细胞毒素范文

细胞毒素范文（精选8篇）

细胞毒素 第1篇

研究人员把碳纳米管植入DNA分子内制成传感器, 以便置入活细胞内。这种碳纳米管传感器可以探测多种特定的损害DNA的物质, 比如某些毒素分子、自由基以及一些癌症化疗药物分子。它能定位这些分子在细胞内的准确位置, 尤其对于过氧化氢这种氧化剂, 其探测精度可以达到单个分子。

美国麻省理工学院研究小组开发的传感器将成型的碳纳米管与DNA包裹在一起, 使其能与细胞内损伤DNA的“代理”相结合。该传感器能发出可在近红外线光谱附近被探测到的荧光, 因为人体组织在这个光谱内不会发光, 纳米管因此显得很突出。

当传感器同细胞内的DNA相互作用时, 光信号发生变化, 这些变化能够帮助研究人员识别特定的分子。因为该传感器被涂在DNA内, 它们能够被安全地注射进活细胞内。最终, 细胞吞噬掉涂层表面的蛋白质, 探测器就能“脱颖而出”。

细胞毒素 第2篇

-对连年发生比较严重水华的官厅水库进行了2 a的浮游植物动态监测,并在206-8月应用酶联免疫吸附法检测了主要水华藻类--铜绿微囊藻藻毒素质量浓度及其季节变化,初步探讨了微囊藻毒素质量浓度与铜绿微囊藻细胞密度之间的.关系.实验结果表明,水库中的浮游植物细胞密度高,平均值为1 308.35×104 cells/L,年达1 599.49×104 cells/L,同时呈现出明显的季节变化,在夏末秋初形成高峰.产毒的铜绿微囊藻为夏季最主要的优势水华种类,其细胞密度在7月达到最高,为4 748.58×104 cells/L;微囊藻毒素的质量浓度在7月亦达到最高值,为20 μg/L,都显著高于6月和8月(p<0.05).水体中微囊藻毒素质量浓度与微囊藻细胞密度呈正相关关系(R=0.926).其结果为全面了解官厅水库水质状况以及对水污染进行治理,恢复其饮用水源的功能提供了科学依据.

作 者：张娟 梁前进 周云龙 包智泓 李启军 ZHANG Juan LIANG Qian-jin ZHOU Yun-long BAO Zhi-hong LI Qi-jun 作者单位：张娟,梁前进,周云龙,ZHANG Juan,LIANG Qian-jin,ZHOU Yun-long(北京师范大学生命科学学院,北京,100875)

包智泓,李启军,BAO Zhi-hong,LI Qi-jun(北京市水利科学研究所,北京,100044)

细胞毒素 第3篇

1 材料与方法

1.1 材料

无菌条件下取健康成人外周血20 ml,Ficoll淋巴细胞分离液(美国康宁公司),达尔伯克必需基本培养基(dulbecco's minimum essential medium,DMEM)/F12 培养基(美国Gibco公司),胎牛血清(美国Gibco公司),血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)(美国Pepro Tech公司),碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)(美国Pepro Tech公司),藻红蛋白(Phycoerythrin,PE)标记的CD31(美国BD公司),异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的血管假性血友病相关因子(von Willeband factor,v WF)(美国Abcam公司),脂多糖(美国Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 PBMCs的提取

无菌条件下取健康成人外周血20 ml,肝素抗凝后,磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline,PBS)液双倍稀释,将稀释后的细胞加入等体积Ficoll淋巴细胞分离液表层,室温下水平2 000 r/min离心25 min,吸取中间浑浊的云雾状的灰白色层,即为外周血单个核细胞层。DMEM/F12培养液洗涤2次,室温下分别2 000和1 500 r/min离心10 min,弃上清液,获取外周血单个核细胞。

1.2.2 PBMCs诱导分化

将离心后的细胞加入至含有10μg/L VEGF、10μg/L b FGF以及体积分数为20%胎牛血清的DMEM/F12培养基,吹打计数后移至培养瓶中,置于37℃、5%饱和湿度的二氧化碳CO2培养箱中,第3天更换细胞培养液,去除未贴壁的细胞,倒置相差显微镜下观察细胞的生长。

1.2.3 PBMCs分组

诱导分化72 h后,各实验组中分别加入不同浓度(0.01、0.10、1.00和10.00μg/ml)的LPS,对照组不加LPS,分别做好标记,继续培养。

1.2.4诱导后的细胞鉴定

(1)细胞形态学观察。在倒置相差显微镜下对各组细胞进行形态学观察,并对比诱导添加生长因子前后以及加入LPS干预后细胞形态及生长的变化,观察是否有铺路石样改变。(2)细胞表型检测。诱导分化20 d后,取贴壁细胞,予以0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液,各管中加入PE标记的CD31抗体,4℃避光孵育15 min;FITC标记的v WF抗体同样条件下孵育30 min;CD31、v WF双标记为先加入PE标记的CD31,避光孵育15 min后加入FITC标记的v WF避光孵育30 min,流式细胞术检测。所有实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0 统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,用方差分析,P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态学变化

倒置相差显微镜下,新分离的PBMCs细胞呈小圆形,培养24 h后部分细胞开始贴壁,细胞胞体开始变大,透亮度也增加。随着培养时间推移,细胞可见伪足样突起伸出,细胞拉长呈梭形的内皮样细胞并保持贴壁生长,开始出现细胞集落。诱导分化20 d后,贴壁细胞开始出现融合(见图1A~D)。在培养过程中,部分细胞一直保持小圆形,且不贴壁生长,换液后弃除。

2.2 诱导分化后细胞表面标志鉴定CD31、v WF阳性细胞和CD31/v WF双阳性细胞

流式细胞术检测结果(右上象限)显示,对照组、0.01、0.10、1.00 和10.00μg/ml LPS组表达CD31/v WF双阳性细胞数所占百分比分别为58.30%、69.10%、55.33%、29.80%和16.80%(见图2)。不同浓度LPS对BPMCs向内皮细胞分化的作用比较见附表。与对照组比较,0.01μg/ml LPS组CD31/v WF双阳性细胞数明显增加,差异有统计学意义(P =0.025),而0.10μg/ml LPS组CD31/v WF双阳性细胞数无明显变化,差异无统计学意义(P =0.277),1.00 和10.00μg/ml LPS组CD31/v WF双阳性细胞数明显减少,差异有统计学意义(P =0.011 和0.000)(见图3)。

A:外周血分离获取PBMCs培养的第1天,细胞呈小圆形(×100);B:培养第5天,PBMCs以集落形式贴壁生长,可见伪足样突起(×40);C:0.01μg/ml LPS干预组诱导分化后第20天(×250);D:对照组诱导分化第20天(×250)

(%,±s)

3 讨论

外周血单个核细胞是指外周血中细胞核为单个的一群混合性,其内存在能分化为血管内皮细胞的前体细胞———内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)。PBMCs治疗缺血性疾病的机制主要包括2方面:(1)EPCs能够参加缺血组织的血管形成;(2)PBMCs能够产生多种细胞因子和生长因子诱导血管的发生。本实验的外周血来自于健康成人,通过密度梯度离心法分离提取PBMCs,再添加细胞因子VEGF和b FGF在DMEM/F12 培养基内诱导分化。从未添加LPS干预的对照组中,笔者观察到新分离的PBMCs呈小圆形,24 h后可见细胞呈贴壁生长,继而细胞体积变大,可见伪足样突起,细胞呈现梭形并形成细胞集落,最后细胞呈铺路石样生长,部分细胞融合,与国内外文献报道的内皮细胞演化过程相同。流式细胞术检测结果显示,诱导分化后细胞表达CD31/v WF双阳性细胞数受LPS的影响,差异有统计学意义。CD31 即血小板内皮细胞黏附分子-1,主要在血管内皮细胞中表达,同时在血小板、巨核细胞、浆细胞、中性粒细胞中弱表达,存在于早期内皮细胞的边缘,体现内皮细胞间接触并诱导胞内信号的传递,是目前公认的特异性内皮细胞标志物[1,2]。v WF即为血管假性血友病相关因子,主要在内皮细胞内合成并释放一种多聚体糖蛋白,可储存在内皮细胞的Weibel-palade小体中,仅在内皮细胞和少量血小板中表达,v WF是凝血因子Ⅷ的载体蛋白,与凝血因子Ⅷ结合后,以复合体的形式存在于外周循环血液中,在血小板黏附于内皮下组织的过程中发挥重要的作用,被认为是鉴定内皮细胞的特异性标志物[3]。本实验对诱导分化后的PBMCs从细胞形态学和细胞表面特异性标志两方面进行鉴定,证实最后所分化的细胞为内皮细胞。

研究显示,大部分缺血性疾病如糖尿病患者体内的EPCs数量较正常人明显减少[4,5],其黏附能力、细胞形成集落以及增殖能力降低[6]。临床发现,患者的血糖和胰岛素水平、氧化应激、感染等微环境因素会干扰细胞的生长,使PBMCs移植治疗糖尿病足的临床疗效受影响。虽然鲜有文献报道感染与干细胞移植的相关性,但笔者从临床部分病例发现,糖尿病足合并感染尤其是革兰阴性菌感染时,干细胞移植的临床疗效无法令人满意。目前,关于内毒素对PBMCs分化、增殖及凋亡等生物特性的影响及其机制还不十分清楚。

内毒素是革兰阴性菌细胞壁外膜的重要组成成分,化学成分为脂多糖,包括脂质A、核心多糖和O抗原3 个组成部分。在细菌生长繁殖的各个阶段及菌体自溶或被裂解时,LPS会从细菌外膜上脱落下来并释放到周围介质中,导致机体代谢、激素水平和神经内分泌的改变,最终可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等一系列病理反应[7]。研究显示,LPS主要通过细胞表面Toll样受体4(toll-like receptors 4,TLR4)结合,激活TLR4 介导的信号传导通路,再通过My D88 依赖性通路最终激活核转录因子-κB (nuclear transcription factor-κB,NF-κB),最后通过NF-κB表现出不同的生物学活性。有研究报道,LPS可通过TLR4 激活癌细胞内Wnt信号通路,促进细胞增殖及肿瘤的发生[8]。但也有研究发现,LPS可通过分泌具有细胞毒作用的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、白介素-1(Interleukin-1,IL-1)等抑制肿瘤细胞的生长,并诱导一氧化氮NO产生,后者能促进肿瘤细胞发生凋亡。还有研究报道,适量LPS可与间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)表面TLR4 结合,进而促进MSCs增殖并提高MSCs移植效率以及抑制氧化应激引起的MSCs凋亡[9,10]。

NF-κB属于Rel家族的转录因子,激活的NF-κB可参与许多基因的转录与调控,在感染、炎症反应、细胞免疫、氧化应激、细胞增殖及凋亡的病理生理过程中发挥重要的作用。具体机制为NF-κB活化后,通过调控多种细胞因子的转录,产生和释放TNF-α、IL-1、IL-6 等炎症因子,该炎症因子除可直接作用于细胞,引起细胞凋亡与坏死外,还能激活其他细胞因子,从而激活整个细胞因子网络结构,引发全身炎症反应综合征;活化后的NF-κB也能参与多种凋亡相关基因的转录调控,具有抑制细胞凋亡和促进细胞凋亡的双重作用[11];此外研究还发现,NF-κB能够引起VEGF、类胰岛素一号增长因子、b FGF、TNF-α、IL-1α、IL-6、IL-8 等血管形成因子的表达增加[12,13,14],进而参与细胞的增殖与分化过程。本研究中,在低浓度LPS(0.01μg/ml)作用下可有效地促进BPMCs分化为VECs,随着LPS浓度进一步增加,对PBMCs的分化呈现抑制作用。笔者推断,该双相效应的原因可能为不同浓度LPS(0.01μg/ml)微环境下激活NF-κB的亚单位和数量不同,但其具体机制有待进一步研究。

综上所述,高浓度LPS是影响PBMCs分化的因素之一,与临床革兰阴性菌感染的糖尿病足患者干细胞移植疗效欠佳结果一致。本研究发现,LPS对PBMCs向内皮细胞分化的作用呈一定的剂量依赖性,低浓度时可表现出促进作用。因此,控制微环境中LPS浓度可提高PBMCs的移植效率,为PBMCs移植时机的掌握提供实验依据。另外,本研究提示,通过体外低浓度LPS预处理干细胞,可作为提高干细胞移植效率的一种新手段。

摘要：目的观察不同浓度脂多糖(LPS)对外周血单个核细胞(PBMCs)体外向血管内皮细胞分化的影响。方法取健康成人PBMCs,以血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)进行诱导,加入不同浓度的LPS干预处理,倒置相差显微镜下观察PBMCs的形态改变,流式细胞术检测细胞表达CD31和血管假性血友病相关因子(vWF)。结果体外培养的PBMCs呈贴壁生长,诱导培养后,经历小圆形→梭形→扁平细胞的演变过程。与对照组比较,0.01μg/mlLPS组最后形成的梭形细胞数增加,随着LPS浓度进一步增加,细胞数呈递减趋势。流式细胞术检测结果显示,与对照组比较,0.01μg/mlLPS组,CD31/vWF双阳性细胞数明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);0.10μg/mlLPS组CD31/vWF双阳性细胞数无明显改变(P>0.05);随着LPS浓度进一步增加,CD31/vWF双阳性细胞数呈减少趋势,差异有统计学意义(P<0.05)。结论0.01μg/mlLPS能最大限度地促进PBMCs向内皮细胞分化,随着LPS浓度增加,PBMCs分化呈抑制作用,这可能与LPS激活核转录因子-κB(NF-κB)的数量及亚单位不同有关。

细胞毒素 第4篇

使用3种细胞浓度,并使用3种浓度的红粘土、蒙脱石、胶岭石、高岭石、斜发沸石、生石灰、氢氧化钙、硫酸铝、壳聚糖、活性二氧化硅和聚合氯化铝作为凝结剂或絮凝剂,在实验室条件下比较了它们对链状裸甲藻细胞和毒素的去除效果。针对细胞去除,使用最大效率下的最低浓度准则,选择了壳聚糖、生石灰和氢氧化钙。将它们成对组合,测试它们的综合性能。全部测试组合下的细胞去除效率达95%~99%。生石灰+壳聚糖的组合能有效地去除细胞,但无法去除由链状裸甲藻产生的细胞外毒素。

细胞毒素 第5篇

1 材料与方法

1.1 细胞株

食管癌干细胞株由甘肃省消化系肿瘤重点实验室惠赠;该实验室利用DNA荧光染料Hoechst33342和流式细胞技术对食管癌EC9706细胞进行分离, 获得肿瘤起始细胞 (SP细胞) [4]。分化抑制培养体系 (包含小鼠胚胎成纤维细胞和分化抑制因子) 由兰州大学基础医学院遗传研究所提供。

1.2 试剂

艰难说菌毒素A (北京普华仕科技发展有限公司) , 细胞裂解液 (2.5 mol/L Na Cl, 100 mmol/L ED-TA-Na2, 10 mmol/L Tris-HCl, 10 g/L肌氨酸钠, p H10) ;碱性电泳缓冲液 (1 mmol/L EDTA-Na2和300mmol/L Na OH, p H>13) , 中性缓冲液 (0.4 mol/L Tris-HCl, p H 7.5) 。

1.3 细胞培养

解冻SP细胞, 分别接种于分化抑制培养体系的24孔板;每孔约2×105个细胞;在37℃、5%二氧化碳培养箱中、饱和湿度条件下常规培养, 每3天半量换液, 7 d后收集细胞并计数;台盼蓝染色活细胞98%以上进行实验。

将细胞分为两组, 实验组加入400 ng/m L Tcd A处理;空白对照组只加培养液, 每孔总体积100μL。37℃、5%二氧化碳培养箱分别培养24 h, 将细胞分为两份, 一份采用单细胞凝胶电泳技术检测;另一份用于荧光染色观察。

1.4 单细胞凝胶电泳检测细胞DNA损伤

单细胞凝胶电泳技术 (SCGE) 即彗星实验, 是一项快速、敏感的检测有核细胞DNA损伤的方法, 不受细胞类型的影响。细胞DNA受损后, DNA分子断裂而致分子量减少;碱性条件下, 损伤的DNA断链及片段会在DNA解螺旋后释放出来;在电泳过程中, DNA断链及片段会离开细胞核向阳极移动, 形成彗星状的图像;而DNA迁移距离 (彗星尾长) 和DNA含量 (荧光强度) 与DNA损伤程度呈线性相关[5]。

将100μL, 1%正常熔点的琼脂糖预热后涂在同样预热的载玻片上, 迅速加盖玻片轻压, 4℃下凝固10 min制成第1层胶;37℃下将50μL的细胞悬液与150μL, 0.5%低熔点琼脂糖混合均匀后取100μL迅速铺在第l层胶上, 加盖玻片轻压, 4℃下凝固10 min制成第2层胶;37℃下取0.5%低熔点琼脂糖100μL涂在第2层胶上并加盖玻片轻压, 凝固后制成第3层胶。去掉盖玻片, 将包埋了细胞的胶板浸入预冷4℃的细胞裂解液中 (用时加入1%Triton X-100, 10%二甲基亚砜) , 置于4℃下裂解2h。取出胶板, 紧密排列于水平电泳槽中, 加入新配置碱性电泳缓冲液盖过胶面0.5 cm左右, 4℃下解旋20 min。在电压25 V、电流300 m A、4℃电泳40 min。电泳后小心将胶板浸于中性缓冲液中15 min 2次。在暗光下使用20μg/m L溴化乙锭染色, 400倍荧光显微镜 (日本尼康E800) 下观察。

1.5 荧光染色观察细胞凋亡的形态学变化

细胞荧光染色是鉴别肿瘤细胞坏死和凋亡的一种简便易行的方法[6];分别离心收集Tcd A处理组和空白对照组细胞, PBS洗1次, 离心弃去上清, 以PBS液重悬细胞, 最终体系约50μL液体;固定15min后涂片, 待稍晾干后均匀滴上100μL Hoechst33342染色液, 避光染色5 min, 弃去Hoechst液, PBS洗2次后, 用荧光显微镜 (日本尼康E800) 观察细胞形态。

2 结果

鉴于SP细胞的筛选和保存条件苛刻, 在实验前使用采用流式细胞技术对SP细胞进行分选纯度检测;纯度≥98%时进一步开始实验。

2.1 单细胞凝胶电泳技术实验结果

A:实验组;B:对照组

图1显示, 实验组和对照组比较, “彗星尾长”变长, 荧光强度明显增高;表明400 ng/m L Tcd A对食管癌SP细胞的细胞核具有明显杀伤作用;但无法明确细胞受损类型;对Tcd A的作用机制及信号传导途径的研究意义有限。

2.2 Tcd A诱导食管癌SP细胞的形态学变化

400 ng/m L Tcd A作用于食管癌SP细胞24 h后, 荧光显微镜下可见典型凋亡细胞形态:细胞体积变小, 核内或胞质内可见致密浓染颗粒, 部分细胞出现核碎裂, 伴凋亡小体形成。而正常细胞大小及染色均匀。见图2。

实验表明Tcd A作用于食管癌SP细胞后主要引起细胞凋亡;张杰等的研究表明:针对细胞凋亡的靶向细胞毒药物有望提高食管癌患者的生存期[7];为深入研究Tcd A对食管癌SP细胞作用机制和评价其临床应用价值提供了方向。

3 讨论

食管癌现已成为全球发病率第7的恶性肿瘤, 全世界每年有30万人死于此病;目前食管癌的治疗模式仍是以外科为主的综合治疗;但多数国家限于经济和医学水平的限制;仍不能达到早期发现及诊断, 使得食管癌的手术切除率较低;而对于不能手术的III期和IV期患者, 化疗和放疗已成为改善其生活治疗和延长生存期的主要方法[8,9]。同时, 围术期的辅助化疗也在食管癌的综合治疗中起着举足轻重的低位。令人遗憾的是, 无论是以铂类药物为基础的化疗方案 (DDP+5-Fu/紫杉醇) 或基因靶药物的应用, 食管癌仍未获得满意的远期生存[10,11]。干细胞的耐药性可能是化疗失败和食管癌复发的根本;寻找针对食管癌干细胞的靶向化疗药物, 成为突破食管癌治疗和延长患者生存期的瓶颈。

食管癌细胞无特异的标志物给食管癌干细胞的分离和鉴定带来很大的困难;利用DNA荧光染料Hoechst 33342和流式细胞技术筛选的食管癌SP细胞, 因其在生物学特性和基因表达谱方面与肿瘤干细胞密切相关而被多数学者肯定为食管癌干细胞[4]。肿瘤干细胞的培养条件要求较高, 为防止食管癌干细胞在培养和传代过程中发生分化;该研究采用了分化抑制培养体系对细胞进行培养[12]。

细胞毒素 第6篇

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

DMEM培养液、胎牛血清 (Gibco, USA) ;I型胶原酶、内毒素 (Sigma, USA) ;抗人波形蛋白抗体、抗人角蛋白抗体、抗鼠、抗兔SP免疫组化试剂盒、RANKL多克隆抗体、OPG多克隆抗体 (北京博奥森生物技术有限公司) ;OPG ELISA试剂盒 (R&D, USA) ;多功能真彩色细胞图像分析管理系统 (Media Cybernetics, USA) ;酶标分析仪 (Thermo corporation, USA) 。

1.2 方法

1.2.1 HGFs培养及鉴定

人牙龈组织取自因正畸需要而拔除的牙齿, 年龄15～25 岁, 无龋病、牙周病和根尖周病。采用组织块法培养并传代, 免疫细胞化学法进行波形丝蛋白和角蛋白染色鉴定细胞组织来源。

1.2.2 免疫细胞化学法检测培养细胞中OPG、RANKL的表达

取纯化且形态良好、生长旺盛的第4 代HGFs以2×104密度接种于预先放置盖玻片的24 孔板, 24 h后更换培养液, 实验组换含5 μg/ml LPS的无血清DMEM培养液分别培养0、 6、 12、 24、 48 h;对照组用不加LPS的无血清培养液相同条件培养。各时间点收集细胞爬片, 4%多聚甲醛固定, 以抗OPG或RANKL多克隆抗体为一抗, 同时设阴性和空白对照组, SP法进行免疫细胞化学染色, DAB显色, 梯度酒精脱水, 二甲苯透明, 中性树胶封片。利用多功能真彩色细胞图像分析管理系统进行图像分析, 根据Soslow[1]的评分方法进行免疫组化评分 (immunohistochemical score, IHS) , 分别计算OPG、RANKL在各个时间段的得分。IHS=A×B, 其中A为阳性细胞评分, <1%=0, 1%～10%=1, 11%～50%=2, 51%～80%=3, >80%=4; B为阳性细胞染色强度评分, 0 (阴性) , 1 (弱阳性) , 2 (阳性) , 3 (强阳性) , 结果以undefined表示, SPSS 11.5软件进行统计学分析。

1.2.3 ELISA法检测培养细胞上清中分泌OPG的表达

培养细胞的实验组和对照组设置同上。在收集细胞爬片的同时, 收集相应的培养上清液作为检测样品。应用Sandwich法, 按试剂盒说明步骤进行操作, 检测各组样品的OPG浓度。结果以undefined表示, 采用SPSS 11.5软件进行单因素方差分析和t检验。

2 结果

2.1 HGFs的培养及鉴定

原代培养的HGFs细胞为梭形或星形, 胞质丰满, 细胞核为圆形。有时可见少量的扁平多角形上皮样细胞, 但生长缓慢并逐渐消失, 传至3～4 代后, 细胞即为纯化的梭形细胞, 免疫细胞化学染色表现为波形丝蛋白阳性, 角蛋白阴性, 符合中胚层来源成纤维细胞的生物学特性 (图 1) 。

2.2 LPS刺激前后OPG、RANKL在HGFs中表达的免疫细胞化学检测

2.2.1 OPG的表达

OPG在HGFs的免疫细胞化学染色表现为胞质内的棕黄色着色, 胞核无着色, 但各时间段的染色强度不一, 0 h时为部分细胞胞质内的淡黄着色, 6、 12、 24、 48 h则表现为胞质内的棕黄着色, 以12、24 h 2 个时间段的着色最强, 且为多数细胞有着色 (图 2, 表 1) 。统计结果显示0 h时实验组与对照组无显著差异, 说明实验开始时细胞状态齐同, 6、 12、 24、 48 h时间段则各实验组均与对照组有显著差异 (P<0.01) 。各实验组之间, 6、 12 h 2 时间段有显著差异 (P<0.05) , 12、 24、 48 h时间段之间无显著差异。无LPS刺激组各时间段OPG染色均为弱阳性, 阳性细胞数量少, 着色浅, 统计结果显示各组间无显著差异 (P>0.05) 。阴性和空白对照组OPG染色为阴性。

A: LPS刺激前; B: LPS刺激后12 h

(IHS, )

(1) 与对照组比较, P<0.01; (2) 与相邻上一时间段比较, P<0.05

2.2.2 RANKL的表达

无LPS刺激组及LPS刺激组各时间段 (0、 6、 12、 24、 48 h) RANKL的免疫细胞化学染色均为弱阳性, 多数细胞无明显着色, 少部分细胞胞质有淡黄色着色, 胞核无着色 (图 3, 表 1) , 统计结果显示各组间均无显著差异 (P>0.05) 。阴性和空白对照组RANKL染色为阴性。

2.3 LPS刺激前后HGFs培养上清中的OPG含量

ELISA检测结果显示HGFs培养上清中的OPG含量随着刺激时间的延长而逐渐升高 (表 2) 。0 h时实验组与对照组无显著差异, 6、 12、 24、 48 h时间段则各实验组均与对照组有显著差异 (P<0.01) 。各实验组之间, 6、12 h 2 时间段有显著差异 (P<0.05) , 12、 24、 48 h时间段之间无显著差异 (P>0.05) , 与OPG免疫细胞化学染色结果的变化趋势类似。未经LPS刺激对照组培养上清中各时间段OPG含量变化无显著差异 (P>0.05) 。

A: LPS刺激前; B: LPS刺激后12 h

(ng/ml, )

(1) 与对照组比较, P<0.01; (2) 与相邻上一时间段比较, P<0.05

3 讨论

OPG和RANKL是破骨细胞的主要调节因子, 两者在局部环境中的浓度比决定破骨细胞的分化、成熟和功能, 与牙周炎时的牙槽骨吸收有密切关系。Liu等[2]发现牙周炎患者牙周组织中RANKL的含量较健康对照组高, 而OPG含量则较低。Cortti等[3]发现牙周炎患者骨吸收区肉芽组织中RANKL表达明显高于非骨吸收区, OPG的表达则相反。本实验检测大肠杆菌LPS刺激体外培养HGFs后不同时间段OPG和RANKL的表达变化, 探讨HGFs是否可产生直接作用于成骨、破骨细胞的细胞因子, 抑制或促进牙槽骨的吸收。

本实验免疫细胞化学染色和ELISA结果显示, 体外培养HGFs在未受到LPS刺激时有微弱的OPG和RANKL的表达, 说明该细胞具备OPG/RANKL骨代谢调节系统, 在生理状态下即可影响牙槽骨的成骨/破骨活动并维持其平衡。经LPS刺激后一定时间内HGFs细胞内和分泌到上清中的OPG表达量均增加, 而RANKL表达量无显著变化, 破骨细胞激活和增殖可能受抑制, 显示HGFs具有防止牙槽骨吸收的作用。此结果与LPS是刺激牙槽骨吸收的重要因素的公认理论有所不同, 可能与我们的实验结果是来自LPS刺激体外培养HGFs有关。实际牙周炎症时HGFs的作用与其在牙周组织中的位置和炎症的发展阶段有关。在牙周组织局部, 牙槽骨的吸收取决于局部HGFs、牙周膜细胞、成骨细胞及T细胞等所产生的影响破骨细胞激活的细胞因子的共同作用[4], 以HGFs数量最多, 炎症早期LPS可通过龈沟上皮侵入牙龈组织并与之接触, 随着炎症进展则深入到牙周膜细胞、成骨细胞, 同时浸润性T细胞亦增多, 这些细胞各具不同的生物学特性, 对LPS刺激的反应不同, 对牙槽骨代谢的影响也不同。Hormdee[5]发现IL- 1刺激后HGFs的OPG产生量显著高于牙周膜细胞。 Nagasawa[6]也发现LPS刺激后HGFs细胞能够分泌高浓度OPG并阻止单核细胞向破骨细胞的分化, 与我们的结果是一致的。而成骨细胞除其成骨作用外, 也参与骨吸收活动, 一般被认为是局部骨组织中RANKL的主要来源, 可与其位于破骨细胞前体细胞上的受体RANK结合, 导致破骨细胞激活和骨吸收开始, 而LPS和多种细胞因子可使成骨细胞RANKL的表达增强[7];激活的T细胞可分泌大量RANKL, 进而激活破骨细胞促进骨吸收[8]。因此, 炎症早期HGFs接触外来刺激, 分泌OPG、抑制破骨活动, 发挥自身防御功能。当炎症发展到牙周膜细胞和成骨细胞时, OPG分泌量较低, 同时T细胞侵入增加产生大量RANKL, 则牙槽骨吸收加快, 这与不同阶段牙周炎症的组织学表现是一致的。应从细胞和分子水平进一步研究HGFs对外来刺激的反应及调控方法, 寻找牙周病早期预防和治疗的新途径。

我们的实验结果显示HGFs在LPS刺激后6 h OPG表达即增强, 24 h为高峰, 而48 h时则减弱, 培养上清中的OPG含量亦仅少量增加, 可能与HGFs在LPS刺激后一定时间可产生IL- 1、IL- 6、PGE2等细胞因子, 这些细胞因子是否作用于HGFs自身使其OPG和RANKL的表达发生改变需进一步研究。本实验使用的LPS浓度和作用时间是根据不同浓度LPS对HGFs的细胞毒性实验结果并参考其他文献而定, 整个实验过程中未发现细胞活性的明显改变, 延长培养时间等对HGFs分泌OPG、RANKL的影响需进一步观察。

参考文献

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细胞毒素 第7篇

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

野黄芩苷(中国生物药品检定所),E. coli LPS(Sigma公司),DMEM培养液(Gibco公司),胎牛血清(fetal bovine serum,FBS 中美合资兰州民海生物工程有限公司),Ⅰ型胶原酶(Bejing Biotechnology),胰蛋白酶(中国医学科学院血研所科技公司),青霉素、链霉素、两性霉素B(华北制药股份有限公司),SP 免疫组化试剂盒、波形丝蛋白和角蛋白单抗(北京中山生物技术公司),YT- CJ- 1N型洁净工作台(北京亚泰科隆实验科技开发中心),倒置相差显微镜及照相系统(Olympus,日本),CO2 孵箱(Sanyo, 日本),BIO- RAD伯乐680型全自动酶标仪 (美国),MTT、二甲基亚砜(Sigma公司, 美国),TNF- α ELISA 试剂盒 (R&D公司,美国)。

1.2 主要溶液配制

野黄芩苷溶液的配制:取2 mg野黄芩苷溶于2 ml PBS中,NaHCO3调pH值至7.4,至野黄芩苷完全溶解, 成为1 mg/ml 的储存液,过滤除菌,用含2% FBS的DMEM 培养基将其稀释成所需浓度。

LPS溶液配制:取10 mg LPS,用含2% FBS 的DMEM 培养基将其稀释、振荡,使充分溶解,并将其配成 200 μg/ml浓度,过滤除菌,备用。

1.3 牙周膜细胞的来源、培养和鉴定

选取承德医学院附属医院口腔科就诊12～18岁青少年因正畸拔除的正常前磨牙,用含青霉素、链霉素、两性霉素B的DMEM培养液充分洗牙,用刀片刮取牙根中1/3的牙周膜组织,Ⅰ型胶原酶摇床振荡消化至大部分细胞游离,吹打、分散,加入少量含胎牛血清的DMEM 培养液,离心,弃上清液,将细胞和组织收集到培养皿中,置CO2培养箱中培养。原代培养成功后,常规换液,待细胞长至80%后,用胰蛋白酶消化传代。取生长良好的第3 代HPDLC接种于盖玻片上培养,待细胞长至70%时,取出盖玻片,常规固定, SP免疫组化法进行波形丝蛋白、角蛋白染色,光镜观察鉴定、摄影。

1.4 实验分组

实验分为正常对照组、 LPS 组和野黄芩苷+LPS 组。正常对照组含2% FBS 的DMEM 培养液; LPS 组含2% FBS的DMEM 培养液+LPS;野黄芩苷+LPS组含2% FBS的DMEM培养液+野黄芩苷+LPS,其中LPS的终末浓度为100 μg/ml,野黄芩苷的终末浓度分别为 0.001、 0.01、 0.1、 1、 10 μg/ml。

1.5 MTT法测定HPDLC的增殖

取生长良好的第6 代HPDLC,用2.5 g/L胰酶消化,调整细胞密度至2×103/ml,接种于3 块96 孔培养板,每孔100 μl。常规培养24 h后,吸去培养液和未贴壁细胞, 更换含不同药物的培养液,每孔加入各组溶液100 μl,每浓度复种6 孔。标准环境下分别各孵育24、48、72 h后,向每孔内加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml),继续培养4 h。倒置显微镜下观察MTT结晶状况,然后弃去孔内上清液,每孔内加入150 μl二甲基亚砜,振荡10 min后,在酶标仪下测定吸光度值(A490),取6 孔平均值,获得最佳增殖密度和培养时间。

1.6 TNF- α的ELISA 检测

取对数生长期的第6代HPDLC,以3×104/ml 的细胞密度接种于48 孔培养板,每孔0.5 ml,接种完毕后, 标准环境下孵育24 h后,弃去培养液和未贴壁细胞,加入以上各组溶液0.5 ml, 复种4孔,标准环境下孵育1 d后,吸取上清,-20 ℃冰箱保存备用。

分别将上述收集的细胞上清液常温下溶解。按照ELISA试剂盒的说明书,各取200 μl 细胞上清液,分别加入包被了TNF- α一抗的ELISA 96 孔板中,采用双抗体夹心法检测。终止反应后,用酶标仪检测450 nm波长的吸光度值(A450)。根据ELISA试剂盒中的TNF- α标准品曲线,换算出所测定细胞上清液中TNF- α的水平。

1.7 统计学方法

数据采用SPSS 11.5统计学软件进行处理,组间比较采用单因素方差分析,两两比较用LSD- t检验, P< 0.05表示有统计学意义。

2 结 果

2.1 形态学观察

原代培养细胞呈长梭形或星形,胞突细长,胞体丰满,胞质均匀,核圆形或卵圆形者为牙周膜细胞(图 1)。

2.2 免疫组化鉴定

HPDLC经免疫组化波形丝蛋白染色阳性(图 2),细胞胞质棕黄色着色;角蛋白染色阴性(图 3),胞质不着色,说明细胞来源于中胚层。取免疫组化角蛋白染色阴性、波形丝蛋白染色阳性的第6 代细胞用于实验。

2.3 野黄芩苷对LPS介导的HPDLC增殖的浓度和时间效应

(SP, ×200)(SP, ×200)

从各实验组A值表 1可见,培养液中加入100 μg/ml LPS 时, HPDLC 增殖活性明显受到抑制,与同期正常对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。当同时加入0.001～10 μg/ml浓度的野黄芩苷后,对LPS抑制HPDLC增殖活性有一定的拮抗作用。24 h时,从0.01 μg/ml浓度的野黄芩苷起即显示出明显的增殖作用; 48 h时,0.001～1 μg/ml浓度的野黄芩苷组,与只加LPS组比较,都具有极显著性差异(P<0.01);到72 h时,仅0.1、1 μg/ml浓度的野黄芩苷对LPS抑制的HPDLC具有增殖作用。同时可见,各实验组24 h与48 h、72 h增殖活性相比具有统计学差异,48 h后增殖作用出现缓慢现象,除LPS组,其它各组48 h和72 h时HPDLC 增殖活性无明显差别。并且在24～72 h范围内,显示 1 μg/ml浓度的野黄芩苷促增殖作用最强,其在不同时间点与其它浓度的野黄芩苷组比较可见显著性差异。

2.4 TNF- α的测定结果

从表 2看出,100 μg/ml LPS作用牙周膜细胞24 h,与正常对照组比较,能有效的刺激HPDLC分泌TNF- α(P<0.01)。同时加入0.001～10 μg/ml不同浓度野黄芩苷,各浓度的野黄芩苷对LPS刺激TNF- α分泌均有显著的抑制作用(P<0.01),其中浓度为1 μg/ml时抑制作用达到最强,抑制率为62.647%。

(1)表示与同期LPS组比较P<0.05,(2)表示与同期LPS组比较P<0.01;(3)表示与同组第1天比较P<0.05,(4)表示与同组第1天比较P<0.01;(5)表示与同期LPS+0.001μg/ml野黄芩苷组比较P<0.05,(6)表示与同期LPS+0.001μg/ml野黄芩苷组比较P<0.01;(7)表示与同期LPS+1μg/ml野黄芩苷组比较P<0.05,(8)表示与同期LPS+1μg/ml野黄芩苷组比较P<0.01;(9)表示与同期LPS+10μg/ml野黄芩苷组比较P<0.05,(10)表示与同期LPS+10μg/ml野黄芩苷组比较P<0.01

3 讨 论

HPDLC 作为牙周组织的主要细胞群具有多种细胞生物学活性,在维护牙周组织的健康中起着重要的作用,其损伤会严重危害牙周组织的健康,阻碍牙周组织的再生与修复。LPS作为革兰阴性厌氧菌中所独有的一种致病物质,对牙周组织细胞具有很强的毒性和抗原作用,被认为是牙周炎症的重要病因之一,在牙周病的发展过程中起着重要作用。其致病机制一方面可能通过作用于牙周组织细胞而直接引起牙周组织的破坏,另一方面牙周组织细胞在LPS的刺激下,经过一系列信号传导,分泌IL- 1β、IL- 6、IL- 8、TNF- α等炎症因子,启动免疫炎症反应,导致牙周组织的损伤[2,3]。

LPS的细胞毒作用直接影响着HPDLC的生长和增殖。 以往有研究表明:LPS在0.1、 0.01 μg/ml低浓度时可促进细胞生长,而在10、 100 μg/ml较高浓度时明显抑制细胞的生长[4]。我们选择了对HPDLC的生长抑制作用的显效浓度100 μg/ml。MTT结果显示:LPS组与同期正常对照组相比,细胞生长受到明显的抑制,其中24 h时抑制作用最明显。本实验观察不同浓度的野黄芩苷在不同时间点对LPS作用的HPDLC增殖的影响,结果显示,0.001～10 μg/ml野黄芩苷在不同的时间点,能明显的拮抗LPS对HPDLC的抑制作用,其中1 μg/ml浓度作用24 h时效果最明显。

(1)与LPS+0.001μg/ml和LPS+0.01μg/m野黄芩苷组比较P<0.01,(2)与LPS组比较P<0.01

TNF- α是淋巴细胞、单核细胞及成纤维细胞等产生的一种多功能细胞因子,作为细胞因子网络中的关键成员,具有广泛的生物学作用。TNF- α在牙周炎发生过程中的主要作用是:作为始动因子启动炎症反应;增加破骨细胞的形成和活性,促进牙槽骨的吸收;增加基质金属蛋白酶的产生,导致胶原纤维的破坏;刺激基质细胞的凋亡,限制牙周组织的修复等。因此阻断TNF- α的分泌对牙周炎的防治具有重要意义。

有研究显示[5],1～100 μg/ ml的LPS均能刺激HPDLC分泌TNF- α,在6～24 h内释放到上清液中的TNF- α量随时间的延长和LPS浓度的升高而增高,24 h后呈下降趋势。因此我们的实验选择了LPS诱导作用最强的时间点24 h和LPS的最佳诱导浓度100 μg/ml。结果证实:100 μg/ml的LPS作用牙周膜细胞24 h,能有效刺激牙周膜细胞分泌TNF- α,加入LPS同时分别给予0.001～10 μg/ml不同浓度野黄芩苷,观察不同浓度的野黄芩苷对LPS刺激HPDLC分泌TNF- α的影响,结果显示:0.001～10 μg/ml野黄芩苷均能明显的抑制LPS对HPDLC的TNF- α分泌,其中1 μg/ml浓度抑制作用最明显,抑制率为62.647%。并且这一浓度与较低浓度的野黄芩苷组,如LPS+0.001 μg/ml、LPS+0.01 μg/ml野黄芩苷组比较有极显著性差异。

野黄芩苷为黄芩茎叶的提取物, 是黄芩茎叶总黄酮中的主要活性成分。现代药理研究证实黄酮类化合物在抗炎、抗变态反应,抗微生物,抗肿瘤等多方面都有一定的作用[6]。研究证实[7],黄芩对常见牙周细菌有明显的抑制作用。并有学者研究发现[8],野黄芩苷对MCF- 7人乳腺癌细胞有促增殖作用,而且野黄芩苷可通过降低细胞凋亡蛋白酶3活性和抑制p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)磷酸化等途径保护大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞免受氯化钴引起的凋亡[9]。但野黄芩苷对牙周组织细胞的影响尚未见研究报道。作为黄芩根的提取物,与野黄芩苷结构相似仅少一个羟基的黄芩苷。李会英研究证实,黄芩苷对LPS作用的牙周膜细胞有促进其增殖的作用,并可抑制细胞TNF- α的分泌[10]。本实验研究的野黄芩苷对牙周膜细胞有与黄芩苷类似的保护作用,分析野黄芩苷可能通过直接降解LPS,从而促进牙周膜细胞增殖、抑制牙周膜细胞TNF- α分泌。但野黄芩苷是否具有直接促进牙周膜细胞增殖和抑制炎症因子TNF- α的产生和释放的作用还有待于进一步的研究。

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细胞毒素 第8篇

关键词：乙型肝炎,慢性,肠源性内毒素血症,细胞因子

乙型肝炎病毒 (HBV) 是一种在世界范围广泛流行、严重危害人类健康的传染病[1]。HBV感染后致肝脏损害主要由机体对HBV免疫应答介导[2]。目前, HBV感染后慢性化进程中免疫应答的确切机制还不清楚, 但可以肯定的是细胞免疫在其中起重要作用。调节性T细胞 (regulatory T cells, Treg) 、Th17细胞是近年来新发现的两类免疫调节细胞, 两者密切相关, 来源与同一初始CD4+T淋巴细胞群, 在分化和功能上既相互联系, 又相互制约[3]。Treg/Th17细胞失衡可导致多种慢性感染性疾病、自身免疫疾病及肿瘤等的发生、发展。已有研究报道, 慢性乙型肝炎 (CHB) 患者体内亦存在Treg/Th17失衡, 参与HBV感染慢性化的进程[4,5]。笔者前期研究发现, CHB患者体内长期持续患有肠源性内毒素血症 (intestinal endotoxemia, IETM) 时可以导致机体的免疫功能低下, 造成HBV难以清除[6]。那IETM与Treg/Th17平衡关系如何呢?本研究通过检测内毒素水平, 将CHB患者分为内毒素阳性组和内毒素阴性组, 通过比较两组患者外周血Treg、Th17细胞相关细胞因子的的水平, 间接探讨IETM中CHB患者外周血Treg/Th17平衡的改变。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年2月-2013年11月在本院住院的80例CHB患者, 其中男58例, 女22例, 年龄18~69岁, 平均 (30±6) 岁。CHB患者诊断均符合《慢性乙型肝炎防治指南》 (2010年版) [7], 近半年均未服用过抗病毒及免疫调节剂药物, 排除其他肝炎病毒感染及其他原因引起的肝损害。同时选取20例健康对照者, 男14例, 女6例, 年龄20~55岁, 平均 (25±9) 岁, 肝功能正常, HBV血清学标志物阴性。本研究经本院医学伦理委员会同意, 所有患者均签署知情同意书。两组研究对象一般资料比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 检测方法

抽取受试对象晨间空腹静脉血1 m L, 离心分离血清, -20℃保存。待所有样本收集完全后, 取冻存血清, ELISA双抗体夹心法检测血浆IL-10、TGF-β、IL-6、IL-17、IL-23及内毒素水平。根据检测的内毒素水平, 将CHB患者分为内毒素阳性组和阴性组, 内毒素阳性的标准为健康者内毒素水平95%可信区间的上限值36.68 pg/m L, >36.68 pg/m L为内毒素阳性组, ≤36.68 pg/m L为内毒素阴性组。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析, 计量资料用 (±s) 表示;采用两个样本比较的Mann-Whitney U检验或多个独立样本比较的Kruskal-Wallis H检验;以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 健康者与CHB患者内毒素、IL-10、TGF-β水平的比较

80例CHB患者中, 45例发生IETM, 占56.25%。内毒素阳性组与阴性组的年龄、性别比较差异均无统计学意义 (P>0.05) 。与健康者比较, CHB患者内毒素水平明显升高 (P<0.01) , 且IL-10、TGF-β水平均明显升高 (Z值分别为5.265、6.859) 。内毒素阳性组IL-10、TGF-β水平均较阴性组升高, 差异均有统计学意义 (P<0.01) , 见表1。

2.2 健康者与CHB患者IL-6、IL-17、IL-23水平的比较

与健康者比较, CHB患者IL-6、IL-17、IL-23水平均明显升高 (Z值分别为6.894、5.028、6.877) 。内毒素阳性组IL-6、IL-17、IL-23水平均较阴性组升高, 差异有统计学意义 (P<0.01) , 见表2。

*与健康对照组比较, P<0.01;△与内毒素阴性组比较, P<0.01

g/m L

*与健康对照组比较, P<0.01;△与内毒素阴性组比较, P<0.01

3 讨论

TGF-β不仅是Treg分泌的发挥抑制作用的主要细胞因子, 体外研究还表明相对较低浓度的TGF-β主要促进Th17细胞的分化, 而高浓度的TGF-β则主要促进Treg的分化而抑制Th17细胞的分化[8]。IL-10是Treg分泌的另一主要细胞因子, 它可调控IL-12的产生, 进而抑制Th1型细胞免疫反应[3]。有研究表明, CHB患者血浆TGF-β、IL-10水平明显升高, 且与病情严重程度密切相关[3]。本研究发现与健康对照组比较, CHB患者TGF-β、IL-10水平亦均明显升高, 按内毒素水平分组后, 内毒素阳性组二者均明显高于内毒素阴性组, 初步提示内毒素可影响CHB患者TGF-β、IL-10的表达水平, 二者可能参与了IETM的病变过程。

IL-6联合TGF-β可促进转录因子RORt的表达和STA-T3通路的活化, 从而可诱导Th17细胞的分化与增殖[9]。在关于糖尿病的研究中发现, IL-6不仅可诱导Th17细胞的分化与增值, 且可以抑制Treg的分化, 使Treg/Th17平衡向Th17方向偏移[10]。IL-23属于IL-12家族, 主要由m DC细胞分泌, 是维持Th17细胞分化及功能发挥的细胞因子, IL-23缺乏使其存活及增殖受限[11]。IL-17是Th7细胞分泌的主要致炎性细胞因子, 可诱导内皮细胞、上皮细胞等分泌IL-6、IL-8、前列腺素E2, 增强TNF-α的功能及细胞间黏附分子的表达, 在炎症性疾病的发生发展中起重要作用[12]。IL-23/IL-17信号通路参与多种炎性疾病, 有研究发现慢性乙型肝炎的病变中亦有IL-23/IL-17信号通路的参与[13]。本发现与健康对照组比较, CHB患者血浆IL-6、IL-23、IL-17水平均明显升高, 按内毒素水平分组后, 内毒素阳性组三者均明显高于内毒素阴性组, 初步提示CHB患者IETM时IL-6、IL-23、IL-17的表达水平亦发生了变化, 它们亦可能参与了IETM的病理生理过程。