人膀胱癌细胞论文

人膀胱癌细胞论文（精选7篇）

人膀胱癌细胞论文 第1篇

1 材料和方法

1.1 试剂及仪器

D-柠檬烯(美国Sigma公司)纯度为97%;人膀胱癌EJ细胞(北京大学泌尿外科研究所);DMEM培养液、XTT试剂盒、胰蛋白酶、小牛血清(GIBCO/BRL公司);酶标比色仪(Bio-Rad公司);显微镜(Roche公司);碘化丙啶(PI,sigma公司)流式细胞仪(FACS Calibur,美国B-D公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

在含10%小牛血清、1%谷氨酸和1%双抗的DMEM培养基T-250培养瓶中常规培养EJ细胞。

1.2.2 还原四氮唑复合物(XTT)分析

取对数生长期的EJ细胞,按每孔100mL(1X104/孔)接种于96孔板,37℃培养24h后,待细胞贴壁后,弃培养液。加入用培养液稀释成不同浓度的D-柠檬烯各100mL。稀释浓度为:0.25、0.5、1、2、4mmol/L。阴性对照为空白组和未给药组。分别于24、48、72、96h时间段,在相应的孔中加入XTT混合液,50 μL/孔,培养箱避光作用8h,吸出后用酶标仪于540nm测定吸光度(OD)值,计算细胞存活率(存活率=给药组OD值/对照组OD值×100%)。

1.2.3 细胞周期分布测定

收集经不同浓度D-柠檬烯处理的EJ细胞1×106 ,PBS 洗涤后,于旋涡混匀状态,滴入95% 乙醇,使乙醇终浓度为70%-75%,固定细胞24h 以上。离心除去乙醇,PBS 洗涤2 次,加入1%RNA 酶溶液200μL,37℃水浴30min,加入PI 100μL染色( 终浓度50μg/mL),室温孵育30min,经350目尼龙网过滤。流式细胞仪对EJ细胞DNA含量进行定量分析, 每个样品检测10000细胞事件,重复3次,结合MultiCycle DNA Analysis 软件计算分析细胞周期的分布。

1.2.4 细胞凋亡率测定

D-柠檬烯作用于EJ细胞后,按AnnexinV-FITC检测试剂盒步骤标记细胞;即胰酶消化细胞后,PBS洗涤细胞1~2次,细胞计数,用稀释后的标记缓冲液调整细胞浓度为3×105/mL。取上述780μL细胞悬液,加AnnexinV-FITC溶液20μL,于室温下孵育10 min,PBS洗细胞1次,加标记缓冲液760μL重悬细胞。加入PI 40μL,在流式细胞仪上检测细胞凋亡。

1.3 统计学处理

药物对细胞生长的抑制作用以IC50表示,采用SPSS11.5 软件分析,计算D-柠檬烯对人膀胱癌EJ细胞生长抑制作用的IC50值及95%可信限,当95%可信限不重叠,则P<0.05。

2 结果

2.1 D-柠檬烯对人膀胱癌EJ细胞增殖的影响

XTT分析发现:在2、4mmol/L浓度时EJ细胞生长受到明显抑制(表1),与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。≤1mmol/L浓度未见明显的急性细胞毒作用,因此,将1mmol/L设为48h无毒剂量。

另外,药物作用24、48、72、96h后,细胞抑制率分别为:0.25mmol/L(4.6%、5.3%、5.2%、5.7%);0.5mmol/L(4.9%、6.8%、7.3%、6.5%);1mmol/L(5.2%、9.0%、8.5%、8.4%);2mmol/L(35.0%、34.2%、35.6%、41.6%);4mmol/L(88.3%、87.8%、86.2%、87.4%)。随着药物作用时间延长,细胞抑制率虽略有升高,但差异无统计学意义(P>0.05)。通过绘制肿瘤细胞生长抑制曲线得出D-柠檬烯作用48h对EJ细胞的IC50值为2.76mmol/L。

2.2 D-柠檬烯对EJ细胞周期时相分布的影响

100μmol/L的D-柠檬烯处理EJ细胞24h,以DMSO作为对照,测定D-柠檬烯对EJ细胞周期的影响。流式细胞仪细胞周期分析显示, D-柠檬烯处理细胞后,给药组的合成期(S)细胞百分比为23.05%,而未给药的对照组为38.59%,两组比较有显著性差异(p<0.05)。另外,D-柠檬烯作用24 h后的EJ细胞出现典型的亚二倍体"凋亡峰",药物浓度越高凋亡细胞数量也越多,与对照组比较,差异有显著性意义(P<0.05)。说明D-柠檬烯可以诱导人膀胱癌EJ细胞凋亡(实验重复3次,结果一致;见图1、2)。

2.3 D-柠檬烯诱导EJ细胞凋亡的作用

不同浓度的D-柠檬烯对EJ细胞凋亡作用均较明显,凋亡与坏死共存。EJ细胞经过不同浓度D-柠檬烯处理24h后发现, D-柠檬烯以浓度依赖性方式诱导EJ细胞凋亡, 与对照组凋亡率相比均有显著性差,P<0.01 (图3,4)。随着时间的延长,坏死也逐渐增多。Annexin V荧光染色检测EJ细胞凋亡率最高为15.7%。

A: Control team; B: 24h of 0.5mmol/L D-limonene treated

3 讨论

细胞凋亡(apoptosis)即程序性细胞死亡(programmed cell death ,PCD),是区别于细胞坏死的另一种细胞死亡方式,其形态学及生物化学改变具有自身特点。大量研究表明,肿瘤的发生不仅与细胞增殖异常有关,而且与细胞凋亡异常有着密切关系[4]。因此,目前抗肿瘤的治疗研究热点便在于如何诱导和调控肿瘤细胞凋亡。细胞凋亡是在基因控制下的细胞自我消亡过程。许多实验均提示,细胞凋亡涉及基因的表达。目前已有的研究表明,与细胞增殖和癌变有关的原癌基因和抑癌基因都参与了对细胞凋亡的调控,如bcl-2, ras, p53等。

D-柠檬烯学名为1-甲基,4-异丙基环己烯,是桔皮油和柠檬油中的主要成分。D-柠檬烯为柠烯最普遍存在的异构体,是一种单萜烯类化合物。具有抗氧化、抗炎、利胆溶石等作用。近年来,人们发现D-柠檬烯可特异性地抑制farnesyl蛋白转移酶(farnesyl transferase,FTase),也是一种选择性farnesyl蛋白转移酶抑制剂(inhibitor of FTase, FTIs),它能阻断rasP21蛋白翻译后所必需的修饰,使rasP21蛋白无法锚于细胞膜上而失去活性[5]。有报道显示某些FTIs能通过Ras上调热休克蛋白70(HSP70), 而后者能促进细胞的凋亡[6],另外,通过Ras信号通路可以影响bcl-2拮抗剂(bcl-2 antagonist of cell death)BAD的活性,而bcl-2 是一种膜整合蛋白,存在于细胞中线粒体、核膜和内质网上,其在细胞内的高表达可以抑制凋亡,引起肿瘤发生[7]。且明显延长细胞的生长周期。

细胞凋亡与肿瘤的发生和抑制有着密切的关系。本研究以D-柠檬烯诱导人膀胱癌EJ细胞凋亡作用来探讨D-柠檬烯引起肿瘤细胞凋亡的机制。我们发现D-柠檬烯通过诱导细胞凋亡而抑制肿瘤的生长。Annexin V 荧光染色和流式细胞仪检测均证实D-柠檬烯可诱导EJ细胞的凋亡。近年来,人们发现D-柠檬烯具有抗癌活性[2]。目前对其抗癌作用的研究主要集中在肿瘤的化学预防方面。而针对该药的肿瘤治疗性研究尤其是对膀胱癌的治疗研究则很少见。

我们采用XTT法、流式细胞术等技术,观察了D-柠檬烯对人膀胱癌EJ细胞周期分布的影响以及诱导EJ细胞凋亡的作用,发现D-柠檬烯处理细胞后,给药组的合成期(S)细胞减少,为23.05%,而未给药的对照组为38.58%。两组比较有显著性差异(P<0.05)。我们推测D-柠檬烯激活了有关S期和G2/M期检测点的基因,从而使得EJ细胞阻滞在S期。说明D-柠檬烯可以透过细胞膜,通过对EJ细胞DNA合成的抑制来影响肿瘤细胞的生长。另外, 100μmol/L的D-柠檬烯作用细胞24h后,有显示细胞凋亡的亚G1期"凋亡峰"的出现,说明D-柠檬烯可以明显诱导EJ细胞的凋亡。而且随药物浓度的升高、作用时间的延长,凋亡细胞数目也随之增多。因此,我们认为改变细胞周期以及诱导肿瘤细胞凋亡是D-柠檬烯抗肿瘤作用的又一重要机制。

参考文献

[1]Witschi H,Uyeminami D,Moran D,et al.Chemoprevention of to-baccosmoke lung carcinogenesis in mice after cessation of smoke exposure[J].Carcinogenesis,2000,21:977-982.

[2]Kaji I,Tatsuta M,Iishi H,et al.Inhibition by d-limonene of experimental hepatocarcinogenesis in Sprague-Dawley rats does not involve p21(ras)plasma membrane association[J].Int J Cancer,2001,93(3):441-444.

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[4]杨清明,陈丽贞.细胞凋亡及其在肿瘤学的意义[J].中国肿瘤临床与康复,1997,4:1-4.

[5]Troutman J M,Roberts MJ,Andres DA,et al.Tools To Analyze Protein Farnesylation in Cells[J].Bioconjugate Chem,2005,16:1209-1217.

[6]Hu W,Wu W,Verschraegen CF,et al.Proteomic identification of heat shock protein70as a candidate target for enhancing apopto-sis induced by farnesyl transferase inhibitor[J].Proteomics,2003,3:1904-1911.

人膀胱癌细胞论文 第2篇

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 来源

人膀胱癌T24细胞株由山西医科大学寄生虫实验中心提供。瑞香狼毒购自山西省医药公司,山西医科大学药物学院进行药物提取。

1.1.2 主要试剂

RPMI-1640为赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司产品;胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产;二甲基亚砜(DMSO)为天津市科密欧化学试剂开发中心产品;丝裂霉素为日本协和发酵工业株式会社富士工厂产品;兔抗人Survivin单克隆抗体(工作液)为中杉金桥公司产品。

1.1.3 主要设备

超净工作台,相差倒置显微镜,二氧化碳恒温培养箱,水浴箱,水平离心机,全自动ELX800酶联免疫分析仪,流式细胞仪。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

将膀胱癌T24细胞复苏后接种至培养瓶,加含有10%胎牛血清和双抗的RPMI-1640培养基5 mL瓶盖微松,放置37℃,5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中,每2～3天更换培养液,待细胞生长至贴满培养瓶壁时,用0.25%胰酶消化传代。

1.2.2 MTT法检测膀胱癌T24细胞抑制率

将细胞消化、计数,将其接种至96孔培养板中,每孔5×104个细胞,容积100μL,置CO2培养箱中继续培养12 h细胞贴壁后,于96孔板中依次加入不同浓度的瑞香狼毒水提取物(0.04、0.2、1、5 g/mL)每一浓度设6个复孔,同时设一个空白组(仅加入100μL RPMI-1640培养基)和对照组(未加药物的100μL细胞悬液)。继续培养12、24、48、72 h后,每孔加入MTT试剂20μL,置CO2培养箱中继续培养4 h后弃上清,每孔加二甲基亚砜100μL置摇床上混匀,10 min后用酶标仪在490 nm发射波长下读OD数值,计算细胞抑制率。抑制率的计算:抑制率=(1-OD处理组/OD对照组)×100%。

1.2.3 细胞凋亡率的检测

将对数生长期的膀胱癌T24细胞消化、计数,种植于6孔板内,每孔1×106个细胞,容积3 mL。待12 h细胞附壁后加入不同浓度药物。实验分为对照组(未加药物的100μL细胞悬液),药物组(0.04、0.2、1、5 g/mL)每组设5个复孔,作用48 h后收集细胞,Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂进行染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4 免疫细胞化学

取对数生长期膀胱癌T24细胞,消化、计数,种植于6孔板内,每孔1×105个细胞,容积3 mL。12 h细胞附壁后加药干预,实验分为对照组(未加药物的100μL细胞悬液),药物组(0.04、0.2、1、5 g/mL)每组设5个复孔,作用48 h后进行免疫细胞化学染色,加入兔抗人Survivin单克隆抗体工作液,4℃温箱孵育过夜,次日滴加二抗(羊抗兔)、显色剂,封片后观察细胞Survivin蛋白的表达。实验以细胞胞浆或细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性结果,在显微镜下拍照并行灰度值测定。

1.3 统计学方法

应用SPSS 17.0软件对数据进行单因素方差分析,多个样本均数间两两比较采用Bonferroni法检验,计量资料采用均数±标准差表示,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法检测结果

瑞香狼毒水提取物对膀胱癌T24细胞的生长抑制作用通过MTT法检测不同浓度药物分别处理12、24、48、72 h后,测各组细胞吸光度(表1)及抑制率(表2),结果显示瑞香狼毒水提取物对该细胞株有明显的生长抑制作用,浓度越高作用,时间越长,抑制作用越明显。

注:与对照组比较,★P<0.05;每个药物浓度组与前一药物浓度组比较,△P<0.05;每个时间段与前一时间段比较,○P<0.05

2.2 凋亡率检测结果

药物组(0.04、0.2、1、5 g/mL)分别作用于膀胱癌T24细胞48 h后,细胞凋亡率分别为(11.67±2.61)%、(22.40±3.18)%、(38.29±2.30)%、(57.57±3.77)%,各组与对照组凋亡率[(1.05±0.34)%]比较差异有统计学意义(P<0.05),高浓度组与低浓度组比较差异亦有统计学意义(P<0.05)。结果显示,随着药物浓度的增高,膀胱癌T24细胞的凋亡率增加。

注:每个浓度组与前一浓度组比较,▲P<0.05;每个时间段与前一时间段比较,◇P<0.05

2.3 免疫细胞化学结果

药物组(0.04、0.2、1、5 g/mL)分别作用于膀胱癌T24细胞48 h后,经过免疫细胞化学染色、封片、显微镜下拍照后,测各组灰度值分别为(142.49±1.67)、(152.14±2.66)、(161.63±4.44)、(171.72±1.17),各组与对照组灰度值(130.84±4.99)比较,差异有统计学意义(P<0.05),高浓度组与低浓度组比较差异亦有统计学意义(P<0.05)。结果显示,瑞香狼毒水提取物作用于膀胱癌T24细胞后,下调细胞中Survivn蛋白表达,浓度越高,下调作用愈明显。

3 讨论

瑞香狼毒为瑞香科狼毒属植物,又名红狼毒、棉大戟、断肠草等,为中药狼毒之正品,有毒,用药部位为根,性味苦平,有逐水祛痰、破积杀虫之功效。现代药理学研究发现具有抗肿瘤、抗病毒、调节免疫等活性[1]。国外膀胱癌的发病率在男性泌尿生殖肿瘤中仅次于前列腺癌,在我国则占首位。目前,国内外采用综合治疗措施,药物治疗在其中发挥重要作用。国内外学者在瑞香狼毒对肺癌、肝癌、宫颈癌等恶性肿瘤的研究中取得一定成果[2,3,4],但对泌尿系统如膀胱癌细胞的抗肿瘤研究少有报道。Survivin是近年发现的细胞凋亡抑制因子,具有高度保守性和明显抵抗细胞凋亡的作用,参与调控细胞分裂、增殖等过程[5]。Survivin在除胸腺外正常组织中不表达,而在大部分肿瘤细胞中高表达[6]。Survivin基因作为一种凋亡抑制基因在膀胱癌发生、发展过程中起着重要的作用[7,8],其表达情况与肿瘤的分级、分期密切相关[9,10],可以作为膀胱癌早期诊断及判断预后的检查指标[11]。本实验研究选择人膀胱癌T24细胞株,给予膀胱癌T24细胞不同浓度瑞香狼毒处理后,观察细胞的抑制率、凋亡率以及Survivin蛋白表达的情况。结果显示:瑞香狼毒水提取物对膀胱癌T24细胞具有明显的抑制作用,具有浓度和时间依赖性。研究结果还发现瑞香狼毒水提取物促进膀胱癌T24细胞凋亡并下调Survivin蛋白的表达。

综上所述,瑞香狼毒水提取物可诱导膀胱癌细胞发生凋亡,抑制肿瘤细胞增殖,其作用机制可能与Survivin蛋白表达的下调有关。由于药物促使肿瘤细胞凋亡是通过多条途径共同作用的结果,因此需要进一步深入研究,为开辟膀胱癌临床治疗新途径提供理论依据。

摘要：目的 研究瑞香狼毒水提取物对人膀胱癌T24细胞的抑制作用及生存素(Survivin)表达的影响。方法 用不同浓度的瑞香狼毒水提取物处理T24细胞,分别用MTT法检测膀胱癌细胞抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率,免疫细胞化学检测药物作用后细胞中Survivin蛋白的表达。结果 瑞香狼毒水提取物干预细胞后,①膀胱癌T24细胞增殖受到抑制,抑制效应呈剂量依赖性并随时间的延长逐渐升高;②瑞香狼毒水提取物可以促进膀胱癌T24细胞的凋亡;③膀胱癌T24细胞中的Survivin蛋白表达下降。结论 瑞香狼毒水提取物可以通过下调Survivin蛋白的表达从而抑制膀胱癌T24细胞增殖,促进其凋亡,并具有浓度和时间依赖性。

人膀胱癌细胞论文 第3篇

1 材料与方法

1.1 实验材料 (1) 药品:消癌平注射液, 由南京圣和制药有限公司提供, 批号:Z200211281, 规格:20ml/支, 为棕黄色澄清液体。 (2) 人膀胱癌细胞株 (EJ细胞) 购自上海瑞齐生物科技有限公司。 (3) 四甲基偶氮唑蓝 (MTT) :上海生工生物工程有限公司。 (4) 胎牛血清、RPMI-1640粉:GIBCO公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:EJ细胞悬浮生长于含5%胎牛血清的RPMI-1640培养基中, 在37℃, 5%的CO2饱和湿度下培养。取状态良好、处于对数生长期EJ细胞进行实验。

1.2.2 MTT比色法检测细胞增殖:取待检细胞与培养液配成悬液, 以每孔1×105个细胞接种于96孔培养板中。实验组加入含有消癌平注射液的培养液, 使其最终药物浓度分别为1、5、10、20、30、40、50、60μl/ml, 同时设不加药阴性对照组和本底对照组 (不含细胞的等体积含相应浓度的药物培养液) , 每组设5个复孔, 每孔200μl。37℃继续孵育24h, 每孔加入MTT溶液 (5mg/ml) 20μl离心, 去上清液。每孔加入150μl二甲基亚砜 (DMSO) , 振荡溶解30min。用自动酶标仪测定490nm波长下的吸光度 (A) , 以光密度 (OD) 表示, 并计算各浓度药物组细胞生长抑制率及IC50的药物浓度。生长抑制率 (%) [4]= (1-实验孔平均OD值/对照孔平均OD值) ×100%;半抑制率 (IC50) =lg-1[Xm-i (ΣP-0.5) ]。Xm:设计的最大浓度的对数值;i:各浓度倍比浓度的对数值;ΣP:各组生长抑制率之和;0.5:经验常数。

1.3 统计学方法 采用SPSS 11.0软件对数据进行统计分析。计量资料以$\overline{x}\pm s$表示, 组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

对EJ细胞的抑制作用:不同浓度的消癌平注射液作用于体外培养的EJ细胞24h后, 用MTT法测定其对细胞增殖的抑制作用。MTT结果显示, 当消癌平注射液浓度为30、40、50、60μl/ml时, 实验组OD值均低于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。实验组生长抑制率随药液浓度的升高而升高, 计算出的IC50=54.17μl/ml。见表1。

注:与对照组比较, *P<0.01

3 讨 论

消癌平是从通关藤中提取的注射液。通关藤为萝藦科牛奶菜属植物, 主要生长在贵州、广东、广西和福建等地。植物分析消癌平主要含有多糖、生物碱和皂苷等有效成分[5]。

表1结果表明, 消癌平注射液在浓度≥30μl/ml时可以显著抑制EJ细胞的增殖, 且抑制率随浓度的升高而升高, 在一定范围内呈浓度依赖性。另有消癌平的体外实验表明, 该药对人膀胱癌细胞株有直接生长抑制作用, 作用机制与诱导肿瘤细胞株发生凋亡有关, 且凋亡峰随着消癌平作用浓度的增高而升高[6]。

总之, 消癌平对人膀胱癌细胞具有一定的抑制作用, 其作用机制有待更深入、更广泛的基础研究, 该实验也为消癌平临床用药浓度的选择提供了一定的实验基础。

摘要：目的 探讨不同浓度的消癌平注射液对人膀胱癌细胞 (EJ细胞) 体外生长的抑制作用。方法 通过四甲基偶氮唑蓝 (MTT) 法检测不同浓度消癌平注射液对EJ细胞体外生长的抑制率, 从而筛选出能够抑制EJ细胞体外生长的药物浓度。结果 消癌平注射液浓度为30、40、50、60μl/ml时对EJ细胞生长具有明显抑制作用, 实验组OD值均低于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。实验组生长抑制率随药液浓度的升高而升高, 计算出的半抑制率 (IC) =54.17μl/ml。结论 消癌平注射液浓度在≥30μl/ml时对EJ细胞体外生长有较好的抑制作用。

关键词：50消癌平,人膀胱癌细胞,EJ细胞系,抑制作用

参考文献

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人膀胱癌细胞论文 第4篇

1 材料与方法

1.1 标本制备

标本来源于7例膀胱癌患者全膀胱切除手术取下的非癌变正常膀胱全层组织(经病理活组织检查无膀胱病变),OCT包埋,恒冷切片机制作冰冻切片(厚度10μm),粘于多聚赖氨酸处理后的载玻片上,-80℃冰箱保存备用。

1.2 主要试剂与仪器

第一种I抗(兔抗人CD117多克隆抗体)购于Abcam公司,第一种Ⅱ抗(FITC异硫氰酸荧光素标记的山羊抗兔抗体)购于Santa cruz公司,第二种I抗(小鼠抗人NOS-1单克隆抗体)购于Santa cruz公司,第二种Ⅱ抗(TRITC四甲基异硫氰酸荧光素标记的山羊抗小鼠抗体)购于Santa cruz公司,磷酸盐缓冲液(PBS)、胎牛血清白蛋白(BSA)均购于上海生工公司,恒冷冰冻切片机(型号Leica cm3050s)及激光共聚焦显微镜(型号LSM 510 META,ZEISS)均由石河子大学医学院地方病与高发病实验室提供。

1.3 试验方法

冰冻切片取出后风干,100%冰丙酮液室温下(25℃)固定10 min,0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗5 min×3次,吸水纸拭去多余液体。免疫荧光染色:组织切片首先滴加1%胎牛血清白蛋白(BSA)室温下封闭30 min,弃去BSA,滴加经0.01 mol/L的PBS液稀释的两种I抗的混合液(100μL,1∶50)置入湿盒内4℃冰箱孵育过夜。次日取出湿盒(此后各步操作均需避光),组织切片用0.01 mol/L PBS液漂洗5 min×3次,滴加经0.01 mol/L的PBS稀释的两种Ⅱ抗的混合液(100μL,1∶100),室温下湿盒内避光孵育60 min,0.01 mol/LPBS液漂洗5 min×2次,双蒸水漂洗5 min×2次,吸水纸拭去多余液体,50%缓冲丙三醇封片剂封片,激光共聚焦显微镜下观察。

1.4 统计学分析

随机取3张冰冻切片,每张切片镜下随机取5个视野观察并计数CD117阳性细胞数及NOS-1阳性细胞数(由同一技术人员计数),所有数据录入SPSS 17.0统计软件分析,检验水准α=0.05,通过Kruskal-Willis H检验,得出CD117阳性细胞数在膀胱肌层的平均秩次为210.37,黏膜下层的平均秩次为171.19,黏膜层的平均秩次为92.44,并进行两两比较,发现膀胱肌层ICCs最多,黏膜下层次之,黏膜层罕见,P<0.05,差异有统计学意义;同样方法得出NOS-1阳性细胞数在肌层的平均秩次为231.45,黏膜下层的平均秩次为18 476,黏膜层的平均秩次为57.80,并进行两两比较,发现NOS-1阳性细胞数在膀胱肌层多于黏膜下层及黏膜层,膀胱黏膜层最少,P<0.05,差异有统计学意义。

2 试验结果

2.1 ICCs在膀胱组织内的分布

经FITC染色,激光共聚焦显微镜下可观察到膀胱ICCs为双极梭形细胞,胞体呈卵圆形,两级可见2个细突起,细胞膜及突起呈绿色荧光,其形态与豚鼠膀胱内ICCs类似,大多分布于肌层及黏膜下层,平滑肌肌束外围和肌内的组织间隙,膀胱顶多于其他部位,ICCs的突起连结交织形成网络。(见附图A)

2.2 NOS-1阳性细胞在膀胱组织内的分布

经TRITC染色,激光共聚焦显微镜下可见细胞浆呈红色荧光的NOS-1阳性神经元细胞成簇密集分布于膀胱肌间神经丛和肌内,并形成神经元细胞网络,轮廓较清晰,多数为DogielⅠ型神经元,胞体多为圆形和卵圆形,部分为三角形及不规则形。(见附图B)

2.3 ICCs和NOS-1细胞免疫荧光双标记染色显示

经双重染色显示细胞浆呈红色荧光的NOS-1神经元细胞(阳性),胞膜呈绿色的ICCs同时可表达NOS-1,故被染成棕黄色(阳性),CD117免疫荧光和NOS-1免疫荧光双重染色未见两种细胞有明显共表达,但发现NOS-1阳性神经元细胞多分布在ICC s及突起的周围。(见附图C)。

A:CD117免疫荧光染色观察到胞膜呈绿色的ICCs(箭头示)在膀胱组织内的分布(×200);B:NOS-1免疫荧光染色观察到的胞浆呈红色的NOS-1阳性细胞(箭头示)(×200);C:免疫荧光双重染色观察到红色的NOS-1阳性细胞(圯箭头示)和棕黄色的ICCs(→示),且NOS-1阳性神经元细胞多在ICCs附近(×200)

3 讨论

最近研究证明,ICCs是胃肠道周期性运动的基础,它具有起搏胃肠道慢波、控制电节律传导,并拥有综控胃肠道神经信息传递的功能[9,10],除此外在胃肠道中已发现含有一氧化氮合酶神经元[11],其可分泌抑制性神经递质,对胃肠运动和分泌起辅助调控作用。研究人员在前期动物实验中也发现在豚鼠膀胱中存在形态和免疫原性与胃肠道相似的ICCs,并证明其可能就是具有类似于心脏窦房结细胞功能的膀胱运动起搏细胞,而众所周知的一氧化氮(NO)作为一种独特的递质因子调节着机体多方面的功能,尤其是对于平滑肌活动的调节,例如在阴茎勃起过程中,NO信号在维持海绵体平滑肌的舒张就发挥了重要生理作用[12,13],那么在人膀胱中的ICCs及NOS-1神经元细胞在膀胱活动过程中扮演什么角色呢?故本实验使用CD117及NOS-1抗体运用免疫荧光双标记技术在激光共聚焦显微镜下观察ICCs与NOS-1阳性神经元细胞在人膀胱组织中的分布规律。

CD117是干细胞生长因子受体,也是酪氨酸激酶受体,国际通用标记ICCs的特异性抗体,NOS-1是机体内催化NO生物合成的关键限速酶,可标记一氧化氮阳性细胞,特异性远远好于NADPH-d酶组织化学间接反映NOS的方法。实验结果发现在人膀胱组织中广泛分布着CD117阳性的ICCs,尤以平滑肌肌束外围和肌束间的组织间隙为多,肌内可见ICCs之间通过突起连结形成网络化,这种分布与其肌原性的兴奋起搏作用密切相关,这与国外学者DAVIDSON RA[14]等在豚鼠膀胱中报道的分布情形类似。同时可见NOS-1阳性神经元细胞在膀胱肌间神经丛成簇大量存在,并形成神经元细胞网络,双染发现NOS-1神经元细胞多分布在ICCs的邻近周围,两者大多伴行在一起,上述结果提示NOS阳性神经元与ICCs关系密切,推测可能NOS-1神经末梢分泌出NO,向ICCs(靶细胞)发出神经信号,其可通过控制对NO的产生,进一步整合神经信号对ICCs的调控,从而起到调节膀胱活动作用。虽然未见两者细胞明显共存,双染发现ICCs同时也可表达NOS-1,被染成棕黄色,提示ICCs可能具有自分泌产生NO的功能,NO作为信使将抑制信号通过弥散作用于周围的平滑肌细胞,产生舒张作用,意味着ICCs具有将抑制性信号加强、放大作用。

尽管近年的研究普遍认定维持胃肠道电机械运动正常的生理基础是胃肠神经系统-Cajal样间质细胞-平滑肌细胞组成的基本功能单元,且有文献报道称NO可激活ICCs内可溶性鸟苷酸环化酶,引起ICCs内c GMP浓度升高,于是激活c GMP依赖性蛋白激酶,进而使ICCs内钙离子增加,并释放某种因子(可能是NO),令周围平滑肌细胞内钙离子减少,最终作用使平滑肌细胞舒张[15]。那么在人膀胱中是否也耦合了膀胱神经系统-ICCs-逼尿肌细胞三者的功能,现在还不能完全得出结论,本研究的意义在于:(1)为一步论证ICCs作为人膀胱自律活动的起搏细胞提供了形态学分布基础。(2)人膀胱组织中,一氧化氮合酶阳性神经元多分布在ICCs周围,提示ICCs可能作为NO的目标细胞,即NO对膀胱运动功能的调节可能通过ICCs来发挥效应的,为生理学及病理生理学研究正常膀胱活动及各类膀胱功能障碍性疾病提供新思路。但研究人员已知膀胱周期性的储尿、排尿功能是非常复杂的,NO作为一种特殊的生物信息分子,在中枢和外周神经系统都可以作为神经信号发挥重要的生物学作用,而且除NOS-1神经元外,膀胱中还存在其他重要神经元,如胆碱能神经元、P物质神经元、嘌呤神经元等,这些神经元释放递质作为信使对膀胱的活动也发挥着不可替代的作用。ICCs以及膀胱中的这些神经元细胞它们具体扮演的角色及分工如何,互相之间如何协调配合,有待进一步深入地研究。

摘要：目的 探讨cajal样间质细胞(ICCs)及一氧化氮合酶-1(NOS-1)神经元细胞在人膀胱组织中的分布规律及意义。方法 人膀胱全层组织冰冻切片,CD117免疫荧光结合NOS-1免疫荧光双重标记染色。结果 激光共聚焦显微镜下观察CD117表达阳性的ICCs及NOS-1阳性神经元细胞广泛分布于人膀胱组织内,发现ICCs可表达NOS-1,总体上双重染色未发现两种细胞有明显的共表达,但可见NOS-1表达阳性神经元细胞的附近存在较多ICCs。结论 人膀胱中的ICCs可能是膀胱自主节律性运动的起搏细胞,NOS-1阳性神经元细胞可能以ICCs作为靶点共同参与对膀胱舒缩活动的综控。

膀胱癌干细胞的研究进展 第5篇

关键词：膀胱癌干细胞,生物学特性,分离,治疗

膀胱癌手术治疗后易复发, 目前的研究认为是由于膀胱癌干细胞的存在。 肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSC) 是指存在于肿瘤组织及肿瘤细胞系中具有自我更新能力、 多向分化潜能并能产生异质性肿瘤细胞的细胞群体。 肿瘤干细胞理论认为,肿瘤干细胞表面存在能排出化疗药物的分子泵, 从而对化疗药物反应不敏感,与肿瘤的远处器官转移、耐药性的产生和复发均有密切关系。 只要肿瘤组织中存在少量的肿瘤干细胞,肿瘤就不可能被治愈,仍会复发。在泌尿生殖道肿瘤中, 目前仅有前列腺癌肿瘤干细胞得到成功分离和鉴定[1,2], 膀胱癌干细胞的研究也有一定的进展。

1 膀胱癌干细胞的生物学特性

1.1 膀胱癌异质性

早在1970年开始, 国外研究人员就已经发现膀胱癌肿瘤组织存在异质性,膀胱癌肿瘤组织中存在一小部分细胞能够在体外形成克隆,而其他绝大多数肿瘤细胞不具备这样的特性。

1.2 极强的致瘤 能力

虽然肿瘤干细胞的含量极低,但其具有极强的致瘤能力,易形成克隆或动物体内成瘤,具有独特的生物学特性。

1.3 自我更新并可多向分化的能力

国外学者研究将乳腺癌干细胞移植到裸鼠体内,可以生成乳腺癌全部的肿瘤组织病理类型,这说明乳腺癌肿瘤干细胞具有自我更新与多向分化的能力[3]。Gaisa等[4]利用双色酶组织化学法证实尿路上皮中细胞色素氧化酶缺陷的区域存在相同的体细胞线粒体DNA变异 ,表明这些区域是一个克隆单位 ,包含尿路上皮中所有分化阶段的细胞,此项研究证实在尿路组织中存在尿路上皮干细胞。

1.4 自我保护能力

细胞周期实验证实,肿瘤干细胞通常处于静止状态,更多的肿瘤干细胞处于细胞周期的G0/G1期,而处于S期的细胞较少,并且具有较高的DNA修复能力,表达高水平的抗凋亡蛋白, 而且过高表达ABCG2蛋白,其能将抗肿瘤药物和细胞毒素泵出细胞外,从而逃避化疗药物的杀伤作用[5,6]。

2 膀胱癌干细胞的分离筛选

早在20世纪70年代,急性髓性白血病[7]的肿瘤干细胞是最先被发现及分离出来的,陆续地又有9种人类肿瘤干细胞被成功分离鉴定,但至今仍有大部分肿瘤干细胞还未被成功分离鉴定,其中包括膀胱癌肿瘤干细胞。 国内有学者证实了膀胱癌初始细胞EMACD44v6+细胞具有膀胱癌干细胞的特性 ,间接地证明存在膀胱癌干细胞,但其仍没有成功得到分离鉴定[8]。但研究者们从未放弃对膀胱癌干细胞的分离及鉴定的探索,并已取得了一定进展。

通常分离肿瘤干细胞的方法有三种。 第一种是利用干细胞表面标志物,应用流式细胞仪和免疫磁珠分选法进行肿瘤干细胞的筛选,这种肿瘤干细胞分离方法也是最常用的,然而膀胱尿路上皮癌没有特定的干细胞表面标志物[9]。Chan等[10]利用Lineage-CD44+CK5+CK20-标志物从原代膀胱癌细胞中成功分离出膀胱癌启动细胞(bladder cancer-initiating cell),在小鼠体内形成移植瘤仅需要1×102~1×103个CD44+肿瘤细胞,并且能促进膀胱癌的进展。 Yang等[8]研究利用干细胞表面标志物发现, 膀胱癌组织中存在的CD44v6+EMA-MUC-细胞可能是膀胱癌干细胞。Tatokoro等[11]也通过实验证实, 膀胱移行细胞癌5637细胞株中的CD44+细胞亚群具有膀胱癌启动细胞的相关特征,对化疗药物顺铂产生更强的耐药抵抗力,并且表达更高的Akt和ERK分子致瘤性信号通路, 使用热休克蛋白90(HSP90)信号通路抑制剂可以显著提高膀胱癌启动细胞对化疗药物顺铂的敏感性。 学者Su等[12]利用乙醛脱氢酶1(ALDH-1)从膀胱移行细胞癌组织中分离膀胱癌干细胞, 发现ALDH-1的表达与膀胱癌患者特异性生存率和总生存率呈负相关。 Atlasi等[13]在2007年首次报道了在膀胱癌细胞中存在高表达OCT-4干细胞标志物。 Xu等[14]研究证实,膀胱癌组织中有少量能用全能干细胞标志物OCT-4成功标记的OCT-4阳性膀胱肿瘤细胞, 这些OCT-4阳性肿瘤细胞被认为可能是膀胱癌干细胞。 但是,这个全能干细胞表面标志物OCT-4并不是膀胱癌干细胞所特有的。 所以试图利用肿瘤干细胞表面标志物成功分离出膀胱癌干细胞的方法需要进一步探索研究。

第二种是利用无血清培养基(serum-free medium,SFM)即普通干细胞的培养基的方法分选膀胱癌干细胞,因胎牛血清中有促进干细胞分化的营养成分,为了避免肿瘤干细胞分化,采用无血清培养基分离肿瘤干细胞。 肿瘤干细胞易呈悬浮球或微球体生长,并且可以连续传代培养, 形成的肿瘤微球体与亲代肿瘤球具有相同的细胞生物学特性。 有研究者发现,利用无血清培养基培养脑神经胶质瘤的肿瘤干细胞时,可以筛选、扩增并形成癌细胞球或微球体[15,16], 但同时这种方法会有大量的非肿瘤干细胞混入, 致使分离出的肿瘤干细胞亚群纯度不高, 这也只能作为分离筛选肿瘤干细胞的辅助方法。 曹正国等[17]从膀胱肿瘤组织中采用无血清悬浮培养法成功分离培养获得膀胱癌干细胞样细胞,其高表达PIWIL12蛋白。 宁志丰等[18]也利用无血清悬浮培养从膀胱癌T24细胞株中分离出微球体, 并验证这些微球体有肿瘤干细胞的特点。

最后一种则是利 用流式细 胞仪分离 侧群细胞(SP)的方法。目前的研究认为,侧群细胞是具有一定干细胞特性的一类细胞亚群,能够有效地从细胞内泵出Hoechst 33342染料而不被染色的一小群细胞 , 普通正常细胞表面因没有相关转运蛋白而被染色,特别适用于没有特异性干细胞表面标志物的肿瘤干细胞筛选[19]。 Ning等[20]在2009年首次报道利用流式细胞术在3种膀胱移行细胞癌细胞系EJ、UM-UC-3、T24中筛选侧群细胞,最后仅在膀胱癌细胞株T24中发现了34.7%的侧群细胞, 且这些筛选出的侧群细胞中的绝大数处于细胞周期的G0/G1期、 具有更强的生长增殖能力和克隆形成能力,对放疗及化疗均不敏感。 但是,肿瘤干细胞理论认为,肿瘤干细胞在普通肿瘤细胞系中的比例小于10%,因此这种筛选侧群细胞的方法仍不合适于用来分离膀胱癌干细胞,但至少,这也能说明膀胱癌T24细胞中可能含有膀胱癌干细胞,是研究膀胱癌干细胞较好的细胞模型。

虽然,目前利用以上三种实验方法都无法成功分离出膀胱癌干细胞。 但上述研究成果为以后实验进行人膀胱癌干细胞样细胞的分离和鉴定提供了重要的理论基础和实验方法。 在2009年Tan等[21]率先利用化疗药物在小鼠荷瘤模型中分选出肝细胞癌肿瘤干细胞后,国内有学者也开始利用化疗药物丝裂霉素C从膀胱癌移行细胞癌T24细胞株中筛选耐药细胞,验证发现, 剩余存在7.5%的耐药细胞可能是膀胱癌干细胞[22]。 Zhang等[23]用高浓度化疗药物顺铂筛选出的耐药细胞被证实是膀胱癌干细胞样细胞。 这也为进行化疗药物结合无血清培养基技术分选出膀胱癌干细胞样细胞提供了实验依据。

3 膀胱癌干细胞的治疗

肿瘤干细胞理论可以解释临床上应用化疗药物或和放射线治疗肿瘤细胞的效果不理想的原因。 普通的肿瘤细胞具有很强的增殖能力,持续地进行细胞增殖,常规的化学药物治疗或和放射治疗能大量杀伤处于细胞周期增殖阶段的肿瘤细胞。 但肿瘤干细胞具有较强的自我更新能力,且多数肿瘤干细胞处于细胞周期的静止期,其细胞表面具有分子泵相关蛋白,这些肿瘤干细胞表面的分子泵蛋白与正常干细胞一样拥有排出化疗药物的功能,导致对化疗药物不敏感。 所以肿瘤干细胞与正常干细胞都具有抵御化疗与放射治疗的能力[24]。 从而使肿瘤干细胞自身逃逸了化疗药物毒性和放射线的杀伤。 虽然如此,但研究人员没有放弃抗肿瘤干细胞药物的研发,针对肿瘤干细胞的化疗药物已经有了一定的发展。 Gupta等[25]利用肿瘤干细胞成功筛选出抗乳腺癌的高效抗癌药, 研究发现,某些药物能够有选择性地杀伤乳腺癌干细胞,如盐霉素药物作用乳腺癌干细胞时,能导致乳腺癌干细胞某些基因表达缺失,从而起到杀伤作用。 Chan等[10]研究发现,免疫球蛋白样跨膜整合素相关蛋白(IAP/CD47)几乎在所有的膀胱癌细胞中表达,且CD47在膀胱癌干细胞表达显著增高。 使用单克隆抗体阻断CD47信号通路可以在体外诱导巨噬细胞对膀胱癌细胞的吞噬作用。由此,CD47可能成为膀胱癌干细胞的一个潜在的治疗靶点。 目前肿瘤干细胞靶向治疗的研究主要集中在表面标志物和相关信号传导途径的小分子抑制物[26],而靶向治疗联合传统治疗对肿瘤干细胞将可能会有更好的疗效。

4 结语与展望

人膀胱癌细胞论文 第6篇

白细胞介素-8 (interleukin-8, IL-8) 是一个多功能、多细胞来源的趋化性细胞因子。它可以刺激肿瘤细胞增殖, 诱导肿瘤细胞移动, 并且作为肿瘤血管发生因子, 加速新生血管的形成, 进而促进肿瘤的发生发展和转移[4]。作为膀胱癌干细胞的重要标志物, CD44阳性表达 (CD44+) 的膀胱癌细胞成瘤的潜力比CD44-的细胞大10~200倍, 故而可以将CD44+的细胞视为膀胱癌干细胞[5]。通过对比CD44-膀胱癌细胞, 研究人员发现CD44+膀胱癌细胞高表达IL-8。本研究就在此基础上, 进一步探讨IL-8在对CSC干细胞特性的维持及其在抗化疗过程中的作用, 为IL-8治疗靶点价值提供可靠的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞

T24细胞系, 来自中国医学科学院细胞中心。培养于含10%胎牛血清、100 U/m L青霉素及100μg/m L的DMEM培养基中, 细胞在相对湿度为95%、37℃、5%二氧化碳的环境中单层生长, 每3天换液传代1次, 取对数生长期的细胞用于实验。

1.1.2材料

Oct4、Bmi1、Notch1、Sox2、Nanog、ABCG2、β-actin、IL-8和CD44引物, sh Ctrl与sh IL-8质粒, 荧光定量PCR试剂盒, 均购自北京康为世纪生物科技有限公司公司;PBS、DMEM培养基、胰酶, 购自Invitrogen公司;CD44、CK5、ABCG2和β-actin抗体, 购自BD公司;相应二抗, 购自Santa Cruz公司;阿霉素、长春新碱, 购自Sigma公司;CCK8试剂盒, 购自同仁化工。

1.2 方法

1.2.1 流式分选

CD44+膀胱癌干细胞:胰酶消化T24细胞, PBS洗3次后, 加入终浓度为1μg/m L的CD44抗体, 4℃孵育20 min。PBS洗3次, 加入终浓度为1∶200的荧光二抗, 4℃孵育20 min。PBS洗3次, 上流式细胞仪进行分选。收获CD44+的T24干细胞, 加至含有EGF与β-FGF的无血清F12培养基进行培养。

1.2.2 实时荧光定量PCR验证

CD44+与CD44-表达差异:常规提取细胞总RNA, 反转录成c DNA, 以β-actin作为内参, 分别采用Oct4、Bmi1、Notch1、Sox2、Nanog、ABCG2、β-actin、IL-8和CD44引物, 进行实时荧光定量PCR。

1.2.3 获取RNA稳定干扰IL-8的CD44+的T24干细胞

分别将sh IL-8与sh Ctrl质粒转染至CD44+的T24干细胞。48 h后, 加入终浓度为1μg/m L的嘌呤霉素进行筛选。2周后, 收集相应的细胞, CD44+sh IL-8-T24细胞和CD44+sh Ctrl-T24细胞。

1.2.4 流式检测CD44+sh IL-8和CD44+sh Ctrl的T24细胞中CD44的表达量

加入终浓度为1μg/m L的CD44抗体, 4℃孵育20 min。PBS洗3次, 加入终浓度为1∶200的荧光二抗, 4℃孵育20 min。PBS洗3次, 上流式细胞仪进行检测。

1.2.5 Western blot检测分选细胞的干细胞特征

常规裂解细胞, 抽提总蛋白, β-actin作为内参, 用CD44、CK5、ABCG2抗体进行免疫印迹, 检测相应靶蛋白的表达量。

1.2.6 细胞集落形成实验

将CD44+sh IL-8和CD44+sh Ctrl的T24细胞, 分别加至含有EGF与β-FGF的无血清F12培养基进行培养。1周后显微镜观察, 拍照。

1.2.7 IC50检测

将CD44+sh IL-8和CD44+sh Ctrl的T24细胞, 按10 000个/孔铺至96孔培养板, 同时分别加入浓度梯度的阿霉素 (0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2及6.4μg/m L) 和长春新碱 (1、2、4、8、16、32、64及128 ng/m L) , 48 h后, 用CCK8试剂盒检测细胞的IC50。

1.3 统计学分析

实验数据采用SPSS 11.0软件进行统计学分析, 采用Student t检验, P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD44+膀胱癌细胞与CD44-膀胱癌细胞中IL-8的表达差异

流式分选CD44+与CD44-的T24非干细胞, 取最强表达的5%定义为干细胞特征细胞, 最弱表达的5%为非干特征细胞。将这两种细胞进行real-time PCR验证, 发现IL-8在CD44+T24细胞中高表达, 是CD44-T24细胞的4.8倍 (图1) 。

2.2 IL-8沉默对T24细胞的CD44表达的影响

对比构建的CD44+sh IL-8-T24和CD44+sh CtrlT24细胞, real-time PCR显示, IL-8的表达降低了80% (图2) 。更有趣的是, 在IL-8被干扰后, 两种细胞CD44的表达也发生了变化:real-time PCR显示CD44+sh IL-8-T24细胞中CD44 m RNA表达下降了60% (图2A) ;同时流式检测也显示干扰IL-8后, CD44的平均荧光强度降低了50% (图2B) 。

2.3 IL-8沉默对肿瘤细胞的干细胞特性的影响

Real-time PCR的结果显示:CD44+细胞在IL-8被敲低后, 干细胞特性相关的转录因子 (Oct4、Bmi1、Notch1、Sox2、Nanog) 与耐药基因 (ABCG2) , 表达量降低 (图3A) ;具有黏附功能的蛋白CD44与CK5的表达也显著降低 (图3B) 。细胞集落形成实验也表明:IL-8被敲低后, 细胞单个分散, 无法聚集成干细胞团 (图4) 。

2.4 IL-8沉默对化疗药物的敏感性影响

IL-8被敲低后, 阿霉素对细胞的IC50降低了43% (CD44+sh Ctrl-T24的IC50=2.43μg/m L, CD44+sh IL-8-T24的IC50=1.39μg/m L) (图5A) ;长春新碱对细胞的IC50降低了40% (CD44+sh Ctrl-T24的IC50=21.6ng/m L, CD44+sh IL-8-T24的IC50=12.9ng/m L) (图5B) 。在耐药机制中起重要作用的蛋白ABCG2 (ABC多药转运蛋白G家族成员2) 蛋白水平也明显降低 (图5C) 。

†与sh Ctrl相比, P<0.01

1) 与sh Ctrl相比, P<0.05, 2) 与sh Ctrl相比, P<0.01

A:sh Ctrl;B:sh IL-8

3 讨论

肿瘤干细胞 (cancer stem cell, CSC) 的概念早在20世纪60年代就已提出:CSC是一小群能够再现肿瘤全部特点的细胞。最近10年研究人员通过对急性髓性白血病[6]、乳腺癌[7]、脑肿瘤[8]等研究, 提出了肿瘤干细胞 (CSC) 理论。该理论认为, CSC是肿瘤形成的起始细胞并维持着肿瘤生长, 是肿瘤复发和转移的根源。肿瘤的治疗应该针对CSC, 只有杀死全部CSC才能最终治愈肿瘤, 即使肿瘤体积没有缩小, 由于其他细胞增殖能力有限, 肿瘤也将逐渐退化萎缩[9]。CSC理论为肿瘤的发病机制和靶向治疗开辟了崭新的方向。鉴于CSC的特点, 膀胱癌中CSC的分离以及分子特征的明确对理解膀胱癌的病理发生及筛选药物靶点很有意义。但是CSC在全部肿瘤细胞中所占比例极低, 很难获得数量充足的CSC对其进行深入研究。因此, 从相应类型的肿瘤细胞系中分离CSC并进行培养是CSC研究的首选。

KEITH等[10]使用与正常膀胱基底细胞表面标志CD44蛋白, 从原代膀胱癌细胞中成功分离出膀胱癌启动细胞 (bladder cancer initiating cell) , 100~1000个CD44+肿瘤细胞能够在免疫缺陷小鼠形成异种移植瘤, 而至少 (2~5) ×104个CD44-肿瘤细胞才能形成肿瘤。TATOKORO等[11]证实膀胱移行细胞癌细胞株5637中CD44+细胞亚群有膀胱癌启动细胞的特征, 对顺铂有更强的抵抗能力, 表达更高的Akt和ERK致瘤性信号通路, 越来越多的证据支持CSC对放疗[8]和化疗[7]有更强的抵抗能力。因此, 联合传统治疗对CSC进行靶向治疗将会产生更好的疗效。

鉴于此, 在此次实验中, 研究人员通过流式细胞技术筛选出CD44+的T24细胞, 并通过与CD44-的T24细胞分析发现, IL-8高表达于CD44+的T24细胞, 是CD44-的T24细胞的4.8倍。IL-8最早发现于细菌脂多糖 (LPS) 刺激后的单核/巨噬细胞上清液中, 故有“单核细胞源粒细胞趋化因子”、“粒细胞激活因子”、粒细胞激活肽或“T细胞趋化因子”之称。在乳腺癌[12]和大肠癌[13]中, IL-8均是维持CSC特性的重要细胞因子。那IL-8是否是作用于膀胱癌CSC的靶点呢?

笔者通过进一步的研究发现验证了以上假设。结果显示, IL-8与膀胱癌的干细胞特性维持密切相关。在CD44+T24细胞敲低IL-8后, CD44的m RNA和蛋白水平均明显表达降低。除了CD44蛋白外, 干细胞的特性与许多转录因子密切相关。比如Oct4、Bmi1、Notch1、Sox2、Nanog, CD44+细胞中这些因子均有较高的表达[5]。本次研究发现在干扰IL-8后, CD44+细胞中这些干细胞特性维持因子的表达也显著下降, 这就降低了癌细胞的集落形成能力, 从而抑制了肿瘤细胞的成团生长。

除去能够促进成瘤外, CSC同样在肿瘤抵抗化疗药物的过程中发挥重要作用[14]。同时发现, IL-8对于维持CD44+细胞的耐药特征也具有积极的意义。干扰IL-8后, 这些细胞对化疗药物阿霉素和长春新碱的敏感性均得到明显增强, 这可能与癌细胞中耐药基因ABCG2的显著下降有关。

人膀胱癌细胞论文 第7篇

1 材料与方法

1.1 主要试剂

胎牛血清(美国Hyclon公司),RPMI-1640和CCK-8试剂盒(美国Sigma公司),Transwell小室(美国Corning公司),雷洛昔芬(美国Sigma公司)

1.2 细胞株培养和药物干预分组

人膀胱癌细胞株RT4(上海复祥生物科技有限公司),依据参考文献[4]进行培养:RPMI1640培养液(含10%胎牛血清),每3d换液。取3代RT4细胞制成单细胞悬液(4×105/ml),分为空白对照组(未加药物),雷洛昔芬低剂量组(1 nmol/L),雷洛昔芬中剂量组(10 nmol/L),雷洛昔芬高剂量组(100 nmol/L)[2]。

1.3 CCK-8法检测

取各组单细胞悬液种植于96孔中国培养板(每孔100μl),培养48h后每孔加入10μL的CCK-8溶液,常规CCK-8法检测,酶联免疫检测仪上测定每孔的吸光度值(OD490)。

1.4 Transwell小室检测

在Transwell小室上室内加入各组单细胞悬液(4×105/ml),依照说明书进行检测,100倍视野下5个视野,计数穿过小室的细胞数目以评估RT4细胞迁移能力。

1.5 统计学处理

采用SPSS 11.5软件进行分析,结果以表示,各组间比较用LSD分析,P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 雷洛昔芬对RT4细胞增殖的影响

培养48h后,与空白对照组相比,雷洛昔芬各干预组能够显著抑制RT4细胞增殖(P<0.01),其中雷洛昔芬高剂量组较中剂量组和低剂量组抑制更为显著(P<0.05),其抑制作用呈浓度依赖性(图1)。

注:*与对照组比较,P<0.01;△与低剂量组比较,P<0.05.

2.2 雷洛昔芬对RT4细胞迁移的影响

Transwell迁移实验结果显示:与空白对照组相比,雷洛昔芬各干预组穿膜细胞数目明显减少(P<0.01),其中雷0洛昔芬高剂量组较中剂量组和低剂量组穿膜细胞数目减少更为显著(P<0.01)(图2)。

3讨论

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,在我国泌尿生殖系统恶性肿瘤中发病率居第一位,其中近90%患者为膀胱上皮癌,尽管相关治疗如经尿道膀胱切除术和膀胱内化学药物治疗已取得了较大的进展,但复发率仍高达30%～80%[3],因此,开发新的有效治疗膀胱癌方法已显得尤为迫切。

雌激素受体ERα和ERβ是调节不同细胞增殖、分化和凋亡的重要转录因子,具有特定的基因编码,这些受体在结构上包含N氨基末端依赖配体的转录激活区-1和位于C羧基端激活依赖配体的转录激活区-2。正常的膀胱上皮组织可检测ERβ表达。ERβ在膀胱癌组织中阳性表达高于75%,并与膀胱癌转移和复发正相关,因此有研究者[5]认为ERβ可能是治疗膀胱癌的新靶点。

新一代选择性雌激素受体调节剂雷洛昔芬目前临床上已用来治疗ERa阳性的乳腺癌,还应用于雌激素受体ERβ阳性的恶性肿瘤如肺癌、结肠癌和前列腺癌等的治疗[6]。但雷洛昔芬对ERβ阳性表达的膀胱癌作用尚不明确。本研究发现与对照组比较,雷洛昔芬干预组能够显著抑制膀胱癌RT4细胞增殖,并具有浓度依赖性,Transwell小室也观察到雷洛昔芬干预组穿膜的RT4细胞数目明显减少,且高剂量组更为明显,证实了雷洛昔芬能够抑制RT4细胞增殖和迁移能力。因此推测其机制可能与雷洛昔芬与膀胱癌ERβ同源的配体竞争拮抗雌激素活性,通过雌激素依赖或不依赖的方式抑制雌激素作用,进而抑制相关膀胱癌细胞增殖和迁移,但其具体作用机制仍有待于进一步研究。

摘要：目的 探讨雷洛昔芬对膀胱癌RT4细胞增殖和迁移的影响。方法 CCK-8法检测雷洛昔芬对RT4细胞增殖的影响,Transwell法检测雷洛昔芬对RT4细迁移能力的影响。结果 与空白对照组相比,雷洛昔芬干预组RT4细胞增殖显著降低(P<0.05),RT4细胞穿膜细胞数目明显减少(P<0.05),成明显剂量依赖性。结论 雷洛昔芬能够抑制RT4细胞增殖和迁移能力。

关键词：雷洛昔芬,RT4细胞,增殖,迁移

参考文献

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