兔膝关节软骨细胞

兔膝关节软骨细胞（精选8篇）

兔膝关节软骨细胞 第1篇

本研究在总结前人研究经验的基础上,通过改良三步酶消化法获取兔关节软骨细胞[2,6],分别构建琼脂板-软骨细胞团块悬浮培养体系和常规单层贴壁培养体系[1,3,8],进行体外扩增和传代。 通过观察细胞形态、 生长动力学特点和Ⅱ型胶原蛋白表达情况综合判断表型维持情况,现报道如下:

1对象与材料

1.1实验动物

新西兰大白兔10只,3个月龄,体重2.4~2.7 kg, 雌雄不限, 购自西安交通大学医学实验动物中心,实验动物合格证号:SCXK(陕)2014-003。

1.2仪器与试剂

超净台(美国LABCONCO公司)、培养箱(HERA CELL)、Olympus相差显微镜、 流式细胞仪(BD FACS Calibur)。 胰蛋白酶、睾丸透明质酸酶、Ⅱ型胶原蛋白酶等均购自上海微科生化试剂有限公司;DMEM/F12培养基购自上海博升生物科技有限公司;胎牛血清购自Gibco生物科技有限公司;分析纯琼脂糖粉购自西安化学试剂有限公司;Ⅱ型胶原蛋白抗体、GAPDH抗体均购自上海微蒙生物科技有限公司。

1.3实验方法

1.3.1兔关节软骨细胞悬液的制备

无菌条件下取双侧肱骨、股骨远近端关节软骨和胫骨近端关节软骨, 切成约1 mm×1 mm×1 mm的软骨块, 用含有青霉素和链霉素的聚丁二酸丁二醇酯(PBS)溶液反复冲洗。 采用改良三步酶消化法分离软骨细胞:第一步,用0.25%胰蛋白酶/PBS溶液,在37℃ 摇动式恒温水浴箱中消化30 min。 用PBS溶液冲洗软骨块。 第二步, 取适量0.2%睾丸透明质酸酶- DMEM/F12溶液消化1 h, 条件同上。 之后用PBS冲洗。第三步,用适量0.2%Ⅱ型胶原蛋白酶-DMEM/F12溶液,消化4 h。 在此消化过程中每隔1 h用玻璃滴管手动轻柔吹打5 min,收取酶液,加入新的Ⅱ型胶原蛋白酶液,继续消化。 在显微镜下观察直到没有软骨细胞从残存基质上释放。 收集含有软骨细胞的消化液, 1000 r/min离心10 min后用含有10% 胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬,200目滤网过滤。 最后用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液将全部细胞重悬。

1.3.2体外培养和传代

1.3.2.1单层贴壁式培养体系的建立和传代用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液将软骨细胞悬液调整到5×105个/m L,种植在底面积为75 cm2塑料培养瓶中,在含有5%CO2的37℃培养箱中培养。24 h后第1次更换培养液,以后每隔48 h换液1次,记录形态学变化。培养达到约70%融合程度时分瓶传代培养。共实施4次传代,原代细胞命名为P0,以此类推。

1.3.2.2琼脂板-软骨细胞团悬浮式培养体系的建立和传代取2 g琼脂糖粉,加入98 m L PBS溶液,煮沸至琼脂糖粉完全溶解并拌均匀。冷却后即形成2%的琼脂凝胶。使用水浴加热至凝胶彻底融化。取1 m L琼脂糖溶液,加入直径为10 cm的培养皿中,沿水平方向迅速摇动培养皿,使琼脂糖均匀地铺在皿底,静置至琼脂糖彻底凝固,培养皿底部即形成一层完整均匀的琼脂板。

取适量软骨细胞悬液,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液调整到5×105个/m L,种植在预铺琼脂板的培养皿中。48 h左右软骨细胞即形成悬浮的细胞团块,进行首次换液。以后每隔48 h换液1次。观察培养过程中细胞团块体积变化,通常至6 d左右细胞团块不再增大,即作为传代的时机。传代时收取细胞团块,用Ⅱ型胶原蛋白酶DMEM/F12溶液消化1 h,每隔30 min辅以轻柔吹打2 min,直至软骨细胞完全分散。

1.3.3两种培养条件下软骨细胞生长动力学研究

应用流式细胞仪荧光计量法绘制两种培养体系中软骨细胞的生长曲线。取48孔细胞培养板,分为A、B两组,分别用于单层贴壁式培养(A组)、悬浮式培养(B组)。将原代软骨细胞按照前面所述的培养方法分别种植在A、B两组的琼脂板上。每天从每个培养体系中取12个孔的样本用于流式细胞仪检测。以P0细胞的荧光强度值为标准,将子代细胞样本的荧光强度值与之相比,所得比值即为细胞的扩增倍数。以时间为横坐标,扩增倍数为纵坐标,绘制细胞生长曲线。

1.3.4 Ⅱ型胶原蛋白表达检测

以A组和B组的P0、P2、P4代细胞为研究对象,依标准流程分别进行Ⅱ型胶原蛋白免疫组化和Wester blot检测。

1.3.4.1免疫组化取样本细胞,4%多聚甲醛固定,经PBS冲洗后用山羊血清封闭液孵育20 min,以此滴加 Ⅰ抗、Ⅱ抗(生物素标记)并分别在37℃孵育1 h,DAB显色后苏木精复染2 min,封片并镜检。 结果判定:免疫组化结果表现为无染色、浅黄色细颗粒、棕黄色颗粒和耀眼可见的褐黄色粗颗粒,分别记为阴性、弱阳性、阳性、强阳性。

1.3.4.2 Western blot取样本细胞悬液,4℃下12 000 r/min离心5 min,取上清于-20℃保存。制备12%聚丙烯酰胺凝胶。充分凝固后,放入电泳槽,加入电冲液,取约10μg处理好的蛋白样品上样电泳。电泳完成后将电泳胶置转移缓冲液中平衡20 min。并将硝酸纤维素膜于转移缓冲液中平衡20 min。转膜顺序:负极-专用滤纸-电泳胶-硝酸纤维素膜-专用滤纸-正极。室温下转膜120 min。转膜所得的硝酸纤维素膜用5%脱脂奶粉室温封闭2 h。之后分别进行一抗孵育(稀释比例为1∶200)和二抗孵育(稀释比例为1∶1000),用凝胶成像系统进行扫描和分析。

2结果

2.1形态学结果

2.1.1单层贴壁式培养的软骨细胞的形态学变化

原代软骨细胞植入普通培养瓶后,数小时即开始贴壁,24 h内绝大多数细胞完成贴壁。 贴壁后的细胞呈不规则的多边形和多角形。 原代细胞培养1周左右达到80%的融合。显微镜下观察绝大多数细胞形态呈多边形,胞浆内可见较多的囊泡样结构,为富含Ⅱ型胶原蛋白的基质小泡。

第1次传代之后的软骨细胞(P1) 贴壁速度较原代细胞明显增快, 基本上在6 h之内就完成贴壁,培养7 d时达到80%融合,胞浆内可见基质囊泡。 P2代软骨细胞贴壁更快,4 h左右即完成贴壁。 从P2开始, 软骨细胞形态变得更加细长。 同时,软骨细胞的增殖速度亦有所加快,在培养6 d左右即可达到70%的融合,但是胞浆内基质囊泡明显减少。 在P3~P4阶段,增殖更为迅速,4~5 d即可达到70%的融合, 但是细胞形态越来越接近长梭形,类似于成纤维细胞,胞浆内基质囊泡基本消失。 原代软骨细胞形态特点完全消失。 见图1。

a:P0兔关节软骨细胞,呈多边形,胞浆内可见基质囊泡(200×);b:P1软骨细胞,细胞呈多边形,胞浆内可见基质囊泡(200×);c:P2软骨细胞,细胞略呈细长形态,胞浆内囊泡明显减少(200×);d:P4软骨细胞,细胞呈细长形态,基本观察不到囊泡(100×)

2.1.2琼脂板-细胞团块悬浮式培养的软骨细胞的形态学变化

原代软骨细胞种植在预铺有琼脂板的培养皿中后,48 h内即可形成肉眼可见的细胞团块, 直径约为1.5 mm,呈不透明的类圆形团块,悬浮于培养液中。 镜下观察,软骨细胞团块较松散。 随后,细胞团块的体积逐渐增大。 悬浮培养10 d左右最大的细胞团块直径可达到4 mm。 镜下观察细胞紧密排布,基本上不能分辨细胞轮廓。 此后,细胞团块体积不再增大,培养至14 d后体积反而有所缩小。 P1~P4代软骨细胞悬浮培养所得的细胞团块在镜下观察形态无显著改变。 见图2。

a:P4细胞悬浮培养2 d后,团块较松散,单个细胞形态尚可分辨(200×);b:P4细胞悬浮培养4 d,细胞排布较致密(200×);c:P4细胞悬浮培养6 d,细胞排列致密(100×);d:P4细胞种植8 d的软骨细胞团块,细胞排列致密,边缘光滑(100×)

2.2单层贴壁式培养和悬浮式培养生长动力学的特点

2.2.1软骨细胞在单层贴壁式培养环境中生长动力学特点

原代细胞培养初期,细胞增殖较慢,生长曲线坡度较为平缓。 经过4 d左右进入对数生长期,生长曲线的坡度较前陡峭;培养8 d后形成接近水平的平台期;继续培养至10 d以上进入衰退期,生长曲线向下转折。

随着传代次数的增加, 软骨细胞增殖周期渐缩短;到了P4阶段,只需1.5 d左右即可进入对数增殖期,生长曲线不具有平台阶段;在5 d左右进入衰退期。 见图3。

2.2.2软骨细胞在琼脂板-细胞团块悬浮培养条件下生长动力学特点

在琼脂板-细胞团块悬浮式培养体系中, 各代次的软骨细胞的生长曲线模式高度一致,起始部分很平缓,从第3天起,曲线坡度逐渐升高,但始终未达到贴壁式培养的上升速度;到培养的第10天后,曲线的斜率又逐渐趋于平缓;培养至13 d以上时,曲线略向下转折,进入生长的衰退期。 与单层贴壁式培养的软骨细胞比较,悬浮培养的软骨细胞生长动力学特点更为稳定,且更接近于原代软骨细胞。 见图4。

P0软骨细胞的生长曲线较为平缓,随着传代次数的增加,到P4时曲线已经相当陡峭,曲线的形态亦发生显著的改变,起始部位陡峭,平台期消失,迅速进入衰退期

2.3两种培养条件下软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白表达水平的比较

2.3.1单层贴壁式培养环境中软骨细胞免疫组化特点

为了明确不同培养条件下软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白表达水平,本实验分别进行免疫组化研究。 结果显示,原代软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白表达呈强阳性,单层贴壁式培养组传代至第二代时,Ⅱ型胶原蛋白表达水平明显降低,传代至第四代时,几乎不表达Ⅱ型胶原蛋白。 而各代次细胞之间,均无Ⅱ型胶原阳性染色表现。 见图5。

a:P0软骨细胞贴壁培养4 d后,细胞呈多边形,Ⅱ型胶原蛋白免疫组化染色呈阳性,包浆内可见深染的颗粒样结构;b:P2软骨细胞,Ⅱ型胶原蛋白免疫组化染色呈弱阳性;c:P2软骨细胞,Ⅱ型胶原蛋白免疫组化染色基本呈阴性;各代细胞之间均无Ⅱ型胶原蛋白染色

2.3.2琼脂板-细胞团块悬浮培养条件下软骨细胞免疫组化特点

琼脂板-细胞团块悬浮培养组在各代次均可稳定表达Ⅱ型胶原蛋白,该Ⅱ型胶原蛋白成分不仅出现在细胞浆内,而且在细胞周围也有表达。 见图6。

a:P0软骨细胞悬浮培养4 d后,细胞仍保持类圆形外观,包浆内Ⅱ型胶原蛋白呈强阳性染色;b、c:悬浮培养的P2和P4代软骨细胞,细胞内Ⅱ型胶原蛋白免疫组化染色始终仍呈阳性,并且细胞外也呈现Ⅱ型胶原蛋白阳性染色

2.3.3 Western blot验证不同培养条件下软骨细胞产生Ⅱ型胶原蛋白的能力

通过Western blot检测进一步证实,单层贴壁式培养的软骨细胞,Ⅱ型胶原蛋白表达能力逐代减弱;而琼脂板-细胞团块悬浮培养的各代次软骨细胞均保持较稳定的Ⅱ型胶原蛋白表达。 见图7。

a:以GAPDH为内参,可见从P1代开始,单层贴壁式培养软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白表达水平逐代降低,至P4代几乎不再表达Ⅱ型胶原蛋白;b:琼脂板-细胞团块悬浮培养的各代次软骨细胞,Ⅱ型胶原蛋白表达始终呈阳性

3讨论

体外软骨细胞的培养是了解软骨细胞生物学性状的重要方法, 有助于研究骨性关节炎的发病机制, 对促进软骨组织工程的发展有重要意义。 近年来随着科技研究的飞速发展,已发现多种方式可体外培养软骨细胞,并受多种因素影响,如力学因素、氧浓度因素和体内细胞因子因素等。 软骨细胞在体内生长始终处于一定的应力环境中,且在体内处于相对缺氧的状态, 同时由体内复杂的细胞因子网络如肿瘤坏死因子 α、 转化生长因子 β 等共同作用生长。体外培养软骨细胞受上述因素的影响,会出现退变现象,一般从第4代后细胞表现为逐渐变为梭形增值能力下降,同时合成和分泌Ⅱ型胶原蛋白的能力也随之降低,称之为“去分化”现象[7]。

“去分化”现象已成为限制软骨细胞组织工程的瓶颈问题之一。 通过体外培养体系中模拟关节软骨细胞的生理环境而获得数量且具有相对正常表型的关节软骨细胞是解决该问题的有效手段。 在该领域内, 国内外诸多学者开发出多种关节软骨细胞培养模式。 并且已经取得相当进展[8]。 其中,公认较为成功的是生物反应器培养方法,此外海藻酸钠凝珠培养也获得表型较稳定的软骨细胞[10,11,12,13]。 但是上述方法均存在一定的不足,如生物反应器购置费用高昂、试剂消耗量较大、运转成本较高。 而在海藻酸钙凝珠培养体系中,凝珠制备条件不易控制、传代过程操作繁琐等诸多因素都在相当程度上限制了其广泛应用。 本研究旨在探索一种操作相对简便,且能通过模拟关节软骨细胞在体环境,使得次代细胞保持关节软骨细胞表型,能够稳定表达Ⅱ型胶原蛋白。

本研究发现,与常规的单层贴壁式培养方法比较琼脂板-软骨细胞悬浮培养法可使得细胞聚集形成软骨细胞团块,较为接近软骨细胞的生理条件,从而可获得表型较稳定的关节软骨子代细胞,保持了Ⅱ型胶原蛋白的合成能力,并且在细胞外形成了含有Ⅱ型胶原蛋白成分的类似于细胞外基质的物质。 该培养模式通过避免细胞贴壁而促使软骨细胞聚集并扩增,用相对简易的方法获得能稳定表达Ⅱ型胶原蛋白的软骨细胞,有可能作为软骨组织工程的种子细胞来源。

目前国内外研究已形成共识,细胞外基质的存在对于维持关节软骨细胞的表型至关重要。 有研究报道,软骨基质中的某些成分与关节软骨表面的整合素分子相互结合,形成整合素介导的细胞跨膜信号途径进而刺激细胞稳定的表达和分泌Ⅱ型胶原蛋白、蛋白多糖等重要分子。 另一方面,在生理条件下,关节软骨细胞的表型维持依赖于其自分泌和旁分泌功能,软骨细胞通过分泌细胞外基质、接受多种生长因子调控等不同机制对其生理功能进行调节[14,15,16,17,18]。

但是在体外培养过程中,为了获得原代软骨细胞而进行的多步酶消化过程使得关节软骨细胞完全从软骨基质上释放,形成单个的游离细胞,细胞外基质- 整合素介导的跨膜信号传导通路结构完全丧失,细胞自分泌、旁分泌环境也受到极大影响,进而失去了软骨基质对关节软骨细胞生理功能重要调控作用。

基于上述考虑,在本研究中,通过在培养皿底部预先铺制琼脂板,使得原代软骨细胞不能进行贴壁生长, 从而在培养液中悬浮并逐渐聚集成细胞团块,在一定程度上模拟了关节软骨细胞的生理环境。 进一步研究发现,聚集成团块的次代软骨细胞不仅能进行数量上的增殖,更重要的是保持了稳定表达Ⅱ型胶原蛋白的能力。 免疫组化染色显示悬浮培养的软骨细胞其细胞浆内和细胞周围均有Ⅱ型胶原蛋白表达,并且在细胞周围形成类似于细胞外基质的成分。 笔者分析,软骨细胞相互聚集而形成细胞团块,使得其表达的Ⅱ型胶原蛋白有机会在细胞外聚集起来,并且其自分泌的某些细胞因子不至于随更换培养液而完全丢失,从而对维持其生理功能起到积极意义。 但因为软骨细胞聚集的较为紧密,其深部的细胞难以获得营养供应,因此最终获得的细胞团块大小有限。 本研究中获得最大细胞团块直径约4 mm,到培养的后期团块反而有所缩小,该现象的发生时间与生长曲线的模式基本符合,前人亦有类似报道[19,20,21,22],因此笔者考虑其原因可能为团块深部细胞因缺乏营养供应而发生凋亡。

兔膝关节软骨细胞 第2篇

【关键词】 骨关节炎，膝；补肾通络颗粒；大鼠；细胞因子；软骨含水率

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.10.001

【ABSTRACT】Objective：To investigate the effect of Bushen Tongluo Granule （补肾通络颗粒） on the levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α and water ratio of articular cartilage in rats with knee osteoarthritis.Methods：60 rats were randomly divided into a blank control group，a model control group，a high-dose Bushen Tongluo Granule group （HBTGG），a medium-dose Bushen Tongluo Granule group （MBTGG），a low-dose Bushen Tongluo Granule group （LBTGG），and a meloxicam group，10 rats in each group.Except for the blank control group，the other groups were modeled by injecting papain into joint cavity.After medicinal intervention，ELISA was used to measure the levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α.At the same time，articular cartilage was observed and its water ratio was measured.Results：After experiment，the knee joint cartilage degeneration was obvious in the model group.

Compared with the blank control group，the levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α and the water ratio of articular cartilage in the model group increased （P < 0.05）.Compared with the model control group，the levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α in the HBTGG，MBTGG and the meloxicam group decreased （P < 0.05） and the water ratios of articular cartilage in the HBTGG and MBTGG were lower than those of the model control group （P < 0.05），and the levels of IL-1βand TNF-α in the LBTGG were lower than those of the model control group （P < 0.05）.Compared with the LBTGG and the meloxicam group，the level of IL-6 and the water ratio of articular cartilage of the HBTGG decreased significantly （P < 0.05） and the water ratio of articular cartilage of the MBTGG were lower （P < 0.05）.The differences of levels of IL-1，IL-6，TNF-α，and the water ratio of the articular cartilage between the HBTGG and MBTGG were not statistically significant （P > 0.05）.Conclusion：Bushen Tongluo Granule may treat knee osteoarthritis by regulating levels of serum cytokines and reducing water ratio of the articular cartilage，especially in the middle and high dose groups.

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【Keywords】ostoarthritis，knee；Bushen Tongluo Granule（补肾通络颗粒）；rat；cytokine；water ratio of the articular cartilage

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种以膝关节软骨退变和关节周围形成骨质增生为病理特征的关节炎，是最常见的一种慢性、进行性、致残性关节疾病。根据流行病学调查，我国KOA患病率在60岁以上人群可达50%，而75岁以上人群则高达80%[1-2]。目前现代医学对于KOA的治疗仍以口服非甾体类抗炎药，或关节腔注射透明质酸、激素，或关节镜、人工关节置换术等方式为主，虽具有一定的疗效，但不良反应较多，且花费高，均限制了在临床的长期运用。本病属中医学“骨痹”范畴，肾虚精亏瘀血阻络为其主要的病机，治疗上多以补肾通络为原则。补肾通络颗粒是本科室治疗KOA经验方，作为院内制剂在临床运用多年，其疗效明确，能改善关节症状并延缓病情进展，且无明显不良反应，价格低廉，适合长期使用。本实验以不同剂量补肾通络颗粒干预KOA大鼠动物模型，观测不同剂量补肾通络颗粒对KOA大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平及关节软骨含水率的影响，探讨其治疗KOA的作用机理，为临床更好地运用奠定基础。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级健康Wistar大鼠60只，10周龄，体质量（180±20） g，雌雄各半，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物合格证号：SCXK（京）2006-0009。以上大鼠饲养地点为北京中医药大学屏障级动物房，许可证号：SYXK（京）2011-0024，饲养环境恒温、恒湿，所有大鼠均自由进食及水瓶给水。

1.2 实验试剂 木瓜蛋白酶（批号BRS009128），由MERCK公司提供；大鼠IL-1β（批号900-K86）、IL-6（批号900-M86）、TNF-α（批号900-M73）试剂盒，均由北京欣博盛生物科技有限公司提供。

1.3 实验药品 补肾通络颗粒，由本院中草药房提供，每剂含生药98 g；美洛昔康片（国药准字H20030679）每片7.5 mg，由江苏飞马药业提供。

1.4 实验设备 JD5000 1S电子天平（沈阳神宇龙腾天平有限公司）；Labofuge 400R离心机（Hearaeus公司）；MR-96A酶标仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；LIBROR AEG-220G分析天平（日本SHIMADZU公司）；SL 101FAB-2型电热鼓风干燥箱（上海树立仪器仪表有限公司）；KL-I型组织自动脱水机（湖北康龙电子科技有限责任公司）；KH-BL生物组织包埋机（湖北孝感阔海医疗科技有限责任公司）；AD202-A轮转式切片机（上海珂淮仪器有限公司）；BX60光学显微镜（日本Olympus公司）。

2 方 法

2.1 动物分组 采用随机数表法，将60只Wistar大鼠分为空白对照组，模型对照组，补肾通络颗粒高、中、低剂量组，美洛昔康组，每组10只，雌雄各半。

2.2 造模方法 参照文献[3-4]，选用已经广泛报道且被反复证实的KOA动物模型经典造模方式：关节腔注射木瓜蛋白酶。除空白对照组外，其余各组大鼠分别于实验第1，4，7天膝关节腔内注射质量分数为4%木瓜蛋白酶生理盐水溶液各0.2 mL。

2.3 给药方法 采用灌胃给药法，用蒸馏水配置药物混悬液，连续给药4周。以60 kg成人为标准，参照人和动物间体表面积折算的等效剂量比率表换算，补肾通络颗粒高、中、低剂量组按20.58，10.29，5.15 g·kg-1给予补肾通络颗粒，美洛昔康组按0.787 5 mg·kg-1给予美洛昔康，空白对照组及模型对照组大鼠每日予蒸馏水灌胃。

2.4 观测指标检测

2.4.1 细胞因子检测 实验结束后，用10%水合氯醛（3 mL·kg-1）腹腔注射麻醉，麻醉成功后，从实验大鼠腹主动脉取血后处死大鼠。将取出的血常温下静置1 h后，用3000 r·min-1离心机离心10 min，离心后取上清液作为检测标本。采用ELISA法，按照大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α试剂盒说明书操作，测定IL-1β、IL-6、TNF-α的OD值，并计算含量。

2.4.2 软骨含水率检测 采用分析天平，先称取软骨湿重，后将其置于鼓风加热机中，60 ℃加热12 h，再称取干重。含水率按以下公式计算：含水率=[（湿重-干重）/湿重]×100%。

2.4.3 病理组织学检测 采用HE染色法观察KOA大鼠膝关节软骨退变程度。打开关节腔后，尽快切取内侧胫骨平台中央条状关节面软骨片，按以下步骤进行：①常规脱蜡后用蒸馏水冲洗，并移入苏木精染液10～15 min；②用1%盐酸酒精分色后，镜下控制，至细胞核及核内染色质清晰为止；③流水冲洗并在碳酸锂饱和液中反蓝后移入0.5%伊红染液约5 min；④逐级经80%、90%、95%、100%各种浓度乙醇脱水；⑤石蜡包埋，切片机切片，中性树胶封片，光镜下观察关节软骨厚度、软骨面情况、软骨细胞数量等。

2.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用t检验，多组数据间比较采用单因素方差分析，方差齐则用LSD检验，方差不齐则用Games-Howell检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 大鼠KOA组织病理学 空白对照组软骨表面较为光滑，细胞排列规律且整齐，间质均匀。模型对照组可见糜烂的软骨面，细胞排列杂乱无规则，存在间质纤维化。美洛昔康组软骨面粗糙，软骨细胞排列紊乱，间质变性。补肾通络颗粒高剂量组软骨面尚光滑，软骨细胞排列不整，间质纤维化。补肾通络颗粒中剂量组可见粗糙的软骨面，细胞排列杂乱无规则，有反应性增生，存在间质纤维化。补肾通络颗粒低剂量组软骨变薄，细胞数量少，排列杂乱无规则，间质纤维化。见图1。

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3.2 各组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较 与空白对照组比较，模型对照组KOA大鼠血清3种细胞因子水平均升高（P < 0.05）。补肾通络颗粒高、中剂量组与美洛昔康组KOA大鼠血清3种细胞因子水平均低于模型对照组（P < 0.05），而补肾通络颗粒低剂量组仅IL-1β、TNF-α水平低于模型对照组（P < 0.05）。补肾通络颗粒高剂量组KOA大鼠血清IL-6水平低于补肾通络颗粒低剂量组及美洛昔康组（P < 0.05），而补肾通络颗粒中、高剂量组KOA大鼠血清3种细胞因子水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

3.3 各大鼠关节软骨含水率比较 与空白对照组比较，模型对照组KOA大鼠关节软骨含水率差异有统计学意义（P < 0.05）。与模型对照组、美洛昔康组、补肾通络颗粒低剂量组比较，补肾通络颗粒高、中剂量组KOA大鼠关节软骨含水率差异有统计学意义（P < 0.05）。补肾通络颗粒高、中剂量组KOA大鼠关节软骨含水率差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

4 讨 论

目前用于大鼠诱导KOA的方式主要包括手术法及化学药物注射法[5]，其中膝关节腔注射药物被誉为建立KOA动物模型的经典方法，而木瓜蛋白酶是较为常用药物之一。已有研究表明，关节腔注射木瓜蛋白酶的造模方式成功率高、成型时间短[6]、重复性好，且具有与人类骨关节炎类似的特点[7]。早在20世纪70年代，国外学者就通过关节腔注射木瓜蛋白酶的方式成功建立了兔髋关节退行性关节炎动物模型。因此，在本项研究中，笔者也采用关节腔注射木瓜蛋白酶的方法建立大鼠KOA动物模型，实验结束后病理检查发现，与空白对照组比较，模型对照组大鼠膝关节软骨可见糜烂等KOA病理表现，也印证了膝关节腔注射木瓜蛋白酶的方法可建立稳定的大鼠KOA动物模型。

在已知的细胞因子中，IL-1β、IL-6、TNF-α是参与骨关节炎发病进程中的重要介质，是调节炎症的始动因素[8]。有研究显示，IL-1β可以与关节软骨细胞上相应受体结合，形成特殊的激素-受体复合物，通过cAMP、GTP等第二信使传达被改变的信息，影响关节软骨细胞的正常代谢活动。不少学者通过实验研究发现，关节IL-1β与软骨周围骨赘的形成密切相关[9]。IL-1β还影响与骨关节炎发病相关的细胞因子水平[10]，如有影响IL-1β可促进软骨细胞分泌前列腺素E2（PGE2），PGE2在关节炎症反应、成骨细胞样细胞增殖方面具有一定的作用。软骨的损伤与软骨糖蛋白的合成受到抑制，成纤维细胞合成增强有关，而这一过程IL-1β可通过介导IL-6而完成[11]。TNF-α既协同IL-1的作用，又可激活IL-6基因、诱导IL-6的生成，在骨关节炎的发生、发展中有可能起着决定性作用[12]。KOA的主要病理改变是关节软骨受到破坏，关节表面失去均质性，如发生中断、斑片凹陷、断裂，使软骨的可压缩性和弹性丧失[13]。研究表明，随着KOA在一定程度上的加重，关节软骨内含水量逐渐增加，如陈孟交等[14]认为，导致关节软骨含水量增加的原因可能与关节软骨蛋白多糖分解，使软骨内渗透压增高，从而导致水进入软骨内有关。也有学者认为，软骨内含水量增多可能与大量高能嗜水性糖蛋白分子团难以通过胶原纤维网架，使网架局限性遭到破损，带负电荷离子暴露增多有关[15]。

补肾通络颗粒是针对骨关节炎本虚标实的特点，以补肾治本为主，又兼顾其瘀血阻络的标象。全方主要由补骨脂、川牛膝、桑寄生、骨碎补、白芍等药物组成，中药药理学认为，上述药物不仅可提高超氧化物歧化酶（SOD）的活性，而且还可在一定程度上降低血清过氧化脂质的水平，进而可以保护生物膜，以达到改善软骨细胞功能，推迟细胞退行性变的目的，同时还对关节急性渗出性和增生性滑膜炎有一定的抑制作用。如补骨脂所含的补骨脂甲素、乙素、补骨脂定、补骨脂异黄酮等均有抗氧化作用，其中补骨脂甲素、乙素还能有效地清除氧自由基[16]。尚平等[17]则观察到骨碎补有显著的抗炎作用，而且止痛效果显著。而白芍有效成分白芍总苷能有效改善胶原性关节炎大鼠滑膜细胞超微结构的变化，并抑制其过度增殖反应和产生IL-1、干扰素和PGE2水平，从而对渗出性关节炎及滑膜炎均有一定的抑制作用[18]。

对于KOA的发病机制，目前研究认为除与软骨合成和分解代谢失调、机械磨损等因素有关外，滑膜炎已被公认为是KOA常见的重要特征之一[19]，其不仅是关节结构的破坏者，同时还可促进KOA的病情进展[20-21]。目前研究认为，在KOA发病早期，关节软骨退变尚不明显时，膝关节就已经存在不同程度的滑膜炎。究其原因，国内外大多数学者认为KOA的软骨病变可产生细小的碎软骨片，此类碎片落入滑液可激活滑膜内衬细胞，从而导致滑膜炎的出现。还有学者认为碱性磷酸钙或双水焦磷酸钙等晶体诱发的轻度炎症反应也是引起滑膜炎的潜在因素[22]。鉴于此，不少学者认为非甾体类抗炎药在KOA治疗中亦具有重要的作用。本项研究中，笔者选取美洛昔康作为西药对照药物，因其不仅具有较好的消炎止痛作用，且其属选择性环氧合酶-2抑制剂，临床不良反应较其他非甾体类抗炎药少。同时还有研究表明，美洛昔康对软骨基质蛋白聚糖的合成无不良影响，国内外已有众多临床使用美洛昔康治疗KOA的报道[23]。

本实验研究结果表明，与模型对照组比较，补肾通络颗粒高、中、低剂量组均可不同程度地降低大鼠KOA动物模型血清IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子水平，其中补肾通络颗粒高、中剂量组对大鼠KOA动物模型血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均有降低作用（P < 0.05），而补肾通络颗粒低剂量组仅能降低大鼠KOA动物模型血清IL-1β、TNF-α水平（P < 0.05）。结合补肾通络颗粒高、中剂量组还能降低大鼠KOA动物模型关节软骨含水率（P < 0.05），而补肾通络颗粒低剂量组则无此作用，提示补肾通络颗粒可能通过有效抑制炎症反应过程中相关炎性因子的释放及有效降低关节软骨含水率对大鼠KOA动物模型的治疗作用。而就不同剂量的补肾通络颗粒在降低大鼠KOA动物模型血清IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子水平及关节软骨含水率方面具有一定的剂量依赖关系，即补肾通络颗粒高、中剂量优于低剂量，而在本项研究中，尚未发现补肾通络颗粒高、中剂量之间的疗效差异，可能与本项实验的动物模型数量偏少以及治疗周期较短有关，故补肾通络颗粒高、中剂量之间是否存在疗效差异有待于今后进一步研究。

nlc202309011847

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收稿日期：2015-05-21；修回日期：2015-08-05

兔膝关节软骨细胞 第3篇

1 材料与方法

1.1 实验动物的选择

成年雄性新西兰大白兔24 只(四川大学华西医学实验动物中心提供),2.5～3.0 kg,购回后先实验性饲养2周。

1.2 实验方法

于兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠(1 ml/kg)进行全身麻醉。自眼外眦外侧5 cm向外耳道方向做1.5 cm切口,钝性分离至颞下颌关节囊,暴露关节盘。将关节盘前外侧1/3部分切除形成穿孔,直径1.5 mm。分层缝合伤口。术后常规颗粒饲料单笼饲养。所有实验动物术后均无感染等并发症,术后第3天咀嚼功能恢复正常。模型建立后4 周,在兔右侧(实验侧)颞下颌关节腔内一次性注射重组人IL- 1Ra 50 μg(稀释于50 μl生理盐水),左侧(对照侧)关节腔内注射50 μl生理盐水。关节腔注射后12、 24 周各处死12 只动物。

1.3 检测方法

1.3.1组织学观察

将标本放置于40g/L甲醛液中固定后,用5%EDTA溶液脱钙,脱水、石蜡包埋后进行5 μm厚连续矢状切片。HE与番红染色后光镜下观察。每个标本随机选取5 个部位参照Neo[7]对关节炎的程度进行组织学评分(表1)。

1.3.2 RT-PCR

动物处死后立即将颞下颌关节髁突软骨层全层完整剥离,剪碎放置于液氮中,放入-80 ℃冰箱中备用。取待测组织100 mg,应用TRIzol Reagent(Gibco. BRL公司)试剂盒,按操作手册操作提取标本中总RNA溶解在DEPC水中,用紫外分光光度仪检测RNA的浓度和纯度。然后用逆转录试剂盒(PrimeScript RT Reagent Kit, Takara公司)反转录合成c- DNA链。引物序列分别为:Ⅱ型胶原(Type Ⅱ collagen):上游引物5′- GCACCCATGGACATTGGAGGG- 3′,下游引物5′- GACACGGAGTAGCACCATCG- 3′;聚集蛋白聚糖(Aggrecan):上游引物5′- GAGGTCGTGGTGAAAGGTGT- 3′,下游引物5′- GTGTGGATGGGGTACCTGAC- 3′;肿瘤坏死因子α(TNF- α):上游引物5′- TAGAAACCTGGACCATGGTGGTGT- 3′,下游引物5′- AGTGAGTCCTGGAAGCCTCAGTTT- 3′;聚集蛋白聚糖酶(Aggrecanase):上游引物5′- CTGTGCCGTGATTGAAGATG- 3′,下游引物5′- GCTGAGTGGCATCGTAGGTTT- 3′;内参照物GAPDH:上游引物5′- TCACCATCTTCCAGGAGCGA- 3′,下游引物5′- CACAATGCCGAAGTGGTCGT- 3′。

1.4 统计学处理

所有结果采用SPSS 10统计软件进行Wilcoxon配对符号秩和检验检测不同时间点实验侧和对照侧的差异情况,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 组织学观察

关节腔内注射IL- 1Ra 12 周后镜下可见实验侧髁突软骨层变厚,软骨细胞数量明显增加,表现出典型的软骨带状组织(图 1A)。对照侧关节炎表现更为明显,软骨层较实验侧薄,软骨细胞数量大幅减少,成簇状排列。髁突表面结构不规则(图 1B)。实验侧与对照侧关节组织学评分分别为:10.0±2.8和4.7±1.3(P<0.05) (图 2)。

注射后24 周,实验侧软骨细胞及细胞外基质的数量均增加,软骨细胞成簇状排列(图 3A)。对照侧关节软骨的退行性病变更为严重。髁突表面软骨层很少或基本丧失(图 3B)。实验侧与对照侧关节组织学评分分别为:7.3±2.1和1.3±0.7(P<0.05)(图 2)。

2.2 RT- PCR检测

注射后12、 24 周实验侧II型胶原及聚集蛋白聚糖表达升高,均较对照侧强(P<0.05);实验侧12周聚集蛋白聚糖酶表达低于对照侧(P<0.05), 24 周聚集蛋白聚糖酶表达与对照侧无明显差异(P>0.05); 注射12、 24 周实验侧TNF- α表达与对照侧无明显差异(P>0.05)(图 4)。

3 讨 论

IL- 1受体拮抗剂是一种天然受体拮抗剂,它与IL- 1受体结合从而阻断IL- 1β的生物学功能。体外实验和大关节OA的动物实验表明IL- 1受体拮抗剂对于OA的症状及关节结构改变有明显的改善作用 [8,9],但其对TMJ关节软骨的作用仍不清楚。

研究表明,在TMJ骨关节炎患者的滑膜液中存在多种细胞因子,IL- 1被认为是对关节软骨造成破坏的主要炎性细胞因子之一。IL- 1受体拮抗剂在正常的TMJ滑液 中未 被检 测到[10]。尽管 在以前 的研究中发现,在颞下颌关节骨关节炎患者的TMJ内IL- 1受体拮抗剂的水平显著偏高,但它的增加无法抑制同样增加的IL- 1β[11]。相反,另一个研究显示,在颞下颌关节紊乱病患者和正常人群的关节滑液中,虽然IL- 1β的水平升高,但是IL- 1受体拮抗剂的水平没有明显的差异[12]。很明显,无论IL- 1受体拮抗剂的水平如何,补充外源性IL- 1受体拮抗剂对颞下颌关节骨关节炎可能是一种很好的治疗方式。本研究证明在实验性诱导兔颞下颌关节骨关节炎24周期间内,关节腔内注射IL- 1受体拮抗剂能降低骨关节炎的发展程度。通过组织学观察也证实关节软骨病损程度较对照组轻。

正常情况下,关节软骨的内部微环境保持着分解和合成代谢的平衡。但是,在骨关节炎中,基质的分解破坏占据着主导地位。因此,抑制过度分解及刺激合成因素的分泌对关节软骨的修复是很有必要的。IL- 1可以刺激降解酶的释放,同时抑制II型胶原蛋白及聚集蛋白聚糖等基质蛋白的合成[5]。本研究结果显示实验侧关节在注射IL- 1受体拮抗剂后12周,关节软骨中II型胶原及聚集蛋白聚糖的表达较对照侧升高,但聚集蛋白聚糖酶的表达较对照侧降低。实验结果提示:在骨关节炎中,IL- 1对软骨的损伤起着重要的作用。另一方面,TNF- α被认为是另一种关节炎性疾病的主要致病因素。IL- 1和TNF- α虽然是不同的致炎因子,但在骨关节炎中,二者的生物学活性起着叠加作用。然而,在本研究中,注射IL- 1受体拮抗剂并不能抑制TNF- α的表达,这表明IL- 1受体拮抗剂通过调节信号转导机制仅仅对IL- 1起到作用。注射IL- 1受体拮抗剂后24周,尽管II型胶原及聚集蛋白聚糖的表达较对照组升高,但聚集蛋白聚糖酶表达与对照组无明显差异,这说明关节腔内注射IL- 1受体拮抗剂对降低或延缓骨关节炎的进展也有远期效应。

本实验结果表明,颞下颌关节腔内注射IL- 1受体拮抗剂能有效缓解骨关节炎导致的软骨病损,因此可以作为治疗颞下颌关节骨关节炎的一种新的有效途径。

摘要：目的:研究关节腔内注射白细胞介素-1受体拮抗剂对颞下颌关节骨关节炎关节软骨修复的影响。方法:取新西兰大白兔24只,用关节盘部分切除致使穿孔法建立双侧颞下颌关节骨关节炎模型。4周后,在每只动物右侧(实验侧)颞下颌关节腔内一次性注射重组人白细胞介素-1受体拮抗剂50μg,左侧(对照侧)关节腔内注射等量安慰剂。注射后12、24周分别处死12只动物,取双侧颞下颌关节标本进行组织学及RT-PCR检测。结果:双侧关节软骨均呈现出不同程度的骨关节炎病损,对照侧病损更严重。实验侧组织学分数明显高于对照侧(P<0.05)。注射后12和24周时实验侧II型胶原及聚集蛋白聚糖mRNA表达高于对照侧(P<0.05);12周时实验侧关节软骨聚集蛋白聚糖酶mRNA表达低于对照侧(P<0.05),24周时两侧无明显差异(P>0.05)。肿瘤坏死因子-αmRNA表达两侧无明显差异(P>0.05)。结论:颞下颌关节腔内注射IL-Ra能缓解骨关节炎导致的软骨病损,可望成为治疗颞下颌关节骨关节炎的一种新方法。

关键词：IL-1受体拮抗剂,颞下颌关节,骨关节炎,兔

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兔膝关节软骨细胞 第4篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究经本单位伦理委员会批准,采用回顾性研究方法,2013年1月至2014年5月我科连续收治并采用自体软骨细胞结合I型胶原三维支架移植治疗膝关节软骨缺损患者共9例。患者手术时平均年龄为30岁(18~41岁);男性6例,女性3例;术前平均病程74个月(4d~360个月);平均身体质量指数(body mass index,BMI)23.5kg/m2(19.3~26.4kg/m2)。

1.2 病例选择

1.2.1 纳入标准

a)软骨缺损面积2.5~10cm2;b)对侧关节软骨损伤不超过国际软骨修复学会(international cartilage repair society,ICRS)分级Ⅱ级;c)患侧至少2/3半月板完整,韧带完整(如有损伤则需重建),髌骨轨迹正常(如有异常则应矫正),下肢力线正常(如偏离大于4°则应矫正),关节活动度正常;d)BMI小于30kg/m2,年龄18~50岁。

1.2.2 排除标准

关节强直,关节纤维化,关节感染,系统性疾病,传染性病毒感染,肥胖。

1.3 手术方法

1.3.1 关节软骨组织的获取

采用腰硬联合麻醉,上止血带,膝关节镜检查软骨损伤的部位、大小和深度(见表1),在距离滑膜缘5mm的股骨内髁或外髁非负重区获取全层软骨,约0.5cm×1.0cm,抽取患者肘正中静脉血约80mL提取其血清,用作软骨细胞培养。如有半月板、前交叉韧带损伤,分别予以修复或重建。

1.3.2 软骨细胞的培养

将取下的软骨组织送至生物科技有限公司,在缓冲溶液中分离软骨细胞,质检合格后与液态胶原载体进行混合,形成凝胶,扩增8~14d,并通过生物安全性检测,术前1d转送回医院。

1.3.3 软骨细胞移植

根据损伤部位,在髌旁作长约6cm手术切口进入关节,暴露软骨损伤部位,用尖刀沿软骨损伤边缘垂直切割至软骨下骨,用刮匙清创病损软骨下骨组织,根据软骨缺损区域的大小和深度,修整载有软骨细胞冻胶原移植物准备移植,用冻干人纤维蛋白胶均匀注射于软骨缺损区,将移植物粘附于缺损部位,失水约25min至移植物高度与周围健康软骨齐平,轻柔的被动活动膝关节数次,确定移植物无移位后,逐层缝合切口。如有髌骨轨迹不良,同时予以矫正。

2 护理

2.1 术前护理

2.1.1 协助完成检查

所有病例均完成膝关节正侧位、膝关节MRI检查,明确软骨损伤位置,保证患者符合纳入标准。协助医生完成膝关节临床功能评定,根据国际膝关节文献委员会(international knee documentation committee,IK-DC)评分及Lysholm评分标准进行临床功能评价。本组患者术前IKDC(52.7±6.9)分,Lysholm(55.8±8.7)分。

2.1.2 预防感染

注意加强手术侧膝关节皮肤清洁,手术区域术前2h剪毛备皮,术前1d晚上用肥皂彻底清洁手术区域皮肤,术晨用2%碘酊消毒,75%酒精脱碘后用灭菌治疗巾包扎。床垫及床上物品严格高压消毒。

2.1.3 心理护理

本方法需要行膝关节镜下取样及切开移植物植入两期手术,部分患者尚需要接受膝十字韧带重建、半月板修复或髌股关节校正术,治疗周期较长。患者均处于青壮年,大多对手术持有较强期望值。多与患者沟通让其了解手术过程和意义,消除过度紧张和对手术的恐惧及焦虑,帮助患者建立信心,理解并配合治疗,同时也要告知患者术后效果与期望值有差距的可能性、手术后康复训练过程比较长,使患者对手术效果保持理性水平并坚持配合康复训练计划。

2.2 术后护理

2.2.1 体位护理

患者取平卧位,手术当天术侧膝关节保持伸直制动,指导其定时以一侧肢体为轴在护士协助下保持侧肢伸直行侧卧位。

2.2.2 观察患肢外周循环及感觉

手术当日均行膝关节加压包扎,观察足背动脉的搏动、皮温和皮肤颜色、感觉的变化,防止包扎过紧影响动脉血液循环及腓神经受压。手术后第1天解除加压包扎后观察有无膝关节血肿形成。

2.2.3 早期功能锻

术后6h指导患者患肢进行踝泵运动及踝关节旋转运动促进静脉回流,预防深静脉血栓形成炼疼痛护理。

2.2.4 多模式联合镇痛

本组患者均接受切开软骨移植物植入手术,对患者进行疼痛评分,采用疼痛病房管理模式的阶梯性镇痛方案,术后疼痛评分在4~6分,采用静脉应用非甾体类抗炎药作为基础方案,配合心理疏导、体位护理、音乐疗法等疼痛辅助护理措施,必要时追加弱阿片类药物口服强化镇痛处理。同时每日4次进行疼痛评估以随时调整镇痛方案,保证患者无痛或微痛状态,作为康复护理的基础。

2.2.5 冷疗护理

术后切口周围冷疗,可促使局部血管收缩,血流减慢,降低毛细血管通透性从而减轻组织液外渗,减慢局部代谢,降低耗氧量,促进术后早期消肿、减少渗血。冷疗还可增加痛觉阈值,降低关节滑液内前列腺素E2的浓度,抑制肌肉牵张反射和痉挛,从而发挥镇痛作用[10]。本组患者手术后均采用术后返回病房即行膝关节冷疗方案24h,密切观察患肢皮肤颜色,足趾及踝关节感觉活动情况,所有患者均未出现皮肤冻伤。

2.2.6 康复护理指导

合理的康复方案是软骨损伤术后患者护理的重要组成部分。术后早期移植物较软,同周围组织结合并不十分紧密,容易受到压力和剪切力的破坏,康复应以被动活动、控制负重为主;中期患者可逐步过渡到完全负重,并指导患者进行闭链力量训练;到后期(术后12周起)则应逐步恢复日常活动,进一步加强肌肉力量和本体感觉的恢复训练[11]。本组患者术后患膝均佩戴可角度调节式支具保护。康复过程如表2所示。应强调持续被动运动训练(continuous passive motion,CPM)在软骨修复治疗的重要性。术后早期出血及肿胀阶段,关节周围组织随着CPM机的屈伸而被动地伸缩,关节内的压力出现正弦曲线型变化,这种压力的变化犹如“泵”的作用将关节及周围的积血、积液挤出关节区,从而减轻关节及周围肿胀、使得关节活动阻力减小,活动范围增大[12]。基础实验研究表明,在不影响关节稳定性的前提下,关节内的这种周期性压力变化,有利于营养物质、液体通过在关节内的交换从而刺激软骨细胞的代谢,改善了关节软骨的营养,避免了因血肿机化和纤维素性渗出造成的关节内外黏连的发生[13]。

2.2.7 出院指导

患者平均住院时间3.5d,术后康复过程长,出院指导尤为重要,出院前1天指导并检视患者康复锻炼方式方法掌握情况,告知患者手术后康复是一个长期过程,应严格遵照康复护理计划进行,建立微信或QQ群随时与患者沟通,以达到手术预期效果。嘱患者术后1、3、6、12、24个月返院门诊复查。

2.3 随访评价

所有患者均获得临床随访,术后2年IKDC(93.7±3.6)分,Lysholm(94.5±6.7)分。除9号患者因行胫骨结节内固定术未行MRI检查外,其余8名患者均行MRI检查评估移植物改建过程,用软骨修复组织的核磁共振评分(magnetic resonance observation of cartilage repair tissue,MOCART)[14]定性评估移植物形态,术后2年(75.6±5.8)分。

3 小结

兔膝关节软骨细胞 第5篇

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

4 周龄新西兰大耳兔1 只,由北京市昌扬西山养殖场提供,许可证号为SCXK(京)2011-0010。磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline,PBS)(北京雷根生物技术有限公司),改良Eagle培养液达尔伯克必需基本培养基(dulbecco's minimum essential medium,DMEM)/F12(美国Hyclone公司),胎牛血清(美国Gibco公司),青霉素- 链霉素混合溶液(北京雷根生物技术有限公司),0.25%胰蛋白酶(北京雷根生物技术有限公司),0.2%Ⅱ型胶原酶(美国Sigma公司),MTT(北京雷根生物技术有限公司),二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(北京索莱宝公司),4%多聚甲醛、1%甲苯胺蓝染液(北京雷根生物技术有限公司),无水乙醇(北京化工厂)。

1.2 实验方法

1.2.1兔关节软骨细胞的分离、培养、传代

取4周龄新西兰大耳兔1只,耳缘静脉注射水合氯醛致死,剪除四肢毛发,碘伏浸泡0.5 h。常规铺单,取出四肢放入无菌弯盘中,无菌敷料包裹。在超净工作台上仔细分离肩、髋、膝关节处的软骨,注意分离表面肌肉、肌腱、半月板、滑膜等组织。用眼科剪将软骨剪成碎片,PBS缓冲液冲洗3次后,置入装有等体积0.25%胰蛋白酶的小烧杯中,与磁力搅拌器一起置于培养箱中37℃恒温消化0.5 h。向烧杯内加入等体积培养液终止消化。取出后放入15 ml离心管中,1 300 r/min离心5 min,弃上清液。将软骨碎片取出放入装有等体积0.2%Ⅱ型胶原酶的烧杯中,置于培养箱中37℃恒温消化2 h。向烧杯内加入等体积培养液终止消化。取出后放入15 ml离心管中,1 300 r/min离心5 min,吸取上清液。将上清放入15 ml离心管中,1 800 r/min离心8 min。弃上清,加6 ml培养液(89%DMEM/F12+10%胎牛血清+1%双抗)于离心管中,小心吹打,使细胞均匀分散在培养液中,之后将其一起移入25 ml细胞培养瓶中,放于培养箱培养(5%二氧化碳CO2,37℃)。如小烧杯内残留软骨块较多,可重复上述步骤进行二次消化。原代细胞培养2 d后给予换液,以后隔日换液。取细胞悬液滴于细胞计数器中,按照如下公式对软骨细胞进行计数。每毫升DMEM/F12培养液中的细胞总数=4大格细胞总数/4×104×稀释倍数。滴少许台盼蓝染液于细胞计数器中,活细胞细胞壁完整不被染色,而死细胞则被染成蓝色。细胞存活率=4大格活细胞数/4大格细胞总数×100%。当软骨细胞融合至>80%时,细胞呈现铺路石样改变,此时可将细胞传代培养。用3 ml吸管吸出原培养液,PBS缓冲液漂洗3次以后,加入2 ml 0.25%胰蛋白酶摇晃培养瓶消化细胞约2 min,直至显微镜下观察细胞呈皱缩状或呈瀑布状落下为止。终止消化后,吹打瓶底。将培养瓶内液体移入15 ml离心管中1 800 r/min离心8 min,留取沉淀物,弃上清。再次加入6 ml培养液同法离心,以保证彻底去除胰蛋白酶,防止细胞消化过度。弃上清,吸取6 ml培养液于离心管中,吹打混合均匀后移入25 ml细胞培养瓶内入培养箱继续培养。

1.2.2软骨细胞爬片甲苯胺蓝染色

将第3代软骨细胞悬液放入有盖玻片的培养皿中,移入培养箱中培养,2 d后细胞贴于盖玻片上,此时细胞爬片制作成功。取出细胞爬片,PBS缓冲液冲洗爬片3次,4%多聚甲醛溶液固定10 min。将爬片放入干净培养皿中,滴入适量0.1%甲苯胺蓝染液浸泡4 h。无水乙醇冲洗3 min,干燥后显微镜观察并拍照。

1.2.3Ⅰ/Ⅱ型复合胶原膜与软骨细胞共培养之前的消毒、浸泡

用眼科剪将Ⅰ/Ⅱ型复合胶原膜修剪成大小合适的圆形材料,75%乙醇浸泡5 h,PBS缓冲液冲洗3次,每次约15 min。放于24孔板中,加入适量DMEM/F12培养液浸泡1 d,将粗糙面向上。

1.2.4 MTT法检测软骨细胞在Ⅰ/Ⅱ型复合胶原膜上的细胞活性

取2 ml 0.25%胰蛋白酶消化第3代软骨细胞后,将细胞浓度调至1×105个/ml接种于4块96孔培养板中,每个培养板分为两组,分别为细胞组、细胞和胶原膜共培养组。每组放置10个样本,每2天换1次液。先后取第2、4、6和8天的培养板,加入5 mg/ml的MTT液10μl/孔,培养箱孵育4 h后加DMSO,100μl/孔,恒温摇床振荡10 min后在酶标仪490 nm波长处测吸光度值(optical density,OD)。

1.2.5糖胺聚糖水平检测

将第3代软骨细胞悬液按照同一细胞浓度接种于4块空白的96孔板和4块含有Ⅰ/Ⅱ型复合胶原膜复合物的96孔培养板中,每组放置10个样本,每2天换1次液。先后取第2、4、6和8天的软骨细胞上清液,以兔糖胺聚糖酶联免疫分析试剂盒检测糖胺聚糖水平。

1.2.6扫描电镜观察软骨细胞与Ⅰ/Ⅱ型复合胶原膜复合物

取第3代软骨细胞,将细胞浓度调至1×105个/ml,与复合胶原膜在24孔板中共培养3 d。其中,第2和3天给予细胞换液。第3天换液后,将细胞胶原膜复合物从培养板中取出,PBS缓冲液漂洗3次,取2.5%戊二醛、1%锇酸进行固定,用不同浓度的乙醇进行梯度脱水。样品行临界点干燥后,将其贴于样品台上喷金行扫描电镜观察。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,用t检验,P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 软骨细胞形态及存活率

原代软骨细胞初为卵圆形,悬浮于培养液中,培养2 d后细胞贴壁生长,其余不能贴壁的细胞可通过换液去除。细胞贴壁以后,逐渐铺展成多角形或梭形,伸出短小的突出。高倍镜下观察到软骨细胞胞核清楚,为圆形、椭圆形。5 d后细胞融合至>80%,呈集落性生长,呈现典型的铺路石样改变。分离的原代软骨细胞浓度约为2.5×105个/ml,台盼蓝染色测定细胞存活率约为90%。传代后的软骨细胞开始时同样为卵圆形,贴壁后变为梭形或多角形。而贴壁时间较原代细胞短,第3 代软骨细胞约36 h即可完成贴壁。随着传代次数的增加,细胞去分化现象明显,细胞伸出伪足,3 代以后的各代细胞增殖能力下降,传代周期较前几代长。见图1。

2.2 软骨细胞爬片甲苯胺蓝染色

软骨细胞均被染色,细胞轮廓清晰。细胞核深染,细胞质浅染,两者分界清晰。细胞质内散在蓝紫色异染颗粒。见图2。

A:原代软骨细胞;B:原代软骨细胞5 d后铺满瓶底;C:传代消化的第3代软骨细胞

2.3MTT法检测软骨细胞在Ⅰ/Ⅱ型复合胶原膜上的细胞活性

MTT法测得细胞组与共培养组第2、4、6 和8天的OD值。可以看出,软骨细胞无论是单独培养还是与胶原膜共培养都能很好地增殖,4 d以内细胞增殖速度较快,此后速度减慢。且同一天共培养组的OD值要高于细胞组,差异有统计学意义(P <0.05)。见表1 和图3。

2.4 糖胺聚糖水平检测

从细胞组与共培养组第2、4、6 和8 天的糖胺聚糖水平可见,复合胶原膜共培养4 d以内的软骨细胞分泌较多的糖胺聚糖,细胞活性较高,且胶原膜能促进软骨细胞增殖,两组的糖胺聚糖水平比较,差异有统计学意义(P <0.05)。这与MTT法得出的结论一致。见表2 和图4。

A:软骨细胞爬片(×400);B:软骨细胞爬片(×800)

2.5 扫描电镜观察软骨细胞与Ⅰ/Ⅱ型复合胶原膜复合物

扫描电镜观察到复合胶原膜的孔径均一,平均为100μm左右。软骨细胞铺展在复合胶原膜上,生长良好,部分细胞伸出伪足,呈现出聚集生长的趋势。高倍镜下观察到细胞膜表面的微绒毛和突起等结构,符合软骨细胞的基本特征。见图5。

(n=10,μg/ml,±s)

A:复合物的扫描电镜图(×500);B:复合物的扫描电镜图(×1 000)

3 讨论

酶在软骨细胞的分离过程中起着至关重要的作用。胰蛋白酶可去除混于软骨块中的滑膜和结缔组织等,保证Ⅱ型胶原酶能更好地与组织块接触。胰蛋白酶消化获取的软骨细胞纯度较高,混入其中的杂质较少。软骨细胞具有贴壁的特性,而杂质并不贴壁,可通过换液的方式去除杂质。Ⅱ型胶原酶的主要作用是把细胞基质中的胶原纤维降解成低分子短链多肽,从而将软骨细胞分离出来。值得强调的是,无论是胰蛋白酶还是Ⅱ型胶原酶,在使用时一定要注意控制好时间和浓度,否则对软骨细胞会有所损伤。一般而言,胰蛋白酶的作用时间约为0.5 h,Ⅱ型胶原酶的作用时间约为2 h。在Ⅱ型胶原酶进行第2 次消化时可加入适量胎牛血清,这样可降低胶原酶对细胞的毒性,对细胞起到一定的保护作用。软骨细胞适合在温度为37℃、二氧化碳浓度为5%的环境中培养。培养液的p H需调至7.3 左右,培养液中需含有胎牛血清和维生素C,以保证细胞正常增殖并维持细胞活性[5,6]。软骨细胞贴壁后一般隔天换液。当细胞培养液由红色变为黄色时说明培养液中的营养已被耗尽,对细胞生长不利,需立即换液。

自软骨细胞移植技术问世以来,如何获取数量充足、表型稳定的种子细胞一直是困扰众多学者的一个难题。研究表明,软骨细胞传至3 代以后,细胞会失去原有的形状,细胞表型发生改变,发生去分化[7]。如何解决软骨细胞的去分化问题是组织工程领域的难点,但细胞聚集培养就能很好地解决这一问题。由于软骨细胞不断地分泌生长因子,在聚集培养的过程中,局部生长因子浓度升高,有利于细胞维持表型[8]。同时,细胞与细胞基质之间进行信号传导,有利于细胞恢复表型。故在软骨细胞体外培养时,一定要注意接种的密度,防止因密度过低发生去分化[9,10,11]。对组织工程而言,选择表型稳定的软骨细胞是至关重要的。软骨细胞传至5 代后呈长梭形,此时可断定细胞的表型发生改变[12]。因此,软骨细胞移植一般用3 代以内的软骨细胞。

本实验中笔者通过细胞形态观察和甲苯胺蓝染色对软骨细胞进行鉴定[13,14]。软骨细胞贴壁前为卵圆形,贴壁后变成三角形、梭形,呈集落性生长,符合软骨细胞的形态[15]。甲苯胺蓝是一种碱性染料,软骨细胞的细胞核及细胞质均为酸性,能与甲苯胺蓝的阳离子结合,细胞核被染成深蓝色,细胞质被染成浅蓝色。除此之外,因软骨细胞可特异性分泌Ⅱ型胶原,故Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和免疫荧光染色也是很好的鉴定方法[16]。细胞线粒体内含有琥珀酸脱氢酶,能把MTT还原为甲瓒,DMSO能将甲瓒溶解。在一定细胞数范围内,用酶标仪测得490 nm波长处的OD值与细胞数成正比。MTT法正是基于上述原理检测细胞活性。笔者研究发现,共培养4 d以内细胞增殖较快,活性较高,与国外的文献报道相符[17]。糖胺聚糖水平检测与MTT法所得结论一致。

兔膝关节软骨细胞 第6篇

关节腔内注射透明质酸 (hyaluronate acid, HA) 自1974年Peyron等[11]首次用于治疗OA以来, 取得了良好疗效, 在临床得到了广泛应用。关节软骨急性损伤后软骨细胞凋亡的高峰在损伤后早期[10], 据此, 我们设想:关节软骨急性创伤后早期立即予以关节腔注射HA, 可能要比发生了创伤性关节炎后再行关节腔内注射HA治疗意义更大。本实验旨在研究关节软骨创伤后早期关节腔内注射透明质酸对软骨细胞凋亡的影响, 在药物应用的时间上关注的是关节软骨创伤后立即在关节腔内注射HA, 探讨创伤后早期关节腔内注射HA对预防软骨细胞凋亡的意义。

1 材料与方法

1.1 动物模型的制作

选用新西兰大白兔36只, 重2.5～3.0 kg。2%戊巴比妥钠静脉麻醉后, 双膝部皮肤脱毛、固定体位, 常规消毒、铺单, 髌韧带内侧切口, 长约2 cm, 过屈膝关节显露股骨髁间凹关节面, 用直径2.0 mm的钻头钻孔, 钻透双膝股骨内外侧髁软骨全层, 深度2～3 mm, 造成膝关节内软骨的急性损伤[10]。等渗盐水冲洗关节腔, 缝合皮肤前随机选择向一侧关节内注射1%的透明质酸钠1 mL (HA组) ;另一侧不应用任何药物, 作为对照组。伤后连续3 d肌肉注射青霉素钠盐预防感染, 笼内喂养, 自由活动。

1.2 标本的采取

我们选择创伤后的第2天、4天、2周、4周、12周作为观察时间点, 切取HA组及对照组损伤区周围直径为3～4 mm全层软骨, 一部分用流式细胞仪检测HA组及对照组的软骨细胞凋亡, 另一部分采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记法 (TUNEL) 观察软骨细胞的凋亡。

1.3 流式细胞仪检测软骨细胞凋亡

无菌操作下切取受损软骨, 剪成2～3 mm, 置于离心管中, 磷酸盐缓冲液 (phosphate buffered saline, PBS) 冲洗, 2 000 r/min离心10 min去除上清液, 0.25%的胰蛋白酶消化30 min, 2 000 r/min离心10 min去除上清液, 0.2%Ⅱ型胶原酶, 在37℃恒温培养箱内消化, 每隔1 h吹打1次, 4～6 h软骨碎片完全溶解, 再经过滤、漂洗、计数制成细胞悬液 (大于1×106/mL) , 加入PI染液, 避光作用20 min, 采用流式细胞仪检测。

1.4 TUNEL检测软骨细胞凋亡率

切取的软骨先经10%的中性福尔马林溶液中固定, 固定时间大于48 h。递增浓度乙醇脱水, 石蜡包埋。连续切片, 切片厚度为5 μm。以PBS代替一抗作阴性对照。凋亡的细胞核呈棕黄色, 采用双盲法, 连续观察10个高倍视野计数每100个细胞中的阳性细胞数, 取其平均值作为该标本的细胞凋亡率。

1.5 统计学分析

计量资料用undefined表示。HA组与对照组的比较采用两样本均数差别的t检验。

2 结果

2.1 流式细胞仪计数检测

通过流式细胞仪检测显示, HA组与对照组比较各时相分析点软骨细胞凋亡率均明显降低, 差异有统计学意义 (P<0.01, 见表1) 。

2.2 TUNEL结果

对照组关节软骨急性损伤后立即在紧靠钻孔区周围的软骨表浅层内可发现很少数量的软骨细胞出现凋亡;伤后第2天凋亡的软骨细胞延伸到中间层, 但主要局限在创伤孔周围1 mm的软骨区域内;伤后第4天凋亡率最高, 凋亡的软骨细胞分布更加广泛, 呈全层分布, 距创伤孔延伸的更远;伤后14 d软骨细胞凋亡减少, 仍主要分布在表浅层和移行层, 深层较少;伤后12周在表浅层见到少量的软骨细胞凋亡。HA治疗组伤后立即予以HA关节腔内注射, 伤后第2天、4天、2周、4周、12周TUNEL结果显示, 各观测点软骨细胞凋亡的数量和密度均较对照组明显降低 (P<0.01, 见表2) 。

3 讨论

透明质酸 (hyaluronate acid, HA) 又名玻璃酸, 是Meyer和Palmer于1934年从牛眼玻璃体中分离得到并命名的。其分子量具有不均一性, 一般平均为50万～200万, HA对人类及动物无抗原性。HA作为细胞外基质的重要组成部分, 被用于预防和治疗骨关节炎的研究, 为治疗骨关节炎治疗提供了新的途径[12]。HA有防止关节软骨凋亡、坏死的作用[13]。Valentina等[14]研究报道, HA对软骨的保护作用可能是通过保护了软骨细胞线粒体的功能, 改善了线粒体驱动的软骨细胞的凋亡来实现其对软骨的保护作用。临床研究还发现, HA减轻关节疼痛, 改善关节功能的效果优于NSAIDS和注射糖皮质激素[15]。HA是治疗OA的一种安全、理想和有效的药物[16]。

HA治疗OA的确切机制还不十分清楚[17], HA具有复杂的、多重的对细胞保护的作用。有研究表明HA的诸多作用可能是通过与CD44受体结合后介导实现的[18]。CD44在维持多种细胞的正常功能和生存上起重要作用, CD44通过一种线粒体控制的路径, 能够明显提高结肠上皮细胞抗凋亡的作用[19]。此外, 在与软骨生物学的联系中, 已发现CD44通过黏附HA, 不论是在软骨正常或不正常的功能中都起着十分重要的作用, CD44黏附HA后可释放一系列的刺激信号来调节软骨微环境中软骨细胞的增殖及基质的合成[20]。HA治疗OA的一个重要机制之一可能是保护了细胞的DNA免受氧化剂的损伤[21], 在氧化剂损伤的条件下, HA可以提高软骨细胞的生存能力和保护线粒体的功能。HA可以直接地清除氧自由基、活性氮和通过与CD 44结合而介导的调节作用, HA作为一种直接的抗氧化剂作用, 保护了线粒体DNA免受自由基的损伤, 保护了细胞的活性, 使细胞免受凋亡。HA的保护作用机制还可能牵涉到:或者是截留了铁离子, 从而抑制了氧化物;或者是间接的作为一种抗氧化剂清理了原发或激发的氧自由基[14]。

关节软骨急性损伤后软骨细胞会发生凋亡, 创伤后第4天软骨细胞凋亡率最高[10], 本实验对照组检测的软骨细胞凋亡结果也证实了这一点。我们在软骨创伤后立即进行关节腔内注射HA, 通过流式细胞仪计数、TUNEL检测显示关节软骨创伤后立即使用HA后, 伤后2 d、4 d、2周、4周、12周各观测点软骨细胞凋亡数量和密度均较对照组明显减少, 创伤后第4 d的凋亡峰值明显下降, 治疗组的软骨细胞凋亡较对照组明显少。

尽管我们还不能完全明确HA是通过何种途径实现对创伤后软骨的保护, 影响软骨细胞凋亡作用的, 但本实验结果却提示我们:关节软骨创伤后, 在其软骨凋亡高峰期前早期 (伤后立即) 进行关节腔注射HA, 能明显的抑制创伤后软骨细胞的凋亡。透明质酸早已在临床广泛用于治疗OA, 但在关节软骨创伤后即早期应用HA的意义, 在临床还未引起重视。我们认为关节软骨损伤后立即行关节腔内注射HA较等到创伤性关节炎发生后再注射意义大, 对预防创伤性关节炎的发生有一定的作用。

摘要：目的 探讨关节软骨创伤后早期 (立即) 行关节腔内注射透明质酸对关节软骨创伤后软骨细胞凋亡的影响。方法 用2mm钻头钻孔造成兔双侧膝关节软骨急性创伤, 术后立即随机选择一侧关节腔内注射1%透明质酸钠1mL (HA组) , 另一侧不注射任何药物 (对照组) 。利用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记法、流式细胞仪两种方法对受损软骨进行检测。结果 治疗组软骨细胞凋亡率较对照组明显小。结论 关节软骨创伤后早期 (立即) 进行关节腔内注射透明质酸, 能有效的抑制软骨细胞的凋亡, 对预防创伤后骨关节炎的发生有重要意义。

兔膝关节软骨细胞 第7篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

从2012年11月-2013年4月在西安交通大学医学院附属红会医院住院预接受膝关节置换手术治疗患者中, 根据根据美国风湿病学会 (ACR) 2008年修订的OA诊断标准, 通过病史、临床检查和X线平片等确诊OA患者共20例作为OA组。其中男6例, 女14例, 平均年龄 (71.3±8.9) 岁。同时收集无关节疾病史及肉眼病变的因外伤截肢、交叉韧带断裂、半月板损伤等行手术治疗的膝关节患者共10例作为对照组, 其中男8例, 女2例, 平均年龄 (42.4±6.7) 岁, 经病理学诊断关节病变, 作为正常对照组。受试者均知情同意参加本实验并经过医学伦理委员会批准。两组受试者一般资料比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 主要试剂及方法

1.2.1 主要试剂

p53及Beclin1引物由南京金斯瑞公司合成, 引物信息见表1;逆转录试剂盒购自加拿大Fermentas公司;SYBR®Premix Ex Taq TMⅡ购自日本Takara公司;p53及Beclin1多克隆抗体购自中国台湾Abnova公司, 即用SP免疫组化两步法检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.2 方法

30例新鲜标分为两部分:一部分立即放入4%多聚甲醛中固定, 10%EDTA脱钙6、7周, 常规脱水, 石蜡包埋, 以4~5μm厚度连续切片。行常规HE染色外, 按试剂盒内说明分别行p53及Beclin1免疫组织化学染色, 用已知的阳性切片作为阳性对照, 以PBS代替一抗作为阴性对照, 经染色后, 阳性信号呈黄褐色。每张切片随机选取5个高倍视野 (×200) , 计算阳性染色细胞所占细胞总数的百分比;另一部分放入1‰DEPC水处理过的冻存管中浸液氮24 h后, 转移到-80℃冻存, Trizol法提取软骨组织总RNA, 经微量核酸/蛋白定量仪鉴定并定量后, 根据Fermentas公司提供说明书进行逆转录, 对逆转录产物进行扩增, 反应结束后, 立即进行熔解曲线分析, 用于判定PCR反应的特异性, 是否有非特异性扩增产物;琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物条带是否单一;内参照为β-actin, 基因表达量采用ΔΔCt法进行计算。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析, 对数据进行方差齐性及正态性检验后, 根据情况, 两组间均数的比较用Mann-Whitney U检验或t检验;OA软骨细胞中p53与Beclin1基因水平表达量用Pearson或Spearman检验进行相关性分析以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE及免疫组织化学染色结果

20例OA组与10例对照组的膝关节软骨组织经HE染色后比较软骨组织的厚度、形态及软骨细胞的数量可见:OA软骨变薄、缺损, 软骨表面毛糙, 软骨细胞数量减少, 呈簇状生长 (见图1A、B) 。OA关节软骨中p53阳性细胞主要分布于表层和中层, 细胞质及细胞核均有表达;对照组关节软骨阳性细胞分布部位与OA相似, 但数量少, 阳性细胞数低, 两组间差异有统计学意义 (P<0.05) , 见图1C、D、图2。OA关节软骨四层结构中均可见到Beclin1阳性细胞分布, 主要表达于细胞质;对照组关节软骨阳性细胞分布部位与OA相似, 但数量较多, 阳性细胞数高, 两组间差异有统计学意义 (P<0.01) , 见图1E、F、图2。

*P<0.05, **P<0.01, 与正常组比较

2.2 real time PCR结果

用realtime q PCR的方法检测p53及Beclin1的表达, β-actin作为内参照。结果显示p53在OA患者的关节软骨组织中表达显著高于对照组 (P<0.01) , 而Beclin1在OA患者的关节软骨组织中表达显著低于对照组 (P<0.01) , 见图3。

**与正常组比较, P<0.001

2.3 相关性分析结果

OA患者20例关节软骨组织中p53及Beclin1基因的表达进行相关性分析, 得出r=-0.629 (P<0.05) , 故认为OA组织中p53及Beclin1基因的表达之间具有相关性, 且呈负相关, 见图4。

3 讨论

OA软骨细胞的减少主要由于软骨细胞过度凋亡引起[4]。Gobbi等[5]发现在OA膝关节软骨的表层和中层有过度的细胞凋亡。应用TUNEL法和荧光标记的钙依赖性的磷脂结合蛋白V法检测正常组和OA组的髋关节软骨发现, 在OA的关节软骨中有18%~21%的软骨细胞出现凋亡的特征, 而只有2%~5%有凋亡特征的软骨细胞出现在正常组关节软骨中[6]。

OA软骨细胞过度凋亡与凋亡基因过度表达有关[7]。p53是重要的抑癌基因, 在转录水平上调促凋亡基因如Bax、PUMA和NOXA, 下调凋亡抑制基因如Bcl-2的表达[8]。细胞质中的p53使Bax诱导的MOMP增加[9]。NO表达增加、细胞外基质降解可以增加软骨细胞中p53的表达, 进而诱导软骨细胞凋亡[10]。本研究也证实OA中p53无论在基因水平及蛋白表达水平均高于正常对照组, 且主要分布在表层和中层, 细胞质与细胞核均有表达。

研究发现, 自噬参与了OA软骨细胞凋亡的调节。自噬通过降解蛋白及残余细胞器为细胞节约并提供能量, 清除某些有害的蛋白来防止或减少由这些聚集蛋白所引起的细胞毒性, 中和细胞的应激反应[11]。Beclin1是重要的自噬调节基因, 它与Vps34形成的复合物可使磷脂酰肌醇磷酸化形成PI3P。PI3P招募并引导自噬相关蛋白定位, 进而介导自噬体的成核[12]。在OA大鼠模型的研究中发现自噬标记物LC3Ⅱ与Caspase3表达分布相反[13]。在OA患者的软骨组织中研究发现, 随着疾病严重程度的增加Beclin1介导的自吞噬途径逐渐减弱, 且与软骨细胞凋亡呈负相关[2]。自噬是保证关节软骨细胞获取ATP、中和应激的重要手段, 因此自噬被抑制使得软骨细胞抵抗凋亡刺激的能力下降。

近年研究发现, p53不仅可以促进凋亡, 也能调节自噬。肿瘤自噬的研究中发现, 细胞质中的p53可抑制Beclin1介导的自噬, 因此当物质和能量缺乏时, 虽然p53表达降低, 但细胞为维持ATP水平自噬不仅没有减弱反而增强[3]。本研究在OA软骨细胞中也证实p53与Beclin1基因表达呈负相关, 说明关节软骨中p53可能抑制了Beclin1介导的自噬反应, 进而使得OA软骨细胞更易发生凋亡。

综上所述, 由于OA中由于NO表达增加、细胞外基质降解等损伤因子增加, 导致OA软骨细胞p53表达增加, 除了直接诱导凋亡外, 还可使Beclin1介导的自噬水平降低, 从而削弱自噬对软骨细胞保护作用 (如提供ATP、中和应激反应等) , 进一步加剧OA软骨细胞的凋亡。中止或者减弱这一过程, 可能对减少OA细胞凋亡, 甚至延缓OA软骨退变的进展, 具有一定积极的意义。但OA软骨细胞中p53抑制Beclin1的具体机制还须进一步在细胞水平及分子水平进行研究。

摘要：目的:研究p53在骨关节炎软骨组织中的表达及与关节软骨细胞自噬的关系。方法:对20例骨关节炎患者 (OA组) 及10例正常膝关节软骨组织 (对照组) , 用实时定量PCR (real-time PCR) 、免疫组化等方法检测p53及Beclin1在膝关节软骨中的表达与分布, 并对两者进行相关性分析。结果:p53在OA组的表达明显高于正常对照组 (P<0.05) , OA组关节软骨组织中Beclin1的表达量明显低于正常对照组 (P<0.01) , p53与Beclin1在软骨组织中表达呈负性相关 (r=-0.629, P<0.05) 。结论:骨关节炎中p53的高表达能够抑制软骨细胞自噬, 从而减弱软骨细胞对凋亡抵抗能力, 促进软骨细胞凋亡。

兔膝关节软骨细胞 第8篇

1 微囊泡的生物学特性

近年来,研究证实多种细胞均可以产生MVs,并且无论其细胞起源或分类( 例如,外切体、细胞微粒等) ,这些MVs均包含母体细胞大量的生物活性分子( 蛋白质、脂质、mRNA、microRNA及siRNA等) ,继而运输到相应的靶细胞调节其生理功能( 包括促进细胞增殖及存活等)[2]。研究表明MVs可能主要通过直接膜性融合、粘附分子( 如L1、CD44) 或信号分子( 如整合素) 等方式与其他细胞相互作用。目前,MVs已被普遍认为是细胞间传递生物学信息的新途径[3],并参与机体多种病理生理反应。

2 间充质干细胞源性微囊泡 ( marrow stem cell-derived microvesicles,MSCs-MVs) 在组织修复中的研究进展

目前,研究者已从MSCs中分离出MVs( MSCs-MVs) ,动物实验证实MSCs-MVs在不同受损组织中的修复能力。在肾脏损伤修复领域,研究者将MSCs-MVs与肾小管上皮细胞共培养,观察到MSCs-MVs融入肾小管上皮细胞并发挥促进细胞增殖、提高细胞活性的作用,进而研究人员对甘油诱导的急性肾小管损伤[4]、缺血再灌注诱导的急慢性肾损伤[5]、顺铂诱导的致死性急性肾损伤[6]、残肾动物模型[7]经静脉注射MSCs-MVs,证实MSCs-MVs可显著恢复受损肾组织的组织学特征,明显改善肾脏功能,提高模型动物的存活率,并且这种作用在MSCs-MVs以较大剂量( 或重复) 应用时更明显。在肝脏损伤修复中,MSCs-MVs发挥的作用亦被证实。Herrera等[8]将肝脏干细胞来源的MVs( liver stem cells - derived microvesicles,LSCs-MVs) 与肝细胞共培养,发现LSCsMVs可促进肝细胞增殖,而较大剂量的LSCs-MVs可显著抑制氨基半乳糖诱导的肝细胞凋亡; 将LSCs-MVs经静脉注射入70% 肝切除的大鼠模型体内,结果同样显示LSCs-MVs可显著减少肝细胞凋亡,促进肝脏再生。MSCs-MVs在呼吸、循环、生殖等系统所发挥的组织修复作用亦有文献报道。Zhu等[9]研究发现,人源性MSCs-MVs对大肠杆菌内毒素诱导的急性肺损伤小鼠具有一定治疗作用,可减轻肺水肿及肺泡蛋白的渗出。Zhang等[10]发现人源性脐带MSCs-MVs可促进人类UC内皮细胞增殖,刺激血管生成,且效应呈剂量依赖性。Mokarizadeh等[11]利用Wistar大鼠研究了MSCs-MVs在生殖领域的功能,发现MSCs-MVs可提高冻存精子的质量参数和黏合性能,部分修复了冻存对精子活力带来的负面影响。王喜梅[12]则对MVs的相关研究做了相对系统的介绍,认为MSCs-MVs的组织修复作用,可能是其主导的mRNA或蛋白质转移诱导了成熟细胞的再分化,触发了增殖程序,从而加快了损伤组织的修复进程。

此外,Kim等[13]对MSCs-MVs进行蛋白组学分析,发现多组与MSCs自我更新及细胞分化相关蛋白,其中包括表面受体( PDGFRB、EGFR及PLAUR) 、信号分子( RRAS/NRAS、MAPK1、GNA13 / GNG12、CDC42及VAV2 ) 、细胞粘附 素( FN1、EZR、IQGAPI、CD47、整合素) 及MSCs相关抗原( CD9、CD63、CD81、CD109、CD151、CD248、CD276 ) 等,此研究为更好地理解MSCs-MVs的组织损伤修复及再生潜能提供了较为全面的分子学基础。

3 MSCs-MVs 在组织修复中的优势

近年来,MSCs的修复再生作用已被普遍认可。然而,亦有研究表明MSCs具有免疫调节的双重性质,一方面具有免疫抑制功能[14],另一方面又可能充当抗原提呈细胞,诱发免疫反应[15]。此外,MSCs已被发现广泛存在于一些肿瘤组织中( 如胃腺癌、脂肪瘤、骨肉瘤)[16],还有学者推测MSCs是成纤维细胞相关肿瘤的潜在来源[17],从而高度怀疑MSCs与这些肿瘤的相关性。这些信息都暗示MSCs可能在肿瘤的发展过程中发挥着某种尚不清楚的作用,应用MSCs进行组织修复必须慎重。

相较于MSCs在组织修复领域所表现出的不确定性,MSCs-MVs则被证实可以诱导抗炎因子产生、抑制同体或异体淋巴细胞增殖、诱导活化T细胞凋亡及增加调节性T细胞的比例,从而可能避免和抑制自身免疫性反应[18]。Bruno等[19]发现人源性MSCs-MVs可以抑制Hep G2肝细胞瘤、卡波西氏肉瘤及Skov-3卵巢肿瘤细胞系的分裂周期进程,诱导上述肿瘤细胞凋亡。Wu等[20]也发现人源性脐带MSCsMVs能够抑制膀胱肿瘤T24细胞的增殖活性,诱导细胞凋亡,抑制肿瘤生长。其他研究也表明,MSCs-MVs较MSCs具有以下优点: a) 性质更稳定,便于贮存[21]; b) 诱导信号更强烈,信息传递能力更强[22]; c) 功能不随时间延长而衰减[23];d) 无异源性风险,无同种异源应用之后的免疫反应[4]。因此,相比MSCs而言,应用MSCs-MVs进行组织损伤修复应该具有更广阔的前景。

4 MSCs-MVs 修复软骨损伤的设想

4. 1软骨损伤及其治疗现状软骨损伤是一种由创伤或活动过度导致的常见关节疾病。由于关节软骨的特殊结构,其自身修复能力有限,损伤后如不经治疗,常可引发各种关节疾病,并最终导致骨关节炎( osteoarthritis,OA) 的发生,严重影响患者生活质量。正常软骨组织在急性或重复性创伤( 包括过度的冲击负荷) 作用下即可导致关节软骨基质发生变化,即蛋白多糖( proteoglycans,PG) 含量减少和胶原纤维网络( 其中Ⅱ型胶原约占80% ~ 90% ) 发生破坏,软骨细胞表型去分化。因此,软骨损伤修复的关键在于促进受损区域软骨细胞表型恢复、增加软骨细胞增殖及基质合成。

目前软骨损伤修复的方法很多,包括药物治疗、关节灌洗清理、软骨下骨微骨折、软骨下骨钻孔、骨软骨移植、软骨细胞移植、MSCs移植等技术和方法。前几种方法仅能减轻疼痛、缓解症状,难以恢复正常软骨组织形态,经多年临床应用,疗效欠佳。此外,虽有研究显示MSCs移植在骨修复再生[24]及软骨损伤修复[25]中具有积极作用,但其作用效果的不确定性亦为人担忧。基于此,探求一种新的安全有效的软骨修复方法就具有重要的现实意义。

4. 2 MSCs-MVs可能是修复软骨损伤的新途径MSCs长期被认为是通过其多向分化潜能来修复组织损伤,但近来更倾向于认为MSCs的修复机制可能是一种间接的、依赖于旁分泌途径的方式,而MSCs-MVs很可能就是其中关键的作用组件。Strassburg等[26]研究了MSCs和退化髓核细胞间的相互作用,发现两者之间存在膜成分的双向交换,MVs在其中扮演重要角色。Diao等[27]将人源MSCs与OA软骨细胞共培养,发现可部分恢复OA软骨细胞的表型,这提示MSCs是通过旁分泌途径发挥损伤修复功能。然而这种发挥软骨损伤修复作用的旁分泌物质是否为MVs,未见文献报道。

目前已知,关节软骨受损时,基质退变、软骨细胞凋亡与NF-κB及MAPKs信号转导通路有密切关系,主要涉及靶基因 ( 抗凋亡基因bcl-2或促凋亡基因P53等) 及凋亡执行蛋白( Casp3等) 的激活。而Bruno等[6]研究发现,致死性急性肾损伤模型小鼠在注射MSCs-MVs后生存率明显提高,经检测发现肾小管上皮细胞抗凋亡基因( bcl-2、Bcl-χL) 表达上调,同时执行凋亡程序的基因( Casp3、8) 表达下调。因此,作者认为MSCs-MVs或许可以通过相似的作用途径提高受损软骨细胞活性,修复关节软骨损伤。