EST治疗范文

EST治疗范文（精选9篇）

EST治疗 第1篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

本组ABP共79例患者, 男48例, 女31例, 年龄60~78岁, 平均67岁。发病到治疗时间最短4h, 最长48h, 全组患者均有不同程度上腹痛及恶心、呕吐、腹胀等, 伴有局限腹膜炎体征30例, 47例伴有黄疸。79例患者入院时查血淀粉酶均增高>180U (其中45例增高大于正常3倍及以上) , 全组79例均行B超或CT检查提示胰腺肿大, 胆总管结石或胆总管扩张。伴发病:合并高血压25例, 糖尿病18例, 冠心病9例, 慢支炎肺气肿6例, 急性肾功不全4例, 肝硬化脾亢血小板减少2例, 同时有两种及以上合并症11例。

1.2 诊断标准

79例符合以下ABP标准: (1) 急性上腹部疼痛伴恶心、呕吐、腹胀; (2) 上腹部压痛、反跳痛等; (3) 血尿淀粉酶升高; (4) 肝功能检验提示血ALT、AST、ALP、GGT增高和 (或) 胆红素增高; (5) 超声、CT或MRCP提示胆管扩张和 (或) 胆管结石、胆囊结石; (6) 超声、CT检查提示急性胰腺炎 (AP) 的影像学改变;参照中华医学会外科学分会胰腺学组重症急性胰腺炎的诊治指南[1], 入院24h内APACHEⅡ>8分病例为重型胆源性胰腺炎 (SABP) , 内镜治疗组:重型ABP有17例, 轻型ABP有21例;非内镜治疗组:重型ABP有14例, 轻型ABP有27例。

1.3 治疗方法

两组79例ABP患者入院后均接受胰腺炎中西医治疗, 重症患者在治疗同时积极补液抗休克纠正水电解质和酸碱失衡。内镜治疗组均于发病72h之内接受ERCP及EST, 术前30min肌注安定10mg、654-Ⅱ10mg及杜冷丁50mg, 病情重者术中监测心率及血压, 选择性胆管造影明确胆总管有无结石, 避免使胰管显影, 乳头部结石嵌顿或乳头狭窄行针式切开取出结石后在造影, ERCP检查明确为胆总管结石则予EST并使用网篮和球囊取石。如患者一般情况较差而不能耐受急诊取石者, 单纯行EST术后放置鼻胆管引流 (ENBD) , ERCP胆道无明确结石但胆总管扩张者也行EST。接受内镜治疗后继续按胰腺炎中西结合治疗, 症状缓解患者延期处理胆道疾患, 对症状不缓解病情加重恶化接受急诊开腹胆道减压手术。非内镜治疗组:对已诊断明确伴有胆道梗阻的14例SABP患者在入院48h内行急诊手术, 手术方式尽量从简, 解除胆道梗阻建立有效的T管引流, 必要时行空肠或胃造瘘及胰腺腺被被膜膜切切开开减减压压;;对对2277例例轻轻型型AABBPP中中经经保保守守治治疗疗症症状状缓缓解解患患者者采采取取延延期手术治疗, 经过保守治疗病情加重者行急诊手术胆道减压引流。

1.4 观察指标

观察患者体温恢复正常时间, 腹痛消失时间, 胆红素WBC及血淀粉酶下降正常时间, 住院时间, 并发症发生率和病死率。同时还对比观察两组轻型ABP在治疗过程中胰腺炎重型化比例。两组疗效按轻型和重型ABP分别比较 (表1和表2) 。

1.5 统计学处理

采用SPSS17.0统计分析, 计数资料以 (±s) 表示, 行χ2检验, 计量资料行t检验, 取α=0.05水准, P<0.05有统计学意义。

2 结果

在轻型ABP病例中, 内镜组病死率及胰腺炎重型化比例均为零, 非内镜组死亡1例, 胰腺炎重型化5例;重型ABP病例中, 内镜组病死率为0, 并发症发生率10.5%, 非内镜组死亡3例 (3/14) 并发症发生率34.5%;内镜治疗组与非内镜治疗组相比, 内镜治疗组在体温恢复正常时间、腹痛消失时间、WBC及血尿淀粉酶下降正常时间以及住院时间均明显缩短 (P<0.05) , 轻型ABP重型化比例、并发症发生率及病死率发生均明显下降 (P<0.05) 。

3 讨论

ABP在我国占急性胰腺炎总数的一半以上, 而对于ABP是原发的胆道问题与继发的胰腺问题两个方面的综合, 处理起来更加复杂, 多数ABP需要先解除原发胆道梗阻后在处理继发的胰腺及全身问题;Acosta等[2]认为壶腹部梗阻持续的时间与ABP的严重程度呈正相关, 发病24h内几乎所有的病变都是可逆的, 常见胰腺水肿, 24~48h可见部分出血、脂肪坏死, 超过48h为广泛的出血坏死。因此治疗ABP的关键是及时解除胆道梗阻, 降低重型胰腺炎的发生率。

老年ABP患者由于全身脏器代偿功能衰退、机体耐受性差同时合并病多使得其一方面临床症状表现不典型, 另一方面病情进展快、容易恶化, 因此在80年代及90年代初大多数外科医师对SABP的治疗采取手术治疗为主, 行胆总管探查T型管引流, 有时常规附加胃造瘘小肠造瘘及胰床引流, 以解除胆道梗阻, 降低胆道压力, 缓解胰腺病变。但是开腹手术和麻醉创伤大, 对老年人机体和脏器功能影响大, 有的危重者合并病多手术耐受性差, 术后并发症多病死率仍较高。而单纯内科治疗又不能缓解胆胰管的梗阻因素, 不能缓解或终止胰腺炎病情的发展。而内镜下治疗性ERCP及EST治疗ABP则不需要开腹和麻醉, 创伤小, 降低胆胰管压力, 使胰腺的病变得到控制, 阻止胰腺炎进一步恶化, 缩短了SAP的自然病程, 既避免了急诊手术, 又为择期手术创造了条件。我们将两组中按轻型和重型病例的治疗效果分别进行对比观察及统计学分析, 内镜组轻型ABP重型化比例0% (0/21) , 明显低于非内镜组18.5% (5/27) ;与非内镜治疗组相比, 内镜治疗组在体温恢复正常时间、腹痛消失时间、WBC及血尿淀粉酶下降正常时间以及住院时间均明显缩短 (P<0.05) , 并发症发生率及病死率的发生生均均明明显显下下降降 ( (PP<<00..0055) ) , , 内内镜镜治治疗疗组组未未发发生生与与内内镜镜操操作作相相关关的的并并发发症, 创伤小, 术后患者恢复快, 住院时间缩短。Ricci等[3]对90例ABP患者行急诊ERCP治疗 (入院72h内) , 结果显示早期内镜治疗效果良好, 成功率95.5%, 继发重症胰腺炎仅2例, 无1例患者死亡, 特别在48h内行内镜介入治疗的ABP患者中, 效果更好;大量的临床研究表明对ABP早期内镜治疗是安全有效的, 不会加重病情, 不会增加并发症的发生率及病死率。

近年来随着内镜诊疗技术水平的提高和ABP的内镜介入治疗日趋成熟, 其疗效已得到公认, 具有安全简便恢复快并发症少等优点。对于治疗性ERCP及EST在ABP的治疗中的作用是肯定的, 特别对重症ABP经内镜介入治疗已达到共识, 但在内镜介入治疗时机及指征上有争议。许多学者主张早期手术, 理由是尽早解除病因, 能有效阻止胰腺炎的病理过程, 防止胰腺进行性坏死, 减少病死率和并发症的发生率, 提高生存率[4]。胆源性胰腺炎在ERCP过程中不论是否发现结石一般均应行括约肌切开 (EST) , 如有可能尽量清除胆管内结石, 尤其是引起梗阻的结石, 病情较重或者情况复杂的病例, 也可先行简便的减压引流措施 (ENBD) , 待病情稳定后在择期介入去除病因[5]。田伏洲等[6]总结20年内镜胆管减压治疗AP的经验, 证实早期内镜治疗能迅速阻断ABP患者由轻型向重型进展, 有效降低了重型胰腺炎的发生率, 并提出若B超或CT检查发现胆管增粗或者确定有结石及蛔虫, 入院后应立即行ERCP及EST。早期解除胆胰管梗阻治疗ABP效果满意, 一旦错过时机, 则疗效明显下降。

老年急性胆源性胰腺炎早期内镜治疗疗效满意, 能及时解除梗阻, 阻断胰腺炎重型化趋势, 尤为适合老年合并病多、难以耐受手术的患者。

摘要：目的 探讨老年急性胆源性胰腺炎早期内镜下十二指肠乳头括约肌切开治疗的疗效。方法 回顾性分析我院2001年至2011年间38例老年ABP早期EST治疗临床资料, 并与1993年至2000年间非内镜治疗组41例老年ABP进行对比观察。结果 与非内镜治疗组相比, 内镜治疗组在体温恢复正常时间、腹痛消失时间、WBC及血淀粉酶下降正常时间以及住院时间均明显缩短 (P<0.05) , 轻型ABP重型化比例、并发症发生率及病死率的发生均明显下降 (P<0.05) 。结论 早期EST治疗老年急性胆源性胰腺炎疗效满意, 能及时解除梗阻, 阻断胰腺炎重型化趋势, 尤为适合老年合并病多、难以耐受手术的患者。

关键词：老年,急性胆源性胰腺炎,早期EST

参考文献

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假臭草EST—SSRs标记的开发 第2篇

关键词 假臭草 ；EST-SSRs ；引物设计 ；优化

分类号 Q754 ；S451

Abstract In this study， we download ESTs form dbEST database and first designed 27 primer pairs for Praxelis clematidea after EST pretreatment and SSR locus identification. The sample were collected from Wenchang City in Hainan province as DNA template， and the optimization and establishment of EST-derived SSR-PCR reaction system for Praxelis clematidea was carried out by single factor test and orthogonal experiment design of L16（45）. The result was indicated that the optimal EST-SSRs PCR reaction system （20 μL） was contained 2.75 mmol/L Mg2+， 35 ng DNA template， 2.25 U Tag DNA polymerase， 0.3 mmol/L dNTPs and 0.6 μmol/L primer. This system was tested by 14 Praxelis clematidea from different places， which stable and clear polymorphic bands were acquired. Accordingly， the development of EST-SSRs can be used for the genetic diversity research of Praxelis clematidea.

Keywords Praxelis clematidea ； EST-SSRs ； primer design ； optimization

假臭草（Praxelis clematidea R. M. King & H. Robinson）是菊科（Composite）假臭草属（Praxelis）植物[1]，原产南美洲，传入中国后曾一直被误认为藿香蓟（Ageratum conyzoides linn.）或熊耳草（Ageratum houstonianum Miller）[2-3]。假臭草适应性强，对土壤养分有较强的吸收力，种子具冠毛，易于传播和对其它植物受体有化感作用，对中国华南入侵生境破坏严重[4-5]。假臭草EST-SSRs分子标记的开发，为其遗传多样性研究及其近缘种的鉴定提供了基础。

EST（Expressed sequence tags）是通过对由mRNA逆转录成的cDNA克隆测序得到的一部分序列，代表着一定条件下基因组的部分转录信息[6]，是一段完整的或部分的基因表达序列，相比SSR而言，EST-SSRs在近缘种间具有更高的通用性和保守性[7]。EST-SSRs分子标记是基于PCR的标记手段，PCR结果受到Tag聚合酶﹑Mg2+浓度、DNA模板浓度、dNTPs浓度及引物浓度的相互影响，因此，ESR-SSRs标记的开发必须建立稳定可靠的PCR反应体系。假臭草EST-SSRs标记的开发未见报道，本研究的主要目的为：（1）利用EST-SSRs的可通用性特征[7-8]，以假臭草近缘种的EST序列设计EST-SSRs引物；（2）采用单因素试验设计对PCR反应体系中五因素（Tag DNA聚合酶、Mg2+浓度、DNA模板、dNTPs及引物浓度）设置不同的水平梯度，筛选出最适浓度范围；（3）基于单因素结果，设计L16（45）正交试验，建立假臭草EST-SSRs标记的最佳PCR反应体系。

1 材料和方法

1.1 材料

假臭草样品来源于海南省和广东省不同市县，见表1。采摘新鲜叶片，硅胶封装，转至-20℃冰箱保存、备用。

1.2方法

1.2.1 假臭草基因组DNA的提取与检测

采用改良的CTAB法提取假臭草基因组DNA[9]。1%琼脂糖凝胶电泳检测，ND-2000超微量紫外分光光度计测出基因组DNA母液浓度（ng/μL）和纯度（A260/A280），并将母液用灭菌ddH2O稀释为10 ng/μL的工作液，-20℃保存备用。

1.2.2 EST-SSRs标记引物的设计和筛选

目前为止，NCBI（National Center for Biotechnology Information）的dbEST数据库中没有公布假臭草EST序列，根据EST-SSRs标记的可通用性特征，分别下载了假臭草同族植物胜红蓟（A. conyzoides）、薇甘菊（Mikania micrantha）和甜叶菊（Stevia rebaudiana）的EST序列设计引物（截止2013年6月）。对下载的EST序列进行预处理：保留长度100～700 bp（5′～3′）的EST序列，用DNA Star软件去除序列中的载体、重复和PolyA/T序列[10-11]，获得最低冗余度的EST序列。SSRIT（Simple Sequence Repeat Identification Tool）软件查找EST中的SSR位点（http：//www.gramene.org /gramene/search es/ssrtool），SSR位点筛选的标准为：含二﹑三﹑四﹑五﹑六核苷酸基元的最小重复数依次为8﹑6﹑5﹑4和3次。用Primer Premer 5.0软件设计EST-SSRs引物，引物设计的主要参数为：（1）退火温度为50～60℃；（2）引物长度为18～24 bp，20 bp最佳；（3）PCR产物长在100～500 bp；（4）GC%含量为40%～60%[12]。首次设计了27对EST-SSRs引物（表2），送往上海生工生物工程有限公司合成。以扩增谱带清晰明亮、具有多态性为标准，对27对引物进行筛选，筛选的反应体系为：20 μL PCR反应体系中，Mg2+浓度为2.5 mmol/L，模板DNA用量为20 ng，Tag DNA聚合酶为1.5 U，dNTPs浓度为0.25 mmol/L，引物浓度为0.6 μmol/L，PCR扩增反应程序：94℃。预变性5 min，然后按94℃变性50 s，53℃退火40 S，72℃延伸70 S，40次循环；72℃延伸5 min[13]。根据实验结果，筛选得出最优的引物作为PCR反应体系的引物。

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1.2.3 EST-SSRs标记PCR反应的单因素试验

分别对模板Mg2+、dNTPs、引物、Tag酶及DNA模板进行梯度试验，筛选最佳适宜浓度范围。Mg2+浓度试验中设0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25、2.50、2.75、3.00 mmol/L 10个梯度；dNTPs浓度试验中设0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mmol/L 8个梯度；引物浓度设0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 μmol/L 8个梯度；Tag酶浓度设0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25、2.50、2.75、3.00 U/20μL 11个梯度；DNA模板量设10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、80、100 ng/20μL 12个梯度。PCR反应程序同1.2.2。

1.2.4 EST-SSRs标记PCR反应因素水平的正交试验设计

基于1.2.3筛选出的EST-SSRs标记PCR反应体系中模板DNA、Tag酶、Mg2+、引物及dNTPs浓度五因素的适宜浓度范围，运用正交辅助软件构建L16（45）正交试验表，设计模板DNA、Mg2+、引物、dNTPs及Tag酶五因素和不同浓度的4水平正交试验（表3）。根据表3，制备总体积为20 μL的PCR反应体系，除了表中的五因素外，加入2.0 μL 10×PCR buffer，不足20 μL用灭菌dd H2O补足，PCR反应程序同1.2.2。

1.2.5 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染

对单因素试验和正交试验设计的PCR扩增产物进行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，DL2000为Marker，220 V电压下电泳2 h。电泳完后，用蒸馏水清洗凝胶2次，放入500 mL的0.1%硝酸银染色液中浸泡10 min，取出凝胶并再次用蒸馏水清洗2次，放入500 mL的显影液中显影。银染结果用数码相机拍照保存。

1.2.6 数据处理

根据扩增条带的敏感性与特异性即条带强弱及杂带的多少作1～16分记分，分数越高，表示敏感性、特异性越好[14]。3次重复独立打分，根据得分计算各因素同一水平的试验值之和（Ki）和该水平下的数据平均值（ki），并计算同一因素不同水平间的极差R。每一因素水平下的数据平均值ki反映了因素各水平间对PCR反应体系的影响情况，PCR反应体系优化时，应选取ki最大值对应的最适浓度水平。

2 结果与分析

2.1 CTAB法提取假臭草基因组DNA

从琼脂糖凝胶电泳图（图1）可以看出，提取的假臭草基因组DNA的电泳条带单一，清晰明亮，点样孔无滞留，ND-2000超微量紫外分光光度计检测结果显示DNA的A260/A230比值为1.8～1.9，A260/A230比值为2.2～2.4，满足EST-SSRs标记需求。

2.2 引物筛选

依据扩增条带的敏感性、特异性和数量，筛选出srSSR716作为PCR反应体系的最佳引物。

2.3 EST-SSRs标记PCR反应体系的单因素试验分析

2.3.1 Mg2+浓度对EST-SSRs标记的PCR扩增影响

Mg2+不同水平梯度试验结果显示（图2-A），当Mg2+浓度为0.75～2.25 mmol/L时，有2条扩增谱带，条带清晰但却有一定的弥散和拖尾现象；当Mg2+浓度为2.25～3.00 mmol/L时，有3条扩增普带，条带清晰明亮，弥散和拖尾现象不明显，因此，假臭草EST-SSRs PCR反应 体系中Mg2+浓度的适宜浓度范围为2.25～3.00 mmol/L。

2.3.2 dNTPs浓度对EST-SSRs标记的PCR扩增影响

dNTPs参与新链DNA的合成，直接影响PCR的产量。由图2-B所示，当dNTPs浓度为0.05 mmol/L时，PCR产物产量少，扩增谱带不清晰，DNA条带较弱；当dNTPs浓度为0.05～0.20 mmol/L时，扩增谱带的清晰度与浓度的大小呈正相关性；当dNTPs浓度为0.25～0.40 mmol/L时，扩增谱带清晰完整，但随着dNTPs浓度的增大，DNA条带并没有显著的变化。因此，假臭草EST-SSRs PCR反应体系中dNTPs浓度的适宜浓度范围为0.25～0.40 mmol/L。

2.3.3 引物浓度对EST-SSRs标记的PCR扩增影响

由图2-C可以看出，PCR的产量与引物浓度呈正相关性，当引物浓度为0.1～0.2 μmol/L时，扩增谱带较弱，不清晰；当引物浓度为0.3～0.4 μmol/L时，随着浓度的增加，扩增谱带变得清晰明亮；当引物浓度为0.5～0.7 μmol/L时，扩增谱带清晰明亮，但并没有随着浓度的增加而呈现出明显的变化；当引物浓度为0.8 μmol/L时，扩增谱带开始出现弥散现象。因此，假臭草EST-SSRs PCR反应体系中引物浓度的适宜浓度范围为0.4～0.8 μmol/L。

2.3.4 Tag DNA聚合酶用量对EST-SSRs标记的PCR扩增影响

Tag酶的用量影响PCR扩增的效率。由图2-D 可见，Tag酶用量过低时，PCR扩增效率低下，当Tag酶用量为0.50～2.00 U时，有扩增谱带出现，但同一Tag酶用量下，DNA条带间清晰不一；当Tag酶用量为2.25～3.00 U时，扩增谱带清晰度随Tag酶用量的增加而增大。因此，假臭草EST-SSRs PCR反应体系中Tag DNA聚合酶用量的适宜浓度范围为2.25～3.00 U。

2.3.5 模板DNA量对EST-SSRs标记的PCR扩增影响

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模板DNA的质量和用量影响PCR结果的敏感性和扩增效率。由图2-E所示，当模板DNA用量为10、15、20 ng/20μL 时，扩增谱带有缺失的现象，相比其他用量而言，DNA条带较弱；当模板DNA用量为40、45、50、60、80、100 ng/20μL时，随着模板DNA用量的增加，PCR结果的敏感性降低，出现非特异性DNA条带，且存在弥散现象；当模板DNA用量为25、30、35 ng/20 μL 时，扩增谱带清晰明亮。因此，假臭草EST-SSRs PCR反应体系中模板DNA量的适宜浓度范围为25～35 ng/20 μL。

2.4 EST-SSRs标记PCR反应体系的正交试验设计分析

实验数据结果显示，EST-SSRs标记PCR反应体系中5个因素的最佳反应水平为A4B3C3D1E2（表4），并不在正交组合表中出现，但与组合9和组合15接近。

2.5 PCR最佳反应体系的稳定性验证

根据正交设计数据分析及PCR扩增产物电泳结果（图3），结合经济原则，选择组合15为最优反应体系，对海南和广东地区的14个假臭草样本进行PCR扩增的结果（图4）显示，扩增谱带清晰明亮，稳定性好，具有多态性。

3 讨论与结论

3.1 EST-SSRs引物的设计

引物的设计是一个复杂的问题：涉及目的条带的长度大小（如大片段的cDNA，小片段的点突变基因及其侧翼序列）；模板DNA的复杂程度[11]；引物设计的软件（Premier Primer、Oligo、Dnastar、Primer-BLAST等）[16]；以及主要参数的差异（引物长度、Tm值、GC%含量、预产物长度），都会导致引物设计结果的变化。

3.2 假臭草EST-SSRs标记PCR反应体系优化

单因素设计仅对PCR反应体系进行优化，不能检测PCR反应体系中各因素间的交互作用，可能会导致亚优化结果的产生[17]，而正交设计试验可以弥补这一缺点，可以了解各因素间的内在规律，找到最佳的水平组合。另外，EST序列中缺乏内含子序列，EST-SSRs标记的对象是基因组DNA，因此，基因组DNA中未识别的内含子剪接位点会干扰引物与模板的结合，导致扩增失败，引物结合位点之间的内含子会导致扩增产物过长，或者扩增失败[8]，如图4中显示，HWC的扩增产物过长。在类群间，内含子位点是相对保守的，同时可以通过与模式植物，如拟南芥或水稻的基因组序列校准提高引物的效率。

本实验中Mg2+浓度对PCR扩增的特异性和产量具有显著影响，PCR反应体系中的Tag DNA聚合酶需要 Mg2+来激活，适量的Mg2+浓度可以提高Tag酶的活性，浓度过高则抑制Tag酶的活性，过低则无法彻底激活Tag酶的活性[18]。dNTPs作为PCR反应的原料，其浓度的大小直接影响PCR的产量，浓度过低，扩增谱带较弱甚至无带，过高则与Tag酶发生竞争性抑制，争夺Mg2+，抑制PCR反应[19]。从单因素试验结果来看，引物浓度超过一定值后，随着浓度的增加，PCR结果并没有明显的变化，相对于PCR反应体系中其他4个因素而言，引物的优化应偏向于经济角度考虑[20]。Tag酶的用量直接影响PCR的扩增效率，酶量过多，不仅增加实验成本，同时也会提高错配率，引起非特异性扩增，用量过低则导致酶与引物无法完美的结合。模板DNA的质量和用量影响PCR的敏感性和扩增效率，图2-E所示，模板DNA用量不同，其扩增结果有显著差异，用量过多时，扩增谱带出现弥散和变弱的现象。正交直观分析结果显示的最佳PCR反应体系并不在正交组合中，但与组合9和组合15接近，然而与组合15相比，组合9中对Tag酶和引物的需求量较多，从经济角度考虑，节约成本，最终选择组合15为假臭草EST-SSRs标记的PCR最优反应体系，即在20 μL的反应体系中，Mg2+浓度为2.75 mmol/L，模板DNA用量为35 ng，Tag DNA聚合酶为2.25 U，dNTPs 浓度为0.3 mmol/L，引物浓度为0.6 μmol/L。与甘蔗[21]、茄子[22]以及蔷薇科植物[23]相比，假臭草EST-SSRs PCR最优反应体系中的Tag酶用量偏高，这可能是由于研究对象以及样品处理方式的差异所导致的。

3.3 EST-SSRs标记的可通用性研究

目前，关于EST-SSRs标记的可通用性研究已取得了一定的成果。Malay等[24]研究发现，苇状羊茅（Festuca arundinacea Schreb.）的EST-SSRs引物在11种禾本科植物间产生清晰的扩增谱带，可用于羊茅属和黑麦草属的遗传研究。 Gasic等[23]研究苹果EST-SSRs引物在50种蔷薇科植物间的通用性，其通用能力为25%（杏子）～59%（梨），其中11对引物可进一步用于蔷薇科植物间的通用性研究。小麦[25]、茄子[22]等也有EST-SSRs通用性研究的相关报道。本研究开发的EST-SSRs标记在14个假臭草样本的稳定性验证结果同样表明，使用胜红蓟、薇甘菊和甜叶菊EST序列建立起来的EST-SSRs标记也可用于研究近缘种假臭草的遗传多样性。

致 谢 感谢国家标本平台教学标本子平台资助（http：//mnh.scu.edu.cn/）。

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EST治疗 第3篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

该研究选取2010年1月1日—2013年12月31日间来该院急诊就诊的SAP病人40例, 都给予急诊EST治疗, 其中有男性病人26例和女性病人14例, 年龄趋于35~66岁之间, 平均 (50.5±1.5) 岁。所有病人表现为所有病人表现为突发上腹痛, 恶心、呕吐、腹胀等, 伴有腹部压痛、反跳痛、腹肌紧张等腹膜刺激征表现, 肠鸣音减弱, 血尿淀粉酶、白细胞都有所升高, 符合SAP诊断标准。所有病人都在发病48 h内入院接受治疗, 可分为重症1级23例, 重症2级17例, 胆源性胰腺炎有21例, 非胆源性有19例。

1.2 治疗方法

回顾分析所有病人的临床资料, 病人入院后禁食禁水, 常规ERCP检查, 及时做好术前准备, 入院48 h内进行治疗。首先进行内镜检查十二指肠, 检查内容包括乳头形态, 有无开口狭窄、水肿、充血等, 有无乳头旁憩室, 有无结石嵌顿等;随后经斑马导丝引导进行ERC检查, 如有插管困难的病人可先进行切开在进行ERC, 明确病人发病原因。十二指肠乳头括约肌的切开角度选择11点钟方向, 依照实际情况选择切开长度, 行中切开。如果检查发现胆总管有蛔虫或结实则应先用网篮取出, 部分病人取出结石或蛔虫后进行ENBD。术中病人发现有切口出血者, 则给予去甲肾上腺素盐水局部冲洗或周围组织注射。在整个手术过程中尽量动作迅速, 减少手术时间, 避免损伤其他器官脏器而加重病情。EST手术前后积极给与抗生素、抑制胰酶活性、维持水电平衡、抑酸等内科治疗。

1.3 疗效评价

将治疗效果分为治愈、有效和无效三级, 治愈为1个月内病人腹痛、腹膜刺激征消失, 血尿淀粉酶恢复正常, 病人可以正常进食, 影像检查未发现病变, 没有出现并发症或得到控制;有效为病人症状、体征明显减轻, 可以进食, 血尿淀粉酶基本恢复正常, 影像检查没有发现病变, 出现并发症得到控制;无效为病人症状、体征没有改善或加重, 血尿淀粉酶没有改善, 出现严重并发症[4]。

1.4 统计方法

所有数据均采用SPSS17.0软件进行统计分析, 计量资料应用均数±标准差 (±s) , 计量资料组间比较采用独立样本t检验, 计数资料以百分率 (%) 表示, 采用χ2检验。

2 结果

经影像检查发现胆总管结石的有14例, 胆总管下端狭窄的有4例。胆道蛔虫的有2例, 乳头开口狭窄、水肿、充血的有21例, 1例病人胆道插管失败但胰管插管成功。其中29例病人治愈, 腹痛、腹膜刺激征消失, 血尿淀粉酶恢复正常。8例病人有效, 病人症状、体征明显减轻, 可以进食, 血尿淀粉酶基本恢复正常。3例病人无效, 症状没有改善, 其中1例病人病情突然加剧出现MODS而导致死亡, 总有效率为92.5%。

3 讨论

SAP是临床中一种常见的急腹症, 是指急性胰腺炎发作伴发坏死、脓肿、或功能障碍等, 起病急骤, 发展快速且并发症较多, 病情严重, 疗程长且容易引发多器官功能衰竭, 预后较差, 病死率高达22.7%以上[5]。SAP有多种发病机制, 常见的有胰酶自身消化学说、微循环障碍、细菌感染等, 但共同点都是胰管阻塞、胆汁或十二指肠液反流所致, 最后严重破坏了胰腺的防御机制, 激活胰蛋白酶原, 进而可能出现其他酶的激活, 出现出血、炎症、坏死等, 还会经体内循环后造成多脏器损害[6]。以往SAP的之劳存在两种意见, 即手术和非手术方法, 且术式、时机等也没有明确定论, 治疗方法不可过于偏向, 应依照病人实际情况选择合理的治疗方案。目前随着人们对SAP的发病机制的深入了解, 更多的人士选择病因入手, 对症治疗, 消除病因;经内镜十二指肠乳头括约肌切开术 (EST) 具有较好的安全性和临床疗效, 逐渐受到广泛人士所认可[7]。

在近十年以来, SAP的治疗研究过程中, 曾经应用过一些治疗方法[8,9,10], 其中液体复苏、预防性抗生素的使用、血液滤过等都经过了临床总结, 治疗效果都差强人意, SAP仍然作为一个高并发症、高致死率的疾病让很多患者的生命受到威胁。而在微创技术手段广泛应用的时代, 对SAP的治疗方法的方向也得到拓展, 在正确把握手术时机的前提下, 选择创伤小、便于操作管理, 且能增加靶向的治疗效果的EST技术进行治疗, 由以上实验数据证明其具有很好的治疗效果。但SAP发病急, 病情复杂的现状仍需要我们进一步去研究更加彻底的治疗方案, 以便大大的降低并发症发生几率和致死率。该研究为分析探究SAP病人进行急诊EST治疗的安全性及临床疗效, 将该院的40例SAP病人, 给予急诊EST治疗, 并观察其安全性和治疗效果, 结果得出, 急诊EST治疗早期重症急性胰腺炎的治疗效果较好, 因此得出结论, EST对SAP病人的治疗具有较好的疗效和安全性, 值得临床上广泛地加以推广应用。

有研究表明, 胰腺炎的发病因素主要有胆汁逆流进胰管、胆管高压、胆、胰管引流不畅等, 相关动物实验也证实胆汁反流进胰管能够刺激胰腺的微血管出现痉挛, 导致血流不畅, 进而出现微循环障碍, 产生并加重胰腺炎, 严重者可有水肿变为坏死[11]。因此重症胰腺炎的治疗过程中, 应主要进行解除胆管、胰管高压、促进胆胰分流、预防胆汁逆流进胰管, 降低胰液分泌潴留等[12]。有学者对急性SAP病人在起病48h内进行EST治疗进行研究分析, 发现早期进行EST能够显著提高治疗效果[13]。

在该实验治疗中, 通过对40例患者的回顾性分析可知, 对于SAP患者, 采用急诊EST的治疗方法可以明显地提高患者的治疗效果, 表现为患者中有29例达到完全治愈的效果, 8例有效, 而仅有3例患者治疗失败, 因此, 在临床上, 对于SAP患者可以采用急诊EST的治疗方法进行治疗。

综上, 该研究认为, 对于SAP早期患者采用急诊EST的方法可以明显提高患者的治疗效果, 值得临床上广泛地加以推广应用。

摘要：目的 探究SAP病人进行急诊EST治疗的安全性及临床疗效。方法 选取2010年1月1日—2013年12月31日间来该院急诊就诊的SAP病人40例, 均给予急诊EST治疗, 回顾分析其临床资料, 总结其安全性和治疗效果。结果 经影像检查发现胆总管结石的有14例, 胆总管下端狭窄的有4例。胆道蛔虫的有2例, 乳头开口狭窄、水肿、充血的有21例, 1例病人胆道插管失败但胰管插管成功。其中29例病人治愈, 8例病人有效, 3例病人无效, 其中1例病人病情突然加剧出现MODS而导致死亡, 总有效率为92.5%。结论 EST对SAP病人的治疗具有较好的疗效和安全性, 值得临床推广。

EST治疗 第4篇

一、人们对提问的普遍认识

1.提问的内容

提问的内容就是指问什么问题。人们普遍认为，提问的内容应该是以教材内容为主。

周大力和周丽萍提出了提问的八个切入点：关键点、疑难点、兴趣点、矛盾点、模糊点、忽略点、空白点、迁移点。

徐放认为设计提问要做到：a.从课文理解的关键处切入；b.从词句理解的疑难处切入；c.从课文内容的矛盾处切入。

郑恩进认为必须围绕教学中的关键点设计：a.在重点处设问。b.在文章感情强烈丰富处设问。c.在文章中看似矛盾之处设问。d.在容易被学生忽略的地方设问。

袁韵提出主问题的设置有三个立足点：a.抓住文章的主要矛盾进行突破。b.抓住主要人物性格进行突破。c.抓住文中的关键句进行突破。

张紫军直截了当地说：“选问点，问在知识关键处。”所谓问点就是指讲授教材时提出问题的切入点。一般而言，问点应选在知识的重点、难点、疑点、关键点、易混点和易误点。

2.提问的呈现

（1）提问的语言呈现

①提问语言要简洁明了

智浩和陈林认为课堂提问的语言应该简洁明了，少用专业术语和绕弯子，易于学生的理解。

②提问语言要精确

冯翠云认为提问应当表达精确。袁良平和王美珍认为提问语言的限制要严密，不要产生理解上的歧义。吴欣歆强调了提问的指向性。

③提问语言的其他要求

张紫军认为提问语言要有变化。马俊和张凤祥提出提问语言要优美。程翔指出要关注提问的体态语言。

（2）提问的呈现时机

①根据课程的推进情况选准提问时机

张紫军提出教师要依据具体情况选准时机进行提问。课程开始、进行中、结尾的提问各有不同的作用。陈林认为可以在教学环节过渡的时候巧妙提出问题，完成自然过渡。

②根据学生的心智状态看准时机

牛雅君和王功立都认为当学生处于“心求通而未得，口欲言而不能”的“愤悱”状态的时候，学生注意力集中，思维活跃，对教师的提问能入耳入脑，这是教师设问的最佳时机。

王英进一步指出要问在当问之时。当学生思维还没有启动的时候，当学生的思维积极向前的时候，当学生对思考过的问题进行整理的时候，层层设问，学生的思维顺利地越过障碍完成转折。

（3）提问的思维呈现

①思维的难度和坡度

张彩荣说设计问题，一定要使问题包含着学生必须完成的比较繁重的智力操作任务。

张俊贤和林姗认为提问难度要适当，要注意学生的最近发展区。李作芳提出提问要注意难度，使问题具有挑战性。牛雅君认为要善于在学生思维的原点上设计问题。

王功立根据解答距具体分析了问题的不同难度。心理学家在研究中把问题从提出到解决的过程称之为解答距。根据解答距的长短，提问可以分为四个级别。微解答距问题、短解答距问题、长解答距问题、新解答距问题。

陈锦珍认为提问要先易后难，由浅入深。郑恩进指出要注意层次性。罗和香说提问要有一定的坡度，把学生的思维引向深入。

②思维的开放性和提问的广度

张俊贤从阐释学的角度分析了思维开放性的根源。在教学中也应该注意不要一味地追求统一的答案，应该有意识地体现一种开放性，允许学生的某些自由理解。

刘万秀进一步研究了问题的开放性问题，从四个角度分析了开放性的问题 ：a.问题内容的开放性；b.问题设计方式的开放性；c.问题结果的开放性；d.提问对象的开放性。

（4）提问的最终方法呈现

①曲问——强调提问形式上的灵巧曲折

曲问是在问题搁浅，再启不发的情况下旁敲侧击、迂回曲折地提问。问在此而意在彼。

杭育提出提问分为直问、曲问、逆问、追问、想象问等。周晓江认为可以迂回曲折问。宋炳新和张燕认为可以巧问，曲折生姿。

杨兴刚用实例证明了曲问的效率。他说钱梦龙老师匠心独运，用“曲问”提升了学生的思维能力。

②追问、递进问注意到了提问的连贯性

周晓江认为针对教材的内容，设置问题链，可以层层递进问。杨兴刚用钱梦龙老师《愚公移山》的实例进一步证明追问能够紧抓文章关键。

3.提问之后的评价

冯翠云认为及时对学生的提问或回答给出所应有的评价是提问有效进行的保证。李朝霞说要做好提问中的评价工作：要保护学生回答问题的积极性，从而进一步调动学生学习的积极性。

冯翠云老师还提到了鼓励和表扬的具体方式：a.引用学生的语言；b.使用肢体语言。

二、提问认识中的缺憾

1.突出教材内容，忽视学生理解

提问的内容当然要来源于教材的内容，但是仅仅这样就够了吗？

有人在比较获得资讯而读和增进理解而读两种情况时说：“我们自己在阅读报纸、杂志或其他的东西时……这样的阅读能增加我们的资讯，却不能增进我们的理解力，因为在开始阅读之前我们的理解力已经与他们完全相同了。”

仅仅关注教材内容也就相当于仅仅关注资讯，然而很明显，我们的教学，对学生而言，应该是侧重于理解力的提升，而不仅仅是获得资讯。

在很多情况下，我们听到的只不过是学生认为我们期待他们会说的话，或者是一些他们已经记住的事实。然而往往他们既不明白自己的回答，也没有理解内容。我们平常做的最成功的就是教与学相分离，内容与理解相分离。我们没有真正关注到学生的理解。

Perkins(1998)把理解定义为思考和灵活运用所学知识的能力。当学习者能思考、能灵活运用自身所学的知识时，理解力就在向人们展示它的存在。相反，如果一个学习者无法超越死记硬背，固执于某种思维和行为方式，这就是缺乏理解的一种表现。

建构主义提倡，由学生自己来建构、论证和展示他们的理解。

如何促进学生的理解呢，怎样提升学生思考和运用知识的能力，怎样让学生自己来建构知识的内涵，怎样提高他们自己建构、论证和展示他们理解的能力？这个我们关注的还远远不够。

2.关注提问结果，忽视思维过程

陈军说：“听了不少公开课，感到不少老师依然是把问题解决看作是课堂教学的头等大事。比如教师提出了一个思考题，然后要求这个同学答，要求那个同学答；答不上来，教师就牵线搭桥，暗示一番，直到把答案从学生嘴里抠出来为止。这样做，无非是‘解决’了问题，使学生‘抄’下了答案。”

这样做肯定是令人遗憾的。我们关注提问的语言，力求简洁明了、精确并辅之以肢体语言，目的就是让学生高效率地理解题干，明白他们的任务。关注提问的时机，根据课程选准时机提问和根据学生心智状态相机提问都是为了能够更好地契合学生的思维状态与内容理解，能在回答时发挥最高的水平，发挥最大的价值。而考虑思维的深度坡度则是能让学生更容易回答。曲问和追问目的也是直指核心——怎样让学生回答出令人满意的接近教师预设的答案。

这样做只不过把陈军老师说的牵线搭桥精致化了一些，但是答案的得出，学生运用了哪些思维操作，根据哪些材料，进行了怎样的推理，他们怎样理解某些核心概念，我们所知甚少。

3.强调初始问题，忽视思维追问

关注提问的内容组成，从哪个点来问；关注提问的时机，从什么时候来问；关注提问的语言，关注提问的思维含量，注意提问的难度坡度和广度，在形式上强调灵活曲折等等这一切，都指向一个问题——怎样问一个问题。然而这个问题问完之后呢？

如果学生的回答比较令人满意，该怎么处理；如果差强人意，那又该怎么办？好的回答是否应该有些共性，如果有，这些共性应该是什么？不好的回答是否也应该有些特征，这些特征又该如何对待？有没有什么具体的操作步骤？所有这些问题我们关注的还比较少。

蒋海莞和陈兆进强调了追问的重要性，但是如何进行追问，他们的回答比较大而化之。

当然也有一些高明的教师自发地艺术地运用过追问艺术，比如钱梦龙老师。然而能够自发地达到钱梦龙老师高度的又能有几个人？

4.指向空泛群体，忽视个体特点

从提问之后的评价我们可以看得出，鼓励、表扬都是面对一个比较空泛的群体。因为每一个人不管回答正确与否，都希望得到教师的肯定。因为这样可以保护学生回答问题的积极性，因为这样是有效提问的保证。然而这里的每一个人和学生都是一个面目模糊的群体概念。

而当我们最初考虑提问的语言、提问的时机、提问的难度以及解答距、最近发展区、提问的连贯性的时候，我们心中考虑的也是一个面目模糊的群体概念。

不是不应该考虑群体概念，但这远远不够。我们应该努力前行，尽可能把它细化。

苏霍姆林斯基《给教师的建议》的第一条建议就是“请记住：没有也不可能有抽象的学生”。他说：“可以把教学和教育的所有规律性都机械地运用到他身上的那种抽象的学生是不存在的。也不存在什么对所有学生都一律适用的在学习上取得成就的先决条件。学习上的成就这个概念本身就是一种相对的东西：对一个学生来说，“五分”是成就的标志，而对另一个学生来说，“三分”就是了不起的成就。教师要善于确定：每一个学生在此刻能够做到什么程度，如何使他的智力才能得到进一步的发展，这是教育技巧的一个非常重要的因素。

细化群体，重视个体，目前的提问研究距离这个目标还很遥远。

三、提问遗憾的根源

1.根源之一在于对于提问目的的理解

提问的目的不能仅仅是让学生走进以及如何走进文本，更应该关注学生理解力的提升。

（1）目前我们对于提问目的研究主要集中在走进文本和怎样走进文本上

黄厚江指出提问是为了引导学生走进文本。阅读教学中提问的最直接目的就是引导学生阅读文本、感受文本、思考文本。

前面我们所做的关注提问的内容组成、关注提问的时机、关注提问的语言呈现、关注思维呈现等等其实都是为让学生更好地走向文本。

当然大家也提到了提问对启发学生思维的重要性。如冯文秀《语文教学中课堂提问技巧浅析》提出课堂提问的目的之一就是启发学生思维。

但是光是启发思维是远远不够的，怎样启发大都也语焉不详。

（2）提问的目的更应侧重于学生理解力的提升

教材无非是个例子，例子背后的才是我们真正需要的。

教材当然具有丰富学生资讯（学习内容）的功能，但是它和校外那些阅读书籍应该有明显的不同。它的不可替代性之一就是侧重于对学生能力的有效提升。

重要的不是理解某个事物，重要的是理解本身。

换种说法就是我们不是为了学习教材而进行学习，而是为学习而运用了教材，在某种意义上，教材只是一种抓手一种途径，而能力的提升才是真正的目的。

而结合初中生处于个人学习知识、认识世界、提升能力的黄金时期来说，丰富知识也是必须的。但是我们必须认识到我们的终极目的在于能力的提升。

作为处理语文教材的一种主要手段，提问的最终指向应该也是能力的提升。而理解能力则是阅读能力中非常重要的一个组成部分。我们必须认识到提问的目的更应侧重于学生理解力的提升。

2.根源之二在于对于落实提问目的有效途径的理解

落实提问的有效性，基础在于学生的回答，关键在于初始问题之后的加工性(processing question)问题。

（1）加工性问题比初始问题更重要

通过前面的分析，我们可以得出，目前对提问有效性的研究大多集中在如何形成一个问题，一个初始问题上。而并没有注意到在发展和改进学习者认知加工的过程中，回答的结构化和随后的教师追问均比提出的初始问题更加重要。

刘祥在评论王开东《林教头风雪山神庙》时说，只是老师提出一个问题，然后三两个同学各自主动从自己的理解出发阐释几句，老师再亮出自己的观点，一个探究就算是完成了。这种解决问题的方式，显然不能算是“对话”。之所以如此，关键的原因就是教师没有注意到加工性问题的价值。

当我们提问加工性问题的时候，特别是如果我们紧跟在学生的回答之后迅速提出这些问题，我们便是在鼓励学生开展元认知式的思考。一旦学生理解了他们正在想什么、他们是怎样形成自己的观点以及什么时候适合应用特定的思维操作，他们就顺理成章地掌握了教学内容。而如此有效的提问变成了学生生成独特见解和独立学习的重要工具。

（2）加工性问题能够为师生的对话指明方向

紧随学生回答之后的，经过精心设计，与核心问题密不可分的加工性问题能为学生提供一套指路标识，引导他们参与目的明确的、以教师和其他学生为互动对象的对话。

学生的回答向我们展示了他们的理解：即学生知道什么、他们对某件事物的了解程度或深度、他们是怎样针对某一事物展开思考的。

打一个比方，如果我们去旅行，初始性问题只是负责发动车子，而到达目的地的关键在于我们怎样按照地图的指示小心驾驶安全通过中间的旅程。加工性问题就是一个非常实用高效的导航仪。

只有以学生的回答为基础来组织核心问题（core question）和加工性问题，才能构建出有效的提问。

四、运用Qu:Est策略提高提问的有效性

（一）什么是Qu:Est策略

Qu:Est策略是美国西南州立大学Marylou Dantonio和PaulC.Beisenherz历时24年，在分析和研究了大量关于课堂提问、理解性教学以及儿童如何学习的文献之后，以建构主义理论与塔巴的教学策略为基础，提出的教学策略：为理解而教学：让学生开动脑筋。（Question for Understanding:EmpoweringStudent Thinking）

Qu:Est策略旨在帮助学生将学科知识与自身经验合二为一，生成对教学内容的深刻的、有意义的理解。教师利用Qu:Est策略可以发现学生在想什么，以及他们是如何生成自己的想法和观点的。它是一项以过程为中心的教学策略，它要求教师把学生当作学习的主体，把教学看作是一个学习的过程，要求学生把学习当作一个发挥自身主动性的积极过程。

（二）Qu:Est策略的组成以及实施

1.Qu:Est策略的组成

Qu:Est教学策略由四个概念组成：a.提出思考为中心的问题 ；b.利用学生的回答作为进一步提问的基础；c.测定提问的速度并按顺序安排追加问题，从而实现对学生开展思考的引导；d.提供“思考时间”，鼓励学生利用适当的非语言手势与教室空间提出经过深思熟虑的回答。

简而言之，Qu:Est策略=核心问题+加工性问题。

2.核心问题

在Qu:Est策略中，具有认知性提示的问题被称作核心问题。有效的核心问题能提示和控制课堂对话中的思考经验，主要被用来集中、引导和指导由课程目的或目标指定的特殊思维操作和课堂内容。关键特征是：a.语言清晰简洁：运用学生能理解的语言，问题或信息不复杂、不绕弯儿。b.中心明确：运用能指定内容和规定实现课程目标所需的认知操作的措词。c.具有开放性：选用的词汇能从尽可能多的学生身上挖掘大量多样化的回答。

语言清晰简洁很简单。中心明确这里有一个区别于我们普遍关注的初始问题的显著特点。也就是说必须有指定的思维操作动词。书中列举了某些思维操作核心词汇：观察、回忆、比较、对照、分组、贴标签和分类等等。

具有开放性是针对封闭性问题而言的。所谓封闭性问题就是指那些只需要回答是或者不是的问题。封闭式问题的主干是：a.你……吗？b.你能……吗？c.你会……吗？等等。开放式问题的主干是a.什么事……c.以什么方式……c.怎样……d.为什么……e.哪些是关于……f.你怎么知道……

简而言之，核心问题要求课堂实践者把学习看成一个过程，而不是对讲授内容的简单记忆。它并不要求学生记住知识，它会标明和向学生提示某种特定的认知操作，并引导学生在回忆和执行这种操作过程时运用这些线索做辅助。它的目的是引导学生去思考学生课堂中互动的内容。

3.加工性问题

（1）定义

加工性问题就是指能促进学习者反思自己的初始回答，进而能帮助他们理解被自己隐藏在表面观点背后的思想的问题。加工性问题主要用于激励学生更全面地理解课堂内容，并构建一个更完善的认知操作。要根据学生的回答加工问题，首先要了解学生回答的品质。

（2）依据和分类

高质量的学生回答至少具有以下七种品质。而这些正是加工型问题的分类依据。

清晰性：学习者回答问题时所用的语词完全可以理解，不带丝毫含糊，也不存在说话不完整或者思维混乱的现象。

精确性：学习者的回答不存在事实性错误，是以正确的信息为基础的。

适当性：学习者回答的问题正是提问者所问的问题。

确切性：学习者很明确他（她）在跟谁说话以及在谈论什么话题。

支持性：学习者提出各种理由、事实或例子来支持他（她）的陈述，或者他（她）会解释构成自身观点的标准或假设。

复杂性：学习者的回答表明他（她）意识到可以从多个角度看待正在讨论的问题，而且在达成一个令人信服的看法之前，他（她）必须考虑多重观点的影响。

原创性：学习者充分利用现有的知识和过去的经验创造或发现了新观点。

根据学生回答的不同品质，加工性问题可以分为以下六类：重新聚焦的问题、解释性问题、验证性问题、限定焦点的问题、支持性问题、重新直接询问的问题。

（3）加工性问题的具体运用

①用重新聚焦的问题调整学生回答的适当性

重新聚焦的问题用来调整学生的答案，使之符合核心问题或限定焦点问题的要求。它的目的是帮助不在研究教学内容的学生，或是帮助那些采用了其他并非核心问题指定的思维操作的学生。在具体应用时，教师重新聚焦的问题必须再次叙述学生的回答，告诉学生这个回答的哪些方面不合适，然后再重新陈述原始问题。这就叫反射镜技术。

例如：你说_____ __。我要求你____ _____。所以，_____。（再一次提问你的原始问题）

郑桂华老师在上《变形记》时有这样提问的片段：

师：……梁山伯与祝英台变成蝴蝶双双飞走，那至少给我一种愉悦的感受。这个格里高尔变成甲虫，是一个看起来让人很不舒服的形象。他为什么会变成这样一个东西？

……

生：我觉得他是通过写甲虫的外表来表现格里高尔内心的一些特质，比如他的好的地方。

师：……你侧重讲格里高尔内心、本质上还是有好的地方。再说一遍我们刚才讨论的问题，我的意思是，他怎么就不化成蝴蝶那样给人美感的东西？他怎么就变成一个基本上没有什么美感的甲虫？

②用解释性问题调整学生回答的清晰度、确切性

清晰性的特征以语法、定义和词语描述的适当性为中心。它让学生有机会运用自己的语言来解释他们对某个事物的理解。这个习惯可以帮助我们剖析学生的回答用语，确保学生的确是把语言当作保障沟通精确性的精密工具。它也使学生对如何运用词汇阐明个人见解或扰乱概念内涵的问题保持高度的警觉性。

因此教师必须保证学生在回答解释性问题时一定会给他们使用的词语下定义，而不是给出解释词语内涵的例子。

例如：你想用________表达什么意思。

③用验证性问题提高学生思考的精确性与原创性

验证问题有助于增进学生思考的精确性与原创性。在提出验证性问题时，教师就是在等着听学生举例子、叙述个人经历、引用权威或参考书目，或者是在等待学生把他们的回答整合起来，概括成极其适合进一步举例说明的结论，或者是最适合为讨论中的内容中提供证据的一般原则。

通过这一步骤，学生可以把正在学习的与已经知道的联系起来，就能更好地领会主要问题的概念内涵。总之，提问验证性问题凸显了高质量回答范畴里的精确性与原创性。

验证性问题的范例如下：

例如：你怎么知道____________？

你能举出什么例子证明_________？

你在哪里发现那条信息的？

李镇西老师在《提醒幸福》一课中曾经这样问：

师：她说提醒的后缀词总是灾祸，我们已经习惯了提醒。你有没有类似的体验？

生：也有过。

师：谁提醒过你什么？

生：我妈妈提醒过。

师：这叫读出了自己。他读到这一段就想到自己的生活，啊呀，真是这样的。你妈妈提醒过你什么？

生：就是有的时候上课不认真听讲，然后老师告诉我妈妈，我妈妈就会提醒我。

师：那不叫提醒，叫批评。

生：不，她不批评，她就是提醒我下次上课好好听讲。如果不好的话，那后面就是灾祸了。

师：什么灾祸？妈妈对你会有什么灾祸？

……

④用限定焦点的问题提高学生回答的确切性

限定焦点的问题就是为了帮助学生运用核心问题指定的、适当的思维操作来研究教学内容的特殊问题。它与学生回答的确切性相关，它要求学生把他们的回答提炼到更高的层次。如果学生分享的主题信息涉及面非常广，或者没有注意到概念的关键特征的特殊含义，那么，教师就必须启发学生思考特定的概念属性。

限定焦点的问题范例如下：

关于——（学生回答尚未涉及的特定内容或关键特征），你（思维操作）想到什么？

宁鸿彬老师在上《皇帝的新装》时这样提问：

师：请你们给本文拟一个副标题——一个什么样的皇帝，最好结合课文做些解释。

……

生11：我拟的副标题是“一个爱美的皇帝”。因为文中的皇帝一天到晚考虑的总是如何穿新衣服。

师：你说的“爱美”是他的优点还是缺点？

生11：当然是缺点。

师：如果是缺点，光说爱美是不行的。爱美之心人皆有之。我也爱美，你们看，我上课还穿西服系领带呢。我这60岁的老头儿，也爱美。但是，这是优点不是缺点。你能不能把刚才的说法稍加修改，使人一听，就知道说的是缺点。

生11：爱美过度。

师：很好，过分讲究穿戴就是缺点了。这也是我们常说的——什么词？

生12：臭美。

⑤用支持性问题提高材料与观点之间的关联性

在做出决定之前，支持性问题将配合信息与悬而未决的判断之间的关系来应对学生回答，直到学生考虑完所有观点为止。它们要求学生抓住能证明自己观点的证据，也要求学生为他们的判断陈述理由。一般情况下，在形成概念的时候，在学生表达的例子或观点与给定的标签或提供的定义无关的时候，就会用到支持性问题。

支持性问题有助于师生了解学生是如何生成回答的。

支持性问题的结构应该体现回答问题的框架。简单地问一个“为什么”并没有建构一个回答设置对应的边界线。支持性问题的准确措词应该是这样的：

例如：

关于________，有什么让你认为_________？

你怎么确定___________是一个__________？

郑桂华老师在《春》里的提问：

生：这篇文章用词十分优美。

师：请举例说明。

生：比如说，“风轻悄悄的，草软绵绵的”这句话就显得十分优美。

师：为什么？

生：因为把春天的草的流动状态、春天的风温暖的感受给写出来了，写出了草刚刚长出来的样子。

师：为什么这样写就好，就优美呢？

……

⑥用重新直接询问的问题提高学生回答的复杂性

重新直接询问的问题就是要求学生与学生之间展开更多互动的问题。它也是师生生成和引出的观点更加多样化的一种方式。重新直接询问的问题支持高质量学生回答的所有特点，尤其是复杂性。为了引出更多的对话，它们可以以任何问题的形式出现。教师在上课期间也应该经常提出重新直接询问的问题，从尽可能多的学生身上获得多种回答。

一些关于重新直接询问的问题例子如下：

还有谁（再问一次你的问题）？

关于（再问一次你的问题），你还有其他什么资料？

胡明道老师在《老王》中这样提问：

师：……首先我们来看看文中是怎样描写老王的生活的。请同学们在书上勾画出具体的语句然后用自己的话总结出来。

……

师：这两处所写的都是老王的谋生手段。那么，对老王生活的描写还有哪些呢？

生：……

师：这里说的是老王的居住条件，那么还有对老王生活的描写吗？

……

重新审视提问的目的，重新规划提问的过程，把问题设计的注意力从初始问题上移开一点，聚焦在加工性问题上，根据学生的回答，提炼并重新塑造学生的回答，能更好地了解学生所想，也能更深入地了解他们怎样生成自己的回答，提问的有效性也将在现有的基础上更上一个台阶。

参考文献：

[1]郑桂华.听郑桂华老师讲课[M].上海：华东师范大学出版社,2007.

[2]周成平.中国著名教师的精彩课堂[M].南京：江苏人民出版社,2007.

基于EST的茶树分子生物学研究 第5篇

关键词：茶树,EST,茶树分子,生物学

对EST-SSR引物进行PCR试验, 由聚丙烯胺凝胶电泳加以验证, 统计出聚丙烯胺凝胶电泳的条带数目并分类与分析, 然后按照EST-SSR多态性利用软件来分析聚类, 建构相应的系统树, 以此辨识不同茶树的亲疏关系, 归纳茶树分类法。分析茶树遗传构造, 讨论茶树的生物学性状存在差异性的遗传学原理, 并验证EST序列和设计SSR引物的可行性与实际作用, 最终试验验证EST-SSR在生物种之间通用性的优劣程度。

1 达序列标签-简单重复序EST-SSR

上世纪八十年代末, 由美国著名科学家Venter首次提出基因组EST计划, 且人类基因组试验逐步被应用于植物类试验, 它可利用c DNA实现随机测序工作, 以此认识基因组试验。EST-SSR具有SSR标记的优点, 且兼具通用特性好、引物成本低、思路缜密和统计方便等好处。因EST-SSR源自与目标性状具有直接联系的转录区, 因而利用标记分子的方法来帮助筛选育种在应用方面相较于全基因组SSR要优越的多。种质资源评价利用EST-SSR方法会体现出转录区的各异性, 即反映出植物性状遗传的多样性特征。EST-SSR被定位于性状基因内部, 可直接选择控制目标性状的等位基因。另外, 分子标记也可用于MAS的筛选, 不同植物的EST-SSR仍然存在较高的共线特征, 因而可以说明该方法在作图研究与合并遗传图谱锚定位点中适用。

SSR具有生物通用性特征。由Marion S.Roder提出基于传统基因组的SSR引物的通用性特征在不同物种间表现极差, EST-SSR引物则通过较为保守的侧翼序列与稳定的SSR进化其通用性特征在不同物种间表现尚好。不同物种之间EST-SSR引物的生物通用性可保障分子标记的价值和标记数量, 这一点在SSR引物中就无法得以保障。究其原因, EST-SSR的侧翼序列在不同物种间保守关系牢靠, 因而使其引物可以在不同物种之间保持良好的生物通用性。

近年, 有关EST研究技术水平不断提高, 庞大的EST数据俨然是SSR的主要来源。据可靠数据分析, 1%~5%的植物在EST中含可标记的SSR。由林范学按照FGP与NCBI检索EST序列, 然后经软件处理设计EST-SSR引物, 最终衍生出多态性的条带。

2 茶树分子EST-SSR标记的开发及生物学研究

讨论植物物种种质的资源分类, 茶树的生理分化类别一直在完善中, 而分子标记技术水平也在不断提高。然而, 茶树SSR研究对比其他物种分子标记要相对滞后, 可用引物毕竟很少, 由此也导致有关茶树采取SSR标记分子的报道少之又少, 成为当下阻碍SSR技术发展的重要原因。另外一方面讲, 建构茶树基因库与遗传图谱系统不足也对SSR引物的设计造成了极大的影响。近年来, 庞大的EST数据群作为SSR引物设计的直接来源, 逐步发展起来的EST-SSR分子标记技术其实是一种建立在表达序列之上研发的微卫星分子标记技术。相较于普通SSR技术, EST-SSR分子标记技术主要依仗的是保守的侧翼序列和稳定的进化过程, 由此即可保障EST-SSR引物能够在不同物种之间保有良好的通用性特征。另外, EST-SSR引物还具有在物种间灵活转移的特点, 其高通用性特征也能保证分子标记的高价值和良好的标记数量, 这一点在SSR方面就显得比较差。忻雅等人将EST-SSR引物与其近亲物种完成扩增, 其扩增效果基本不低于50%, 更有甚者可达到超过80%的扩增效果, 如此之高的扩增下过间接说明EST-SSR分子标记于近亲物种之间的高通用性。ESTSSR引物与普通SSR引物通用性特征的研究报道更多集中于如玉米、蚕豆、水稻、黄豆和马尾松等经济作物。从研究结果来看, ESTSSR引物的通用性显然要高于普通SSR引物。当前, EST-SSR分子标记不仅限于对物种遗传多样性的研究, 更为实际的应用则是物种种质鉴定与选育。在建构物种遗传图谱系统当中, EST-SSR分子标记技术得到了良好的发展机会。本文试验将研究EST-SSR分子标记在茶树中的应用, 讨论分子标记技术开发和物种通用性问题, 以期研发出一种既具有精准性又具便捷性的遗传分类引物, 以此即可严重不同物种之间EST-SSR引物的高通用性特征。

本节内容以江西地区野外采集可供试验研究的17 类茶树样本, 然后统一采取EST-SSR分子标记技术来探讨茶树物种的通用性特征。按照EST-SSR引物能在物种间通用的基本特征, 并从NCBI与EMBL检索有关茶树的EST序列, 同时辅以EST-trimmer、CAP3 和SSRIT等程序予以处理, PCR引物则是利用PRIMER5.0 程序来设计的。经过数据库检索发现, 茶树的EST序列并不适合于SSR引物, 按照此法我们也可选择亲近的茶树EST-SSR引物。

定位查找genebank内的茶树EST序列, 我们可以查找到20 条符合要求的茶树EST序列, 然后采用SSRhunter程序予以分析与处理, 并未找到符合SSR引物设计要求的茶树EST序列, 因而利用茶树EST序列来设计SSR引物可实现验证其通用性的目的。刘春燕、王艳芳等人按照已公布于世NCBI的茶树EST序列信息, 利用ESTtrimmer程序对其予以筛选, 并采取CP3 程序对序列片段予以分析与聚类, 得到品质较高的Unigene, 然后利用MISA程序再行处理得到40 对EST引物。借助此40 对EST引物作试验分析, 并以重复基序在茶树出现的频率、GC含量约为50%左右、退火温度约58℃左右、序列片段长约200bp左右和EST引物长约20bp作为基本标准, 筛选出28 对执行下一步试验有价值的EST引物。

对以上筛选出的28 对EST引物, 记录其分子标记的PCR扩增效果, 按照不同的扩增率依上而下分别将其赋值记为“0”, 有条带的则将赋值记为“1”。统一构建EST-SSR引物的“0-1”数据表, 以矩阵形式转化不同分析程序相应数据格式并予以严格分析。然后, 利用POPGENE32、POWERMARKER V3.25 对等位基因数 (A) 、有效等位基因数 (Ne) 、等位基因频率 (P) 、平均基因多态性和多态信息含量 (PIC) 等物种遗传多样性参数和物种遗传距离指标予以运算, 得出计算结果。

3 EST-SSR茶树分子标记试验的结果分析

按照Lewers针对分子生物学的理论研究成果来看, EST-SSR引物的设计于SSR长度的要求较高, 其长度于EST-SSR引物在不同物种之间多态性的效率息息相关。我们将SSR长度设定在18bp左右, 目的便是为了增强EST-SSR引物扩增的多态性。因此, 从40 对EST-SSR引物中筛选出28 对, 均要求其长度在12bp~22bp范围以内。其中, 13 对具有二核苷酸重复基序, 经电泳鉴定具备多态性的则为3 对;15 对具有三核苷酸重复基序, 经电泳鉴定具备多态性的则为10 对。这样的结果与刘春燕2010 年所做试验的结果基本相同。经本次试验证明, 28 对EST-SSR引物可扩展的多达24 对, 且其中13对EST-SSR引物附特异性扩增产物并具有良好的多态性特征。

上述EST-SSR引物附特异性扩增产物, 其多态性特征的表现则为茶树间条带的差异性, 这也说明了茶树之间的物种差异性。大部分EST-SSR引物的重复基序都大于18bp, 总体通用率高达46.4%, 较之黑莓、甜瓜和鲤鱼等物种要高的多。另外, 对PCR产物检测可发现, 共计得到81 条条带, 其扩增片段均保持在300bp左右。每对ESTSSR引物的扩增条带数目少则2 条, 多则14 条。

本论文基于前人研究成果, 精心筛选28 对茶树的EST-SSR引物, 并对其中17 个茶树全基因组DNA加以扩增与鉴定, 并成功扩增其中24 对EST-SSR引物, 占据总数约为85.7%, 而成功扩增的ESTSSR引物又有13 对可作为有效通用引物, 通用率高达46.4%。

4 结束语

本文基于EST-SSR分子标记技术研究茶树分子生物学特征 (物种通用性) , 着眼分子生物学对江西地区茶树予以种类分析与聚类分析, 建构系统树, 比较物种亲疏关系, 并揭示江西地区茶树的物种遗传性状的构造、进化过程和种质资源情况。同时, 改善我国在茶树分子标记技术水平不高的现状, 通过试验研究验证茶树EST-SSR引物的物种通用性特征, 且说明EST-SSR技术比SSR技术优势明显, 进而深入推广EST-SSR作为一种物种分子标记手段应该成为物种鉴别的第一选择。EST序列原因物种基因的表达过程, 可反映出基因编码的信息特征和转录区的差异性, 因而在茶树分子遗传多样性分析及其建构遗传连锁图、分子标记、筛选育种等研究皆可适用, 以此推广EST-SSR分子标记技术作为茶树分子生物学研究的基本理论和可靠依据。

参考文献

[1]张亚丽, 赵丽萍, 马春雷, 等.茶树亲环素基因c DNA全长的分析鉴定与原核表达[J].茶叶科学, 2011, 27 (2) :112-114.

[2]阮宏鹏.复方丹参滴丸联合氨茶碱预防急性轻症高原病[J].茶叶科学, 2010, 12 (9) :76-79.

[3]傅海平, 张亚莲, 常硕其, 等.湖南省茶叶研究所茶园土壤养分现状及20余年变化研究[D].2009.

[4]戴前颖, 夏涛, 朱博, 等.β-环糊精对茶汤体系的动力学稳定性影响[J].茶叶科学, 2012, 11 (15) :82-84.

EST治疗 第6篇

1 逆行性胆管炎

Hawes等[10]报道过EST术后胆道系统细菌感染率可高达60%, 胰液及肠道内容物反流至胆管, 细菌入侵, 便可引起细菌的逆行感染。Sherman等[11]对肝移植术后并发胆瘘的患者成功完成了EST加支架置入术, 术后跟踪随访9 个月, 发现胆道并发症发生率为11.1%, 其中1 例并发症为轻度胆道炎, 考虑是支架阻塞引起, 取出支架以及对症抗感染后炎症消失。有关EST术与胆道细菌感染的关系, Mandryka等[12]做过相关的预测评估, 得出的结论是基本全部的EST术患者胆管内都会有细菌感染, 且定殖的细菌大部分是革兰氏阴性菌, 其中以大肠杆菌最为多见。张博等[13]的研究发现, ERCP术后感染的病原菌大部分具有耐药性, 因此, 当感染发生时, 首先应该做的是对病原菌进行分离培养及进行药敏实验, 根据得出结果再选用恰当抗菌药物进行治疗。

2 胆管结石复发

对于胆管结石复发的概念, Dong等[14]对其的定义为原发结石证实被完全清除后的6 个月以上再次被发现的胆管结石。EST术后胆管结石复发的发生率高达4%~24%[10,15,16]。Tanaka等[17]发现胆管结石复发中的30% 是发生于内镜取石术的5 年之后。刘渊等[18]分析EST术后胆管结石复发的成因主要归结于以下几点: (1) 胆管手术史; (2) 丧失乳头括约肌功能及胆囊功能; (3) 胆总管扩张; (4) 术后残留的原发结石; (5) 胆管有寄生虫感染。目前对EST术后的患者是否常规行胆囊切除术仍存在很大争议, 认为EST术后应常规切除胆囊的学者推测保存胆囊是术后远期并发症发生的促成因素之一, 故为了减少并发症的发生, 应常规行胆囊切除术。但是, Schreurs等[19]对437 例患者进行了长达13 年的对照研究, 得出的结论是无论切除胆囊与否, 对EST术后远期结石的复发并无影响, 而且认为无需预防性行胆囊切除, 只有并发症确实出现后才有必要切除胆囊。由此可知, 保留胆囊不但不是造成胆管结石复发的因素, 重要的是, 它可以提供正常的胆汁分泌, 减少了患者术后消化不良等症状, 与此同时, 胆汁排泌还可以起到清洁胆道的作用, 进而有效防止了胆道结石的形成。

3 术后胆管末端狭窄

当充气为2 m L的球囊无法通过十二指肠乳头时就可以诊断为乳头狭窄, 这通常发生于胆总管结石复发患者[17]。EST术后发生乳头再狭窄的几率是单纯胆总管结石患者的5 倍左右, 乳头的再狭窄主要发生于EST术后的第1 年[20]。行EST术时, 手术部位有可能会出现瘢痕挛缩, 从而引起乳头狭窄, 进而导致胆汁流出通道不通畅, 随之一系列的并发症也会接踵而至。有报道指出, 十二指肠乳头狭窄的患者EST术后出现乳头再狭窄的发生率比单纯胆管结石患者高, 十二指肠乳头狭窄患者, 采用中小切开就足以解决梗阻问题;而对于乳头功能不全或者丧失的患者, 为了防止出现胆汁排泄不畅以及结石形成等症状, 一般要求要行大切开[21]。然而, 虽然大切开解决了当前的问题, 但随着对括约肌破坏的增大, 并发症发生的几率也相对增高, 因为切口越大, 乳头括约肌本身形成的屏障抗反流作用丧失, 肠内容物向着相反方向反流, 继而容易引起一系列胆道炎症甚至癌症的发生。

4 胆道癌症

有相关研究报道, 对EST术患者进行术后跟踪随访, 8 年后胆囊癌的发病率为0.7%~2.5%[22]。而对于采用外科手术治疗的胆石症患者, 跟踪随访5年后, 胆囊癌的发病率为0.1%~0.8%[23], 男女的比率为1∶4, 多见于妇女。Hammarstrom等[24]跟踪随访了35 例患者18 个月, 这些患者均为采用EST术后保留胆囊, 最后发现死于胆囊癌患者的有2 例 (5.7%) , 因此, 他们提出为了预防胆囊癌, 建议术后即行胆囊切除术。另外, 也有学者对EST术后患者随访10~20 年, 结果发现胆管癌的发生率高于普通人, 其发病机制可能是Oddi括约肌遭受破坏后, 其抗反流作用丧失, 长期的胆汁刺激会促进胆管癌细胞的生长。

5 术后胰腺炎

术后胰腺炎 (post-ERCP pancreatitis, PEP) 是ERCP术后最常见而且严重的并发症, 占了ERCP术后并发症的一半多。大多数学者认为治疗性ERCPPEP发生率高于诊断性的ERCP[25,26], 但是, 也有学者研究发现两者的发生率并没有明显的差异。Cheng[27]做过一个相关研究, 得出的结论是小切开容易出现急性胰腺炎, 相反, 大切开则很少出现, 进而推测, 出现这种并发症的原因与切开充分与否有关, 倘若切开不够充分, 一旦切开出现充血水肿时, 胰液无法顺利流出, 胰管压力增高, 则容易出现PEP。应用内镜下乳头括约肌球囊扩张术 (Endoscopic papillary balloon dilatation, EPBD) , 不但可以保留乳头括约肌的功能, 而且减少了EST术后所引发的出血风险。但是有学者通过研究认为, EPBD比EST有着较高胰腺炎发生率, 主要是因为扩张的球囊反复进出牵拉, 对括约肌造成一定的机械性损害。然而, Lin等[28]对胆管结石患者进行过对照研究, 将病例随机分成EPBD术与EST术两组, 均检测病例术后血淀粉酶水平, 结果发现两者检测水平无明显差异。钱东等[29]通过研究发现预防性胰管支架植入术可以有效地降低ERCP术后高淀粉酶血症和胰腺炎的发生率, 并减轻胰腺炎的严重程度。

6 消化不良

行乳头括约肌大切开的患者, 因其整体性遭到破坏, 其胆囊功能也会受到损害, 进而导致胆汁在消化间期无法正常储存, 没有足够的胆汁在进食后帮助消化, 长此以往足以引发消化不良等症状[30]。

作为一种简单易行且微创的手术, EST术发展方兴未艾, 在胆总管结石及十二指肠乳头狭窄等疾病的处理方法中, EST术仍作为大多数患者的首选。然而, 随着对治疗性ERCP术后远期并发症的认识逐渐深入, 医务工作者开始思考探索是否能找到一种方法, 既能取出结石解除梗阻, 又能不破坏括约肌, 并取得了一些成就, 如乳头括约肌成形术、内镜下球囊扩张术、腹腔镜下胆总管探查等。然而, 近年来开展的这些新技术, 并不是适合每一位胆总管结石或者乳头狭窄的患者, 而更适合的是凝血功能障碍患者[31]。因此, 对于没有凝血功能障碍的胆管结石患者, 其首选治疗措施仍然是EST术。用EST术治疗胆总管结石后的并发症仅为4.9%[9], 相反, 用外科手术治疗胆总管结石患者则更容易出现一系列相关并发症[24], 由此可知, EST术治疗胆管结石是相对安全及有效的方法, 在一定程度上可以代替外科手术, 但是不能轻易忽视其远期并发症。

摘要：十二指肠乳头括约肌切开术 (Endoscopic sphincterotomy, EST) 作为内镜下逆行胰胆管造影术 (Endoscopic retrograde cholangiopancreatography, ERCP) 核心诊疗技术之一, 因其具有无需开腹、创伤小、疗效显著、术后恢复快、住院时间短等优点, 深受患者及家属欢迎。然而, EST属侵入性技术, 不可避免地会带来相关并发症, 在一定程度上限制了该技术的发展。本文将EST术后远期并发症及防治的研究进展综述如下, 以期在EST术达到治疗效果的同时, 为减少近期及远期并发症的发生所借鉴。

EST治疗 第7篇

1 EST-SSR的概述

EST-SSR是一种新型的分子标记方式, 在种植的多种作物上都能建立良好的标记效果, 也能对物种进行有效的遗传分析。由于EST数据的不断增长, SSR成为主要的引物来源, 所以EST-SSR引物开发成为花生作物主要的研究途径。从EST中体现的EST-SSR引物改变了传统的SSR引物开发形式, 对一些基因建构和DNA复杂文库进行了优化, 而且在表达基因上也得到间接和直接的联系, 在遗传学领域发展中得到有效的利用。EST-SSR具有3种特殊优势:实现的信息量比较大, 如果EST在某一处的标志发生连锁效应, EST就会与控制形状的相关基因有联系;通用性也比较好, 由于EST是转录区的来源方式, 具有较高的保守型, 所以在亲缘物种之间具有明显的利用价值;不仅开发的成本比较低, 开发形式也比较简单。在花生标记和研发上具有重要作用, 不仅对分子标记实现了开发性和稳定性, 对花生种子的栽培也具有重要意义[1]。

2 研究材料与方法

选择花生抗青枯病高油品系列, 根据每个叶子和根的EST数量, 对栽培品种的EST-SSR进行检测。要提取花生基因组的DNA, 利用CTAB-酚方法, 还要保证一定的测试浓度和纯度、DNA的质量等。实现EST的序列拼接方式, 利用聚类的相关软件, 将所有的EST拼接起来, 并保证一定的拼接标准。再使用SSR位点进行搜索, 在拼接后产生的序列方式上, 利用一定的时间, 搜索出相关的应用材料。还要对SSR引物进行设计, 根据两端的保守区域, 利用Primer3软件对引物进行设计, 在引物温度的选择上、长度范围都要经过严谨筛选。实现PCR的扩增, 根据PCR中每个反应体系, 对SSR的正反向建立DNA模板, 利用电泳方式在显微镜下进行分析。

3 对结果进行分析

根据实验的研究表明, 栽培花生种子在DNA下的提取可以看出, 所有的品种叶子都得到了较高的DNA质量, 而且在紫外分光上的检测以及电泳上的检测, 所有得到的DNA都比较完整, 没有发生讲解现象[2]。在序列拼接期间, 为了减少EST序列的冗余, 就要对某个特定的基因实现共有序列方式。在EST-SSR中产生的分布频率和特点也不同, 花生栽培中的种类比较丰富, 在各个材料中, 核苷酸出现的频率比较高, 二核苷酸出现的重复类型比较多。在已经搜索出的栽培花生种子EST-SSR中, 出现的频率也不同。在EST-SSR引物中产生的设计和检测的多态性中, 利用Primer3可以看出, 由于SSR位点出现的序列比较短、结构比较复杂, 不能进行引物的设计。所以利用EST-SSR引物对花生的栽培品种进行PCR扩增, 然后根据清晰的条带检测出种子的多样性, 从而检测出引物的等位基因。

4 对结论进行讨论

根据实验和结果的分析可以得到, 花生SSR引物在开发期间, 主要对基因组SSR引物的开发、引物的开发转移等。利用EST-SSR方法, 在花生种子栽培中检测出EST的位点, 然后对作物中EST产生的SSR进行表示[3]。在EST-SSR中, 大多数的植物都是以三核苷酸和二核苷酸作为主要的重复类型的, 由于植物叶子的不同性, 花生中的栽培品种以EST-SSR中的三核苷酸作为主要的重复类型。由于叶子中含有丰富的重复类型, 所以在四、五、六核苷酸重复类型中不会经常出现。该实验也使用了扩增性, 由于扩充区的复杂结构, 引物在进行扩增期间, 就会出现一些条带的显示, 从而为栽培花生中的基因作为重要的引物序为。

5 结论

在花生栽培过程中, 利用EST-SSR引物进行开发和标记是可行的, 不仅实现了野生种子的有效性和扩展效果, 对花生中产生的多样性资源也产生重要意义。EST-SSR这种表达基因方式不仅能够对花生的分子类型进行标记, 还能在遗传性方面实现多种方式的应用价值。

摘要：由于对农作物的要求不断提高, 栽培种花生在产量和应用开发上实现了有效的实施。河南省内乡县农业技术推广中心在本文中利用相关材料, 通过对EST-SSR引物和应用效果进行分析, 从而实现了最佳的引物效果, 实现了野生种子的有效性和扩展效果。

关键词：花生,EST-SSR,开发及应用

参考文献

[1]江建华, 倪皖莉, 肖美华.花生SSR标记的开发及其应用现状和前景[J].花生学报, 2012 (2) :39-45.

[2]唐梅, 陈玉宁, 任小平等.源于栽培种花生的EST-SSR引物对野生花生扩增的多态性[J].作物学报, 2012 (7) :1221-1231.

EST治疗 第8篇

资料和方法

1、资料

将2000年1月～2006年12月期间,临床治愈的296例ABP患者入选本研究,其中男131例,女165例;年龄26～88岁,平均年龄61.4岁。入院APACHE II评分,EST治疗组<8分88例,≥8分31例;非EST治疗组<8分128例,≥8分49例。

入选患者的具体标准:(1)起病至入院24小时以内;(2)EST治疗组在入院24h以内行ERCP+EST;(3)有急性上腹部疼痛;(4)有胆道结石病史;(5)血、尿淀粉酶升高;(6)B超、CT、MRI发现胆囊结石、胆总管结石或胆总管扩张;(7)能排除其他原因引起的胰腺炎(酒精性、高钙血症、高脂血症和外伤等)。本组296例患者均符合ABP的诊断标准。

将EST治疗组和非EST对照组再进一步分为胆囊切除组和非胆囊切除组。

2、方法

将入选ABP患者分为EST治疗组和非EST对照组。入院后均给予禁食、纠正水电解质酸碱平衡紊乱、重要脏器功能监测、抗生素、奥曲肽、解痉剂以及中医中药应用等治疗措施。EST治疗组在入院24h内行ERCP+EST,如果发现胆总管和胆胰共同管有结石,并估计能将结石取出,则行网篮、气囊或碎石器碎石取石。如发现结石多、直径大,难以取净,急性期则不强行内镜下取石术。如ERCP造影提示:胰管狭窄或胰管结石,给于患者行胰管支架植入术。所有患者EST术后均行内镜下鼻胆管引流术(ENBD)。

随访临床治愈的ABP患者,根据ABP复发率来评价EST技术对预防ABP复发的临床价值。

3、统计学处理

全部数据均数采用形式表示,组间比较采用x2检验,所有检验以P<0.05作为有统计学意义标准。

结果

EST治疗组128例ERCP+EST均成功,其中63例内镜下胆管结石取石成功,12例因结石多、结石直径大急诊未行取石。9例患者ERCP造影提示:胰管狭窄或胰管结石,给于行胰管支架植入术。所有患者EST术后均行ENBD术。ERCP术中发现39例患者合并有乳头周围大小不等的十二指肠降段憩室。

本研究305例ABP患者,排除EST治疗组9例因胰管结石、胰管狭窄而行胰管支架植入患者。平均随访时间32±14月,15例失访,随访率94.9%(281/296)。EST治疗组119例患者随访至今,其中胆囊切除组55例,有3例失访,有5例复发急性ABP(5/52);非胆囊切除组64例,3例失访,有6例复发急性ABP(6/61)。而177例非EST对照组中,胆囊切除组81例,4例失访,有28例复发急性ABP(28/77);非胆囊切除组96例,5例失访,有47例复发急性ABP(47/91)。

将患者分为EST治疗组和非EST治疗组,EST治疗组(11/113)的复发率明显低于非EST治疗组(75/168),其差异有显著性,P<O.01。

而将患者进一步分为胆囊切除组和非胆囊切除组。在EST治疗组中,EST+胆囊切除组(5/52)与EST+非胆囊切除组(6/61),两组ABP复发率无显著性差异(P<0.05=。而在对照组中,非EST+胆囊切除组(28/77)ABP的复发率虽然比非EST+非胆囊切除组低(47/91),但两组ABP的复发率统计学上也无显著差异(P<0.05)。

本研究两组患者的年龄、性别、APACHE II评分,在统计学上差异无显著性,符合随机性原则。所以根据结果可以发现,对于ABP患者,EST治疗组的复发率明显低于非EST对照组,而胆囊切除虽然能降低ABP的复发率,但其差异无显著性。

讨论

Neoptolemos等[1]于1988年首次应用随机、前瞻性研究,探讨应用十二指肠镜治疗ABP的有效性。结果发现,与对照组相比,早期采用ERCP+EST,可显著降低重症ABP的并发症发生率,缩短住院天数。近年来Soetikno等[2]的研究,也有力地支持了这一观点。对于EST术后能否预防ABP的再次发作,Siegel[3]曾报道49例ABP患者行ERCP+EST而不做胆囊切除,随访2年,无1例再次发作胰腺炎。而Hammarstrom[4]进一步认为,是十二指肠镜下EST,而不是胆囊切除,能预防ABP再次发作。Kaw[5]等比较胆囊切除与EST在预防ABP复发中的作用,83例胆囊切除术后的ABP患者,2例再次发作ABP。34例行EST而未行胆囊切除患者,1例再次发作ABP,Kaw认为EST术后ABP复发是罕见的。本研究跟踪随访296例首次发作ABP患者的复发情况,结果发现EST术后不管是否行胆囊切除,其ABP的复发率仅为9.7%(11/113);而既不行EST术,也不行胆囊切除患者,ABP复发率高达51.6%(47/91)。而在对照组中,胆囊切除组(28/77)ABP的复发率虽然比非胆囊切除组低(47/91),但两组复发率在统计学上也无显著差异(P>0.05)。因此EST是预防ABP复发的有效手段。

ERCP+EST可显著降低ABP的复发率,其原因可能是由于ABP患者,胆道结石在移行过程中嵌顿、梗阻在胆胰共同开口,引起胆汁返流、胰管高压,这是ABP发病的始动因素,特别是胆囊结石直径小于5mm,很容易通过胆囊管进入胆总管,在向十二指肠移行过程中容易嵌顿在胆总管下段或十二指肠乳头[6]。胆胰共同通道的梗阻,胆汁返流入胰管,短时间内胰管内压力明显升高致胰管破裂,胰液外渗,微血管痉挛[4],同时返流胆汁激活胰消化酶或直接损伤胰腺细胞而引起胰腺急性自身消化和坏死[7]。由于嵌塞结石难以自行排出,或者胆胰共同通道梗阻缓解后,极有可能再次发生胆胰共同通道结石嵌塞、乳头水肿、乳头狭窄等情况,从而导致ABP病变反复发作。单纯胆囊切除虽然能减少胆囊结石进入胆总管,降低ABP的复发率,但是胆囊切除术后,胆道残余、再生细小结石,十二指肠乳头旁憩室和胆总管下端,尤其是胆胰共同通道炎性狭窄等引起乳头水肿、结石嵌塞和管腔闭塞等因素仍然存在,所以胆囊切除术后仍有可能再次复发ABP。而根据ERCP操作和读片体会,我们认为胆胰共同通道实际上就是十二指肠乳头环状皱襞下胆汁和胰液会合后流入十二指肠的通道,在EST操作过程中只要在乳头11～12点方向切开至环状皱襞边缘,除极少数胆胰管会合异常的病例以外,绝大多数都可以在内镜直视或导管插管情况下发现胆管和胰管分别直接开口于十二指肠,一般情况下胆管开口于乳头的上方,而胰管一般垂直于十二指肠壁,开口于乳头的中央。所以作者认为EST可永久性地解除胆胰共同通道,使得胆管和胰管分别直接开口于十二指肠,这就避免了ABP的再次发作,使得ABP的复发率明显降低。由此作者认为应用EST技术治疗ABP,可预防ABP的再次发作。

摘要：目的:探讨内镜下乳头括约肌切开(EST)对预防急性胆源性胰腺炎(ABP)复发的临床价值。方法:将临床治愈的296例ABP患者分为EST治疗组(n=119)和非EST对照组(n=177)。将两组患者进一步分为胆囊切除组和非胆囊切除组。随访所有ABP患者,比较二组复发率有无显著差异。结果:两组ABP患者,平均随访时间32±14月;15例失访,随访率94.9%。EST治疗组(11/113)的复发率明显低于非EST治疗组(75/168),其差异有显著性,P<O.01;而胆囊切除虽然能降低ABP的复发率,但其差异无显著性P>0.05。结论应用EST技术治疗ABP,可预防ABP的再次发作。

关键词：急性胆源性胰腺炎,ERCP,EST

参考文献

[1]Neoptolemos JP,Carr-Locke DL,London NJ,et al.Controlled trial of urgent endoscopic retrograde cholangiopancreatography and endoscopic sphincterotomy versus conservative treatment for acutepancreatitis due to gallstonEST.Lancet,1988,2:979-,83.

[2]Soetikno RM,Carr-Locke DL.Endoscopic management of acute gallstone pancreatitis.Gastrointest Endosc Clin N Am,1998,8:1-12.

[3]Siegel JH,Veerapan A,Cohen SA,et al.Endoscopic sphincterotomy for biliary pancreatitis:an alternative to cholecystectomy in high-risk patients.GastrointESTt Endosc1994;40:573.

[4]Hammarstrom LE,Stridbeck H,Ihse-I.Effect of endoscopic sphincterotomy and interval cholecystectomy on late outcome after gallstone pancreatitis.1998;85:333.

[5]Kaw m,Al-Antalby Y,Kaw P.Management of gallstone pancreatitis:cholecystectomy or ERCP and endoscopic sphincterotomy.2002,56:61-65.

[6]Sugiyama M,Atomi Y.Risk factors for acute biliary pancreatitis.Gastrointest Endosc,2004,60:210-212.

EST治疗 第9篇

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