肺干细胞范文（精选8篇）
肺干细胞 第1篇
1 材料与方法
1.1 材料
(1)动物购买,雄性Wistar大鼠60只,体重250g左右,购于哈尔滨医科大学附属二院动物实验中心。(2)主要实验药物和试剂,博来霉素(Bleomycin,BLM)系日本化药株式会社产品;胎牛血清(美国Gibco公司);胰酶(德国Sigma公司);DMEM/F12(美国Gibco公司);转化生长因子-β1(TGF-β1)免疫组化试剂盒(武汉博士德生物有限公司);羟脯氨酸试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。(3)主要实验仪器,电子天平BL610、石蜡切片机、倒置相差显微镜、数显电热恒温水温箱HH.W21.600S、KR-180FA高速离心机、Olympus数码相机、流式细胞仪、恒温培养箱、紫外分光光度仪、动物手术器械、纱布、注射器等。
1.2 方法
(1)骨髓间充质干细胞的分离培养,将4周龄Wistar雄性鼠一只放至动物实验室操作台上,用0.5mL水合氯醛腹腔注射,用无菌手术刀将鼠股骨和胫骨的皮毛剥离,在股骨头处剪断,放入培养皿中;迅速回到细胞间,取出股骨后向胫骨头剔除肌肉到关节处反向瓣,取出胫骨,放入另一培养皿中;左手用小镊子夹住骨干,右手用小剪刀将干骺端剪断,尽量多的保留干骺端;用5mL注射器冲洗骨髓直至骨髓变白;以1 000r/min离心5 min;用吸管吸约5 mL含10%FBS的DMEM/F12到离心管中;血细胞计数器计算细胞总数;按1×106个细胞/cm2接种到T25的塑料培养瓶;将培养瓶放入37.0℃、5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱中培养;72h后去除未贴壁的造血细胞、全量换液,以后每隔(2~3)d换液1次。10d~14d,待贴壁细胞85%融合后需进行消化传代,倒置相差显微镜下观察细胞形态变化;待大部分细胞变圆悬浮后,加入10 mL含10%FBS的DMEM/F12培养液终止消化;用含10%FBS的DMEM/Fl2培养液重新悬浮细胞;按1∶2传代培养。以后各传代过程如上,根据细胞密度调整细胞传代时间及比例。
1.3 动物分组
大鼠称重后腹腔注射10%水合氯醛(0.3mL/100g)麻醉,锐性分离浅筋膜,用1 mL注射器在两个环状软骨之间刺入。气管内注入含博来霉素的生理盐水(0.2~0.3)mL(5mg/kg),对照组气管内注入等体积生理盐水,以大鼠长轴为中心,立即旋转大鼠,使药液在肺内分布均匀,缝合颈部皮肤,局部青霉素消毒防止感染。将(220~250)g雌性Wistar大鼠60只随机分入以下各组,各组15只。生理盐水对照组(A组)即刻气管内注入PBS溶液50μL;BLMS模型组(B组),即刻气管内注入博莱霉素5mg/kg;MSC治疗组(C组),即刻气管内注入博莱霉素后立即尾静脉注射移植MSC 1×107/mL,200μL;MSC治疗组(D组),气管内注入BLMS14d后移植MSC 1×107/mL,200μL。
1.4 标本采集与处理
4组分别于造模后7d、14d、28d各随机处死5只。称取小鼠体重,剖开腹腔,充分暴露腹主动脉,经腹主动脉放血后处死;剪开胸腔,分离肺组织,从右主支气管气管插管,然后结扎近端,注入4%多聚甲醛,完全冷却后加入固定液使肺复张,置于同样固定液中浸泡右肺,石蜡包埋和连续性切片,切片厚度为4μm,其中一部分进行HE染色和Masson染色做组织诊断学用,另外一部分进行免疫组化染色。
1.5动物一般情况
观察Wistar大鼠精神状态、反应灵敏度、活动情况、被毛(被毛是否光滑、有无光泽、有无脱毛)、皮肤(颜色、温度、弹性等)、食欲、体重、死亡情况。
1.6 病理组织学改变HE染色
参照Szapiel等方法,观察肺泡炎的程度。0级:无肺泡炎;Ⅰ级:轻度肺泡炎,镜下可见到肺泡间隔是由于单核细胞浸润而增厚,但病变仅仅局限于局部和胸膜底部,所占面积少于全肺20%,肺泡结构正常;Ⅱ级:中度肺泡炎,肺泡炎症病变较广泛,受累面积占全肺的20%~50%,胸膜基底部较重;Ⅲ级:弥漫性肺泡炎,病变范围>50%,偶可见到肺泡腔内有单核细胞及出血造成的实变。
1.7 胶原纤维染色的定性分析
参照Fulmer方法,用Masson染色将肺纤维化分5级:0级:正常肺组织;Ⅰ级:微小纤维化,肺泡间隔基本正常,局部有间质纤维化,无肺泡的破坏及肺网架结构的改变,肺胶原纤维与正常肺相比升高不小于10%;Ⅱ级:轻度纤维化,肺泡间隔为轻度增厚,部分区域有正常肺泡,全肺的胶原纤维与正常肺相比占10%~25%;Ⅲ级:中度纤维化,肺泡间隔中度增厚,正常肺泡少见,间质结构破坏,全肺胶原纤维与正常肺相比升高至25%~40%;Ⅳ级:严重纤维化,所有的肺泡间隔均有不同程度增厚,但仍有可辨认的肺泡结构存在,许多修复部位失去正常间质结构,全肺胶原纤维与正常肺相比升高至40%以上。
1.8 大鼠肺组织细胞来源检测
取(50~100)mg肺组织按照组织基因组DNA提取试剂盒方法,分别于C组7d、14d、28d及D组28d肺组织提取DNA,聚合酶链反应(PCR)扩增SRY基因。以2%琼脂糖凝胶中电泳,凝胶成像系统摄像,以雌、雄Wistar大鼠为阴、阳性对照。合成SRY大鼠基因,上游引物:5’-tttagtgttcagccctacagcc-3’,下游引物:5’-atgctgggattctgttgagcc-3’,扩增长度为322bp;内参照:β肌动蛋白(β-actin)上游引物:5’-cacgatggaggggccggactcatc-3’,下游引物:5’-taaagacctctatgccaacacagt-3’,扩增长度为240bp。聚合酶链反应(PCR)扩增反应条件:94℃预变性5min,94℃变性30s,52℃退火30s,72℃退火3 0s,循环50次,72℃延伸7min。
1.9 HYP检测
取各组大鼠右肺中上叶称重(50mg),采用分光光度计560nm波长比色,记录吸光度值,根据试剂盒所给公式计算待测标本的HYP含量,确定肺组织纤维化程度。
1.1 0 免疫组织化学法测定TGF-β1蛋白表达
免疫组化检测指标的半定量分析,自动计算其积分光密度(integrated optical density,IOD)值进行半定量分析。
1.11统计学处理
采用SPSS13.0统计软件处理,P<0.05为有统计学意义,统计方法使用方差分析等。
2 结果
2.1 细胞培养
第1天即贴壁,第2天时贴壁细胞较多,第3天可以看到骨髓细胞在培养瓶中长出明显的MSC克隆,为椭圆形、梭状,似成纤维细胞样。骨髓内的造血干细胞等其他的细胞在培养瓶中为悬浮方式生长,经多次换液后造血干细胞及其他的细胞逐渐减少。约10d后原代细胞85%融合,进行传代。传代后细胞度过抑制期后迅速增长,每传1代需要(3~4)d,随着传代次数的增加,细胞形态呈均匀一致的长梭形,排列成旋涡状或放射状。
2.2 大鼠术后观察
A组大鼠术后苏醒很快,苏醒后仅有短暂活力下降,恢复术前的活力快,进食好,体重逐渐增长;B组大鼠术后苏醒较慢,不爱活动,进食较少,皮毛凌乱、无光泽,唇及爪发绀,可以听到大鼠的喘息声,体重明显减轻;C组大鼠术后苏醒较慢,术后4d~5d内活力较差,进食较少,体重不增长,第5天后大鼠一般情况逐渐好转,体重逐渐增长。D组大鼠术后苏醒更慢,于术后7d、8d活力仍差,进食少,体重不增长,第8天后小鼠一般情况才逐渐好转,体重逐渐增长。
2.3 肺组织HE染色、Masson染色
A组光镜下可见肺泡间隔无增厚,无水肿、炎症及纤维化表现,肺泡腔没有缩小,且无明显渗出。B组灌注博来霉素后的7d内表现为急性炎症,肺泡的间隔增厚,肺泡腔及间隔内炎症细胞聚集;第14天炎性细胞渗出明显减轻,肺泡间隔增厚,而成纤维细胞增多,肺组织以纤维化改变为主。第28天肺泡结构破坏,肺泡腔明显缩小,肺间质被胶原纤维和成纤维细胞替代,纤维化明显。C组:于7d肺组织的充血明显减轻,点状出血明显减少,14d和28d双肺颜色发暗,表面较粗糙,体积缩小不明显。各时间点肺泡炎与肺纤维化评分与B组比较均显著减轻(P<0.05),仍较A组严重(P<0.05)。D组:28d时双肺颜色暗,表面粗糙,体积缩小不明显。肺泡炎较B组减轻,肺纤维化评分较B组减少,但均较A组、C组严重。各组肺泡炎及肺纤维化评分结果见表1、表2。
分
分
2.4 Y染色体性别决定区SRY基因检测
A组及B组检测不到SRY基因,但C组和D组各时间点均能检测到SRY基因。
2.5 HYP检测肺组织纤维化程度
B组注BLM后7d,HYP含量开始升高,28d达到最高峰,高于其他3组,与A组相比各时间点HYP含量有统计学意义(P<0.01)。C组与D组大鼠HYP含量均呈低水平升高趋势,造模后7d、14d、28dHYP含量均显著低于B组(P<0.05)。与形态学肺纤维化观察结果相一致(见表3)。
μg/g
2.6 大鼠肺组织中TGF-β1
大鼠肺组织TGF-β1蛋白表达在胞浆呈黄色或棕黄色颗粒,主要定位于肺泡巨噬细胞胞浆中,以细胞胞浆、胞膜、细胞外基质染为棕色为阳性;每张切片选取5个视野,计阳性细胞数/高倍视野(见表4)。博莱霉素处理大鼠的肺组织TGF-β1表达明显、范围广,特别是在第14天时肺泡腔和间质中出现大量的TGF-β1强阳性的肺泡巨噬细胞,肺组织中TGF-β1阳性的肺泡巨噬细胞,可以单个或成群肺泡巨噬细胞出现。
3 讨论
在间质性肺疾病中,以IPF最为常见,预后极差,从最初确诊到死亡的平均时间是(3~5)年。尽管过去数十年在IPF发病机制研究取得了很大进展,但其发病机制尚不十分清楚。过去认为IPF是一种慢性的炎症反应,因而解释了最初使用皮质类固醇激素治疗的原因。目前糖皮质激素为治疗IPF的经典药物,但是仅有10%~30%的IPF病人对糖皮质激素治疗有一定的疗效[3],而且没有完全或持续缓解者,因此有学者不推荐单独使用糖皮质激素治疗IPF病人。且糖皮质激素副反应大,临床应用受限。近年来,随着对本病发病机制和病理生理变化的研究以及分子生物学技术的应用,干细胞的研究引起了人们的极大关注,其中研究最多的是MSC。在体外特定的条件下,MSC可以定向诱导分化为骨、软骨、脂肪、心肌、神经、皮肤上皮、肝脏、胰岛B细胞等多种类型细胞[4],被认为是组织工程领域的理想种子细胞来源。本实验研究的是MCS对博来霉素诱导的肺纤维化的治疗机制。文献上报道的构建肺纤维化模型的方法有多种,如应用博来霉素、百草枯、放射线、高浓度氧等,博莱霉素气管内给药因存在方法可靠、操作简单、制模时间短等[5]优点,且博莱霉素致纤维化动物模型与人类IPF的病理学改变相似,所以用博莱霉素复制肺纤维化动物模型是目前普遍采用的方法[6]。本实验表明:灌注博来霉素后7d内表现为急性炎症,肺泡间隔明显增厚,肺泡腔及间隔内炎症细胞聚集;于第14天时炎性细胞渗出减轻,成纤维细胞增多,肺组织以纤维化改变为主。于第28天肺泡结构破坏,肺泡腔明显缩小,纤维化明显。说明大鼠肺纤维化模型造模成功。
骨髓来源干细胞疗法是生物学发展最为迅速的领域之一。骨髓间充质干细胞是由中胚层发育的早期细胞,有着较强的自我增殖能力和多向分化潜能,因此为许多复杂疾病的治疗带来了曙光。按发生学来源可将干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。近年来,越来越多的证据表明成体干细胞具有较强的多系分化潜能,大量的研究显示成体干细胞可以向包括肺组织在内的多种非造血细胞类型分化[7]。作为成体干细胞的一种,MSC在研究和应用方面具有以下优点:(1)可自体移植避免了免疫排斥;(2)在正常情况下处于静止状态,只有在病理情况下才显示出一定的自我更新潜能,因此癌变的可能性较小;(3)由于分化潜能比较局限,更容易被诱导向特定的组织细胞分裂,可以直接用于体内组织的原位修复;(4)某种类型的成体干细胞有向同种组织的损伤部位迁移的趋势,这有助于临床应用干细胞来进行疾病替代治疗时的定位;(5)分离和使用成体干细胞不存在伦理学问题[8]。至今为止,MSC的分离、培养方法比较常用的是贴壁细胞分离法、密度梯度离心法、流式细胞分选法、免疫磁珠分离法等。本实验所采取的是全骨髓贴壁细胞分离法,这个方法操作比较简单、快速、容易掌握、不易污染,比较符合细胞生长的微环境,可经过多次传代以获得足够量细胞的优点。收集第4代MSC细胞用于实验,经过3次传代后可以获得足够的细胞数量;另外第4代细胞很好地保持了其分化特性,符合实验要求。
转化生长因子-β1最初是从血小板中分离出来的一种细胞因子,因其能促进成纤维细胞转化生长而得名。它是由多种细胞分泌的具有多重生物学效应的细胞因子。TGF-β1是迄今发现的最强的细胞外基质沉积促进剂,其作用于多个环节,刺激各种细胞外基质成分合成和沉积,在减少基质降解酶及增加降解抑制剂合成的同时,还是一个强大的细胞增殖调节剂,促进肺成纤维细胞增殖,在肺纤维化发展中起关键作用,是目前研究最多的纤维化促发因子[9]。早期通过趋化炎症细胞参与肺损伤和炎症反应,而后主要是促进细胞外基质形成和抑制其酶解作用,促进纤维蛋白原向肌成纤维细胞转化,同时影响其他纤维化细胞因子,导致纤维化发生[10]。本实验研究结果表明,博来霉素灌注后第7天可见肺泡腔和间质中出现较多的TGF-β1强阳性的肺泡巨噬细胞,第14天时肺泡腔和间质TGF-β1阳性的肺泡巨噬细胞达到高峰,于第28天肺组织中TGF-β1阳性的肺泡巨噬细胞比第7天及第14天减少。与B组比较,C组、D两组肺组织中TGF-β1阳性的巨噬细胞数量明显少,差异有统计学意义。
外源性MSC的确能移植到损伤肺组织中,并具有减轻肺泡炎、肺纤维化的作用。MSC在体外培养即能分泌TGF-β1,且该细胞因子有抑制淋巴细胞增殖的作用,而当MSC进入实验动物体内后,由于微环境的改变,TGF-β1的表达可能会有改变,因此其在这个修复过程中的作用需进一步研究。
参考文献
[1]Raghu G,Collard HR,Egan JJ,et al.ATS/ERS/JRS/ALATCommittee on idiopathic pulmonary fibrosis:an official ATS/ER S/JRS/ALAT statement:idiopathic pulmonary fibrosis:evidence-based guide lines for diagnosis and management[J].Am JRespir Crit Care Med,2011,183(6):788-824.
[2]Raghu G,Weycker D,Edelsberg J,et al.Incidence and prevalence of idiopathic pulmonary fibrosis[J].Am J Respir Crit Care Med,2006,174:810-816.
[3]罗玲,刘忠.特发性肺纤维化的治疗现状[J].临床肺科杂志,2007,12:967-969.
[4]Gimble JM,Guilak F,Nuttall ME,et al.In vitro differentiation potential of mesenchymal stem cells[J].Transfus Med Hemoth,2008,35:228-238.
[5]Taooka Y,Maeda A,Hiyama K,et al.Effects of neutrophil elastase inhitbitor on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice[J].Am J Respir Crit Care Med,1997,156(1):260-265.
[6]Felix C,Jack G,Geoffrey J.Pulmonary fibrosis searching for model answers[J].Am J Respir CellMol Biol,2005,33:9-13.
[7]Krause DS,Theise ND,Collector MI,et al.Multi-organ,multilineage engratlnaent by a sinmarrow-derived stem cell[J].Cell,2001,105:369-377.
[8]裴雪涛.于细胞生物学[J].北京:科学出版社,2003:34-38.
[9]魏立,赖西南,王正国,等.创伤愈合过程中伤口组织内SP、NO和NOS表达变化及其可能作用[J].第三军医大学学报,2004,26(19):1704-1707.
肺干细胞 第2篇
关键词：电针经穴;COPD;单肺通气;红细胞免fa疫
慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种以呼吸道、肺实质和肺血管的慢性炎症为基础的疾病，COPD患者单肺通气期间易发生气道痉挛和分泌物增多，气道阻力升高，肺通气血流比例失调，肺换气功能下降，易发生低氧血症。研究表明，COPD患者存在明显的红细胞免疫功能低下，红细胞免疫功能与肺心病的发生密切相关。而电针经穴可减轻肺缺血再灌注损伤。本课题前期研究也证实电针经穴可降低COPD患者单肺通气期间气道阻力，提高氧合功能因此，筆者旨在继续探讨电针经穴是否能通过改善COPD患者的红细胞免疫功能从而在单肺通气中起肺保护作用。
一、临床资料
1. COPD诊断标准。具有长期咳嗽以及咳痰的病史，胸部呈现桶装，胸部听诊音过清;呼吸缓慢加重;胸透显示肺气肿;第1秒的FEV1/FVC<0.7：1。
2.所有患者均符合慢性阴阻型疾病的诊断标准，同时本次试验均在患者自愿的前提下进行的。
3.一般资料。选取2012年1月～2013年6月，于中山市医院节后胸科手术的患者为研究对象，共有患者90例。年龄在19～67岁之间，平均年龄为（49.1±4.5）岁;ASA有三个等级分别为Ⅱ级、Ⅲ级。心功能等级为1级或者2级。所有患者的肝肾没有发现异常。将研究对象随机分为3组，每组各有患者30例.3组分别为对照组（C组）、电针非经穴组（EN组）和电针经穴组（EA组）。3组患者在年龄、性别等一般资料上，不具有明显差异（P>0.05）.具有可比性。具体情况如表1所示。
二、治疗方法
1. 行胸科手术并单肺通气。对进入手术室后患者实施常规监测，注射药物有四种，分别为：咪达唑仑、芬太尼、丙泊酚、罗库溴胺。四种药物的注射剂量分别为：0.05 mg/kg、4 μg/kg、2 mg/kg、1 mg/kg。注射方式为静脉注射法。将双肺的通气参数设置为：10 ml/kg的VT，1︰2的吸呼比，4～4.7kPa的维持呼气末二氧化碳分压。对于手术时间大于4小时、单肺通气时间小于1.5小时、手术中输血以及接受全肺切除手术的患者，排除此次研究。分别于单肺通气前（T1）、单肺通气30、60、90 min时（T2～4）、术毕（T5）时取颈内静脉血样3ml，分离红细胞，采用郭峰法测定红细胞C3b受体花环率（RC3bRR）及免疫复合物花环率（RICR），红细胞C3b受体花环促进率（RFER）和抑制率（RFIR）。
2. EA组。在手术前3天，对患者的双侧经穴进行电刺激，对于合谷、足三里穴位刺入针，使用G6805-2型电针仪，对其进行通电。电波频率设置为疏波4Hz、密波20Hz.刺激强度必须要在患者的耐受范围内。电流最高值为5mA。电刺激每天执行2次，每次实施半小时，一共刺激六次。刺激时间固定在每天的9：00和17：00。
3. EN组。在非经非穴处进行针刺处理，接受与EA组相同的处理方式。
4. C组。不接受任何处理方式。
三、观察指标与统计学方法
1.观察指标 。分别在单肺通气前（T1）、单肺通气30、60、90 min时（T2～4）时，取颈内静脉血5ml。采用郭峰法测量红细胞C3b受体花环率（RC3bRR）及免疫复合物花环率（RICR），红细胞C3b受体花环促进率（RFER）和抑制率（RFIR）。
2.统计学方法。实验数据使用均数±标准差（ ±s）的方式表示，采用SPSS 17.0 统计软件对分析试验数据，利用单因素方差分析，多重比较满足方差齐性时采用LSD检验，方差不齐采用Dunnetts T3检验。上述检验均以P<0.05为差异具有统计学意义。
四、结果
3组COPD患者单肺通气期间不同时点红细胞免疫功能变化 见表2。与C组比较，EN组在T1～5各时间点RC3bRR、RICR、RFER、RFIR差异均无显著性意义（P>0.05）;EA组各时点RC3bRR、RFER升高，RICR、RFIR降低，差异均有统计差异（P<0.05）。与EN组比较，EA组T1～5各时间点RC3bRR、RFER升高，RICR、RFIR降低，差异均有统计差异（P<0.05）。
五、讨论
针刺足三里、合谷穴有良好的镇痛作用。动物实验显示，电针刺激足三里能明显改善COPD大鼠肺功能及降低炎症介质IL-1β和IL-6含量;足三里穴是足阳明胃经的重要穴位，也是目前研究针刺调节免疫系统的常用穴位之一。因此，本研究选择双侧合谷穴、足三里穴，具体方法参照文献的电针方法。
红细胞有非常重要的免疫功能，对许多疾病的免疫发病机制有重要的作用，具有重要的地位。红细胞是体内清除循环免疫复合物（CIC）的主力，通过其膜表面的C3b受体（RC3bRR）与C3b相黏附现其上述作用;红细胞还可识别、储存和提呈抗原。红细胞的免疫功能主要体现为，可以将携带抗原的细胞有效识别出来，同时能够将代谢过程中产生的代谢废物清除人体循环，能够增强T细胞的依赖作用，同时起到了效应细胞的样作用，对病原体进行吞噬。这些免疫功能的基础在于红细胞的黏附作用。可以通过C3b受体，将循环中的代谢废物粘附在红细胞上，进而转移到肝脏或者脾脏位置，利用吞噬细胞，销毁废物细胞。如果红细胞的黏附作用降低，则会使循环中的免疫复合物增多，进而影响到循环的正常运行。RC3bRR、RICR主要反应红细胞的免疫粘附功能，RFER、RFIR反应红细胞自身调控能力。
有研究显示：COPD患者红细胞免疫功能表现异常，红细胞C3b受体活性受到一定抑制，同时粘附CIC增加并伴有CIC解离障碍，属“继发性红细胞免疫功能低下”。且红细胞免疫功能与COPD患者病情的严重程度密切关系。
COPD患者单肺通气时可產生通气与血流比例失调和肺内分流增加等一系列病理生理反应，易导致换气功能异常及低氧血症的发生。本课题前期研究结果表明，围术期电针经穴可改善COPD患者围术期单肺通气时呼吸做功，提高肺顺应性。
本研究显示，COPD患者单肺通气期间，RC3bRR、RFER随单肺通气的时间延长进行性下降，RICR、RFIR进行性升高，直至单肺通气结束，提示COPD患者单肺通气期间红细胞免疫功能随单肺通气的时间延长而产生继发性下降。而电针经穴治疗组与对症组、电针非经穴组相比，RC3bRR、RFER升高，RICR、RFIR降低。提示，围术期电针经穴可抑制COPD患者围术期单肺通气时的红细胞免疫功能下降。
综上所述，电针经穴可改善COPD患者单肺通气期间的红细胞免疫功能。
参考文献：
[1] 安符臣，唐爱霞，党小军等.慢性阻塞性肺疾病患者红细胞免疫功能和T淋巴细胞亚群变化及其相关性研究[J].陕西医学杂志，2005，34（1）：19-22.
[2] 王慧，卢文菊，陈柏铭等.慢性阻塞性肺疾病红细胞免疫功能的研究[J].广州医药，1999，30（1）：55-57.
肺干细胞 第3篇
关键词：骨髓间充质干细胞,移植,大鼠模型,急性肺损伤,炎症因子
急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是临床上常见的一种危急重症,病情严重者甚至会出现急性呼吸窘迫综合征,病死率极高,占30%~40%[1]。该病的发病机制尚未明确,但一般认为是肺内抗炎促炎平衡失调所致[2]。目前,临床上对该病尚无有效治疗措施,常用方法包括机械通气、纤溶与凝血失衡改善、抗氧化、抗炎等,治疗效果有限[3]。最近文献报道,骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)具有再生修复、免疫调节、抗氧化、抗凋亡等作用[4],且已用于治疗心、脑、肾及全身炎症反应性疾病,并取得良好的效果[5]。但MSC在急性肺损伤中的作用及其机制尚无明确结论,需进一步验证。本实验在成功建立大鼠脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)ALI模型的基础上,采取尾静脉注射MSC,观察其对脂多糖ALI大鼠白细胞介素-1β(Interleukine-1 beta,IL-1β)、人肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)等炎症因子水平及大鼠血气指标等的影响,并探讨其可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
4只无特定病原体(specefic pathogen free,SPF)级健康C57BL/6J雄性小鼠,年龄4个月,体重20~25 g,用于骨髓间充质干细胞培养。45只SPF级健康雄性Sprague Dawley大鼠,体重180~220 g。所有实验动物由天津中医药大学实验动物中心提供。
1.1.2 实验试剂
IL-1β试剂盒(武汉华美生物工程有限公司),TNF-α试剂盒(武汉博士德生物科技公司),胎牛血清(美国Hyclone公司),0.02 mol/L乙二胺四乙酸+0.25%胰酶(美国Gibco公司),低糖改良Eagle培养基(dulbecco's modified eagle medium,DMEM)培养基(美国Gibco公司),内毒素LPS(美国Sigma公司)。
1.2 方法
1.2.1 制备MSC
根据既往文献[6]标准进行小鼠MSC培养及鉴定。无菌获取SPF级雄性C57BL/6J小鼠的胫骨、股骨,取出骨髓,制成单细胞悬液,1 200 g离心3 min,选取含100 IU/ml双抗的低糖DMEM及10%胎牛血清对基重悬细胞予以培养,将浓度调至1×108/ml,并在25 cm2培养瓶中进行接种,置于二氧化碳CO2培养箱中培养,培养箱的饱和湿度控制在37℃左右,5%CO2细胞融合达80%~90%后,经0.25%胰蛋白酶消化,获取较为均质的MSC,并按1∶2传至Ⅳ代。MSC流式细胞仪分析CD34阴性(0.9%)、CD105阳性(95.3%),可见细胞纯度>95%。见图1。
1.2.2 建立大鼠ALI模型
45只SD大鼠随机划分5组,每组9只:MSC对照组(A组)、MSC低剂量组(B组)、MSC高剂量组(C组)、内毒素组(D组)、正常对照组(E组)。A组MSC 1×106个/ml 0.5 ml经尾静脉注射;B组MSC 1×106个/ml 0.5 ml+LPS 5 mg/kg经尾静脉注射;C组MSC 1×106个/ml 0.5 ml+LPS5 mg/kg经尾静脉注射;D组LPS 5 mg/kg经尾静脉注射;E组尾静脉注射等量生理盐水。于造模后6、24和72 h处死大鼠,获取标本,每个时间各组处死3只大鼠。
1.2.3 收集与处理血及肺组织标本
腹主动脉采血后立即予以血气分析。取右肺上叶,在多聚甲醛中置入右肺下叶组织,观察组织形态学。取大鼠余肺组织,生理盐水洗净,置于-70℃冰箱内液氮冷冻保存。
1.2.4肺湿重/干重比值
取右肺上叶,取量控制在250~300 mg,吸净肺表面血液,分析天平测湿重后,置入80℃烘烤,48 h后测干重。
1.2.5 肺组织形态学
取右肺下叶组织,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋、切片,苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)染色,常规光镜观察、照相。
1.2.6 测定肺组织中IL-1β和TNF-α
利用酶联免疫吸附试验法检测肺组织IL-1β、TNF-α含量。
1.3 统计学方法
采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组间比较用方差分析,方差齐则两两比较用独立样本t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肺组织病理学改变
光镜观察发现,A组肺泡腔内无明显炎症细胞浸润与红细胞渗出,间质水肿不明显,肺泡结构完整;B组肺泡腔内炎症细胞、红细胞多量渗出,部分肺泡结构破坏;C组肺泡腔内可见少量中性粒细胞、红细胞浸润,一部分肺泡间隔宽度稍微增加,大部分肺组织完整;D组肺泡腔内出现大量中性粒细胞、红细胞,可见浆液性渗出,肺组织水肿严重,大部分肺泡结构破坏;E组肺泡腔内没有发现炎症细胞浸润,支气管黏膜上皮处于完整状态,肺泡壁薄,肺组织结构十分清晰。A组和E组肺组织病理改变一致,属正常肺组织,故笔者只留取A组肺组织的镜下图。见图2。
2.2 肺湿重/干重比值
5组各时间肺湿重/干重比值比较,经方差分析,差异有统计学意义(P<0.05)。其中两两结果比较,D组6、24和72 h肺湿重/干重比值高于E组,差异有统计学意义(P<0.05);D组6 h肺湿重/干重比值与B、C组比较,差异无统计学意义(P>0.05);D组24和72 h肺湿重/干重比值高于B、C组,差异有统计学意义(P<0.05);A组与E组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
(HE染色×200)
注:1)与D组比较,t=12.154,P=0.004;2)与D组比较,t=3.497,P=0.046;3)与D组比较,t=9.367,P=0.036;4)与D组比较,t=19.253,P=0.002;5)与E组比较,t=23.790,P=0.001;6)与E组比较,t=39.098,P=0.000;7)与E组比较,t=13.843,P=0.002
注:1)与D组比较,t=23.445,P=0.001;2)与D组比较,t=19.716,P=0.002;3)与D组比较,t=36.643,P=0.000;4)与D组比较,t=6.308,P=0.043;5)与D组比较,t=38.042,P=0.000;6)与E组比较,t=41.097,P=0.000;7)与E组比较,t=7.695,P=0.040;8)与E组比较,t=21.474,P=0.001;9)与E组比较,t=43.983,P=0.000;10)与E组比较,t=47.485,P=0.000;11)与E组比较,t=17.632,P=0.002
2.3 血气分析
5组各时间动脉血氧分压(partial pressure of oxygen in arterial blood,Pa O2)、动脉血二氧化碳分压(partial pressure of carbon dioxide in arterial blood,Pa CO2)比较,经方差分析,差异有统计学意义(P<0.05)。其中两两比较结果,D组Pa CO2高于E组,差异有统计学意义(P<0.05);D组6、24和72 h Pa CO2较C组升高,差异有统计学意义(P<0.05);D组Pa O2低于E组,差异有统计学意义(P<0.05);D组24和72 h Pa O2与C组比较,差异有统计学意义(P<0.05);B组72 h Pa O2与D组比较,差异有统计学意义(P<0.05);A组Pa CO2、Pa O2与E组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。
2.4 肺组织IL-1β、TNF-α水平
5组各时间IL-1β、TNF-α水平比较,经方差分析,差异有统计学意义(P<0.05)。其中两两比较结果,D组较A组6、24和72 h肺组织IL-1β、TNF-α水平上升,差异有统计学意义(P<0.05);D组6、24和72 h肺组织IL-1β、TNF-α水平高于B、C组,差异有统计学意义(P<0.05);A组6、24和72 h肺组织IL-1β、TNF-α水平与E组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。
注:t1、P1值:A组与E组比较;t2、P2值:B组与D组比较;t3、P3值:C组与D组比较;t4、P4值:D组与E组比较
3 讨论
ALI的病理特征为多形核白细胞积聚、微血管通透性增加及非心源性肺水肿[7]。其临床表现主要为进行性低氧血症与呼吸窘迫[8];而在肺部影像学上的表现主要为非均一性的渗出性病变[9]。关于其发病机制,现阶段普遍认为多种致病因素可激活全身炎症反应或者肺组织炎症反应,多种炎症细胞穿过上皮细胞屏障与内皮细胞屏障进入肺泡腔内,大量释放细胞因子与毒素,导致肺氧合功能障碍、肺水肿及肺泡-毛细血管屏障通透性增加[10]。目前,有较多学者对于ALI的治疗进行深入研究,主要治疗措施仍是针对缺氧对症处理[11],对于ALI的失控性或失平衡性炎症,临床仍缺乏行之有效的治疗策略[12]。另外,中医药对于该病的发病机制及治疗也有一定进展,从中医角度,ALI属于暴喘、喘脱等范畴[13],病理基础为肺不主气[14],目前某些中药或复方制剂从抑制炎症反应、调节免疫功能、抗氧化等方面着手,对该病的治疗有一定疗效[15]。尽管如此,该病仍是一种极危重症,有极高的致死率,因此需要有效、可靠的治疗方法来提高临床疗效。
目前,干细胞移植术对危重疑难系统系疾病的治疗效果逐渐崭露头角[16],是国内外学者的研究热点。干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞,其自我增值能力强,可归巢至组织、修复组织损伤[17]。据报道,某些干细胞可分泌细胞因子和生长因子,该因子也可促进组织修复[18]。现阶段临床上及科研中常用的干细胞有两种,即胚胎干细胞和成体干细胞,但前者因伦理因素及致瘤风险使其应用受到限制[19],成体干细胞因不受限制则有广泛的应用前景。MSC属于干细胞的一种,主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ蛋白、MHCⅠ蛋白表达低,故其免疫原性低,异体干细胞移植耐受性高[20]。目前已有较多关于MSC的临床应用研究,如自身免疫病[21]、心脏疾病、骨骼疾病等[22]。
在体内或体外特定条件诱导下,MSC可向支气管上皮和肺泡上皮细胞分化[23]。最新研究发现,MSC对急性肺损伤具有修复功效,可以有效降低髓过氧化酶活性、肺湿干重比值[24]。张峰等[25]探讨骨髓间充质干细胞移植对内毒素诱发急性肺损伤模型兔的保护作用,发现与对照组比较,MSC移植组家兔支气管肺泡灌洗液中性粒细胞数目、蛋白含量明显升高,湿干比明显降低,且病理变化较轻。郑凯等[26]建立急性放射性肺损伤大鼠模型,观察MSC移植对其治疗作用,结果表明,骨髓间充质干细胞可以迁移到放射性损伤的肺组织,促进放射性肺损伤组织的修复,其治疗机制可能与MSC抑制炎症反应、抗氧化、减轻肺组织纤维化等有关。本研究中,MSC移植组6 h肺湿重/干重比值与对照组比较,差异无统计学意义;移植后24和72 h肺湿重/干重比值下降,表示MSC移植有利于降低肺泡-毛细血管膜通透性,可抑制肺泡、肺间质中血浆渗透,有利于缓解肺水肿。除此之外,血气分析中,MSC高剂量组Pa O2、Pa CO2改善情况明显优于对照组,间接表明干细胞移植有利于缓解肺水肿。6 h时MSC的治疗作用不明显,可能是因为作用时间短,其修复能力未显现。相关研究报道中提出,干细胞移植可缓解肺水肿,主要在于干细胞分泌血管生成素-1可抑制肌动蛋白结构破坏,但是现阶段具体机制尚未明确。另外,本研究结果显示,与对照组比较,MSC高剂量组6、24和72 h肺组织IL-1β、TNF-α水平降低,表明MSC移植有利于缓解急性肺损伤炎症反应。A组与E组(即MSC对照组和正常对照组)各个指标比较,差异无统计学意义,表明高剂量干细胞的毒副作用不明显。
肺干细胞 第4篇
1 材料与方法
1.1 材料
家兔34只,雌雄不分,体重2 kg左右,来自南昌大学医学院动物实验中心。2只用于制备骨髓间充质干细胞,剩余32只随机分4个组:肺损伤组、HFOV组、MSCs移植组和HFOV+MSCs移植组,每组8只。
兔IL-lβ、TNF-α和IL-10定量酶联免疫吸附测定试剂盒 (上海森雄科技实业有限公司),兔IL-lβ、TNF-α和IL-10PCR引物合成(上海生工生物工程有限公司),Trizol RNA分离液(Invitrogen公司),RT-PCR反应试剂(南昌强生生物试剂有限公司)。
PCR扩增仪(Biometra公司,德国),全自动酶标仪(美国BIO-RAD公司)。
1.2 急性肺损伤 / 急性呼吸窘迫综合征模型的建立
用3 g/L戊巴比妥钠1.0 ml/kg耳缘静脉麻醉后,仰卧手术台上,颈正中切口,分离气管,通过注射器缓慢向气管内滴注内毒素2 mg/kg,复制急性肺损伤 / 急性呼吸窘迫综合征模型。同时分离出右侧颈静脉,留置塑料导管供注射骨髓间充质干细胞使用[2,3]。
1.3 HFOV
造模成功后,HFOV组和HFOV+MSCs移植组通气模式为HFOV,参数设置为:平均气道压10cmH 2O,FiO 2100%,振幅20 cm H2O,频率10 Hz,吸呼比(I∶E)1∶1。肺损伤组、MSCs移植组不予任何呼吸支持。
1.4 兔骨髓间充质干细胞的分离与培养
取家兔2只,用3 g/L戊巴比妥钠1.0 ml/kg耳缘静脉麻醉,5 min后角膜反射明显减弱,在无菌操作下(局部碘伏消毒后铺巾),分别于双侧胫骨上端内侧部及双侧骼后上棘,用16# 成人骨髓穿刺针接5 ml注射器(内含625 IU肝素 /1 ml生理盐水)抽出骨髓血约4 ml。抽出的骨髓血立即用等量的PBS洗涤后1 500 g,10 min离心,弃去上清液,重复洗涤两次后即可进行原代培养。分离处理后的沉淀与含10% FBS的DMEM-F12培养基(添加青霉素100IU/ml、链霉素l00μg/ml)混匀后,取4 ml接种于75m(l25 cm2)培养瓶中,置于37℃、5%二氧化碳(CO2)培养箱中恒温培养。原代培养24 h后,半量换液,去除掉未贴壁细胞和部分血凝块。原代培养72 h后,全量换液,以后每隔2~3 d换液1次,每次约4 ml培养基,约7~8 d后,倒置显微镜下观察细胞可达到80%融合后,进行传代培养,按1∶3比例传代,传至第3代备用[4]。
1.5 细胞移植
造模成功后,立即经右侧颈静脉注入骨髓间充质干细胞悬浮液2 ml(细胞数1×105),肺损伤模型组同法给予等量生理盐水。
1.6 肺组织匀浆炎症因子检测
致伤后24 h处死动物,取右肺中叶肺组织,准确称取1g,以2∶1加入40℃PBS液,迅速制备肺组织匀浆,3 000 r/min离心5 min,取上清液用ELISA法测IL-1β、TNF-α和IL-10水平,按试剂盒说明,采用酶标仪于450 nm处读取OD值,以OD值为纵坐标,以标准品为横坐标,绘制标准曲线。根据样品的OD值在标准曲线上查出IL-lβ、TNF-α和IL-10含量。
1.7 肺组织炎症因子表达
采用RT-PCR方法检测兔右肺下叶肺组织炎症因子表达。总RNA的提取采用Trizol提取法,定量后行逆转录。β-actin 221bp正义引物:5'-CTGGACCTGGCTGGCCGCGACCTCACCGAC-3', 反义引物:5'-CTCATTGCCAATGGGTGATACCTGGCCGTC3',IL-1β305bp正义引物5'-GGATGACGGCCTGAGAACTT-3';反义引物:5'-TCACGCAGGACAGGTACAGA-3';TNF-α340 bp正义引物:5'-GCTGAGCCAGCGTGCGAACG-3',反义引物:5'-CAGGTACTCAGGCTGGTTGA-3';IL-10 267 bp正义引物:5'-CATGCTCCGCGAGCTCCGTGCTGCCTTTGG-3', 反义引物5'-TCGGTGACATTGTCGCAGCCTCAGCCTGAG-3'。反应条件:IL-1β、TNF-α为94℃30 s、54℃30 s、72℃60 s,30个循环,72℃终延伸5 min;IL-10为94℃30 s、50℃30s、72℃60 s,35个循环,72℃终延伸5 min,Actin为94℃30 s、60℃30 s、72℃60s,30个循环,72℃终延伸5 min。共35个循环。扩增产物10μl上样,1.5%琼脂糖凝胶电泳30 min,用成像分析系统照相分析结果。分别测定目的基因的PCR产物条带与内参照β-actin条带的光密度值,并计算IL-lβ、TNF-α和IL-10条带值与β-actin条带值相比定为光密度相对比值。
1.8 统计学方法
采用SPSS 13.0软件包处理,计量资料以(±s)表示,组内比较用配对t检验,组间比较用方差分析。P <0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 骨髓间充质干细胞的形态学观察
MSCs原代培养4 d后可以观察到细胞附壁铺伸,呈梭形,数量较多,局部呈多个散在分布的细胞集落。第4~6天开始形成典型的、均匀分布的MSCs簇状增殖灶,细胞数量增多,细胞形态呈长梭形,紧密排列,第7~9天细胞生长即可达80%~90%的融合,呈长梭形,紧密排列类似旋涡状。见图1。
2.2 肺组织匀浆炎症因子检测
HFOV组、MSCs组在24 h肺组织匀 浆中IL-1β、TNF-α水平均明显低于肺损伤组,IL-10水平均高于肺损伤组,差异有统计学意义(P <0.05);而HFOV+MSCs组IL-1β、TNF-α和IL-10分别与单一MSCs组及HFOV组比较,差异也均有统计学意义(P <0.05)。见表1。
注:1)与肺损伤组比较,P <0.05;2)与 MSCs 组及HFOV 组分别比较,P <0.05
2.3 肺组织炎症因子表达
β-actin在所有组中均表达(见图2),肺组织IL-1β、TNF-α及IL-10 m RNA在各组中表达强弱不等 (见图3~5),发现在HFOV组和MSCs组中IL-1β和TNF-αmR NA表达较弱,而IL-10m RNA表达较强,分别与肺损伤组相比,差异有统计学意义(P <0.05);联合HFOV组与MSCs组,肺组织IL-1β与TNF-αmR NA表达最低,而IL-10m RNA表达最强,分别与单一HFOV组和MSCs组比较,差异有统计学意义(P <0.05)。见表2。
注:1)与肺损伤组比较,P <0.05;2)与 MSCs 组及 HFOV 组分别比较,P <0.05
3 讨论
ALI/ARDS的病理改变首先是肺部的炎性浸润,表现为炎症性或渗出性肺水肿。目前认为,肺内及全身的炎症反应是其最主要的发病机制之一,炎性介质调控失衡在ALI/ARDS的发生和发展中起重要作用,如何最大限度地减少炎症反应和加快组织修复是改善ALI/ARDS预后的两个主要方面,而减少炎症反应更是促进和加快组织修复的前提,也是防治其重要措施之一。因此,本实验采用HFOV联合MSCs移植来观察急性肺损伤时体内炎症反应变化。
IL-1β和TNF-α是最为经典的促炎介质,由活化的单核一巨噬细胞产生,具有广泛的生物学活性,目前认为它们在急性肺损伤与ARDS炎症反应的始动和发展中起重要作用[5]。而IL-10又称细胞因子合成抑制因子,是重要的抗炎因子,能够广泛抑制TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子的形成,有利于重建促炎因子和抗炎因子的平衡[6]。文献认为高频振荡通气能减轻ARDS肺组织炎性反应,能减轻巨噬细胞的激活和中性粒细胞的积聚,能减少促炎因子的增加和向血液的扩散[7]。最新研究认为[8],当INF-γ和致炎细胞因子TNF-α、IL-lα或IL-lβ中任何一种联合使用时,会诱导趋化因子和NO的协同作用以促进MSCs免疫抑制。因此,近年来MSCs被大量应用于创伤、炎症损伤修复以及抗炎和免疫调节的实验研究,在肺损伤领域的基础研究和临床实践也越来越受到人们的关注[9]。GUPTA等[10]在肺内给予内毒素造成ALI后4 h向肺内直接给予MSCs,结果显示能降低肺衬液内MIP-1(巨噬细胞炎症蛋白 -1) 水平,升高血浆和肺衬液内的IL-10水平。国内学者将MSCs经过静脉移植给内毒素攻击造成ALI的大鼠体内发现,MSCs移植能降低内毒素肺损伤大鼠血浆TNF-α及IL-6水平,减轻肺泡炎症损伤。上述研究表明,单一HFOV和MSCs均对ALI/ARDS炎症反应具有一定的保护作用。因此,设想将两者结合起来去治疗ALI/ARDS,在改善肺部炎症反应方面,可能会起到协同作用。笔者的实验结果证实了这样的假设,研究发现单一HFOV组和MSCs组中肺组织促炎因子IL-1β和TNF-α的水平和其m RNA的表达,低于肺损伤组,而IL-10的水平升高和其m RNA的表达增加;在HFOV+MSCs组中,促炎因子IL-1β和TNF-α的水平及其m RNA的表达最低,抗炎因子IL-10的水平及其m RNA的表达最高,分别与单一HFOV组和MSCs组比较,差异均有统计学意义(P <0.05),表明了两者联合具有强烈的协同作用,这可能是与HFOV模式利于ARDS肺中塌陷和闭塞的小气道和肺泡重新开放,以及外源性MSCs的均匀分布,从而提高MSCs的植入比例,更好的修复受损的肺泡上皮细胞和血管内皮细胞有关。
肺干细胞 第5篇
1 材料与方法
1.1 大鼠MSCs的体外分离与鉴定
(1) MSCs的分离与培养:无菌条件下取出大鼠双侧股骨和胫骨, 无菌PBS冲洗骨髓腔获取骨单细胞悬液, 将单细胞悬液1000 r/min, 离心5 min, 10%胎牛血清的DMEM培养液5 m L重悬细胞, 接种于培养瓶37℃、5%CO2培养箱培, 每3天换液一次。倒置相差显微镜逐日观察并记录的形态及生长情况, 当细胞融合达90%时, 按1∶3比例传代培养。取第4代MSCs进行鉴定。 (2) 流式细胞仪检测细胞CD表型:取第3代MSCs, 生长至90%融合时PBS洗涤2次, 1×106的MSCs重悬于含0.1 m L PBS的PE管中, 各管加入CD34、CD45、CD44及CD29, 加入抗兔FITC, 室温孵育40 min, 流式细胞仪检测上述细胞表型, 阴性对照为未加荧光抗体的MSCs细胞悬液。
1.2 移植MSCs的培养、标记
取6孔培养板, 向每孔中加入2 m L含 (1~2) ×105个细胞培养液, 37℃5%CO2培养至40%~50%汇合时转染 (汇合过度, 不利于转染细胞) 。PBS洗细胞, 10%FBS的DMEM/F12继续培养, 72 h后荧光显微镜下观察转染细胞的绿色荧光, 弃病毒混合培养液, 流式细胞仪检测转染效率, 转染后携带GFP的MSCs (GFP-MSCs) 按1:3传代培养, 取第4代MSCs进行鉴定。
1.3 实验动物分组及大鼠肺气肿模型建立
SD大鼠34只按随机数字表分为四组, MSCs干预组 (A组, 10只, 慢阻肺大鼠, 尾静脉输注MSCs 1×106个/m L) , 肺气肿模型组 (B组, 10只, 慢阻肺大鼠, 尾静脉输注等体积PBS) 及MSCs对照组 (C组, 10只, 正常大鼠, 尾静脉输注MSCs 1×106个/m L) , 正常对照组 (D组, 4只, 正常大鼠, 尾静脉输注等体积PBS) 。采用烟熏法复制大鼠肺气肿模型。将A、B组大鼠置于烟室内, 采用静式吸入染毒方法, 10支椰树牌香烟置于吸烟孔内, 点燃香烟, 每支香烟每分钟吸一次, 35 m L/次, 收集主流烟气和侧流烟气, 通过塑料软管与熏烟箱相连, 将烟雾导入熏烟箱。其间, 每隔5秒将箱内流风机开启10 s, 使箱内气体分布均匀。8 min香烟点燃完毕, 关闭吸烟系统。动物每次暴露45 min, 45 min后取出动物, 清洗熏烟箱。2次/d, 共12周。烟雾暴露时动物可在箱内自由取食饮水。按上述方法将MSCs干预组第3代的转染GFP质粒的间充质干细胞 (每只1×106个/m L) 尾静脉注入A组大鼠体内, B组注入等体积PBS;C组在相同时间内注入1×106个/m L骨髓间充质干细胞等, D组注入等体积PBS, 注入后24 h内处死大鼠, 取肺组织迅速冰冻切片, 共聚焦激光显微镜下观察观察转染GPF的间充质干细胞在大鼠肺内定植情况。第3代的转染GFP质粒的间充质干细胞 (每只1×106) 进行下一步实验。
1.4 统计学处理
采用SPSS 12.0统计学软件对数据进行统计分析, 计量资料以 (±s) 表示, 比较采用单因素方差分析, 以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 MSCs培养与鉴定
原代培养的MSCs第24小时即可见梭形细胞贴壁生长, 到第6天时有大量梭形细胞呈克隆生长, 第10天左右细胞可长满皿底。细胞长满后与成体MSCs相似, 呈旋涡状 (图1) 。按1:3进行传代培养, 细胞在体外培养可稳定传至48代, 在第4代做流式细胞表型鉴定, 符合目前公认间充质干细胞细胞表型标志。经流式细胞仪检测, 分离细胞传至第4代时有99.5%表达CD44、99.6%表达CD29等间充质干细胞表面标志, 0.4%表达CD34、1.0%表达CD45单核细胞以及造血干细胞表型 (图2) 。
注:原代培养的MSCs第10天左右细胞长满皿底后, 成体MSCs相似, 呈旋涡状。
注:MSCs传至第4代时有99.5%表达CD44 (图2A) ;99.6%表达CD29等间充质干细胞表面标志 (图2B) ;仅有0.4%表达CD34 (图2C) ;1.0%表达CD45单核细胞以及造血干细胞表型 (图2D)
2.2 SD大鼠肺气肿模型的建立
香烟烟雾暴露后A、B组大鼠小气道上皮呈锯齿状增生增厚, 上皮脱落, 纤毛倒伏, 气管内见大量炎性渗出物, 管壁结缔组织增生, 可见炎性细胞, 及淋巴小结。肺泡结构紊乱, 肺泡壁断裂, 肺泡腔扩大, 部分融合成肺大疱 (图3A) 。C、D对照组大鼠小气道黏膜上皮完整, 纤毛未见黏连脱落, 管壁规整未见增厚, 未见炎细胞浸润, 管腔内未见炎性渗出物, 肺泡腔未见病理性扩大 (图3B) 。
香烟烟雾暴露组 (A、B组) 平均肺泡间隔为 (119.0±26.2) μm, 高于对照组 (C、D组) 的 (89.8±17.3) μm, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;平均肺泡数为 (173.9±68.3) 个/mm2低于对照组的 (280.3±104.0) 个/mm2, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。
2.3 各组转染GPF绿色荧光蛋白的表达
取第8代培养的间充质干细胞, 调整合适的间充质干细胞培养密度, 细胞融合40%~5%时转染GPF绿色荧光蛋白质粒, 24 h后观察转染效果, 在转染GPF绿色荧光蛋白质粒后48~96 h表达效果最好, 质粒发光强度大、数量多, 效率可达40%左右。微共聚焦发现MSCs经尾静脉注入大鼠体内24 h后, A组大鼠肺组织内可见携带MSCs的绿色荧光, 而B组、C组及D组均未见转染荧光 (图4) 。
注:肺气肿组, 肺泡结构紊乱, 肺泡壁断裂, 肺泡腔扩大 (图3A) ;正常对照组, 镜下见肺泡壁无明显炎性细胞浸润, 肺泡腔未见病理性扩大 (图3B)
注:MSCs在转染GPF绿色荧光蛋白质粒后48~96 h表达效果 (图4A) ;经尾静脉注入肺气肿模型大鼠体内, 24 h后可见肺气肿模型大鼠鼠肺组织内转染绿色荧光蛋白质粒的MSCs分布情况 (图4B)
3 讨论
慢阻肺是一种全球性患病率较高的疾病, 40岁以上人群, 慢阻肺患病率为8.2%[5]。其患病率之高十分惊人, 死亡率高, 目前居全球死亡原因的第4位, 经济负担重, 已成为世界第5大负担的疾病, 由于慢阻肺的发病机制复杂, 病理改变可引起气道结构重塑、肺泡结构破坏及肺血管减少, 依靠机体的自我再生能力无法达到完全的修复, 导致病情进行性进展。目前慢阻肺的内科治疗以抗炎、扩张支气管、氧疗、呼吸运动锻炼及增强免疫力等来缓解患者症状及降低患者未来健康恶化的风险, 其作用非常有限, 外科肺减容术及经纤支镜肺减容术等治疗目的在于缓解症状和改善生活质量, 二者均不能阻止病情的进行性发展。因此, 如能寻找到一种有效修复气道及肺部组织结构, 从而恢复肺功能的方法, 将在慢阻肺的治疗上将具有里程碑式的意义。
骨髓间充质干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞。在一定条件下它可分化为心肌细胞、支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞等多个胚层来源的细胞[6,7,8]。而且骨髓间充质干细胞在体外易于分离、培养和扩增, 免疫原性低, 使其在组织工程、细胞移植、基因治疗等领域具有十分广阔的应用前景[1]。近年来许多研究表明, 干细胞移植可能为某些肺部疾病的治疗带来新希望[9,10,11,12,13]。1995年Pereira等[14]从表达人小基因胶原酶I的转基因鼠中分离获得成年骨髓间充质干细胞, 体外扩增、培养, 再通过尾静脉注射入受致死剂量照射的小鼠中, 1~5个月后, 发现肺实质、骨、软骨细胞中都含有胶原酶I阳性的细胞, 骨髓来源干细胞移植移植到博莱霉素肺纤维化小鼠体内, 可产生肺泡I型细胞, 并使其肺纤维化程度得到改善。目前MSCs在肺部疾病治疗研究主要集中于急性肺损伤与肺间质纤维化, 在慢阻肺中的研究较少, 骨髓间充质干细胞是否在慢阻肺大鼠体内定植、分化呢?本研究通过全骨髓贴壁法获得了足够数量和活力的骨髓间充质干细胞, 培养的MSCs不表达CD34和CD45, 表达CD29和CD44, 在一定的诱导条件下可向脂肪细胞骨细胞及软骨细胞分化, 提示成功培养MSCs。应用GFP标记的MSCs可表达绿色荧光蛋白, 可应用于体内实验。笔者应用香烟烟熏成功复制肺气肿大鼠, 观察经尾静脉注入的MSCs在肺气肿大鼠肺内的生存。将转染GFP质粒的大鼠骨髓间充质干细胞经尾静脉输注入肺气肿模型大鼠体内, 经快速冰冻切片发现肺气肿模型大鼠肺内骨髓间充质干细胞有骨髓间充质干细胞定植, 这与Kidds等[15]报道相一致, 为MSCs治疗慢阻肺提供理论基础。
摘要：目的:观察骨髓间充质干细胞移植在肺气肿大鼠模型肺组织内的定植情况。方法:选择健康SD大鼠34只, 按随机数字表法分为MSCs干预组 (A组, 10只, 慢阻肺大鼠, 尾静脉输注MSC 1×106个/mL) , 肺气肿模型组 (B组, 10只, 慢阻肺大鼠, 尾静脉输注等体积PBS) 及MSC对照组 (C组, 10只, 正常大鼠, 尾静脉输注MSCs 1×106个/mL) , 正常对照组 (D组, 4只, 正常大鼠, 尾静脉输注等体积PBS) , 采用烟熏法复制大鼠肺气肿模型。全骨髓培养法体外培养扩增雄性SD大鼠来源的MSCs, 经GFP标记细胞后将其经尾静脉注入肺气肿模型SD大鼠体内, 24 h内处死大鼠, 取肺组织迅速冰冻切片, 共聚焦激光显微镜下观察观察转染GPF的间充质干细胞在大鼠肺内定植情况。结果:成功培养具有分化潜能的骨髓间充质干细胞, MSCs传至第4代时有99.5%表达CD44、99.6%表达CD29等间充质干细胞表面标志, 仅有0.4%表达CD34、1.0%表达CD45单核细胞以及造血干细胞表型;成功复制大鼠肺气肿模型, 香烟烟雾暴露组 (A、B组) 平均肺泡间隔为 (119.0±26.2) μm, 高于对照组 (C、D组) 的 (89.8±17.3) μm, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;平均肺泡数为 (173.9±68.3) 个/mm2低于对照组的 (280.3±104.0) 个/mm2, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;显微共聚焦发现MSCs经尾静脉注入大鼠体内24 h后可见A组大鼠肺组织内转染绿色荧光蛋白质粒的MSCs, 而B组、C组及D组均未见转染荧光。结论:骨髓间充质干细胞经尾静脉输注入后可在肺气肿模型大鼠肺内定植, 为MSCs治疗慢阻肺可能提供理论依据。
肺干细胞 第6篇
1 材料与方法
1. 1 细胞株
人肺腺癌A549细胞株,购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库( 批号: TCHu150) ,常规复苏、传代,细胞处于对数生长期开始用于实验。
1. 2 药品与试剂
平肺复方处方源于中日友好医院中西医结合肿瘤内科首席专家李佩文教授,由中日友好医院药学部制备,生药含量2 g/ml。平肺复方的药物组成:沙参10 g、党参10 g、百合10 g、麦冬10 g、五味子10 g、桑白皮10 g、贝母10 g、全瓜蒌10 g、白芨10 g、鱼腥草10 g、白花蛇舌草20 g。实验前经定性滤纸粗滤,0. 22μm滤膜过滤后分装,-80℃冻存,避免反复冻融。0. 25% 胰酶溶液,进口胎牛血清,DMEM高糖培养基,CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒( 日本同仁化学研究所) 。PPAR-γ特异性阻断剂GW9662( 美国Sigma-Aldrich公司) 。
1. 3 主要器材及设备
倒置显微镜( 日本OLYMPUS IX51) ,CO2培养箱( 美国Thermo Forma,3111) ,离心机( 德国Heraeus,Labofuge 400R) ,酶标仪 ( 美国Thermo,MULTISKAN MK3) 。
1. 4 分组
1. 4. 1观察不同浓度平肺复方对A549细胞增殖影响的分组空白对照组: 完全培养基( 含10%胎牛血清的高糖DMEM) 常规培养;平肺1组:完全培养基中含平肺复方,生药终浓度1 mg/ml; 平肺2组: 完全培养基中含平肺复方,生药终浓度5 mg/ml; 平肺3组:完全培养基中含平肺复方,生药终浓度10 mg/ml。
1. 4. 2观察PPAR-γ通路特异性阻断剂GW9662对平肺复方作用的影响空白对照组: 完全培养基( 含10%胎牛血清的高糖DMEM) ; 平肺组: 完全培养基中含平肺复方生药,生药终浓度10 mg/ml。GW组: 完全培养基中含GW9662 10μM。平肺 +GW组: 完全培养基中含平肺复方生药,生药终浓度10 mg /ml,并加入GW9662 10μM。
每组设3个复孔,每次实验重复3次以上。接种A549细胞于96孔板中。
1. 5 细胞计数试剂盒法检测细胞的增殖情况
将A549细胞以每孔7×104/ml接种于96孔培养板。孵育24小时,细胞贴壁,弃上清,按上述分组添加完全培养基或含不同浓度平肺复方生药的培养基。
分别培养24小时、48小时、72小时,细胞计数试剂盒( cell counting kit-8,CCK-8) 检测细胞存活率: 弃上清,每孔加入含10%CCK-8试剂的培养基,孵育2小时,检测前振荡10秒,于酶标仪450 nm处测定各孔的吸光度( A) 值,参考波长630 nm。
计算细胞存活率: 各组细胞存活率( %) = ( 实验组平均A值/对照组平均A值) ×100%。
1. 6 统计分析
数据录入Excel软件进行保存,使用SPSS 17.0软件进行分析。计量资料以均数±标准误( ±s)表示,多个样本均数的比较采用t检验,P <0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2. 1 不同浓度平肺复方对 A549 细胞增殖影响
应用CCK-8法检测人肺腺癌A549细胞的增殖显示,平肺复方生药1 mg/ml在体外作用72小时内对细胞生长没有明显影响( P =0.07084 >0.05) ,平肺复方生药5 mg/ml和10 mg/ml在作用24小时、48小时和72小时表现出对A549细胞增殖的抑制作用,结果经t检验显示与空白对照组相比存在统计学差异( P <0.05) 。
[ ±s,存活率( %) ,n =4]
注: 与空白对照组相比aP < 0. 05,bP < 0. 01
2. 2 PPAR-γ 通路特异性阻断剂 GW9662 对平肺复方作用的影响
以生药终浓度为10 mg/ml的平肺复方生药和PPAR-γ特异性阻断剂GW9662处理人肺腺癌A549细胞,平肺组在体外作用24小时后即显现对A549细胞的生长抑制作用,这种抑制作用随时间的延长而增强,t检验显示与对照组相比具有明显差异( P <0. 01) ; 单纯加入GW9662对细胞的生长并未产生影响( P =0.08564 >0.05) ; 平肺 + GW组在培养至24小时、48小时、72小时均对细胞生长产生抑制作用,与对照组相比具有统计学差异( P <0.05) ,但这种抑制作用较平肺组弱( P < 0.05) 。结果显示GW9662可部分逆转平肺复方对A549细胞的增殖抑制作用,但平肺复方的PPAR-γ通路被GW9662阻断后,仍可表现出对A549细胞的增殖抑制作用。
[ ±s,存活率( %) ,n =4]
注: 与空白对照组相比aP < 0. 05,bP < 0. 01; 与平肺组相比cP < 0. 05。
3 讨论
肺癌的发病根本在于正气虚弱、脏腑功能失调。脏腑亏虚是肺癌发病的先决条件,痰、湿、气、瘀、热、毒相互搏结,兼见为患,导致了肺癌的进一步发展。肺癌早期的患者辨证多为肺阴不足; 肺癌中期的患者辨证多为气阴两虚; 晚期病人由于久病伤阴,肺脏的阴虚症状更加严重[1]。肺阴亏虚贯穿了肺癌发生发展的各个阶段,阴虚内热是肺癌常见的临床证型,与之相对应的养阴清肺法亦是肺癌治疗的常用方法。平肺复方是李佩文教授根据多年临床经验. 以养阴清肺、解毒散结为治法的自拟方剂。方中选用沙参、党参、百合、麦冬、五味子滋养肺阴,生津润燥,清上焦虚火; 桑白皮、浙贝母、全瓜蒌清热润肺,涤痰散结,宽胸利膈,导痰浊下行; 白芨凉血止血,清血分之热; 鱼腥草、白花蛇舌草清热解毒,消痈散结。纵观全方,扶正与祛邪并行,临床多用于中晚期肺癌患者毒热内盛、阴津亏虚的治疗。
近年来,针对恶性肿瘤自身及其治疗方法的机制研究在分子生物学和细胞生物学领域获得了迅速发展,许多新的药物靶标被发现,多种新药相继问世。PPAR属于核内受体超家族[2],于1990年由英国学者Issemam等[3]首次在大鼠中发现。PPAR-γ作为PPAR亚型中研究的最为广泛的一种,目前在临床和实验室研究方面都获得了巨大关注。有诸多相关报道显示PPAR-γ在肺癌、结直肠癌、乳腺癌、肾癌、子宫内膜癌等多种肿瘤组织中存在高表达,并且与临床分期、淋巴结转移、分化程度等肿瘤相关预后因素密切相关。通过PPAR-γ分子信号通路,可对肿瘤细胞产生增殖抑制和促进凋亡的作用[4];还可影响肿瘤相关的巨噬细胞和肿瘤的血管生成,甚至延缓肿瘤的发展进程[5]。PPAR-γ信号通路是可以从多个角度发挥抗肿瘤作用的上游通路,其激活物也许可以通过对肿瘤及其微环境通路的改变,成为肿瘤的新生疗法[6]。
GW9662作为人工合成的PPAR-γ特异性拮抗剂,具有不可逆转的特性。本研究在实验体系中添加GW9662作为对照,可以揭示中药复方调控PPAR-γ信号通路的特异性。中药复方具有多途径、多种组分活性的特点,其作用机制和途径更是具有多向性、多层面和多靶点的特点。在PPAR-γ通路被特异性拮抗剂阻断后,平肺复方仍可抑制A549细胞的增殖,提示平肺复方的抗肿瘤作用机制可能部分涉及到PPAR-γ信号通路,其中的某些有效成分可能具有PPAR-γ激活物的作用,通过PPAR-γ通路发挥抗肿瘤作用,但并不完全是通过这一条信号通路在发挥作用。中药复方的抗肿瘤机制仍有待于进一步研究。
摘要：目的 研究平肺复方对人肺腺癌A549细胞增殖及过氧化物酶体增长因子活化受体(peroxisome proliferators-activated receptor,PPAR)-γ信号通路的影响。方法 运用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)比色法检测平肺复方对人肺腺癌A549细胞增殖的影响,并添加PPAR-γ特异性阻断剂GW9662,观察PPAR-γ通路阻断后平肺复方对A549细胞生长的影响。结果 平肺复方生药5 mg/ml和10 mg/ml在作用24小时、48小时和72小时表现出对A549细胞增殖的抑制作用(P<0.05);单纯加入GW9662对细胞的生长并未产生影响;加入GW9662的平肺复方仍可对细胞生长产生抑制作用(P<0.05),但这种抑制作用明显弱于平肺复方(P<0.05)。结论 平肺复方的抗肿瘤作用机制可能部分涉及到PPAR-γ信号通路,但并不完全是通过这一条信号通路在发挥作用。
肺干细胞 第7篇
1 对象与方法
1.1 研究对象
选取在本院治疗的70例慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者, 按患者的治疗方式分为治疗组及对照组, 治疗组35例, 其中男性20例, 女性15例, 年龄处于56～78岁之间, 平均 (64.7±4.2) 岁;对照组35例, 男性21例, 女性14例, 年龄处于57～79岁之间, 平均 (65.5±4.8) 岁。两组患者在年龄、性别方面经统计分析差异无统计学意义 (P<0.05) 。
1.2 治疗方法
两组患者均进行抗感染、β受体激动剂、氨茶碱、雾化吸入糖皮质激素等常规治疗, 给治疗组患者加用盐酸氨溴索针剂 (沐舒坦, 德国勃林殷格翰, 批号811526, 规格15mg/mL) 60mg入5%葡萄糖注射液250mL中静脉点滴, 每天1次, 连续应用10d, 后复查两组患者肺功能及血清细胞因子包括肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 、白介素-8 (IL-8) 水平。
1.3 入选标准
入选患者符合我国2007年制定的《慢性阻塞性肺疾病 (COPD) 诊治规范 (草案) 》, 肺通气功能测定FEV1<80%预计值, 支气管扩张试验 (-) , 1月后复查FEV1<80%预计值, 戒烟≥3个月, 患者3个月内未应用激素类药物, 无糖尿病、自身免疫性疾病、其他部位感染以及严重心脑肾血管疾病等[1]。
1.4 统计分析
选择SPSS 17.0软件对数据进行统计分析, 各项参数以均值±标准差表示, 使用χ2以及t检验, P<0.05时差异有统计学意义。
2 结果
治疗组及对照组治疗后肺功能及血清细胞因子水平比较见表1。
两组患者比较差异有统计学意义 (P<0.05) , 治疗组患者肺功能及血清细胞因子改变优于对照组。
3 讨论
慢性阻塞性肺疾病是一种慢性炎症性呼吸系统疾病, 其显著的特征就是气流受限, 其发病机制尚不十分清楚, 目前认为气道、肺实质、肺血管的慢性炎症与其相关, 肺部不同部位聚集着肺泡巨噬细胞、中性粒细胞及T淋巴细胞, 激活的炎症细胞释放IL-8、IL-10、TNF-α等多种细胞因子[2], 破坏肺结构或进一步加重细胞炎症反应。
有研究资料表明, COPD急性发作时患者体内的IL-8、TNF-α水平均升高明显, 它们在气道慢性炎症的形成和发展中起到重要作用, IL-8是中性粒细胞的激活剂及化学吸引剂, 在急性感染时中性粒细胞浸润至肺部十分重要。TNF-α是一种多显性多肽调节因子, 是机体免疫防御、炎症损伤、休克等发病的重要介质, 同时与宿主防御功能及稳定内环境密切相关。氨溴索能起到清除氧自由基、降低气道高反应性[3];抑制白细胞和肥大细胞释放组胺, 降低嗜酸性粒细胞炎症因子释放量;抑制组胺释放所引起的平滑肌收缩, 起到保护肺功能的作用。
COPD患者气道黏液高分泌状态是促使COPD病情加重的重要因素, 因此促使痰液尽快排出是临床治疗的目标之一。盐酸氨溴索是一种黏液溶解剂, 主要作用于气道分泌细胞, 起调节细胞黏液、浆液分泌, 增强纤毛摆动频率及强度作用, 利于痰液排出, 氨溴索还可促进纤毛上皮的再生及纤毛正常运动功能恢复, 加速粘膜纤毛的运动[4], 维护上呼吸道自净机制, 防止有害因子的损伤;氨溴索可刺激Ⅱ型细胞合成分泌肺泡表面活性物质, 防止肺泡萎缩及肺不张, 协助无纤毛区痰液的运送;还能恢复粘膜的正常分泌, 改善分泌物浆液/粘液的比值, 改善痰液的流变学, 降低痰液对气道壁的粘附, 有利于排痰。在经过治疗后治疗组患者肺功能相关指标明显改善, 且由于对照组。
氨溴索用于辅助治疗慢性阻塞性肺疾病急性加重的患者能明显改善其肺功能, 使炎症细胞因子的水平降低, 效果满意。
摘要：目的 探讨氨溴索对慢性阻塞性肺疾病患者血清细胞因子及肺功能的影响。方法 回顾性分析我院收治的70例慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者的临床资料, 根据患者的治疗方式分为治疗组和对照组, 治疗组在常规治疗的基础上加用盐酸氨溴索注射液, 对照组仅用常规治疗, 对两组患者治疗后肺功能相关治疗及血清细胞因子进行评价。结果 治疗组患者肺功能和血清细胞因子改善优于对照组, 两组的差异有统计学显著性 (P<0.05) 。结论 慢性阻塞性肺疾病急性加重时应用氨溴索辅助治疗能在明显改善患者肺功能的同时降低炎症细胞因子的水平, 并且效果满意。
关键词：氨溴索,慢性阻塞性肺疾病急性加重期,肺功能,血清细胞因子
参考文献
[1]中华医学会呼吸病学分会, 慢性阻塞性肺疾病学组.慢性阻塞性肺疾病诊治指南 (2007年修订版) [J].中华结核和呼吸杂志, 2007, 30 (1) :8.
[2]晓慧, 钮善福.盐酸氨溴索注射液针剂治疗呼吸系统疾病疗效观察[J].上海医科大学学报, 2009, 27 (2) :152-153.
[3]王嘉漫, 包红, 陈小东, 等.氨溴索对COPD患者血清细胞因子和肺功能的影响[J].临床肺科杂志, 2010, 15 (2) :194-195.
肺干细胞 第8篇
1 资料与方法
1.1 一般资料
回顾性分析2009年1月至2012年12月在福建医科大学附属第一医院胸外科手术的非小细胞肺癌患者219例。219例均已排除患有严重心脏疾病和肺功能检查前行放疗或化疗的患者。据肺薄层CT按病变部位分为中央型79例和周围型140例。根据CT报告结果, 肿瘤最大直径≤3cm、≤5cm与>5cm各组分别为71例、75例和73例。其中非吸烟109例 (男性37例、女性72例) , 吸烟110例 (均为男性) ;<50岁、50~60岁和≥60岁分别为49例、64例和106例。
1.2 方法
1.2.1 肺功能检测
采用意大利COSMED Quark PFT4型肺功能仪行肺功能测定, 其中肺通气功能测定包括FVC%、FEV1%、FEV1/FVC% (实测值%) 、MVV%, 弥散功能测定包括DLCO%。因不同年龄、性别、身高、体质量患者肺功能正常值有所不同, 故除相对比指标外, 其余指标均用实测值占预计值百分比来评估。
1.2.2 采用SPSS 18.
0统计软件包进行统计学处理, 多个样本均数的比较采用方差分析, 对有差异的指标采用LSD-t检验进行多个样本均数间的两两比较。两样本均数间的比较采用独立样本的t检验进行分析。上述分析均以P<0.05作为显著性水准。
2 结果
2.1 不同肿瘤部位对肺功能的影响
由表1可见, 中央型与周围型肺癌相比, 前者通气功能指标 (FVC%、FEV1%、FEV1/FVC%、MVV%) 均低于后者, 且差异有统计学意义 (P<0.01) , 弥散功能指标 (DLCO%) 差异无统计学意义 (P>0.05) 。
*P<0.01, □P>0.05
*P<0.05, □P>0.05
2.2 不同肿瘤大小对肺功能的影响
由表2可见, 不同肿瘤大小三组之间两两比较, 肿瘤小的患者通气功能指标 (FVC%、FEV1%、FEV1/FVC%、MVV%) 均高于肿瘤大的患者 (P<0.01) , 且差异有统计学意义 (P<0.05) , 而弥散功能指标 (DLCO%) 三组之间两两比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。
3 讨论
手术治疗是早期非小细胞肺癌患者治疗的首选方法, 而常规肺癌根治手术治疗需开胸和切除包括肿瘤在内的一叶肺组织, 会造成术后肺功能的损害。肺功能检查是开胸手术必不可少的检查项目, 是对术后是否发生呼吸衰竭等严重并发症的初步筛选。FEV1 (通气功能) 和DLCO (换气功能) 被认为是预测患者术后生存率和并发症的敏感指标[4,5]。另外, MVV也经常作为判断手术危险性的指标[6]。徐卫松等[7]对伴有支气管阻塞的肺癌患者分析表明:肺癌支气管阻塞平面越高, 对肺功能的损害越重, 影像学显示发生肺不张或实变等阻塞性改变的机会就越大。中央型肺癌由于其生长部位的原因, 易于阻塞较大的气道而导致更为显著的术前肺功能减损。有文献报道只有当肺组织损伤程度达到30%以上时, 肺功能才会有明显异常[6]。当肿瘤较小时, 肿瘤所致的肺功能损害较轻, 之后随肿瘤体积的增大, 肺功能损害加重明显。
本研究将年龄、性别及吸烟做均衡化处理, 对219例非小细胞肺癌患者的肺功能分析结果表明:非小细胞肺癌患者的肺功能受肿瘤部位及大小的影响, 中央型肺癌和巨大肿瘤较周围型肺癌和微小肿瘤明显造成肺功能障碍, 且以通气功能受限为主, 从而增加手术的危险及围手术期出现并发症的可能性。因此术前可通过肺薄层CT详细观察肿瘤的部位及大小, 估计对肺功能的影响, 加强对肺癌患者术前准备, 行呼吸功能锻炼, 特别是通气功能锻炼, 改善患者的肺功能, 提高医疗安全, 减少围手术期并发症的发生。同时由于影响肺功能测定的因素较为复杂, 且肺癌自身其他因素 (如肿瘤病理类型等) 对肺功能的影响, 以及它们之间的相互关系对肺功能的影响还有待进一步研究。
参考文献
[1]彭云武, 蔡鹏, 龙志雄.200例肺癌患者肺功能观察[J].中国肿瘤临床与康复, 2006, 13 (1) :48-49.
[2]门桐林, 关舒, 赵俊华, 等.非小细胞肺癌病理类型对肺功能的影响[J].现代肿瘤医学, 2011, 19 (1) :46-48.
[3]刘敏, 刘珲, 王蕊恒, 等.肺癌患者的肺功能改变及临床分析[J].实用肿瘤学杂志, 1996, 10 (3) :72-74.
[4]Lizasa T, Suzuki M, Yasufuku K, et a1.Preoperative pulmonary function as a prognostic factor for stage I non-small cell lung carcinoma[J].Ann Thorac Surg, 2004, 77 (6) :1896-1902.
[5]朱蕾, 刘又宁, 于润江.临床肺功能[M].北京:人民卫生出版社, 2004:80.
[6]徐卫松, 毛友生, 赫捷, et al.伴有支气管阻塞肺癌患者的术前肺功能分析[J].中国肿瘤临床与康复, 2011, 18 (2) :97-101.