早期食管鳞癌范文（精选7篇）
早期食管鳞癌 第1篇
1 资料与方法
1.1 一般资料:
选取我院2012年5月至2013年6月期间收治的头颈鳞癌患者94例进行伴发症的检查。94例患者中, 男71例, 女23例, 年龄从34~71岁, 平均年龄 (53.4±3.7) 岁。有2例为双重癌, 56例为口腔鳞癌, 13例为口咽鳞癌, 11例为喉咽鳞癌, 12例为喉部鳞癌, 2例为颈段食管鳞癌。两例双重癌患者的癌变部位分别是口腔与喉咽以及口咽与喉部。
1.2 方法:
对于头颈鳞癌是否伴发食管病变的检查, 主要包括了软管纤维喉镜检查与食管镜检查、硬管纤维喉镜检查与食管镜检查、色素内镜检查等3个部分[2]。软管纤维喉镜检查与食管镜检查通常在门诊时就可进行, 在检查时进行局部麻醉;硬管纤维喉镜检查与食管镜检查是在进行软管检查后, 发现阳性病变的情况下进行的, 在检查时进行全身麻醉;色素内镜检查是在纤维喉镜检查及食管镜检查发现黏膜阳性病变后进行的更深入的检查, 在检查时于目标部位均匀地喷涂3%的卢戈氏碘液, 大约10 s后用温水洗净并观察。为了达到观察效果, 可进行适当的反复喷涂, 卢戈氏碘液的用量一般不超过20 mL。如果食管上皮组织发生了溃疡、糜烂、非典型增生、过度角化等病变的话, 碘液就会出现无法染色或者染色不良的现象, 在出现这种现象的部位进行取样分析, 就可以较为准确地检查出食管发生病变的情况。
1.3 统计学分析:
在临床上, 头颈鳞癌患者的性别、年龄、是否饮酒、肿瘤部位等因素会影响伴发的食管病变的发生率。进行单因素分析, 采用卡方检验, 连续变量配对t检验以及均衡分类变量检验;进行多因素分析, 采用向前逐步法logistic回归分析方法, 用P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
有51例患者进行了色素内镜检查, 发现了10例食管病变的患者, 其中, 8例为食管癌, 2例为非典型食管增生, 有3例是在普通食管镜检查未发现异常的前提下, 经色素内镜检查才发现的病变, 1例病变为食管癌, 2例病变为非典型食管增生, 这3例患者在经过色素内镜检查后, 在治疗方案上做出了相应的调整, 改变了原治疗计划。另外, 有76例患者还进行了纤维支气管镜检查, 没有检查到相应部位的阳性病变。并且通过对患者的基本资料进行调查, 进行了影响食管病变发生的单因素分析以及多变量分析。在单因素分析中, 性别、年龄、是否饮酒、肿瘤部位对发生食管病变的影响有意义 (P<0.05) ;在多变量分析中, 只有肿瘤部位对发生食管病变的影响有意义 (P<0.05) 。见表1。
3 讨论
头颈鳞癌容易伴发食管病变以及肺部病变, 在如今已经被医学领域所公认, 但对于伴发病变的准确检查, 却仍然存在着许多的问题。受到医院设备条件以及患者本身经济条件的影响, 头颈鳞癌伴发病变情况检查的3种主要方法并没有得到充分的利用, 导致了漏检情况的出现。在本研究的调查数据中, 头颈鳞癌患者伴发食管病变的概率已经达到了10.6%, 这是一个不容忽视的数字, 需要引起相关医疗工作者的足够注意。
而引起头颈鳞癌伴发食管病变发生的因素则是多方面的, 通过单因素分析得知, 患者的性别、年龄、肿瘤部位等都会对食管病变的发生造成较大的影响。而通过多变量分析发现, 只有肿瘤部位对食管病变的发生影响有显著意义, 因此在进行检查的时候, 对于单一的口腔鳞癌患者的检查可以不需要常规的检查手段。另外, 随着科技技术的不断发展, 利用影像学手段进行食管病变的检查已经逐渐取代了3种基本的内镜检查技术, 使检查的效率更高, 对患者的影响更小, 也更能保证检查结果的准确性[3]。
综合本研究结果以及相关文献可知, 在通常情况下, 口腔鳞癌患者可以不用进行食管镜的检查。而利用色素内镜检查, 可以较为及时地发现病变情况, 为患者的早期治疗提供完善的理论基础, 让治疗方案更加全面, 更具有针对性。为了提高患者的治愈概率与存活能力, 应该对色素内镜检查技术有充分的重视。
参考文献
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早期食管鳞癌 第2篇
1 材料与方法
1.1 临床材料
收集我院2009年1月至2009年4月手术切除食管鳞癌标本52例, 均经病理证实为鳞状细胞癌。患者年龄41~81 (均65.4±5.3) 岁, 男39例, 女13例, 所有患者术前均未接受化疗或放疗。根据国际抗癌联盟 (UICC) 制定的恶性肿瘤TNM分期系统进行临床分期, 均为pTNM, Ⅰ期3例, Ⅱa期6例, Ⅱb期18例, Ⅲ期25例。组织学分级为高分化13例, 中分化18例, 低分化21例。蜡块制备5μm厚连续切片, 贴附于涂有Paly-lysine的载玻片上。同期取20例癌旁正常食管组织做对照。
1.2 实验试剂
兔抗人iNOS多克隆抗体、蓝色DAB显色试剂盒 (编号AR1025) 均购于武汉博士德生物工程有限公司。
1.3 方法
采用免疫组织化学SABC法按试剂盒说明书进行, 用0.01mol/L PBS液取代第一抗体作为阴性对照。用己证实iNOS染色阳性的乳腺癌切片作阳性对照。
1.4 结果判定
高倍镜下 (放大200倍) 对每张切片随机选择5个视野, 每个视野计数200个细胞, 共计1000个, 计算每张切片的阳性细胞百分率。iNOS蛋白以肿瘤细胞胞质内出现淡蓝色颗粒为阳性, 根据纪小龙[5]等提供的免疫组化阳性判断标准, 阳性细胞<10%为阴性, 阳性细胞数≥10%为阳性。
1.5 统计学处理
应用《中国医学百科全书·医学统计学》统计软件包PEMS 3.1对试验所得数据进行卡方检验和相关分析, P<0.05具有统计学意义。
2 结果
2.1 食管鳞癌中i NOS与癌旁正常组织的表达
52例食管癌组织中, 有33例表达iNOS, iNOS阳性表达率是63.46%, 在20例癌旁正常组织中, iNOS的阳性表达2例 (10%) 。食管鳞癌中iNOS的阳性表达明显高于癌旁组, 二者比较有显著差异 (P<0.01) 。见表1。
2.2 食管鳞癌i NOS蛋白表达与临床病理的关系
iNOS蛋白的阳性表达在不同的临床分期和有无淋巴结转移 (P<0.05) 、不同的病理分级 (P<0.01) 有显著差异;但与患者性别无明显差异 (P>0.05) 。见表2和图1。
3 讨论
充足的血流是肿瘤细胞获得营养、维持适度pH所必须, 是肿瘤生长的基础;持续合适浓度的NO调节肿瘤血流量, 维持血管扩张状态, 促进血管内皮黏附分子的表达、增加血管内皮通透性、参与VEGF生血管机制、促进肿瘤新生血管生成等, 为肿瘤细胞的增殖和转移提供了有利条件[6]。NO是生物体内一种结构简单的自由基气体, 有广泛的生理及病理学功能, 过高浓度的NO可产生抗肿瘤效应, NO极不稳定, 半衰期很弱, 仅为30s左右[6], 很快被氧化成亚硝酸盐和硝酸盐, NOS是生成内源性NO的关键限速酶, 它有两种同工酶, 分别是结构型 (cNOS) 和诱导型 (iNOS) , cNOS主要存在于内皮细胞、神经原细胞、平滑肌细胞和血小板中, 依赖Ca2+或钙调素而激活, 合成皮摩尔水平的NO, 其作用时间短, 仅在生理情况下起作用[6]。iNOS在健康人体组织中不表达或低表达, iNOS为Ca2+非依赖性, 在细胞因子及其他细胞毒性物质的作用下产生大量的一氧化氮 (NO) [7], 目前已在多种肿瘤组织中检测到iNOS的表达明显高于正常组织[8,9]。iNOS诱导合成纳摩尔 (nmol) 水平的NO, 较生理条件下的NO浓度高1000倍, 但却比引起细胞凋亡的活性低1~2个数量级[7], 因NO化学性质极不稳定, 所以研究中常检测i NOS的表达来间接反应NO含量。
张箐华[9]的研究证实iNOS与肺癌生长关系密切, 与本研究的食管癌组织中i NOS的表达高于癌旁正常组织一致。
耿艳华[10]等的研究发现iNOS在骨肉瘤组织中的表达增高, 并随病理分级和临床分期的增高而增加, 且与组织学分型密切相关。本试验结果显示, iNOS在食管癌组织中显著表达, iNOS阳性与食管癌的分化程度、有无淋巴结转移及TNM分期密切相关。由此可见iNOS可能参与了食管癌的发生、发展、浸润和转移。
参考文献
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早期食管鳞癌 第3篇
1 材料与方法
1.1 材料
收集广西医科大学第一附属医院2006年1月～2007年9月接受食管癌根治术的食管鳞癌及癌旁组织标本33例。其中男21例，女12例;平均年龄(56.58±16.32)岁。患者临床资料见表1，所有患者术前均未接受化疗、放疗或免疫治疗。
1.2 试剂与仪器
鼠抗人TFF1单克隆抗体(即用型)、S-P免疫组织化学试剂盒和DAB显色剂购自福建迈新生物技术开发公司。鼠抗人VEGF鼠抗人单克隆抗体和CD34单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司。病理切片采用Leica Qwin DMR+Q550病理图像分析仪分析观察。
1.3 方法
采用免疫组织化染色超敏两步法(SP染色)。标本先用10%甲醛固定。分别用一抗鼠抗人TFF1单克隆抗体标记TFF1、鼠抗人VEGF鼠抗人单克隆抗体标记TFF1和CD34单克隆抗体标记MVD。组织标本常规脱水、透明、渗蜡、包埋，4μm厚连续切片。常规脱蜡、水化，DAB显色，苏木素复染，吹干，具体操作按S-P试剂盒说明书进行。阴性对照采用生理盐水磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗，余步骤相同。
1.4 判断标准
TFF1、VEGF：阳性信号为细胞胞浆和胞膜上出现黄色或棕黄色染色，每张切片中看到有>5%的肿瘤细胞胞质或胞膜染色阳性，即判定为阳性，见图1和图2。MVD计算方法：被染成棕色的血管内皮细胞或血管内皮细胞簇均作为一个血管计数。每例先在低倍镜(×100)下观察全片以确定肿瘤内血管密度最高处，再在中倍镜(×200)下记录5个视野内的微血管数，取其平均值作为该病例的MVD值。
1.5 统计学方法
使用SPSS11.5统计学软件对数据进行分析，MVD值以均数±标准差表示。MVD值比较用t检验，计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 临床病理特征
33例食管癌组织中共4例TFF1阳性，阳性率为12.12%。TFF1阳性表达与食管癌的性别、年龄、肿瘤长度、分化程度、浸润深度以及有无淋巴结转移均无关。MVD水平与性别、年龄、肿瘤长度和浸润深度无关，与分化程度以及有无淋巴结转移有关，有淋巴结转移组较无转移组高(P<0.05)，见表1。
2.2 TFF1、VEGF表达与MVD的关系
33例食管癌VEGF阳性19例(阳性率57.58%)，阴性14例。分别按TFF1、VEGF阳性与阴性分组比较MVD平均值，TFF1阳性组MVD值比阴性组高(P<0.05),VEGF阳性组比阴性组高(P<0.01)，见表2。
2.3 食管癌与癌旁组织对比
33例食管癌组织与33例癌旁组织TFF1表达阳性率无差异(12.12%vs 9.09%，P>0.05)。食管癌组VEGF阳性表达率为，比癌旁组织高(57.58%vs 30.30%，P<0.05)。食管癌组MVD值比癌旁组织高(22.88±13.38 vs 11.58±6.55,P<0.01)，见表3。
注:1)χ2=0,P>0.05;2)χ2=4.98,P<0.05;3)t=4.36,P<0.01
3 讨论
肿瘤的生长有赖于血管的生成，血管新生在其过程中的作用和器官发生时同样重要，已经有研究表明VEGF、MVD与胃癌侵袭、转移等恶性生物学行为密切相关，MVD甚至可作为预测胃癌转移的指标[2]。因此，VEGF、MVD与肿瘤新生血管形成机制有关已经得到认可。
三叶因子具有肿瘤抑制、信号传导和诱导细胞凋亡等功能，已经在多种恶性肿瘤组织中检测到TFF1高水平表达[3]，但TFF1与食管癌的关系尚未明确。研究表明，TFF1与Barrett食管(Barrett's esophagus,BE)有关。VAN DE BOVENKAMP等[4]认为，BE由于鳞状上皮被柱状上皮代替，所有细胞都出现分泌性的表型，可见黏蛋白和TFFs分泌增加，检测71例患者活检标本中有66例可见TFF1强表达于分泌黏蛋白MUC5AC的上皮表层;另通过对不同病种进行病例分析发现，发生食管溃疡的BE病例比其他食管炎或出现不典型增生的病例组表达增高，因此认为BE患者TFFs的表达可能是食管腺癌癌变前的表现，其中TFF1可被视为BE进展到腺癌过程中化生的标志之一[5]。
国内学者[6]在食管癌及癌旁组织中未检测到TFF1的阳性表达，但LABOUVIE等人[7]用免疫组织化学的方法研究了40例食管鳞状细胞癌和21例BE化生上皮的标本，发现其中10%鳞状细胞癌和100%BE化生上皮TFF1高表达，作者另取11例食管鳞状细胞癌活检标本用RT-PCR方法进行研究，发现全部11例标本中都可见TFF1表达，而正常食管上皮则无TFF1表达。本研究检测33例食管癌及癌旁组织中均有低水平表达，分别为12.12%和9.09%，两者差异无统计学意义，由于正常食管黏膜无TFF1分泌，此结果提示TFF1对食管癌的发病可能有一定影响。本研究TFF1阳性组食管癌组织的MVD值比阴性组高，与MATSUURA等[8]研究结果相似，提示TFF1可能与肿瘤新生血管形成有关。其机制与表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶信号途径有关，EGFR可通过刺激环氧合酶-2表达诱导产生前列腺素、血栓素A2等物质[9]，由于研究发现三叶因子可通过Src原癌基因相关自体活化环对花生四烯酸代谢过程进行调控[10]。因此，认为TFF1可能通过EGFR途径诱导环氧合酶-2过表达，导致血栓素A2增多从而诱导血管形成[1]。
VEGF是特异性的血管内皮细胞刺激因子，可与血管内皮细胞特异性地结合，刺激血管内皮细胞的增殖，降解血管内皮基质，使新生血管基底膜不完整，促进血管内物质的渗出，为内细胞的迁移和肿瘤细胞的转移提供形态学基础。已经有研究认为VEGF与食管癌的分期、转移和预后都密切相关[11,12]，本研究结果进一步证实了VEGF在食管癌发病机制中的重要地位，在食管癌组织中VEGF和MVD的表达水平比癌旁组织增高，MVD在低分化以及发生淋巴结转移病例中表达水平更高，VEGF阳性组的MVD水平比阴性组高，说明VEGF可能参与了食管鳞癌血管生成，通过促进血管生成、上调MVD表达而参与食管癌的生长、浸润、转移等恶性生物学行为。
据此，本研究结果为VEGF与食管鳞癌新生血管形成有关提供了新的证据，TFF1可能参与食管鳞癌的发病机制，其机制可能是通过上调VEGF表达刺激新生血管形成。
摘要：目的探讨三叶因子1(TFF1)与食管癌新生血管形成的关系。方法采用免疫组织化学法检测33例食管鳞癌及癌旁组织的TFF1、血管内皮生长因子(VEGF)和微血管密度(MVD)的表达。结果TFF1在33例食管癌及癌旁组织中有低阳性率表达(12.12%和9.09%);食管癌的MVD水平与有无淋巴结转移有关(P<0.05);TFF1和VEGF阳性组的MVD水平分别高于阴性组(P<0.05,P<0.01);食管癌组织的TFF1阳性率与癌旁组织无差异(P>0.05),食管癌VEGF阳性率高于癌旁组织(P<0.05),食管癌MVD水平高于癌旁组织(P<0.01)。结论TFF1可能通过上调VEGF表达促进食管鳞癌新生血管的形成。
关键词：食管癌,三叶因子1,血管内皮生长因子,微血管密度
参考文献
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早期食管鳞癌 第4篇
1 材料与方法
1.1 材料
本研究所用组织样本分别来自:汕头大学医学院李恩民教授惠赠的冰冻ESCC组织样本7例,其中,男6例,年龄大于60岁患者5例,用于高通量测序分析;国家癌症中心北京协和医学院中国医学科学院肿瘤医院病理科提供ESCC石蜡包埋组织10例,其中,男8例,年龄大于60岁患者5例,用于检测DNA甲基化水平;中国医学科学院肿瘤医院腔镜科王贵齐主任提供的冰冻ESCC组织10例,其中,男9例,年龄大于60岁患者5例,用于检测RNA表达水平。所有癌旁组织均取自距肿瘤组织5 cm,样本均选自术前无放疗化疗患者,病理诊断均为ESCC,都处于T3期无远处转移,且样本收集时均签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 高通量测序分析
采用简化的、具有代表性的DNA甲基化测序(RRBS)[7]及基因表达谱芯片(由中国医学科学院肿瘤医院程书钧课题组设计)对7例冰冻ESCC患者的癌组织及其配对癌旁进行高通量分析。分析其DNA甲基化水平和RNA表达水平,并获得甲基化图谱和表达图谱。将甲基化差异基因用DAVID工具进行功能富集分析,从中筛选DNA甲基化与RNA表达负相关的基因进行验证。
1.2.2 硫化测序分析
采用重亚硫酸盐测序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP)方法[8]对7例冰冻ESCC及10例石蜡包埋ESCC组织进行DNA甲基化验证性研究。
1.2.2. 1 DNA提取与DNA硫化
提取ESCC及配对癌旁的全基因组DNA(天根组织细胞基因组DNA提取试剂盒),检测DNA浓度。用DNA甲基化试剂盒(ZY-MO RESEARCH),DNA硫化量750 ng,反应条件为98℃10 min,64℃2.5 h,然后将DNA洗脱保存。
1.2.2. 2 巢式PCR
引物设计使用在线工具Methprimer,CCNYL1启动子区引物分别为Nest1上游引物:5'-GGGTTTTTGATTATGATGATTAG-3',下游引物:5'-AAACTTCCAAATTTCTCTTCTTATA-3';Nest2上游引物:5'-TTTTGATTATGATGATTAGAAAATAA-3',下游引物:5'-AACACTATATACCAAACAATATTCC-3'。PCR反应根据试剂盒说明书进行,反应体系为20μL。Nest1产物稀释100倍作为Nest2的反应模板。
1.2.2. 3 PCR产物验证及琼脂糖凝胶回收后连接及转化
PCR反应后进行琼脂糖凝胶电泳验证,在紫外显像仪下观察凝胶电泳结果,切取预期扩增片段,根据天根生化科技有限公司提供的DNA纯化回收试剂盒进行回收。连接载体为p EASYR-Blunt Zero载体(北京全式金生物有限公司)。该载体是一种高效PCR产物连接的专用T载体,通过自杀基因表达与否筛选阳性重组子。转化后37℃倒置过夜培养,每样本挑取10个阳性单克隆振荡培养。
1.2.3 BSP测序分析
将单克隆菌液进行Sanger测序,由立菲生物技术有限公司合成引物及测序。采用QUMA分析工具对CCNYL1基因单克隆测序结果进行分析。分析候选区域整体甲基化水平及单个Cp G位点甲基化水平。
1.2.4 芯片结果验证
将冰冻组织加入Trizol Reagent并用研磨棒研磨至充分裂解,提取总RNA。用Promega试剂盒将2μg的总RNA逆转成c DNA,接着进行实时定量PCR扩增。引物采用Oligo7软件设计,上游引为5'-A-CATTTGTCCCACCAACTGGAA-3',下游引物为5'-GAAGAAGCTCCAGAAAATGCCTT-3',扩增片段为165 bp。反应根据SYBR-Green方法(TAKARA)进行半定量,每次实验重复至少3次。表达谱芯片数据经提取后运用Gene Spring GX 12.0(美国Agilent公司)软件进行数据分析。
1.3 统计学方法
利用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析,计数资料用率表示,组间比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 高通量测序分析图谱
将7例冰冻癌和癌旁组织进行Cp G甲基化聚类分析(图1A),癌和癌旁Cp G甲基化具有较好聚类。经芯片表达谱检测癌及癌旁组织中总m RNA表达谱差异(图1B),获得表达差异显著的基因1210个(P≤0.005,FC≥4.0),其中,表达下调955个,表达上调255个。
A:癌和癌旁组织中Cp G甲基化聚类分析;B:表达谱芯片癌和癌旁基因表达差异情况
2.2 差异基因功能富集
7例冰冻ESCC样本经RRBS测序得到癌和癌旁DNA甲基化显著差异基因5268个,其中689个差异甲基化区位于Promoter及CDS上。将差异基因用DAVID工具进行功能富集分析,获得15条差异信号通路,包括Notch信号通路、Wnt信号通路及黏着斑信号通路等肿瘤中常见信号通路。见表1。
2.3 RRBS测序与芯片表达谱关联分析
将甲基化差异基因与表达差异基因相关联,获得负相关基因共82个(图2A,封三),异常甲基化在启动子区有29个,其中,CCNYL1甲基化水平差异显著,在癌症数据库中(http://www.cbioportal.org/),CC-NYL1基因在EAC中有缺失也有扩增,而在ESCC中未发现异常改变,结合CCNYL1单个DMR甲基化分布(图2B,封三),红色(虚线上部分)代表在ESCC中甲基化水平,绿色(虚线下部分)代表在癌旁中甲基化水平,可看出CCNYL1的启动子区在ESCC中呈现高甲基化。
2.4 BSP验证结果
2.4.1 CCNYL1基因DMR PCR扩增
ESCC与配对癌旁组织基因组DNA提取后,经重亚硫酸氢钠修饰后做模板进行CCNYL1基因巢式PCR扩增,扩增序列包含DMR,按照扩增序列给Cp G编序,DMR包含从Cp G13到Cp G19。见图3。
2.4.2 CCNYL1基因DMR处单个Cp G位点甲基化程度
在线软件QUMA分析CCNYL1基因甲基化程度,图4表示癌旁和癌组织CCNYL1基因在170个阳性单克隆中Cp G位点甲基化程度。柱形图表示,CC-NYL1基因启动子区Cp G位点甲基化与未甲基化差异。经χ2检验,DMR处Cp G位点13、Cp G位点16、Cp G位点17、Cp G位点18、Cp G位点19在ESCC中呈现高甲基化(P<0.01)。见表2。
2.5 CCNYL1基因DMR整体甲基化状态分析
CCNYL1基因DMR Cp G位点整体甲基化状态为癌旁组织甲基化率为52.8%,癌组织甲基化率为73.3%,经χ2检验差异有高度统计学意义(P<0.01)。见表3。
2.6 CCNYL1基因表达水平
在10例冰冻ESCC组织中提取总RNA,并用Real-time PCR检测CCNYL1表达水平,结果显示,CCNYL1溶解曲线特异性较好,在9例冰冻ESCC组织中表达显著降低。见图5。
3 讨论
CCNYL1为最新识别的Cyclin家族一员,蛋白序列与Cyclin Y(CCNY)高度相似,然而,其功能在不同组织中没有明确特征,主要起到蛋白激酶连接作用[9]。最新研究显示,CCNYL1与CDK相互作用调节Wnt信号通路影响雄鼠精子形成,敲除CCNYL1基因小鼠CCNYL1(-/-)可导致雄性小鼠不育,而野生型雄鼠无此现象[10]。前期,笔者对7例ESCC组织样本RRBS测序及表达谱检测[11],RRBS可单碱基分辨率所需数据量小,能覆盖到启动子区域中约20%的Cp G位点[7,12]。经分析获得差异甲基化区位于启动子区并与表达谱芯片结果相关联得到显著一致基因29个。在甲基化差异显著基因中,已有报道PRSS3在非小细胞肺癌中高甲基化导致肿瘤细胞增殖[13];在EAC中,其激活PAR-2促进肿瘤细胞增殖[14]。PSCA在结肠癌、胃癌、前列腺癌和膀胱癌等中都有研究[15,16,17]。为了研究ESCC发生过程中DNA甲基化水平的改变,结合癌症数据库及功能分析,从中筛选出甲基化升高并且表达降低基因CCNYL1,其在ESCC中未有突变、缺失和扩增等改变。
为验证ESCC中CCNYL1甲基化与测序结果一致,进一步采用BSP方法检测ESCC组织中CCNYL1的甲基化情况。BSP是一种灵敏的能直接检测分析基因组DNA甲基化模式的方法。重亚硫酸盐处理后,PCR产物中原先非甲基化的胞嘧啶位点被胸腺嘧啶所替代,而甲基化的胞嘧啶位点保持不变。通过这个方法能得到特定位点在各个基因组DNA分子中的甲基化状态[7,18]。BSP实验结果与测序结果一致,CCNYL1启动子区DMR在ESCC组织中发生高甲基化。用Real-time PCR检测10例ESCC及癌旁组织CC-NYL1基因表达水平,发现其在ESCC中表达降低,与芯片结果一致。CCNYL1基因启动子区在ESCC中异常甲基化,可能为ESCC潜在生物标志。
A:CCNYL1溶解曲线,峰值单一;B:RT-PCR检测ESCC及癌旁组织中CCNYL1表达量差异;与癌旁组织比较,**P<0.01,***P<0.001
脊椎动物中甲基化修饰有两种形式:一种分散于DNA中,另一种是Cp G位点高度聚集在一起,称Cp G岛(CGIs)。绝大多数CGI与管家基因相关,余下的CGIs则与组织特异性基因的启动子区相关[19]。本研究中,对20例ESCC组织中CCNYL1启动子区21个Cp G位点进行甲基化分析,经统计,ESCC中DMR区Cp G位点13、Cp G位点16、Cp G位点17、Cp G位点18、Cp G位点19呈现高甲基化。本实验发现,ESCC甲基化异常基因CCNYL1,尽管其功能研究较少,但其启动子区甲基化改变可为ESCC发病机制提供新的理论基础,对于食管癌在临床上的诊治有着潜在应用价值[20]。
早期食管鳞癌 第5篇
关键词：食管鳞癌,基质金属蛋白酶抑制剂-1 (TIMP-1)
食管癌是全世界发病率较高的恶性肿瘤之一, 其中鳞状细胞癌占90%以上。探讨与食管鳞癌浸润、转移相关的分子生物学因素, 并寻找有效预防、治疗的相关途径是当今研究的热点。基质金属蛋白酶抑制剂 (TIMPs) 是基质金属蛋白酶 (MMPs) 的天然特异性抑制剂, 而且是一组能抑制MMP活性的多功能因子。在所有TIMPs中TIMP-1作用最强, 无论何种类型肿瘤均可被诱导产生以对抗各种类型的MMPs。TIMP-1分布广泛且可被多种细胞因子诱导表达, 并与激活的胶原酶、明胶酶有高亲和性。
1 临床资料
本研究采用免疫组化SP法, 分别检测了64例食管鳞癌组织、30例癌旁非典型增生组织以及26例正常食管粘膜上皮组织中TIMP-1蛋白的表达。
实验组织标本系漯河医学高等专科学校—附院及郑州大学—附院2007年9月至2009年9月存档蜡块共64例, 所取标本分别选择在癌灶、癌旁、正常组织3处取材。癌旁组织距癌灶边缘3cm以内, 正常组织取自手术残端, 距癌组织3cm以上的部位。病理证实64例均为食管鳞癌, 癌旁粘膜中有30例呈重度非典型增生改变, 64例手术残端组织中有26例正常食管粘膜。64例食管鳞癌标本中, 按有无淋巴结转移分为:转移组30例和无转移组34例;按浸润深度分为:粘膜下组3例、浅肌层组17例、深肌层组23例、外膜组21例。64例食管鳞癌患者, 术前均未接受化疗、放疗抑或免疫治疗。其中男性40例女性24例, 年龄在41~86岁之间, 平均年龄为 (63.76±10.09) 岁。TIMP-1免疫组化染色的阳性信号均定位于细胞质, 呈棕黄色颗粒, 显色强时为棕褐色颗粒。
注:a:bχ2=4.414, P=0.036;a:cχ2=15.670, P=0.000;b:cχ2=5.824, P=0.016
注:a:bχ2=0.065 P=0.798;a:cχ2=0.112, P=0.738;a:dχ2=6.171, P=0.013;b:cχ2=0.021, P=0.884;b:dχ2=10.568, P=0.001;c:dχ2=10.791, P=0.001;e:fχ2=8.231, P=0.004
参照文献报道[1~2]:根据染色程度及免疫阳性细胞占肿瘤细胞总数百分比综合计分。按照阳性细胞比例计分:≤10%为1分, 11%~50%为2分, >50%为3分。按染色强弱计分:阴性为0分, 淡黄色染色为1分, 中度黄色染色为2分, 棕褐色染色为3分。以二者之积计总分:总分<3为阴性, 总分≥3为阳性。
采用SPSS 13.0统计学软件包对所有数据进行处理, 阳性率间的比较采用χ2检验, 两变量之间的关系分析采用spearman等级相关分析表示, α=0.05。
2 结果与分析
2.1 TIMP-1的蛋白表达
TIMP-1在正常食管粘膜上皮组织为阴性表达;TIMP-1蛋白阳性信号位于癌旁非典型增生细胞、食管鳞癌细胞的细胞质中, 呈棕黄色颗粒。
2.2 TIMP-1蛋白表达与食管鳞癌发生发展的关系
正常食管粘膜上皮组织、癌旁非典型组织和食管鳞癌组织中, TIMP-1蛋白阳性率依次增高, 分别为0%、20.00%和42.19%。癌组织TIMP-1蛋白阳性率与相应的癌旁非典型增生组织及正常食管粘膜组织两两相比, 均有显著性差异 (P<0.05) (表1) 。
2.3 TIMP-1蛋白的表达与食管鳞癌浸润、转移的关系
侵及粘膜下、浅肌层、深肌层以及外膜的食管鳞癌组织中TIMP-1蛋白阳性率分别为66.67%、58.82%、56.52%和9.52%。浸及外膜的食管鳞癌组织TIMP-1蛋白阳性率明显低于粘膜下组、浅肌层组、深肌层组, 差异均有统计学意义 (P<0.05) ;而粘膜下组、浅肌层组、深肌层组的食管癌组织中TIMP-1蛋白表达率两两相比, 差异均无统计学意义 (P>0.05) 。30例伴有淋巴结转移食管鳞癌组织中TIMP-1蛋白表达率为23.33%, 无淋巴结转移的34例食管鳞癌组织中TIMP-1蛋白表达率为58.82%, 2组间食管鳞癌组织TIMP-1的表达率差异有统计学意义 (P<0.01) (表2) 。
3 结语
TIMP-1蛋白异常表达可能参与食管鳞癌的发生发展过程。TIMP-1蛋白异常表达与食管鳞癌浸润及淋巴结转移有关。
参考文献
[1]王战会, 冯笑山, 王公平, 等.KISS-1和E钙黏蛋白在贲门癌组织中的表达及临床意义[J].中华胃肠外科杂志, 2007, 10 (4) :380～382.
早期食管鳞癌 第6篇
1 资料与方法
1.1 入组标准
病理确诊的食管鳞癌患者;接受不包含伊立替康化疗后进展的患者;1个月内未行化疗及放疗等抗肿瘤治疗;有可测量的病灶, 能客观评价疗效;年龄在65~78岁;预计生存时间≥3个月;美国东部肿瘤协作组 (ECOG) 评分0~2分;血红蛋白≥90 g/L, 中性粒细胞≥1.5×109/L, 血小板≥100×109/L;胆红素≤1.5×正常值上限 (UNL) , 肌酐≤1.5×UNL, 丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 或天冬氨酸氨基转移酶 (AST) ≤2.5×UNL;患者签署知情同意书。
1.2 临床资料
2008年5月20日~2010年5月20日共入组进展期老年食管鳞癌患者32例, 其中男性21例, 女性11例;平均年龄 (70.9±3.1) 岁, 中位年龄71岁。ECOG评分:0分11例 (34.4%) 、1分12例 (37.5%) 、2分9例 (28.1%) 。局部进展7例 (21.9%) , 远处转移25例 (78.1%) 。
1.3 治疗方法
伊立替康75 mg/㎡, 持续静脉滴注90 min, 第1、8、15天, 28 d为1个周期。有效者最多化疗6个周期。化疗前常规给予托烷司琼等预防呕吐及伊立替康前常规给予阿托品0.25 mg肌内注射, 预防类胆碱能综合征, 化疗后如有延迟性腹泻给予洛哌丁胺治疗, 治疗过程中, 不允许预防性使用集落刺激因子, 也不允许同时运用其他抗肿瘤治疗和免疫治疗。
1.4 疗效及毒副反应评价
采用实体瘤疗效评价标准分为完全缓解 (CR) 、部分缓解 (PR) 、稳定 (SD) 和进展 (PD) 。毒性评价依据美国癌症研究所 (NCI) 化疗毒性分级标准 (CTC3.0版) 。化疗期间每天记录化疗毒副反应, 每周期化疗前3天内查体, 每2个周期影像学检查, 评价客观肿瘤变化。有效者 (CR+PR) 需在4~5周内再次确认, 化疗疗效及毒副反应由独立评估人员评定。疾病进展时间 (TTP) 和生存时间 (OS) 均从治疗的第1天开始计算。
1.5 随访
采用患者来院复诊、电话随访等方式进行随访。对那些中止治疗后无疾病进展的患者来说, 应每隔6周进行一次肿瘤评估, 直至疾病进展为止。此外, 应每3个月记录所有患者的生存期和其他治疗情况, 直至患者死亡为止。
1.6 统计学方法
采用SPSS 17.0软件进行统计分析, 生存率和缓解期用Kaplan-Meier法计算, α=0.05。
2 结果
2.1 疗效
全组患者共完成120个周期化疗, 每例患者中位化疗周期为4个, 患者至少完成2个周期化疗方可进行疗效评价, 有1例患者未完成2个周期化疗, 在可疗效评价的31例患者中, CR 0例, PR 5例, SD 7例, PD 19例, 有效率为16.1%, 疾病控制率为38.7%, 1年生存率为12.9%。
2.2 生存情况
本组患者中位疾病进展时间为3个月, 95%CI为2.039~3.961个月, 图1为本组疾病进展时间的Kaplan Meier曲线。
本组中位总生存时间为7个月, 95%CI为5.980~8.020个月, 图2为本组总生存时间的Kaplan-Meier曲线。
2.3 伊立替康化疗期间主要不良反应
本组31例患者在伊立替康化疗期间主要不良反应为消化道反应、黏膜炎及血液学毒性 (见附表) , 其他还有过敏反应、手足综合征及心电图的改变等。
3 讨论
食管癌侵袭性高、预后差, 在我国主要以食管鳞癌为主, 西方国家以腺癌为主。以顺铂+氟尿嘧啶为基础的化疗有效率在25%~35%[4], 多数有效的患者仅为部分缓解, 缓解时间短。对治疗失败的进展期老年食管鳞癌患者的治疗, 目前没有标准的化疗方案。研究显示紫杉醇类、吉西他滨、奥沙利铂等治疗进展期食管癌有一定的疗效。伊立替康为半合成水溶性喜树碱衍生物, 其代谢产物SN-38为DNA拓扑异构酶Ⅰ的抑制剂, 其与拓扑异构酶Ⅰ及DNA形成的复合物能引起DNA单链断裂, 阻止DNA复制及RNA的合成, 为细胞S期特异性药物。伊立替康对多种肿瘤细胞有抑制及杀灭作用, 起初用在大肠癌、宫颈癌及小细胞肺癌等治疗上, 近年来受到广泛的重视, 在食管癌的治疗上取得良好的效果, 对顺铂治疗失败的食管癌, 仍有较好的效果[5]。研究发现伊立替康单药治疗食管癌的有效率为14.0%~22.2%。LLSON、AJANI等研究显示伊立替康+顺铂在缓解率及疾病控制率方面较顺铂+氟尿嘧啶有优势, 但是伊立替康+顺铂的不良反应发生率较顺铂+氟尿嘧啶高。HAWKES等[6]研究显示伊立替康+多西他赛治疗食管癌的PFS为11个月, OS为24个月, 取得了不错的治疗效果, 但是毒副作用较明显, 患者耐受性差。
伊立替康+其他药物治疗食管癌时患者不良反应较重, 考虑本研究入组的为老年进展期食管鳞癌患者, 既往有化疗史, 一般情况相对较差, 联合用药可能导致老年患者毒副反应严重, 不能耐受, 所以, 本研究采用单药伊立替康75 mg/m2静脉滴注第1、8、15天, 28 d 1个周期, 治疗进展期老年食管鳞癌患者31例, 实验结果显示有效率为16.1%, 疾病控制率为38.7%, 1年生存率为12.9%。中位疾病进展时间为3个月, 中位总生存时间为7个月。该方案的毒副作用主要为延迟性腹泻、骨髓抑制及消化道不良反应, Ⅲ、Ⅳ血小板减少为16.1%, 粒细胞减少为19.4%, 腹泻为12.9%, 恶心呕吐为19.4%, 患者能耐受治疗期间的不良反应。ENZINGER等[7]Ⅱ期临床试验纳入46例食管腺癌, 接受伊立替康125 mg/m2, 静脉滴注大于90 min, 第1、8、15、22, 1次/6周, 总有效率为14%, 中位生存期6.4个月, 3~4级不良反应包括中性粒细胞降低23%, 迟发性腹泻30%, 呕吐14%, 疲劳14%。BURKART等[5]报道了13例含铂方案失败后的食管癌患者接受CPT-11单药100 mg/m2第1、8、15天, 1次/4周, 缓解率15.4%, 耐受性尚可, Ⅲ度腹泻23.1%, 但中位疾病进展时间仅2个月。本研究纳入的32例老年食管鳞癌与ENZINGER研究纳入的46例食管腺癌在生存期方面基本相似, 说明伊立替康治疗食管鳞癌的疗效与腺癌相近, 较BURKART研究延长, 可能是研究样本量较小有关, 需要大样本的临床试验证实。在毒副反应方面较ENZINGER研究轻, 与BURKART研究相近, 可能与用药的时间及剂量不同有关。
综上所述, 本研究纳入的均为进展期老年食管癌患者, 伊立替康单药治疗后显示, 中位疾病进展时间及中位总生存时间分别为3个月和7个月, Ⅳ度不良反应发生率为12.9%, 毒副反应尚可耐受, 未出现化疗相关性死亡。伊立替康单药可以作为进展期老年食管鳞癌的治疗方案。伊立替康的使用剂量、用药时间及治疗进展期食管腺癌的效果有无差异需要进一步研究。
参考文献
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[2]JEMAL A, SIEGEL R, WARD E, et al.Cancer statistics, 2007[J].CA Cancer J Clin, 2007, 57 (1) :43-46.
[3]王瑞林.晚期、复发转移性食管癌姑息性药物治疗进展[J].肿瘤基础与临床, 2009, 22 (1) :83-90.[3]WANG RL.Progress in palliative drug therapy of advanced, recurrent metastatic esophageal cancer[J].Gournal of Basic and Clinical Oncology, 2009, 22 (1) :83-90.Chinese
[4]SHIBATA Y, BABA E, ARIYAMA H, et al.Metastatic basaloid squamous cell carcinoma of the esophagus treated by 5-fluorouracil and ciaplatin[J].World J Gastroenterol, 2007, 13 (26) :3634-3637.
[5]BURKART C, BOKEMEYER C, KLUMP B, et al.A phaseⅡtrial of weekly irinotecan in cisplatin refractory esophageal cancer[J].Anticancer Res, 2007, 27 (4C) :2845-2848.
[6]HAWKES E, OKINES AF, PAPAMICHAEL D, et al.Docetaxel and irinotecan as second-line therapy for advanced esophagogastric cancer[J].Eur J Cancer, 2011, 47 (8) :1146-1151.
早期食管鳞癌 第7篇
1 材料与方法
1.1 材料
本组59例, 取材2011年1月-2012年1月本院胸心外科手术切除的食管鳞癌标本为癌症组, 同一患者癌旁>5 cm的正常组织为对照组, 其中男35例, 女24例, 年龄48~79岁, 平均 (53.85±6.36) 岁;按照2003版国际抗癌联盟UICC标准分期:I期1例, Ⅱ期28例, Ⅲ期27例, Ⅳ期3例;分化程度按高、中、低分化分别为12、34、13例;有淋巴结转移18例, 无淋巴结转移41例。大体分型:髓质型31例、蕈伞型8例、溃疡型8例、缩窄型6例。所有病例术前均未行化疗、放疗、免疫或生物治疗, 并且均有完整临床资料以及病理诊断。
1.2 主要试剂
DAB显色剂、Trizol RNA提取液试剂盒、目的基因引物、β-actin基因引物购自上海生基生物科技有限公司, DNA Marker购自广州东盛生物科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1逆转录-聚合酶链反应 (reversetranscription PCR, RT-PCR)
1.3.1.1 RNA的提取
标本研磨后, 用Ta Ka Ra公司的Trizol试剂和氯仿提取RNA, 经异丙醇沉淀, 75%乙醇洗涤, 室温干燥后加30μL的DEPC进行沉淀。取2μL进行1%琼脂糖凝胶测定, 另取2μL稀释50倍后紫外测OD 260的吸光度, 其余进行c DNA合成。
1.3.1.2 c DNA合成
根据M-MLV第一链c DNA合成试剂盒 (上海生工生物工程技术服务有限公司) 使用说明:上述提取的RNA 4μL (约1μg) , Oligo (d T) (5μM) 1μL, RNase free d H2O至6μL, 70℃保温10 min, 冰上急冷2 min, 离心数秒使模版RNA/引物的变性溶液聚集与EP管底部。在上述EP管中再加入2μL 5×M-MLV Buffer, 0.5μL d NTP mix (各10 m M) , 0.25μL RNase Inhibitor (40 U/μL) , 0.5μL RTase M-MLV (RNase H-) 加RNase free d H2O至10μL, 42℃, 1 h。70℃, 保温15 min后冰上冷却, 得到的c DNA保存-20℃, 并直接用于下一步PCR扩增。
1.3.1.3目的条带扩增
参照试剂盒上的说明, 按照表1数据配制PCR反应液。加入后, 充分混匀, 按表2条件进行PCR扩增。
1.3.1.4琼脂糖凝胶电泳和图像分析
取10μL PCR扩增产物、2μL上样缓冲液、1μL Syber-green混匀, 向2.0%琼脂糖凝胶孔中点样, 设定电泳条件:电压120 V, 电流50 m A, 电泳后取出凝胶, 在紫外灯下观察并进行扫描及拍照, 目的基因及β-actin扩增产物在紫外灯下的荧光条带与Maker比较后, 显示扩增产物大小与预期相符。分别为Rho E 169 bp;EGFR341 bp;β-actin 660 bp;见图1、2。用UVIbland凝胶图像处理软件对扩增产物Rho E、EGFR和β-actin的表达强度进行分析, 并计算各个基因的表达相对系数 (即目的基因表达强度/β-actin的表达强度) 。
*表示2~4步进行30个循环
1.4 统计学处理
运用SPSS 17.0对所得数据进行分析, 计量资料以 (±s) 表示, 比较使用t (或t') 检验, 对于三者或者三者以上之间的比较则应用单因素方差分析以及非参数检验等统计学方法进行分析, 以P<0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Rho E与EGFR在食管癌组织及正常组织中的表达
RT-PCR结果显示, 食管癌组织中Rho E蛋白呈低表达, EGFR蛋白呈高表达, 见表3。
2.2 Rho E与EGFR基因的表达与食管鳞癌的临床病理指标之间的关系
Rho E与EGFR表达水平的高低与食管鳞癌的分化程度、浸润与否、淋巴转移以及病理分期都有着密切的关系 (P<0.001) , 但是与肿瘤的位置、大小和分型无关 (P>0.05) , 见表4。
*经方差齐性检验, 两组总体方差不等, 采用t′检验
2.3 食管鳞癌组织中Rho E与EGFR表达的相关性
运用Spearman秩相关分析对食管鳞癌组织中Rho E与EGFR m RNA的相对表达系数进行分析, 结果显示r=-0.812, P<0.01, 提示两者在食管癌组织中的表达呈负相关。
3 讨论
Rho E又称Rnd3, 属于一种小分子G蛋白[2];它独特的结构及特点决定了它许多特异的功能。Rho E在很多肿瘤中都存在异常表达, 并呈现出一定的特异性[3]。研究表明Rho E可以通过抑制Ras→Raf→MEK→ERK信号通路的传导而抑制细胞周期的进展。Zhao等[1]发现, 食管鳞癌体外癌细胞中Rho E基因表达的上调, 可以抑制细胞的增值、降低癌细胞的侵袭性、促进细胞的凋亡。
EGFR属于Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶生长因子受体, EGFR的经典信号传导通路有:PI3K/PDK1/AKT通路、Ras/Raf/MAPK通路、STATs通路、PLCγ/Ca MK/PKC通路。EGFR的核内信号通路属于非经典的信号传导通路, 此通路启动后, 可以使细胞周期的进程加速[4]。现有研究发现, 多种恶性肿瘤细胞的增值、侵袭及转移与EGFR表达水平上调密切相关[5]。
由上述各研究结果可以看出, EGFR和Rho E均作用于Ras传导通路, 但两者所起的作用不同, 甚至在某些方面是恰恰相反的, 目前尚没有研究证明两者之间有无联系以及有着怎样的联系。根据本实验的研究数据不难发现, 在食管鳞状细胞癌中, Rho E可能是一个候选的抑癌基因, 并反馈抑制EGFR的高表达。因此笔者考虑在进一步的实验中拟通过基因沉默及过表达的方法人为的提高或降低Rho E的表达水平, 同时检测EGFR的表达水平, 并进一步行动物实验构建食管鳞癌动物模型。如果实验成功, 将能够为延缓食管癌的发展、提高患者的生存率、充分评估预后生存以及为食管癌的临床治疗提供新的思路和方法。
参考文献
[1]Zhao H, Yang J, Fan T.Rho E functions as a tumor suppressor in esophageal squamous cell carcinoma and modulates the PTEN/PI3K/Akt signaling pathway[J].Tumour Biol, 2012, 33 (5) :1363-1374.
[2]Foster R, Hu K Q, Lu Y, et al.Identification of a novel human Rho protein with unusual properties;GTPase deficiency and in vivo famesylation[J].Mol Cell Biol, 1996, 16 (6) :2689-2699.
[3]Belgiovine C, Frapolli R, Bonezzi K, et al.Reduced expression of the ROCK inhibitor Rnd3 is associated with increased invasiveness and metastatic potential in mesenchymal tumor cells[J].PLo S One, 2010, 5 (11) :141-154.
[4]Hsu J M, Chen C T, Chou C K, et al.Crosstalk between Arg 1175methylation and Tyr 1173 phosphorylation negatively modulates EGFR-mediated ERK activation[J].Nat Cell Biol, 2011, 13 (2) :174-181.