞输注,但脐血0~2个位点移植可以耐受,可在短时间内找到供体以及低严重GVHD发生率足以弥补上述不足;(3)考虑到该研究为非随机对照,故不能评价预处理方案对植入等的影响。上述结果初步显示非清髓预处理方案在CBT方面的潜在作用,对于HLA相合/不合患者来说,非清髓CBT是可行的;并且多数资料显示移植失败率不足10%,90%以上的患者可获得至少50%的供者嵌合体。尽管如此,目前还不能对非清髓CBT后的植入、GVHD发生率以及GVL作用等作出评价。

4.5 脐血血浆输注

近年来,脐血血浆潜在的临床应用价值日益受到重视。初步证明,胎盘是一个非常复杂的内分泌器官,除产生甾体类激素外,还能产生种类繁多的调节肽、生长因子及细胞因子[14]。胎盘/脐带血血浆含有IL-1B,粒-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)等。张林生等[1]报道脐血血浆可支持成人骨髓造血祖细胞CFU的增殖,但脐血血浆对造血祖细胞集落形成的刺激作用似有一定选择性,除与造血祖细胞的来源有关外,还与ABO血型相关。即对脐血细胞而言,无论细胞与脐血血浆的来源者血型是否相同,均有明显的刺激作用,研究结果发现,血型不同的混合脐血血浆和同型脐血血浆均能刺激人体造血祖细胞造血功能,但血型不同的混合脐血血浆的刺激效应更强。

5 展望

脐血移植临床应用研究 第2篇

目的探讨人脐血CD34+细胞体外分离、纯化、诱导扩增和分化为内皮细胞的`可行性,并检测其表型.方法采集新鲜脐血经抗凝处理及无菌包装,Ficoll密度梯度离心法得单个核细胞,磁珠分选方法(MACS)分离出CD34+单个核细胞,M-199培养基中诱导分化,细胞形态学观察CD34+和CD34-细胞生长情况,流式细胞仪检测内皮细胞CD31表型,免疫组化验证蛋白水平表达.结果细胞形态学观察发现,刚分离的CD34+ 和CD34-单个核细胞呈圆形,形态小.CD34+细胞培养3 d后有明显集落形成,7 d后呈梭行细胞,出现典型线样排列结构.经诱导培养后,内皮细胞表型CD31阳性率为(70.03±10.27)%.免疫组化染色证实了内皮特异性成分ecNOS和flk-1/KDR蛋白水平的表达.而CD34-细胞单独培养,少部分细胞贴壁,呈现出不规则形态.结论 MACS法分离脐血CD34+细胞,体外诱导扩增和分化后贴壁细胞具有内皮细胞形态,通过流式细胞仪和免疫组化验证了贴壁细胞中大部分细胞具有内皮系标志物表达.

作 者：邵琴 王长谦 范华骅 何奔 刘 聂晓绚 姜萌 高跞 SHAO Qin WANG Chang-qian FAN Hua-hua HE Ben LIU Yan NIE Xiao-xuan JIANG Meng GAO Li 作者单位：邵琴,王长谦,何奔,姜萌,SHAO Qin,WANG Chang-qian,HE Ben,JIANG Meng(上海交通大学医学院仁济医院心内科,上海,01)

范华骅,刘,聂晓绚,高跞,FAN Hua-hua,LIU Yan,NIE Xiao-xuan,GAO Li(上海血液中心血液工程研究室)

脐血移植临床应用研究 第3篇

关键词 长管状骨干骨折 自体骨泥 骨移植

资料与方法

一般资料：本组103例112处，男82例，女21例，年龄15~68岁，闭合骨折87处，开放骨折25处，均为新鲜骨折，以骨折切开复位钢板螺丝钉内固定时一期自体骨泥移植与否分为两组，A组：自体骨泥一期移植组53例59处，男39例，女14例，年龄16~68岁，骨折部位：肱骨6例，桡骨2例，尺骨3例，股骨15例，胫骨21例，肱骨+尺骨1例，股骨+胫骨4例，胫骨+桡骨1例。骨折类型：横断4处，斜行6处，螺旋3处，粉碎46处；B组：未行自体骨泥移植组50例，53处，男33例，女17例，年龄13~65岁，骨折部位：肱骨4例，桡骨4例，尺骨3例，股骨17例，胫骨19例，股骨+胫骨1例，胫骨+桡骨2例；骨折类型：横断5处，斜行7处，螺旋3处，粉碎38处。

治疗方法：两组病例均切开复位钢板螺丝钉内固定，除尺、桡骨用普通型或重建钢板螺丝钉内固定外，其余均用动力加压型钢板螺丝钉内固定，钻骨孔时电钻调至低速，用手摇钻更适宜，防止固钻速过快而局部产生高热，使骨细胞失去生物活性，钻孔时用小匙勺细心采集所能留取的骨粉沫于无菌盘内备用，待骨折内固定完成后，放松止血带止血、冲洗伤口，将备用之自体骨粉沫用伤口内不凝血液少许，搅拌为骨泥，呈胶冻状为度，牵开软组织，在直视下将骨泥环形移植于骨折缝隙处，形成厚约3mm，宽约10mm的骨泥桥，软组织回位时防止骨泥脱落移位。

评价方法：治疗组与对照组均在术后6、14、18、26周分别摄X线正、侧位片，并在术前及术后2周化验血清碱性磷酸酶（AKP），对骨折进行评价。

疗效评定：本组参照临床骨科学骨折愈合标准相关内容自定评定标准，以术后14周为界限。

骨折局部不痛、不肿、无压痛，无纵向叩击痛、局部无反常活动，可负重，X线位显示骨折线模糊，有大量连续性骨痂通过骨折线，定为优。骨折局部不肿，负重时微痛，轻微压痛，无反常活动，X线位显示骨折线较模糊，有连续性骨痂通过骨折线，定为良。骨折局部肿胀、痛，局部压痛较明显，X线片显示折线清晰，有少量外骨痂形成，但无连续性骨痂通过骨折线，定为差。18周未达临床愈合为骨折延迟愈合，26周未达骨折愈合者为骨折不愈合。

统计方法：采用t检验，有关数据输入统计软件SPSS 10.0 进行统计处理，行两组间疗效对照分析。

结 果

治疗组53例术后随访6~26周，平均18周，47例6周有骨痂形成，46例14周骨折愈合，4例18周骨折愈合，1例26周后骨折未愈合。对照组50例术后随访6~26周，平均18周，38例6周有骨痂形成，34例14周骨折愈合，12例18周骨折愈合，4例26周后骨折未愈合。治疗组优46例，占89%，良6例，占11.6%，差1例，占1.9%；对照组优34例，占68%；良12例，占24%；差4例，占8%，经SPSS 10.0软件进行t检验后P<0.01，两组之间存在较明显差异。

治疗组42例术后2周血清碱性磷酸酶均有不同程度增高，对照组有31例血清碱性磷酸酶增高，具体数值如下。

 以上两组数据经过SPSS 10.0软件进行t检验后，P<0.05，有统计学意义。

讨 论

本组对四肢长管状骨干骨折在切开复位钢板螺丝钉内固定时一期自体骨泥移植进行前瞻性随机临床观察研究并与非骨泥移植组进行对照，治疗组骨折延迟愈合6例，骨折不愈合1例，该患者为19岁男性，偏食、消瘦、营养不良，考虑骨折不愈合与其营养不良有关。对照组骨折延迟愈合12例，骨折不愈合4例，无营养不良因素，证明自体骨泥移植具有诱导成骨作用，可促进骨折愈合，对减少或避免骨折延迟愈合或不愈合有效。

自体骨泥一期骨移植有其独特优点：①骨源丰富，取材方便，简便安全；②不增加患者的创伤及痛苦，骨折愈合率高，降低了医疗费用，减轻了经济负担；③不增加医源性污染，无免疫反应的困扰。

结 论

自体骨泥移植不仅骨源丰富，取材方便、有成骨能力，且可起到骨桥梁连接作用，便于骨细胞再生后生长爬行，有促进骨折愈合效果。另有观察自体骨泥移植后碱性磷酸酶较高，碱性磷酸酶含量升高可促进血浆内有机结合的磷酸释放磷酸盐，与钙结合为磷酸钙，使其沉积后的骨样组织变为骨组织，促进骨折愈合。虽然自体骨泥一期骨移植的优点较多，可我们进行临床观察研究的病例数有限，需进一步完善有关资料的积累研究，使自体骨泥移植应用范围更广，造福于更多骨折患者。

参考文献

1 陆裕朴，胥少汀，葛宝丰，等. 实用骨科学. 北京：人民军医出版社，1996.63.

2 刘好源，音星杰，包锦昌，应可满.自身骨泥成活性的实验研究. 中国矫形外科杂志. 1999；6（6）：441.

脐血移植临床应用研究 第4篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2009年1月~2010年12月在我科收治的53例经CT、核磁共振(MRI)或彩超影像学检查诊断为失代偿期肝硬化伴脾大,门静脉高压患者。其中乙型肝炎肝硬化47例,酒精性肝硬化6例。Child-Pugh分级B级31例,C级22例。男44例,女9例,年龄35~58岁,平均(44.81±9.37)岁,平均病程(7.9±5.8)年,均经过系统内科治疗,疗效差。报医院器官伦理委员会审查批准,患者签定《知情同意书》。在给予UCBSC移植治疗同时给予综合基础治疗。全部病例无感染、活动性上消化道出血、严重肝昏迷、肝肾综合征及肝癌。

1.2 UCBSC制备

干细胞浓度为1.0×107/m L~1.0×108/m L,悬液量30 m L。由深圳北科生物科技有限公司采用酶消化法分离、培养、扩增、纯化后提供。

1.3 移植途径及方法

患者平卧位,取肘前正中静脉穿刺建立静脉通道,先以输血器滴入生理盐水,再连接复温的细胞袋输注UCBSC悬液,30 m L悬液滴注10 min,再滴入生理盐水10 m L冲洗管道,4次为1个疗程,每次间隔1周。

1.4 观察指标和时间

移植前和移植后12周进行彩超影像学检查,观察肝脏的体积变化。于移植前和移植后2、4、8、12周进行实验室检查,指标包括血清谷丙转氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)、纤维蛋白原(FIB)、凝血酶原时间(PT)、总胆红素(TB)。观察患者食欲、体力、腹胀、腹水、下肢水肿改善情况及不良反应。

1.5 统计学方法

应用SPSS 13.0统计软件建立数据库并进行统计分析。用均数±标准差表示计量资料,采用t检验;计数资料行χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 术后影像学表现

移植后12周肝胆脾彩超影像学检查结果显示患者的左右肝叶大小与移植前对比无显著改变。

2.2 UCBSC外周静脉移植治疗前后实验室指标变化

与移植前比较,移植后2周ALT、ALB、FIB、PT和TB指标并无明显改善(P>0.05);4~12周患者的ALT、ALB、FIB和TB指标均有改善,差异有统计学意义(P<0.05);PT在8~12周指标改善,差异有统计学意义(P<0.05)。经外周静脉移植UCBSC后实验室指标变化见表1。

2.3 UCBSC外周静脉移植治疗后症状和体征的变化

移植后12周食欲、体力、腹胀改善率分别为75.5%(4053)、67.9%(36/53)、54.7%(29/53),腹水减少或消失54.7%(29/53)和下肢水肿减轻或消失50.9%(27/53)。

2.4 UCBSC外周静脉移植治疗不良反应

53例患者均成功输入UCBSC悬液,5例出现低热,对症处理后缓解。无静脉炎、呼吸困难等其他并发症发生。

3 讨论

3.1 选择UCBSC作为干细胞治疗失代偿期肝硬化的依据

干细胞作为一类具有自我更新、扩增和多向分化潜能的细胞,在一定的条件下可分化为多种功能细胞。体外实验和临床均证实在肝损伤及肝细胞再生过程中,干细胞对肝功能的恢复和再生起着重要作用[1]。随着干细胞技术研究的不断深入,为干细胞移植治疗失代偿期肝硬化提供了新的前景[2]。用于治疗肝硬化的干细胞根据起源可分为肝源性干细胞和非肝源性干细胞,后者包括骨髓源性干细胞、UCBSC、胰腺上皮细胞及神经干细胞等。在使用干细胞移植治疗失代偿期肝硬化的细胞治疗尝试中,较早使用的是骨髓间充质干细胞。由于骨髓间充质干细胞获取的有创操作所带来的痛苦及医疗风险,UCBSC逐渐成为了治疗失代偿性肝硬化的研究热点。UCBSC大量存在于脐血,来源丰富,且免疫原性较弱,不受伦理及法律方面的限制。更重要的是脐带血中的干/祖细胞较成人骨髓中的干/祖细胞更原始,理论上有更强的分化和增殖能力,适合用于细胞治疗[3,4]。

3.2 UCBSC经外周静脉移植治疗失代偿期肝硬化的效果

虽然移植后12周彩超影像学检查结果显示患者的左右肝叶大小与移植前对比无显著改变,但从表1可见,与移植前比较,移植后2周ALT、ALB、FIB、PT和TB指标比较差异无统计学意义(P>0.05);4~12周患者的ALT、ALB、FIB和TB指标均有改善,与移植前比较,差异有统计学意义(P<0.05);PT在8~12周指标比较差异有统计学意义(P<0.05)。移植后12周食欲、体力、腹胀有明显的改善,腹水和下肢水肿减轻或消失者超过50%。考虑UCBSC移植后在肝脏内定居,分化成有功能的肝细胞样细胞进行替代和发挥修复功能需要一定的时间,移植后4周移植UCBSC在肝脏逐渐发挥了替代和修复的作用,能有效地恢复肝脏的生物合成、转化及排泄等功能,使实验室指标明显好转,改善失代偿期肝硬化患者的部分症状和体征,提高了患者的生活质量,有广阔的临床应用前景。

3.3 UCBSC移植途经的选择

移植后移植干细胞的归巢率直接影响到定居分化的细胞数量,也直接影响着治疗的效果。目前干细胞移植治疗失代偿期肝硬化的途径主要有经外周静脉、肝动脉及门静脉。本组病例采用经外周静脉输注移植方法,术后12周的肝功能指标、临床症状和体征均有所改善,提示经外周静脉干细胞移植简单、可行,在治疗失代偿期肝硬化取得了初步疗效。与国外学者报告的动物实验经外周静脉移植的干细胞可以定居肝脏并分化成肝细胞相一致[5],满足移植干细胞在肝脏归巢、定位和分化的需要。

3.4 干细胞移植治疗失代偿性肝硬化的安全性和可行性

全部53例患者均成功输注了UCBSC并取得了初步的临床疗效,5例出现低热,经对症处理后缓解,未出现其他并发症。此组病例在选择上排除了感染、活动性上消化道出血、严重肝昏迷、肝肾综合征及肝癌,也为移植UCBSC的定居和分化提供了相对好的内环境。

本研究在使用UCBSC经外周静脉移植治疗失代偿期肝硬化上初步取得了较好的近期疗效,未发生严重不良反应和并发症,提示此方法有效、安全、可行。远期疗效及副作用有待进一步的大样本和中、远期的观察。

摘要：目的 探讨人脐血干细胞(umbilical cord blood stem cell,UCBSC)经外周静脉移植治疗失代偿期肝硬化的临床疗效及安全性。方法 对53例肝硬化失代偿期患者采用经外周静脉UCBSC移植治疗,移植术后2、4、8、12周观察血清转氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)、纤维蛋白原(FIB)、凝血酶原时间(PT)、总胆红素(TB)水平变化,同时观察临床症状和体征的改善情况及不良反应。结果 术后4、8、12周ALT、ALB、FIB和TB指标均有明显改善,差异有统计学意义(P<0.05),PT在术后8、12周指标有明显改善(P<0.05)。移植后12周食欲、体力改善率分别为75.5%(40/53)、67.9%(36/53)、腹水减少54.7%(29/53)。移植术中和术后未见明显不良反应。结论 UCBSC经外周静脉移植是治疗失代偿期肝硬化是一种有效、安全的方法,可以显著改善失代偿期肝硬化患者的肝功能、临床症状和体征。

关键词：脐血干细胞,移植,肝硬化

参考文献

[1]Flohr TR,Bonatti HJ,Brayman KL,et al.The use of stem cells in liverdisease[J].Curr Opin Organ Transplant,2009,14(1):64-71.

[2]Lee MW,Jang IK,Yoo KH,et al.Stem and progenitor cells in humanumbilical cord blood[J].Int J Hematol,2010,92(1):45-51.

[3]翁敬飚,阮海兰,韦玲,等.人脐带干细胞外周静脉移植治疗失代偿期肝硬化的临床疗效[J].武汉大学学报:医学版,2010,31(4):541-543.

[4]Hematti P.Role of mesenchymal stromal cells in solid organtransplanta-tion[J].Transplant Rev(Orlando).2008,22(4):262-273.

脐血移植临床应用研究 第5篇

关键词：脐血干细胞,移植,1型糖尿病

1型糖尿病(T1DM)是一种T细胞介导的自身免疫性疾病,以胰腺β细胞选择性破坏,导致患者体内胰岛素分泌绝对不足为特征[1]。目前,T1DM患者需要终生依赖外源性胰岛素,而且这种替代治疗只是延缓疾病的发展却并不能从根本上治愈糖尿病。恢复胰岛β细胞功能是治疗T1DM最理想的方法。研究发现:干细胞具备很强的增殖能力和分化潜能,在一定条件下,脐血干细胞可分化为胰岛β细胞进而起到治疗糖尿病作用。

1 人脐血干细胞的特性

1.1 人脐血干细胞的生物学特性

脐血中含有丰富的造血干细胞和间充质干细胞。CD34+抗原是造血干细胞分离纯化的主要标志。脐血中CD34+细胞所占比例与骨髓相似,高于外周血,约占有核细胞的1%,这类细胞具有更强的增殖和分化能力[2]。脐血中的高增殖潜能集落形成细胞(HPP-CFC)更为原始[3]。脐血中传代达5代,并且在第5代仍可见到混合形成集落单位,在骨髓中也可检测到HPP-CFC,但其检出频率只有脐血的1/8。脐血造血干细胞的自我复制、增殖能力、刺激后进入细胞周期的速度以及自分泌生长因子的能力也均较骨髓和外周血强,其端粒及端粒酶活性均长于和高于骨髓及外周血,并且低表达或不表达细胞凋亡配基CD95Fas,因此其寿命更长[4]。脐血中的间充质干细胞与骨髓间充质干细胞不仅在形态和细胞表面标志方面十分相似,而且都具有非常相似的分化潜能,可以向内、中、外三个胚层的组织细胞分化。在体外,脐血间充质干细胞具有向胰岛β样细胞分化的潜能[5]。

1.2 人脐血干细胞的免疫学特性

脐血免疫系统相对不成熟,脐血中T淋巴细胞比较原始,缺乏T淋巴细胞活化P生长因子,所以其表型和免疫功能均不成熟,表达白介素2(IL-2)受体及人类白细胞分化抗原DR(HLA-DR)能力低下;脐血中已接触抗原或记忆细胞极少(<5%),其淋巴细胞对有丝分裂原、植物血球凝集素(PHA)或异种抗原及IL-2反应差,B细胞不能转化为能产生抗体的浆细胞,亦不能产生IgA和IgG,只产生一定量的IgM;细胞间的信号传导通路不完善;自然杀伤细胞(NK)活性较弱,CD34+CD45RO+细胞在脐血中明显高于骨髓,且CD45RO+以抑制性亚群为主,因此淋巴细胞的细胞毒性较低,较少发生移植物抗宿主病(GVHD)和宿主抗移植物病(HVGD)反应[6]。由于脐血免疫系统的原始性,从而可以进行人类白细胞分化抗原(HLA)1～3个位点不合的同胞间及无关供者间的移植,使更多的患者及时得到脐血干细胞移植。

2 人脐血干细胞的选择、采集、分离、培养、诱导分化、鉴定及输注

2.1 脐血的选择

脐血的筛选严格,对提供脐血的产妇和胎儿都有标准要求。产妇必须是35岁以下,身体健康,无各种急、慢性疾病及传染病、家族遗传性疾病,妊娠期内无严重合并症,分娩过程顺利;既往有输血史、多胎妊娠、孕期少于37周或多于42周者均不能作为脐血采集对象。胎儿则要求无任何畸形、体质量超过2 500 g。此外,胎盘剥离距分娩时间超过12 h,胎膜早破超过24 h,羊水内有胎粪,胎儿呼吸窘迫者脐血亦不能采用。

2.2 脐血的采集

目前脐血常采用密闭式采集法,该方法使用方便,污染机会少。采集时间为新生儿娩出后即刻采血,即在胎盘尚未娩出时,采血完毕时间不超过分娩后5 min。采集方法为在距新生儿脐部5～7 cm处,用两把血管钳夹住脐带,在两钳中间断脐,包扎处理新生儿脐带后,以采血袋针穿刺胎盘侧脐带较粗脐静脉,脐血随产妇子宫收缩,直接流入采血袋中,轻轻摇匀,在胎盘剥离前轻压宫底,胎盘娩出后轻轻挤压胎盘及脐带,以使残存血液流入袋内,以增加采集血,直至脐血不流为止。每只胎盘的脐血作为一个包装单位,每份脐血采集的量60～120 ml,其中单个核细胞约为1.6×106/ml。采集后对脐血进行生物学检测(单个核细胞、活细胞计数、CD34+计数等)、细菌污染检查、血型及HLA分型检测、血清学病毒检查(艾滋病病毒、巨细胞病毒、肝炎病毒、梅毒螺旋体、弓形体病毒等)以及遗传疾病的检测。只有在各项检查中合格的脐血才会被用来移植。

2.3 脐血的分离及保存

脐血的分离通常使用的方法包括:密度梯度离心法及贴壁细胞分离法:首先从脐血中分离出单个核细胞,再依据其体外培养中贴壁生长的特性,使用贴壁筛选法将其从造血系统细胞中分离出来。此法简单有效,成本低廉,对细胞的损伤小,能较好的保持细胞活性,但成分复杂,纯度不高[7]。流式细胞仪分离法:依据干细胞的大小或细胞表面的特殊标志,采用流式细胞仪进行分离,获得的干细胞纯化度高,但对细胞活性影响大,且实验条件要求高,需要的标本量大。免疫磁珠分离法:利用表面覆有特异性抗体的磁珠与干细胞结合,再用永久磁铁吸引出干细胞,可获得较为纯化的干细胞,不过分离过程中会影响细胞的活性。也有学者采用单细胞克隆技术获取纯的干细胞株[8]。国内外多采用平衡慢冷速冻法冷冻保存脐血干细胞[9],但在降温过程中会对细胞造成损伤。陈光明等[10]引入非晶态物理学玻璃化方法冷冻保存脐带血干细胞,并通过理论模拟计算及实验结果证明细胞在冷冻前后均得以维持其完整形态。

2.4 脐血干细胞的培养、诱导分化及鉴定

脐血干细胞在培养方面还没有统一的方案,培养的条件也各不相同。Romanov等[11]用含10%胎牛血清培养基培养出优质生长良好的间充质干细胞。Lee等[12]用含20%胎牛血清,L-谷氨酰胺的IMDM培养基,并加入碱性成纤维生长因子,也培养出生长良好的干细胞。李启明等[13]利用DMEM/F12培养基进行培养得到了形态较为均一脐血间充质干细胞群。陈镭等[14]采用偏酸性的MesencultTM培养基更好的促进了脐血间充质干细胞的生长。迟作华等[15]研究发现,5×106/cm2是脐血间充质干细胞的适宜接种密度。王茜等[16]认为,人脐血间充质干细胞与骨髓间充质干细胞培养上清液共孵育,对脐血间充质干细胞体外培养及扩增有支持作用。金玮等[17]选用自体血浆加胎牛血清的DMEM/F12培养基为脐血间充质干细胞提供较好的生长条件,在促进脐源性间充质干细胞增殖的同时还使之保持未分化状态。脐血间充质干细胞在不同的诱导条件下能够向不同的谱系分化,不仅分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和胰岛β样细胞等,还可以跨胚层分化。

2.5 脐血干细胞的输注

临床上,干细胞移植一般是通过静脉注射途径,细胞注入受者体内后需要通过归巢到达其骨髓的造血微环境才能存活、自我更新、增殖、分化,进而重建造血系统。不过,Mazurier等[18]将人CD34+细胞通过股骨内注射的方式移植到非肥胖糖尿病-严重联合免疫缺陷(NOD-SCID)鼠,发现一类可以快速产生高水平髓系和红系细胞的造血干细胞亚群。Christopherson等[19]发现去除或抑制CD26细胞表面的1种二肽基肽酶,可以提高鼠造血干细胞在致死量放射后小鼠体内的归巢和再植。因此,采用股骨内注射或改变经静脉注射的细胞的表面成分可以提高脐带血内部分细胞再植能力,从而提高单份脐血的利用率。有报道证明同时移植两份及以上脐血是可行的,不仅可获得稳定的造血重建、持久植入,弥补单份脐血细胞数不足的缺点,而且未增加GVHD的发生率和严重程度,进一步扩大了脐血移植的适用人群,尤其对体质量较大的成人患者[20]。另外,多份脐血移植时,扩增后回输是可以临床尝试的又一克服单份脐血移植干细胞数量少的方法。关于脐血干细胞移植治疗1型糖尿病输注方法暂无报道。

3 脐血干细胞移植治疗T1DM的实验研究

T1DM是一种T细胞介导的自身免疫性疾病,以胰腺β细胞选择性破坏,导致患者体内胰岛素分泌绝对不足。T1DM的最终治疗需要去除免疫介导的β细胞破坏和恢复胰岛素分泌细胞功能。脐血干细胞移植作为一种治疗T1DM的新方法越来越受到人们的关注。脐血干细胞移植后,多种免疫细胞、免疫调节因子、抗体、补体等发生改变,原先的免疫网络被打破,机体重建新的免疫网络,并在体内分化为胰岛细胞或促进胰腺内源性胰岛细胞再生。

研究发现:糖尿病高危人群和NOD鼠抗糖尿病等位基因存在结构上的差异,但相同的是它们的组织相容性抗原(MHC)Ⅱ类分子β链57位均缺少一个带电氨基酸,以致不能与α链76位精氨酸形成盐键,这一结构上的异常影响肽链的结合和暴露,同时将影响那些可以控制糖尿病的T细胞的正性选择[21]。Tian等[22]认为干细胞移植可以改良MHCⅡ类分子β链表达,其中约15%细胞共同表达保护性β链和疾病倾向性β链,而这已足够恢复中心耐受并阻止胰腺炎及糖尿病的发展。表达糖尿病抵抗MHCⅡ类分子干细胞输注使存在自身反应性糖尿病基因的T细胞发生负性选择,使得机体对自身和同种异体抗原产生免疫耐受,从而预防胰岛炎发生及β细胞的损伤。Norman等[23]分离脐血单个核细胞,经静脉注入2型糖尿病小鼠体内后,能缓解糖尿病症状,改善肾小球肥大及肾小管扩张,延长存活时间。而注入T1DM小鼠体内后,显著降低血糖,且随着移植细胞数的增多,血糖下降幅度增大,减少胰腺炎的发生,延长存活时间[24]。Chao等[25]将人脐血来源的间充质干细胞进行体外诱导分化,得到胰岛样细胞团,在这些细胞群中可以检测到胰岛素和其他胰岛β细胞相关基因的表达,将其移植到改良链脲佐菌素(STZ)处理的大鼠体内,高血糖显著改善。脐血单个核细胞[26],原代培养第8天的贴壁细胞,24 h的悬浮细胞,表达多个与胰腺Langerhans岛发育相关的分子,如巢蛋白(Nestin)、胰岛素基因启动子结合蛋白(Isl-l)等,这些基因与胰腺祖细胞、胰腺的内分泌及外分泌细胞的发育都有一定的关系,但是脐血细胞不表达胰岛素的转录因子,究竟是单个核细胞中的哪一种细胞表达这些胰腺相关分子尚不能确定,但在单个核细胞中肯定有一部分是间充质干细胞。有报道将人的骨髓和小鼠、大鼠骨髓间充质干细胞在体外诱导分化为胰岛样结构,在糖刺激下可分泌胰岛素,从胚胎胰腺中分离的Nestin+祖细胞与骨髓来源的间充质干细胞有很多相同的表型[27],脐血及骨髓间充质干细胞又有很相似的形态和标志,所以脐血间充质干细胞也有这种潜能。Zhao等[28]在成人外周血单个核细胞中发现一种全新的细胞群——外周血产胰岛素细胞(PB-IPC),研究发现70%左右的PB-IPC表达CD45并分泌胰岛素。通过流式分析发现,PB-IPC细胞标记CD45、CD117为强阳性,但并不表达CD34。糖尿病小鼠尾静脉回输PB-IPC,发现PB-IPC可以很好的归巢定位于胰腺,小鼠血糖明显下降。Ruhnker等[29]将贴壁分选的单核细胞予M-CSF和白介素-3共培养6 d后,予胰岛细胞条件培养基培养一段时间后,发现经诱导的细胞可以分泌胰岛素,白介素-3等刺激6 d后的单核细胞CD45为强阳性。CD45是一种造血源细胞标志物仅表示造血细胞谱系,而不是间质干细胞或多潜能成人祖细胞[30]。这表明PB-IPC及体外诱导分泌胰岛素的细胞是由造血干细胞分化而来的细胞。Hess等[31]发现移植骨髓源造血干细胞能使内源性胰腺细胞再生,胰腺中出现的移植物使得受者的胰腺细胞迅速增殖并新生出胰岛素阳性细胞,这些新生的细胞并非移植细胞转化而来。Hess推测移植物可能转化为血管内皮细胞,并分泌某些未知生长分化因子,使得移植受者自身β细胞增殖。脐血造血干细胞的自我复制、增殖能力、刺激后进入细胞周期的速度以及自分泌生长因子的能力也均较骨髓和外周血强,所以相信脐血造血干细胞也有这种潜能。2003年11月—2006年7月,共有15例新近诊断的T1DM患者在巴西圣保罗大学附属医院进行了自体干细胞移植治疗,2007年Voltarelli等[32]报道了这15例接受自体造血干细胞治疗的患者中,14例患者治疗后停用胰岛素,最长已达35个月。2006年8月南京大学医学院附属鼓楼医院进行了国内首例造血干细胞移植治疗T1DM,迄今患者已停用胰岛素20个月余,血糖一直维持在正常水平。脐血干细胞移植治疗T1DM仍需进一步的临床试验来证明其疗效。

4 问题与展望

脐血移植临床应用研究 第6篇

1 材料与方法

本实验于2011年6月-2012年1月在中南大学湘雅医院医学实验研究中心和中南大学实验动物学部完成。

1.1 实验动物

健康纯种中国家兔60只, 雌雄不拘, 兔龄4~5个月, 体重1.5~2.0 kg, 购自中南大学实验动物学部, 动物许可证号:SYXK (湘) 2011-00041。饲养环境:室内25℃常温、12 h灯光照明、单笼常规饲养。

1.2 主要药物、试剂和仪器

阿托伐他汀 (美国Pfizer Ireland Pharmaceuticals) , XDS-100倒置显微镜 (上海蔡康光学仪器有限公司) , JX0197097细胞培养箱 (博士德公司) , 淋巴细胞分离液 (美国GICBO公司) , DMEM (美国GICBO公司) , RPMI1640液 (美国GICBO公司) , 绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein, GFP) 慢病毒 (上海英为信生物科技有限公司) , KIT-5020通用型二抗羊抗鼠免疫组织化学广谱试剂盒 (福州迈新公司) , 鼠抗兔VEGF单克隆抗体、鼠抗兔v WF单克隆抗体 (一抗) (博士德公司) , Vevo770型高分辨率小动物超声仪 (加拿大VISUALSONICS公司) 。

1.3 人脐血单个核细胞提取、制备与GPF标记

HUMNCs的体外分离、纯化和培养参照6%HES法[6]。脐血来自中南大学湘雅医院产科、身体健康、足月分娩 (37~42周) 产妇, 取传2代细胞为移植细胞。将HUMNCs按5×104个每孔接入24孔板, 加入含10%胎牛血清的RPMI 1640液为培养液培养12 h。将GFP慢病毒载体与无血清的RPMI 1640液混合后分别加入每孔细胞中培养24 h, 再在每孔中加入1 m L含10%胎牛血清的RPMI 1640液, 继续培养48 h。在荧光显微镜下计数绿色荧光细胞, 计算转染效率, 移植前调终浓度至3×107细胞/500μL备用。

1.4 动物模型制作与实验分组

对60只家兔结扎冠状动脉左前降支, 制备AMI模型[6]。建模成功者60只随机分为4组, 每组15只。对照组:生理盐水2 m L灌胃, 建模术后24 h生理盐水0.5 m L耳缘静脉注射;阿托伐他汀组:阿托伐他汀5 mg/ (kg·d) 溶入生理盐水2 m L灌胃4周, 同时间点、同途径注射生理盐水0.5 m L;细胞移植组:生理盐水2 m L灌胃4周, 同时间点、同途径注入含3×107GFP标记人脐血单个核细胞生理盐水0.5 m L;联合治疗组:同时间点、同途径注入含3×107GFP标记人脐血单个核细胞生理盐水0.5 m L, 阿托伐他汀5 mg/ (kg·d) 溶入生理盐水2 m L灌胃4周。

1.5 超声心动图检测

分别于移植后1、2和4周用配备7.5 MHz心脏超声探头Ve Vo770型高分辨率小动物超声仪测心功能。在大鼠胸骨旁以二维超声和M型超声行功能检测。测量指标为左室短轴缩短率 (LVFS) 、左室射血分数 (LVEF) , 取3次测量平均值。

1.6 病理学与免疫组织化学检测

移植后1、2和4周每组随机处死5只家兔。取左室心肌梗死部位及其周边区域沿长轴切成4段, 10%甲醛溶液固定, 脱水, 石蜡包埋, 5μm连续切片, 每3连续切片分别取一张, 进行免疫组织化学和荧光显微镜检测。抗VEGF免疫组织化学阳性细胞胞质呈红褐色, 每组每个时间点取6张片, 每切片随机选取10个高倍视野 (×400) , Image Pro Plus图像分析系统测VEGF免疫组织化学染色的平均吸光度值。抗VⅢ因子免疫组织化学血管内皮阳性细胞胞浆呈红色, 每切片随机取5个400倍视野, 计算每个视野内毛细血管的数目, 取平均值即为毛细血管密度。

取上述制备第1、2和4周石蜡切片脱蜡、蒸馏水冲洗后, 荧光显微镜高倍视野 (×400) 观察GFP阳性细胞。每切片随机选取10个高倍视野, 取其均数为GFP阳性细胞数量。

1.7 统计学方法

所有数据采用SPSS 17.0统计软件包处理, 数据用均数±标准差 (±s) 表示, 多样本均数比较采用方差分析, 两组比较采用t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物数量分析

急性心梗模型制备成功的健康纯种中国家兔60只, 全部完成整个实验过程。

2.2 观察GFP慢病毒转染HUCBMCs效应

普通光镜下HUCBMCs呈长梭形、无色透明, GFP慢病毒转染后荧光显微镜下GFP转染阳性细胞呈发绿色荧光的长梭形, GFP转染效率为 (90±3) %。见图1。

2.3 各组超声心功能比较

由表1可见, 与对照组比较, 阿托伐他汀组、细胞移植组及联合治疗组于移植后1、2和4周心功能均有改善, LVFS和LVEF均有增加。细胞移植组较阿托伐他汀组心功能改善明显, 联合治疗组较其他两组改善更加明显。各治疗组不同时间点比较, 心功能指标LVEF和LVFS有好转趋势, 但差异无统计学意义。

2.4 各组心肌免疫组织化学检测VEGF蛋白的表达比较

由图2和表2可见, 治疗后第1、2和4周对照组心肌组织可见少量表达VEGF蛋白表达;阿托伐他汀组、细胞移植组及联合治疗组心肌梗死区域与周边组织均有VEGF蛋白表达阳性细胞, 与对照组比较, VEGF蛋白表达阳性细胞数量均显著增多 (P<0.05) ;与阿托伐他汀组、细胞移植组相比, 联合治疗组VEGF蛋白表达阳性细胞数量增多更显著 (P<0.05) ;且细胞移植组VEGF蛋白表达阳性心肌细胞数量多于阿托伐他汀组 (P<0.05) 。治疗后第2和4周VEGF蛋白表达阳性心肌细胞数量有增多趋势, 但各治疗组不同时间点比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。见表2。

注:1) 与对照组比较, P<0.05;2) 与阿托伐他汀组比较, P<0.05;3) 与移植组比较, P<0.05

注:1) 与对照组比较, P<0.05;2) 与阿托伐他汀组比较, P<0.05;3) 与移植组比较, P<0.05

2.5 各组v WF免疫组织化学染色及心肌组织毛细血管密度

由图3和表3可见, 治疗后第1、2和4周, 对照组心肌组织均可见少量新生血管生成, 第4周血管数量多于第1和2周 (P<0.05) , 第2和4周间比较差异无统计学意义。与对照组比较, 阿托伐他汀组、细胞移植组及联合治疗组第1、2和4周心肌组织毛细血管密度均显著升高 (P<0.05) ;联合治疗组与阿托伐他汀组、细胞移植组比较心肌组织毛细血管密度更明显增加 (P<0.05) ;且细胞移植组毛细血管密度多于阿托伐他汀组 (P<0.05) 。治疗后第2和4周毛细血管密度数量有增多趋势, 但各治疗组不同时间点比较差异无统计学意义。

2.6 各组心肌组织内GFP阳性细胞比较

对照组与阿托伐他汀组各时间点均未见GFP阳性细胞。细胞移植组及联合治疗组治疗后第1、2和4周荧光显微镜下心肌梗死区域与周边组织无数可观察散在分布的GFP阳性细胞。由图4和表4可见, 与细胞移植组比较, 联合治疗组GFP阳性细胞数量明显增多 (P<0.05) , 两组不同时间点组内比较差异无统计学意义。

注:1) 与对照组比较, P<0.05;2) 与阿托伐他汀组比较, P<0.05;3) 与移植组比较, P<0.05

注:覮与细胞移植组比较, P<0.05

3 讨论

包括笔者在内的国内外研究[6,7,8]显示, 移植细胞在急性梗死心肌内存活率低、增殖分化能力有限是目前干细胞移植治疗急性心肌梗死疗效有限的主要原因。大多数细胞移植后4 d内在急性心肌梗死心肌组织内发生细胞凋亡[9];还有研究证实, 即使心肌内注射自身同基因的骨髓干细胞, 72 h后心肌组织内仅有5.0%移植细胞存活[10]。分析其原因主要是心肌梗死后继发炎症反应、低氧状态和营养物质的缺乏等恶劣微环境下导致的细胞凋亡[7,8,9,10], 从而严重制约干细胞移植治疗心肌梗死近、远期疗效。

近年来, 他汀类药物已公认为是治疗冠心病心肌梗死基础药物之一, 除了他汀类药物有调脂作用、稳定冠状动脉斑块外, 还通过其他多效性机制改善梗死区心肌微环境, 其多效性主要机制如下: (1) 降低促炎症因子和炎症趋化因子表达, 拮抗局部炎症反应[5]; (2) 上调VEGF表达, 促进毛细血管再生[11]; (3) 降低梗死区局灶组织氧化应激反应[5]; (4) 改善内皮功能[5,11]; (5) 调节内皮祖细胞迀移和分化能力[11]。

近期国内杨跃进等[5]研究证实阿托伐他汀联合骨髓间充质干细胞心肌内移植治疗急性心肌梗死疗效增强, 其机制主要是两者联合增强抗炎、抗氧化应激作用, 促进血管新生, 从而协同改善梗死区心肌微环境, 提高组织内定植的骨髓间充质干细胞存活率。

既往已有实验研究[12,13]证实经静脉途经移植HUCBMCs治疗急性心肌梗死疗效。多数研究结果显示移植细胞可归巢于心肌梗死区域, 并能存活;移植细胞在心肌组织可发挥抗炎效应、促进组织内血管再生, 改善梗死区心肌微环境, 从而发挥对缺血损伤心肌细胞保护作用。且移植细胞可分化为心肌细胞, 参与梗死后心功能的恢复。

本研究结果显示阿托伐他汀或静脉移植HUCBMCs治疗急性心肌梗死, 心肌梗死区及其周边区域心肌组织内VEGF蛋白表达和毛细血管密度增加, 同时伴有心功能改善, 进一步证实本研究及其他国内外近期研究的结论, 证实他汀类或静脉移植HUCBMCs治疗急性心肌梗死, 上调心肌组织VEGF表达, 促进毛细血管再生是心功能改善的主要机制之一。更重要的是本研究结果显示, 与单纯阿托伐他汀或静脉移植HUCBMCs治疗比较, 静脉移植HUCBMCs联合阿托伐他汀治疗急性心肌梗死, 心肌梗死区及其周边区域心肌组织内VEGF蛋白表达和毛细血管密度进一步增加, 且心肌组织GFP标记阳性细胞数增多, 超声心功能指标改善。本研究结果提示HUCBMCs静脉移植联合阿托伐他汀治疗急性心肌梗死, 能增加移植细胞在急性心肌梗死区域存活率, 并进一步改善心功能, 其机制可能与联合治疗促进组织内血管再生, 改善梗死区心肌微环境有关。

本研究尚有以下缺陷:未对心肌内移植细胞是否分化为心肌细胞进行定性检测;未对心肌组织RAS系统活性进行分析;观察时间有限, 没有明确脐血细胞静脉移植治疗心肌梗死的远期疗效。这有待于进一步研究和探讨。

本实验证实HUCBMCs静脉移植联合阿托伐他汀治疗急性心肌梗死, 促进组织内血管再生, 增加移植细胞在急性心肌梗死区域存活率, 并进一步改善心功能。本研究是对提高干细胞移植治疗急性心肌梗死疗效方法学的新探索, 力求改善目前干细胞移植治疗心肌梗死疗效有限的困惑状况, 其结果对临床干细胞移植治疗急性心肌梗死推广应用具有指导意义。

摘要：目的 探讨人脐血单个核细胞 (HUCBMCs) 静脉移植联合阿托伐他汀对急性心肌梗死 (AMI) 模型兔心肌组织血管再生的影响。方法 中国家兔AMI模型60只随机分4组, 每组15只。对照组:术后24 h生理盐水0.5 m L静脉注射 (静注) , 生理盐水灌胃4周;阿托伐他汀组:同时间静注生理盐水0.5 m L, 阿托伐他汀5mg/ (kg·d) 溶入生理盐水灌胃4周;细胞移植组:同时间静注含3×107GFP标记HUCBMCs生理盐水0.5 m L, 生理盐水2 m L灌胃4周;联合治疗组:同时间静注含3×107GFP标记HUCBMCs生理盐水0.5 m L, 阿托伐他汀5 mg/ (kg·d) 溶入生理盐水2 m L灌胃4周。移植后分别超声检测左室短轴缩短率 (LVFS) 、左室射血分数 (LVEF) ;荧光显微镜检测GFP阳性细胞;免疫组织化学检测抗第VⅢ因子染色检测毛细血管密度、血管内皮生长因子 (VEGF) 。结果 1与对照组、阿托伐他汀组治疗后比较, 细胞移植组与联合治疗组LVFS、LVEF改善, 联合治疗组改善更加显著;2移植4周后, 细胞移植组及联合治疗组梗死区周边可见GFP阳性细胞, 后组GFP阳性细胞数量计数多于前组;3与对照组、阿托伐他汀组治疗后比较, 移植组及联合治疗组VEGF表达增加, 毛细血管密度增加, 后组增加幅度显著。结论 HUCBMCs静脉移植联合阿托伐他汀治疗AMI, 提高移植细胞在心肌组织内存活率, 进一步改善心功能, 心肌梗死组织内血管再生增强可能是其联合治疗AMI疗效改善的主要机制之一。