系统发育分析范文

系统发育分析范文（精选12篇）

系统发育分析 第1篇

关键词：物种进化,分子系统发育,计算机技术,生物信息学

生命的进化是漫长的。史学界针对物种的进化史进行研究, 都试图从生物化石中寻找物种进化的证据, 但毕竟化石数量有限, 而且通过这种方式所获得的进化信息是零散的。所以, 要对生物的进化史以及生物之间的进化关系充分掌握, 目前的学术界会普遍采用解剖学、发育学的相关理论进行研究。但是, 这些研究方法都不同程度地存在着依赖性, 这就必然会导致研究中存在着局限性。生物的结构相似, 但是, 进化的途径并不完全相同。比如, 鱼类和脊椎动物的眼睛所发挥的功能是相同的, 但是, 进化的途径却是完全不同的。随着分子生物学的发展, 对物种进化的研究就可以从生物分子的层面展开, 以获得更为准确的物种进化信息。

1 物种进化研究中分子系统发育分析所发挥的作用

系统发育学又被称为“系统发生学”, 主要的研究内容是物种形成的历史和进化的历史, 而且还针对物种在进化过程中相互之间所存在的关系进行研究。在生物信息学研究领域中, 系统发育学是重要的分支。在对物种进化进行研究的过程中, 从系统发育学的角度进行研究, 可以对物种的进化史更好地掌握, 基于此而对生命的起源进行探索, 包括物种的变异、物种的差异、物种的基因功能以及从生态学的角度对微生物的研究等等。

随着生物学的研究进入到分子层面, 基因技术开始融入到生物进化史研究中。特别是基因测序技术的发展, 诸如RNA、DNA以及蛋白质等等的生物序列逐渐积累起来, 这就使得生物进化史研究进入到分析层面。在很多生物学专家看来, 在生物分子中就可以获得物种进化的信息, 而且相比较于从生物化石获取信息要容易得多[1]。所以, 生物研究领域对于物种的进化进行研究, 多会从分析层面展开。

随着学界对物种发育的研究采用生物信息学的方法, 能够涉及到的研究学科越来越多, 除了计算机技术和生物学之外, 包括数学、统计学等等都被用于研究中, 从分子的层面对生物进化史研究水平逐渐提高, 而且在研究方法上不断实现创新。

2 分子层面的物种进化信息

2.1 单条生物序列中所含有的进化信息

如果生物的基因或者蛋白质均为同源的, 当从一条序列向另一条序列进化的时候, 对于进化的概率进行计算, 就需要通过变异的次数对物种进化的距离进行衡量。刻画单条序列的分子进化的过程中所产生的信息, 就是计算局部位点上所存在的碱基变异情况或者是氨基酸残基上所存在的变异情况, 所有的进化事件, 包括进化信息的插入、进化信息的删除以及进化信息的转化等等, 都会详细记录下来。

在提取进化信息的时候, 从单基因水平进行提取, 就是将能够对物种进化情况有所反映的基因提取出来, 通过比较不同物种之间的基因而获得两条基因序列所存在的不同之处。不同物种的基因序列差异越小, 就意味着物种之间所存在的进化距离就越近。

2.2 多条生物序列中所含有的进化信息

对于多条生物序列中所含有的进化信息进行研究, 主要采用两种方法。其一, 在系统发育树的构建上采用单序列信息, 用于表示物种系统;其二, 采用比对的算法从多条生物序列的角度对同源基因进行比对, 之后串联所获得的结果。根据所获得的比对结果将系统发育树进行重新构建[2]。同源基因被找出来之后, 就将这些基因信息充分利用起来, 并对这些信息进行分类。

比如, 对神经嵴细胞采用生物信息学的方法对基因差异进行分析, 可以利用DAVID数据库对与基因有关的数据进行富集, 并根据需要予以分类。DAVID数据库可以对500个基因所发生的改变情况进行生物信息学分析, 具体操作:打开DAVID网页进入到指定的数据库中, 将发生改变的神经嵴细胞基因提取出来, 从原有的表格中复制到具有统计功能的基因输入框中。数据提交完毕后, 选择“Start Analysis”并点击, 就可以对这500个基因进行生物信息学分析了。 (下图:神经嵴细胞分化)

3 采用系统发育树针对物种进化关系进行研究

3.1 建立在字符序列基础上而采用的系统发育树算法

建立在字符序列基础上而采用的系统发育树算法是将可以发挥各种功能的树搜索出来, 选择对给定序列能够给予很好的解释的树, 用以对物种的系统发育进行研究。

3.1.1 最大简约法。

最大简约法以通过最小的改变对物种群体之间所存在的差异进行观察。在对发育树的选择上, 要选择进化次数最小的那棵树而对物种进化关系进行研究。多年来, 采用这种方式对生物的进化情况进行研究, 随着物种数量的增多, 这种方法由于没有对树中的分支进行掌握, 导致物种进化的距离无法明确地反映出来。

3.1.2 最大似然法。

最大似然法所采用的是进化模型, 通过将模式数据与真实的数据信息之间对比, 统计相似程度。最大似然法的数据统计效果良好, 其不仅对物种进化的距离充分考虑, 还对距离的相关内容进行了刻画。但是, 采用这种方法需要对发育树分支的拓扑结构进行研究, 计算过程非常复杂。如果物种的数量大, 采用这种方法很显然是不适宜的。

3.1.3 贝叶斯推断法。

贝叶斯推断法是基于最大后验概率原理, 通过所掌握的先验知识对后验的分布情况进行求解。要求所选择的发育树为最大后验概率, 对发育树为真的概率进行分析, 并采用贝叶斯法进行推断。这种方法被广泛地应用。但是, 在推断的过程中, 需要对先验概率进行估计, 还要对各种参数进行集成, 所以, 在计算的时候需要消耗大量的时间, 所以, 贝叶斯推断法存在着局限性。

3.2 基于物种进化距离的系统发育树算法

基于物种进化距离的系统发育树算法中, 较为经典的是两种算法, 即, UPJMA法和邻接法。其中的邻接法属于是合并算法, 虽然这种算法并不能将计算结果精确到最小进化树, 但是可以获得近似的数值, 不仅计算的速度快, 而且具有较高的准确率。基于物种进化距离而采用邻接法, 可以使得计算的过程和所获得的结果更容易被理解, 与常规的字符序列方法相比, 不仅计算的速度上存在着优势, 而且还可以将物种距离的矩阵计算出来, 之后就能够采用聚类算法将物种的发育树构建起来。

结束语

随着信息技术的发展, 计算机技术逐渐渗入到生物进化史研究中。计算机具有很强的数据处理能力, 在对生物进化相关的数据进行处理的时候, 不仅数据处理能力提高了, 而且数据处理成本有所降低。所以, 采用生物信息学方法对分析系统发育系统进行分析非常必要。

参考文献

[1]詹永勤, 余敏, 杨长平.关于中美生物信息学研究现状的研究[J].西南农业学报, 2013 (02) :789—794.

系统发育分析 第2篇

中国小蜂科属间系统发育关系分析(膜翅目:小蜂科)

利用Hennig86程序的nelsen合意和Phylip程序的多数规则合意2种支序分析方法,探讨了中国小蜂科的系统发育关系.基于中国21属的`30个性状,计算得到2个合意树,其分类系统与传统分类系统基本保持一致.在进化关系和亲缘关系上表现为:小蜂属(Chalcis)、卡诺小蜂属(Conura)、大腿小蜂属(Brachymeria)和脊柄小蜂属(Epitranus)相对最为原始,而泰内小蜂属(Tainaniella)和背突小蜂属(Oxycoryphe)相对最为进化,前者和后者之间的亲缘关系最远;亲缘关系最近的有:泰内小蜂属(Tainaniella)和背突小蜂属(Oxycoryphe),泊卡小蜂属(Proconura)和日本小蜂属(Nipponochalcidia),小蜂属(Chalcis)和卡诺小蜂属(Conura)以及细尾小蜂属(Megalocolus)和三角小蜂属(Trigonura),它们分别构成姊妹群关系.

作 者：杨郁霞 刘长明 YANG Yu-xia LIU Chang-ming  作者单位：教育部生物农药与化学生物学重点实验室,福建农林大学,福建,福州,350002 刊 名：昆虫分类学报  ISTIC PKU英文刊名：ENTOMOTAXONOMIA 年，卷(期)：2006 28(4) 分类号：Q969.54+5.6 关键词：膜翅目   小蜂科   系统发育   支序分析  

宝宝的神经系统发育正常吗? 第3篇

一般正常婴儿都会出现以下一些反射现象。

食物反射包括觅食反射、吮吸反射和吞咽反射。当你用手指或乳头抚弄婴儿的面颊时，他就会转头，张嘴，并有吮吸、吞咽动作，和真的吃奶一样。在出生仅半小时、醒着的婴儿身上已经可以观察到这种反射；酣睡着的婴儿没有食物反射。这种反射在九个月时消失。

防御反射儿童出生后的头几天就能对温度刺激或疼痛刺激产生泛化性反应，也就是说，刺激他的某一个部位，会引起全身性的反应，如呕吐、喷嚏、眨眼、打呵欠、瞳孔反射等。这个反射是不会消失的。

定向反射儿童出生后12～24小时就会把眼睛转向光源，强的声音刺激可以停止他的吮吸动作。

巴彬斯基反射用手指轻划新生儿脚底外侧，曲脚跟至脚尖，他的脚趾会象扇形似的张开，脚会朝里弯曲。6～9个月后，这种反射就消失了。此后，再这样触摸他的脚底，他的脚趾就会朝里弯曲。

抓握反射当触摸新生几的手掌时，他就会握紧拳头。如果他的两只小拳头握紧一根棍棒的话，我们可以拉住棍棒使他站起来。这种反射，四个月时消失。

惊跳反射这是一种全身动作，在新生儿躺着时看得最清楚。当新生儿感受到突然的刺激(如大的噪音)，就会伸开双臂、双腿、手指张开，背部伸展或弯曲，头朝后仰，又迅速收回。四个月后这种反射消{失。

巴布金反射新生儿躺着时，按住他的手掌，他的头会转来转去，嘴巴张开，就象打呵欠一样。六个月后这种反射消失，

游泳反射将新生儿托起来，面朝下，他的四肢会做游泳动作。六个月前，将新生儿俯卧放在水里，他会表现为不随意游泳动作；满六个月后，如果再这样把他放在水里，表现为挣扎活动；直到八个月以后，才表现为随意的游泳动作。

行走反射托住新生儿的腋下，让他的光脚板接触平面，他会做迈步动作，看上去非常象动作协调的行走。这种反射在八周左右消失。

蜷缩反射当新生儿缩起脚背碰到手面边缘时，他会做出与小猫动作相似的蜷缩动作。这种反射也在：八周左右消失。

系统发育分析 第4篇

笔者从秦皇岛地区某貉养殖场病死貉的肺脏、肝脏、心血等病料中分离出1株细菌并命名H1,通过对该菌的形态特征、培养特性进行鉴定,初步鉴定为变形杆菌,对该菌进行16S rRNA序列分析,最终从分子水平上证实H1为奇异变形杆菌,为对其进行病原学、流行病学、免疫防治等深入研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 病料来源

无菌采集秦皇岛市昌黎县某养貉场病死貉的肺脏、肝脏、心血等病料,进行细菌分离培养,分离菌株命名为H1。

1.2 试剂

DL-2 000 Marker、2×Taq Marker Mix、树脂型TM基因组DNA提取试剂盒,均购自北京康为世纪生物科技有限公司;ID32E肠道菌鉴定试剂条,由法国梅里埃公司生产。

1.3 实验动物

健康Balb/c小白鼠(雌鼠)12只,体重20 g左右,购自北京维通利华实验动物有限公司。

1.4 细菌的分离纯化及镜检

无菌挑取病料接种于普通营养琼脂培养基,37℃培养16~20 h。在麦康凯琼脂平板上进行纯化培养,纯化3次后用甘油保存菌种[4];对麦康凯琼脂平板纯化培养的菌落进行革兰氏染色镜检。

1.5 细菌生化特性鉴定

利用自动生化鉴定系统ID32E肠道菌鉴定试剂条进行生化试验。

1.6 动物致病性试验

将分离菌接种于营养肉汤中,37℃培养16 h,采用平板稀释法计数含菌量,使菌液浓度达到8×108cfu/m L。将20 g左右的小鼠10只分成2组,每组5只,试验组腹腔注射0.5 m L菌液,对照组腹腔注射等量生理盐水。观察发病及死亡情况,剖检小白鼠,无菌取其肺脏、肝脏、心血分离细菌并鉴定。

1.7 16S rRNA基因组DNA的PCR扩增与测序分析

按照树脂型TM基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA,16S rRNA基因组DNA通用引物,P1 5'-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3',P2 5'-GT-GGCGGACGGGTGAGTAA-3',引物由北京赛百盛基因有限公司合成。以基因组DNA为模板进行PCR反应。PCR扩增反应体系(50μL):2×Taq Marker Mix 25μL,dd H2O 19μL,上、下游引物各1μL,DNA模板4μL。反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性50 s,55℃退火50 s,72℃延伸50 s,72℃终延伸10 min,共30个循环。取5μL扩增产物于1%琼脂糖凝胶中,120 V电泳15 min,观察PCR扩增产物的条带。将PCR产物送上海生物工程有限公司进行序列测定,测序结果与Genebank数据库中登录的基因序列进行同源性比对分析,用DNA Star软件构建系统进化树,并进行同源性分析。

1.8 药敏试验

按照K-B纸片法进行试验操作和结果判断,取分离纯化的分离菌接种到营养肉汤中,37℃培养16~20 h,调整菌液浓度至0.5号麦氏标准管浊度,然后均匀涂抹于M-H琼脂平板上,贴上药敏片,置37℃培养16~18 h,测定抑菌圈直径。

2 结果

2.1 细菌培养特性及形态观察

分离菌株在普通营养琼脂平板上培养16 h,可见扁平的透明或半透明菌落,表面光滑,菌落边缘有迁徙生长现象;革兰氏染色镜检为革兰氏阴性小杆菌,呈两端钝圆的杆状、球状,无芽孢及荚膜。

2.2 细菌生化特性鉴定

生化鉴定结果显示:分离菌发酵葡萄糖、木糖、半乳糖产酸产气,甲基红、过氧化酶、V-P、硫化氢、鸟氨酸脱羧酶、尿素酶为阳性,吲哚、氧化酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水酶为阴性。鉴定结果为奇异变形杆菌,评定结果合格率为99.6%。

2.3 动物致病性试验结果

试验组小鼠24 h左右全部发病死亡,剖检死亡小鼠发现,肺脏出血、肿大,肝脏、肾脏出血等;对照组5只小白鼠健康存活,表明该菌具有一定致病性。对其进行分离培养鉴定,结果显示与H1一致。

2.4 16s rRNA基因组DNA序列分析

将分离菌株H1的PCR扩增产物进行测序,并在NCBI上利用BLAST软件与Gen Bank中公布的12株参考菌株进行同源性对比分析,与参考菌株的同源性为96.5%~99.9%,见图1;系统发育树分析发现,H1与4株参考株亲缘关系较近,同源性均为99.9%,见图2。确定H1为奇异变形杆菌。

2.5 药敏试验结果

药敏试验结果见表1。

mm

注:S表示高度敏感,I表示中度敏感,R表示耐药。

由表1可知:该分离菌耐药性较强,在测定的24种常用药物中,仅对氟苯尼考、头孢曲松和阿奇霉素3种药物高度敏感,对恩诺沙星、阿莫西林等16种药物均耐药。

3 讨论

本试验从病死貉的肺脏、肝脏、心血等病料中分离出1株细菌,对其进行形态特征观察、培养特性分析、生化鉴定,与《伯杰细菌鉴定手册》中报道的奇异变形杆菌的特性一致,初步确定该菌为奇异变形杆菌。通过致病性试验发现,该菌有一定致病性。通过对该菌进行16S rRNA序列分析,从分子生物学水平上证实该分离菌株为奇异变形杆菌,系统发育树分析表明该分离菌株与参考株同源性达到99.9%,证实该菌是引起貉肺炎的主要病原菌。禹文海等[5]报道了用PCR的方法快速检测猕猴的奇异变形杆菌;段二珍等[6]报道了从病死的狐狸体内分离出奇异变形杆菌,该菌具有很强的致病力,通过系统发育树分析与貉的奇异变形杆菌有很高的同源性;周芳等[7]报道了鸡源的奇异变形杆菌感染后通过系统发育分析发现该菌发生变异,耐药性增强。奇异变形杆菌血清型复杂,血清型多达340~360个[3],免疫预防难度较大,当动物机体抵抗力不足,尤其是发生其他疾病时更容易引起继发或混合感染。其作为人畜共患传染病原更应该引起重视[8]。

笔者对分离的菌株H1用24种抗生素进行药敏试验,结果显示该分离菌株仅对氟苯尼考、头孢曲松和阿奇霉素高度敏感,对其他16种药物耐药,这表明分离菌株H1对多数药物具有高度抗药性。史同瑞等[9]报道了水貂的奇异变形杆菌对卡那霉素、链霉素、阿米考星等药物敏感,对氧氟沙星、红霉素等多种抗生素耐药;任梅渗等[10]报道了猪源奇异变形杆菌对很多种抗生素有很强的耐药性;李欣南等[11]报道了鸡源奇异变形杆菌在肉鸡养殖中具有较高的感染率,该菌对11种抗生素的耐药性普遍偏高,其中对黏杆菌素、氟苯尼考、恩诺沙星等9种药物耐药率达到了80%以上,对头孢噻呋等药物敏感。综合参考近年来人和动物奇异变形杆菌的药敏试验结果发现该菌对绝大多数药物均耐药;奇异变形杆菌感染的宿主(水貂、猪、鸡)不同,其耐药性也不同。因此,长期不科学使用抗生素可导致很强的耐药性,同时也会增加奇异变形杆菌病的治疗难度。当临床发生奇异变形杆菌感染时,最好依据药敏试验结果科学用药。

参考文献

[1]崔国林,朱瑞良,左雪梅,等.16-23S rRNA基因间隔序列PCR及RFLP对奇异变形杆菌分离株的鉴别与系统发育分析[J].中国兽医学报,2013,33(3):367-370,399.

[2]房海,陈翠珍.中国食物中毒细菌[M].北京:科学出版社,2014.

[3]房海,陈翠珍,张晓君.肠杆菌科病原细菌[M].北京:中国农业科学技术出版社,2011.

[4]姚火春.兽医微生物实验指导[M].2版.北京:中国农业出版社,2010.

[5]禹文海,赵远,黄芬,等.PCR方法检测猕猴奇异变形杆菌[J].中国人兽共患病学报,2013,29(3):278-281.

[6]段二珍,夏平安,张凤华,等.狐狸奇异变形杆菌的分离与鉴定[J].中国兽医科学,2008,38(12):1050-1054.

[7]周芳,冉丹丹,刘飞,等.鸡源奇异变形杆菌的分离鉴定及系统进化分析[J].动物医学进展,2015,36(7):29-32.

[8]李文建,汪正清.奇异变形杆菌的毒力因子[J].中国人兽共患病杂志,2001,17(2):80-82,86.

[9]史同瑞,李丹,刘宇,等.貂奇异变形杆菌的分离及其生物学鉴定[J].中国预防兽医学报,2013,35(10):817-820.

[10]任梅渗,王印,杨泽晓,等.猪源奇异变形杆菌的分离鉴定与生物学分析[J].中国人兽共患病学报,2015,31(12):1093-1097.

系统发育分析 第5篇

具抗肿瘤活性放线菌菌株YIM 90022的分离和系统发育分析

从青海盐碱土壤样品中分离到一株兼性嗜碱放线菌YIM 90022,该菌株的发酵产物具有很强的体外抗胃癌、肺癌、乳腺癌、皮肤癌、肾癌和子宫癌肿瘤细胞株活性.基于16S rRNA基因序列的系统发育分析表明,菌株YIM90022属于拟诺卡氏属(Nocardiopsis)的成员,与该属的4个有效发表种N.exhalans DSM 44407T,N.prasina DSM 43845T,N.metallicus DSM 44598T和N.listeri DSM 40297T系统发育关系最密切,与其分别以98.8%,98.5%,98.4%和97.8%的16S rRNA基因核苷酸序列相似性聚为一簇.但菌株YIM 90022不与这4个有效种中任何一个单独相聚,形成了一个独立亚分枝.结合形态特征、生理生化特性、细胞化学分类特征,以及rep-PCR基因指纹分析等方面的研究结果,菌株YIM 90022可能为拟诺卡氏菌属的`一个潜在新种.菌株YIM 90022在大多数培养基上生长良好,气生菌丝和基内菌丝丰富,在酵母膏麦芽膏琼脂、燕麦片琼脂等培养基中产生可溶性色素.生长pH范围6.0～12.0,最适pH 8.5;能在含0～15%NaCl(W/V)的培养基上生长.

作 者：陈义光 李文均 崔晓龙 姜成林 徐丽华 CHEN Yi-guang LI Wen-jun CUI Xiao-long JIANG Cheng-lin XU Li-hua  作者单位：陈义光,CHEN Yi-guang(云南大学,云南省微生物研究所,云南省生物资源保护与利用重点实验室,昆明,650091;吉首大学生物资源与环境科学学院,吉首,416000)

李文均,崔晓龙,姜成林,徐丽华,LI Wen-jun,CUI Xiao-long,JIANG Cheng-lin,XU Li-hua(云南大学,云南省微生物研究所,云南省生物资源保护与利用重点实验室,昆明,650091)

刊 名：微生物学报  ISTIC PKU英文刊名：ACTA MICROBIOLOGICA SINICA 年，卷(期)： 46(5) 分类号：Q93 关键词：拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)   抗肿瘤活性   16S   rRNA基因   Rep-PCR基因指纹分析   系统发育分析  

系统发育分析 第6篇

关键词：斑皮蠹属；皮蠹属；圆皮蠹属；mtDNA CO Ⅰ基因；遗传距离；分子系统树

中图分类号： Q969.492.503 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0023-04

皮蠹科（Dermestidae）隶属于鞘翅目皮蠹总科，包括6亚科34属，约700种，分布在世界各地，我国已知8属约40种，遍布全国各地。该科昆虫多为小型甲虫，生活隐蔽，繁殖力强，食性广，可取食动物尸体、羽毛、水产品、皮张、药材等各种储藏物，是具有重要检疫意义的储藏物害虫[1-2]。昆虫的mtDNA是一种闭合的双链环状遗传物质，稳定性高，大小一般为15.4～16.3 kb，以高拷贝数存在于线粒体内，检测样品无论是完整还是残缺，均可通过测定mtDNA序列进行鉴别[3]。mtDNA进化速率较核DNA更快，且为母系遗传，在遗传过程中不会发生基因重组、倒位、易变等突变，是动物种内不同地理种群间相对保守又有一定变异的序列，即使是亲缘关系很近的类群也存在几个百分比的差异，所以常被用来反映种群遗传变异信息，被广泛应用于不同分类阶元的分子系统学研究[4]。皮蠹科昆虫是十分重要的储藏物害虫，我国口岸多有截获。该科昆虫分类地位一直存在争议，准确进行种类鉴定对检验检疫口岸工作具有重要意义。因此，本研究对皮蠹科下斑皮蠹属（Trogoderma）、皮蠹属（Dermestes）、圆皮蠹属（Anthrenus）3个属共计30个分析对象的CO Ⅰ基因序列进行分析，并构建出不同的分子系统发育树，以期在分子水平对这3个属的系统发育关系进行探讨。

1 材料与方法

1.1 分析对象及序列信息

分析对象共计30个，序列均从GenBank下载，信息见表1。

1.2 DNA序列数据的处理

应用Mega 5.0软件进行序列比对、拼接和剪切。将比对结果进行序列组成分析，基于Kimura 2-parameter模型计算各分类单元之间的遗传距离及其标准差、序列碱基组成、保守位点、变异位点、转换/颠换比值等[5]。应用Mega 5.0软件，使用邻接法（NJ）、最大简约法（MP）和最大似然法（ML）分别构建分子系统树，1 000次循环估计系统树中节点的自举置信水平，碱基转换和颠换赋予相同的加权值。

2 结果与分析

2.1 mtDNA CO Ⅰ基因序列组成和变异

应用Mega 5.0软件对30个分析对象的CO Ⅰ基因序列进行比对剪裁，得到620 bp大小的的序列片段进行分析。所有分析对象的CO Ⅰ基因的620个位点中没有插入、缺失现象，其中共有104个保守位点，502个变异位点，265个简约信息位点，保守位点占16.77%，变异位点占80.97%，简约信息位点占42.74%。A、T、C、G的平均含量分别为32.3%、317%、22.1%、13.9%，A+T含量较高，为64.0%。第3位点的A+T含量最高，达到73.9%；G的含量最低，平均为40%，在不同种间差异也较大（1.1%～13.6%）；A的含量最高，达到47.9%，这表明密码子的碱基使用频率存在明显的偏向性，与典型的昆虫线粒体DNA碱基组成一致[6]。

2.2 碱基替换分析

采用Mega 5.0软件对分析对象CO Ⅰ基因序列的替换数进行分析，由结果看出，分析对象 CO Ⅰ基因620个核苷酸序列中，核苷酸替换主要发生在密码子第3位点上，全体转换/颠换（R）为20.7。

2.3 遗传距离分析

采用Mega 5.0，基于Kimura 2-param eter模型对分析对象（包括外群）之间的遗传距离进行分析，并采用Bootstrap重抽样1 000次进行检验，结果见表2。由表2可知，总体平均遗传距离为1.017，属间遗传距离介于0.466～0.784之间，各种之间遗传距离介于0～0.875之间，与外群之间的遗传距离较大，为8.176～8.889，说明皮蠹科3个属之间的亲缘关系相对于外群更接近，且基于CO Ⅰ基因3个属间可得到有效区分。

2.4 皮蠹科系统发育树构建

以对粒材小蠹为外群，利用Mega 50系统发育分析软件对分析对象mtDNA CO Ⅰ序列进行NJ、MP、ML系统发育树构建（图1、图2、图3）。

由构建的NJ树（图1）来看，属于圆皮蠹属中的小圆皮蠹编号为3、4、6的3个对象位于系统树的一支；圆皮蠹属中的地毯圆皮蠹独立位于系统树的另一支；斑皮蠹属、皮蠹属的样品聚合成另一支，形成3大分支格局。从基因序列数据可以看出，圆皮蠹属中的地毯圆皮蠹和小圆皮蠹样品之间的遗传距离为0.737，皮蠹属中的秘鲁皮蠹与斑皮蠹属各样品之间的最小遗传距离为0.466，与圆皮蠹属各样品之间的最小遗传距离为0.784。圆皮蠹属与斑皮蠹属各样品之间的平均遗传距离为0.59～0.773。以上结果表明，秘鲁皮蠹与斑皮蠹属各样品之间的遗传距离较近，与圆皮蠹属各样品之间的遗传距离相对较远，这与NJ树构建结果相同，符合NJ树构建规律。

由构建的MP、ML树（图2、图3）可以发现，30个分析对象构建的MP、ML系统发育树表现出一致的格局，在这2个树中，斑皮蠹属、皮蠹属样品、圆皮蠹属的小圆皮蠹样品聚在一起，圆皮蠹属的地毯圆皮蠹单独聚在另一支。圆皮蠹属位于系统发育树的最外缘，斑皮蠹属的谷斑皮蠹进化速率最快。

nlc202309051057

从前面的分析来看，昆虫的密码子表现出明显的A+T的含量偏向性，特别是在密码子第3位，A+T含量很高，该位点的转换较频繁，并且碱基的替换也主要发生在第3位点上，但第3位点的转换虽频繁，却很少会引起氨基酸的改变，因此将线粒体DNA CO Ⅰ全序列翻译成氨基酸序列进行2次建树。

在氨基酸序列NJ系统发育树中，斑皮蠹属、皮蠹属、圆皮蠹属分别聚为一支，明显好于直接用CO Ⅰ序列构建的系统树。将各发育树进行比较发现结果基本一致，圆皮蠹属均聚于最外缘（图4）。

3 结论与讨论

本研究通过下载整理皮蠹科30个分析对象的mtDNA CO Ⅰ序列并构建了不同分子系统发育树，其结果在一定程度上反映了各属之间的进化关系与亲缘关系，秘鲁皮蠹与斑皮蠹属各分析对象之间的遗传距离较近，与圆皮蠹属的遗传距离相对较远，斑皮蠹属较圆皮蠹属进化速率快。当利用CO Ⅰ基因建树后结果不很理想时，可将mtDNA中CO Ⅰ全序列翻译成氨基酸序列进行2次建树再次分析，以达到较好结果。另外，从形态学来看，地毯圆皮蠹复眼内缘凹入，鞘翅具3条狭窄的白色横带，翅上以黑色鳞片居多，沿翅缝两侧尚有红色鳞片形成的纵带。而小圆皮蠹复眼内缘不凹入，鞘翅上有3条由黄色及白色鳞片构成的波状横带，体背面密生长三角形端部钝的鳞片，二者虽同属，却差别明显，系统进化树同样也验证了这点，两者的遗传距离为0.737（>0.02），达到分子水平不同种的鉴定要求。

目前，NCBI上公布的皮蠹科昆虫mtDNA CO Ⅰ基因较少，虽然本研究涉及的皮蠹种类不多，但其研究结果在一定程度上说明了mtDNA CO Ⅰ基因作为遗传标记应用于皮蠹科系统分类研究是可行的方法之一。在下一步的研究中可增加标本的数量，以增强分类单元的代表性，通过研究mtDNA CO Ⅰ基因全序列以及其他分子标记基因，使其包含更多的信息量，为皮蠹科不同阶元的分类提供更多的分子生物学证据。

参考文献：

[1]张生芳，陈洪俊，薛光华. 储藏物甲虫彩色图鉴[M]. 北京：中国农业科学技术出版社，2008：20.

[2]张生芳，刘永平，武增强. 中国储藏物甲虫[M]. 北京：中国农业科学技术出版社，1998：100-101.

[3]刘 聪，蒋 湘，班丽萍. 斑皮蠹属害虫鉴别方法研究进展[J]. 植物检疫，2012，26（4）：60-64.

[4]王银竹，余道坚，张润杰，等. 基于mtDNA CO Ⅰ基因的十种长小蠹分子系统进化研究[J]. 昆虫学报，2010，53（4）：457-463.

[5]Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al. Mega5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution，2011，28（10）：2731-2739.

[6]Liu H，Beckenbach A T.Evolution of mitochondrial cytochrome oxidase Ⅱ gene among the orders of insects[J]. Mol Phylogene Evol，1992，1（1）：41-52.

系统发育分析 第7篇

鲍曼不动杆菌感染的大多数报道来源于人类,而动物感染该菌的相关报道较少,其流行病学情况并不清楚。在苏格兰的一些屠宰场(厂)里采集1 381份临床样品,结果检测到16株鲍曼不动杆菌(8株来自猪,8株来自牛)[4]。在法国的Reunion Island的138家宠物所采集的口腔和泄殖腔样品中分离到了9株鲍曼不动杆菌,其携带率达到6.5%[5]。而关于禽类感染该菌的报道甚少,在我国也少有报道。本研究从发生严重细菌性感染的发病蛋鸡内脏中分离病原菌,经鉴定显示分离菌为鲍曼不动杆菌,笔者对其部分生物学特性进行了研究,以期为临床诊断、治疗及进一步深入研究奠定基础。

1 材料

1.1 病料及试验动物

2015年年初,河南省某养鸡场3 500只成年蛋鸡表现精神萎靡、呼吸急促、有呼噜音、流涕、闭眼嗜睡等症状,发病率约为50%,死亡率约为20%。剖检病死鸡发现,气管轻微出血、肝脏有斑驳状出血、脾脏肿大等病理变化。采集发病鸡的肝脏和脾脏并送至实验室进行分离鉴定。30只6周龄SPF级昆明小鼠,购自河南省实验动物中心。

1.2 培养基和主要试剂

血平板、麦康凯培养基,购自郑州市道合伟业生物技术有限公司;氯化钠、琼脂粉、胰蛋白胨、酵母浸出粉,均购自北京双旋生化试剂公司;p MD18-T载体、DL-2 000 Marker、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒,均购自宝生物工程(大连)有限公司;革兰氏染色液,自配;生化微量管、药敏纸片(共15种),购自杭州天和微生物试剂有限公司;大肠杆菌DH5α感受态细胞,由河南农业大学禽病研究所保存。

2 方法

2.1 病原菌的分离培养与纯化

静脉放血处死病死鸡,无菌采集病死鸡的肝脏和脾脏,接种于1%肉汤中,37℃增菌培养12~24 h后接种于血平板。从血平板上挑取密度大的疑似病原菌的典型单个菌落,重复接种于血平板,直至镜检观察菌落形态单一时,对其冻干保存,同时在血平板、普通琼脂培养基、麦康凯培养基上划线培养观察其生长特性。分离纯化的菌株编号为HN01。

2.2 生化鉴定

将纯化培养的HN01分离株接种于微量生化管中,37℃培养24~48 h后观察结果。

2.3 药敏试验

采用K-B纸片扩散法对分离菌HN01进行药敏试验。挑取分离纯化的单个菌落置LB液体培养基中过夜培养,然后取适量菌液涂板,贴上药敏纸片;倒置在37℃恒温培养箱中培养24 h,测量抑菌圈直径。药敏试验结果的判定参照2010年美国临床实验室标准化研究所CLSI M100-S20的判定标准。

2.4 小鼠致病性试验

将细菌接种于LB液体培养基中,37℃培养12 h,采用涂布平板法确定细菌含量。先通过预试验测出该菌对小鼠的最小致死浓度和最大不死浓度,之后以此为基础进行正式试验。首先将30只小鼠随机分成6组,1~5组为试验组,分别腹腔注射剂量为1.14×109cfu/m L、2.28×108cfu/m L、4.56×107cfu/m L、9.12×106cfu/m L、1.824×106cfu/m L的生理盐水细菌悬液各0.5 m L,空白对照组注射生理盐水0.5 m L。观察5 d,记录小鼠发病死亡情况及剖检病理变化。采用改良寇氏法计算半数致死量(LD50),计算公式:lg LD50=Xm-i(∑p-0.5)。式中:Xm为最大剂量组对数值,i为相邻两组对数剂量的差值,Σp为各组动物死亡率之和。

2.5 特异性基因检测与16S rRNA基因序列分析

采用细菌16S rRNA通用引物,引物序列:27F5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';1541R 5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。OXA-51碳氢霉烯酶基因是不动杆菌属中鲍曼不动杆菌独有的,可用于进一步鉴别属内相近的种[6],其引物序列:OXA-51F 5'-TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3';OXA-51R 5'-TGGATTGCACTTCATCTTGG-3'。分别对它们进行PCR扩增,并采用胶回收试剂盒回收基因扩增产物,于16℃与p MD-18 T载体过夜连接,之后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,次日进行PCR鉴定,阳性菌送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。测序成功后,将所得基因序列在NCBI上通过BLAST进行序列比对。针对16S rRNA基因序列将Gen Bank中收录的同属不同种菌株及其他属的细菌通过DNAStar中的Meg Align进行核苷酸同源性分析,并采用MAGE 6.0软件邻接法绘制系统进化树。

3 结果与分析

3.1 细菌培养特性和镜检结果

病料增菌后接种在血平板上培养,结果10份送检样品中均有比例极高且密度很大的针尖状、灰白色小菌落,此病菌疑似为病原菌。该病原菌增菌后在血平板上生长良好,可见到不溶血、边缘整齐、表面光滑、呈灰白色、针尖状的菌落,直径大小约为2 mm。在普通琼脂培养基上菌落呈圆形、乳白色、不透明、光滑、微凸。在麦康凯培养基上菌落呈圆形,粉红色。该分离菌为革兰氏阴性菌,球杆状或类球状,无鞭毛,无芽孢,菌体大小为(1.0~1.5)μm×(1.5~2.5)μm。

3.2 生化试验

结果见表1。

由表1可知,分离菌的生化鉴定结果与鲍曼不动杆菌的生化鉴定结果基本一致。

3.3 药敏试验

结果见表2。

由表2可知,该分离菌对头孢唑啉、阿莫西林、头孢哌酮、氨苄西林等耐药,其中对头孢唑啉耐药性最强,而对其他抗生素处于中介或敏感。

3.4 小鼠致病性试验

用不同稀释度的菌液接种小鼠,按照改良寇氏法计算LD50,结果该菌的LD50为1.4×108cfu/m L。以1.14×109cfu/m L剂量接种小鼠后12 h内5只小鼠全部死亡;2.28×108cfu/m L剂量接种小鼠后24 h内死亡3只小鼠;4.56×107cfu/m L剂量接种小鼠后36 h内死亡1只小鼠;其他剂量组未出现死亡,但在接种后小鼠出现精神沉郁、饮食和饮水减少、被毛凌乱无光泽、呼吸频率加快、腹部抖动等情况。对死亡小鼠剖检可见,肝脏呈暗红色、肺脏淤血、脾脏肿大、十二指肠肠壁变薄。空白对照组小鼠一切正常。无菌采集攻毒组小鼠的肝脏、脾脏组织接种于无菌肉汤中,37℃恒温培养12 h,对其进行鉴定证实为鲍曼不动杆菌,表明接种该菌后可从小鼠体内重新分离到。以上说明该菌对小鼠有较强的致病性。

注:-表示为阴性,+表示为阳性。

mm

注:R表示耐药,I表示中介,S表示耐药。

3.5 特异性基因检测与16S rRNA基因序列分析

采用煮沸法提取分离菌的基因组,分别对16S rRNA基因和OXA-51基因进行扩增,获得的目的条带与预期扩增片段大小相符,见图1和图2。PCR产物胶回收后,与p MD-18 T载体连接转化,测序结果显示,16S rRNA大小为1 529 bp,OXA-51大小为353 bp。应用DNAstar软件中的Megaglin对该分离菌HN01的16S rRNA基因序列和参考序列进行同源性对比分析,结果显示,HN01株与其他8株鲍曼不动杆菌的核苷酸同源性高达99.9%,与不动杆菌属的醋酸钙不动杆菌、鲁菲不动杆菌等6个其他种的同源性为95.9%~97.9%,与莫拉氏菌属的同源性为90.8%~91.1%,与大肠杆菌(KP326369)的同源性最低仅为85.5%。采用MAGE 6.0软件邻接法构建系统进化树,见图3,结果分离株HN01分支与其他8株人源鲍曼不动杆菌处于同一大分支上。综合以上分析,HN01株细菌属于鲍曼不动杆菌菌种。

M.DL-2 000 Marker;1.阴性对照;2分离菌。

M.DL-2 000 Marker;1.空白对照;2阴性对照;3分离菌。

4 讨论

不动杆菌是由荷兰微生物学家Beijerinck在1911年首次发现的,到目前为止该菌属已发现31个基因种,被命名的有17种,其中鲍曼不动杆菌是临床分离率最高、研究最多的一种条件性致病菌[7]。在兽医领域该菌的相关报道较少,在禽类感染上相关研究更是滞后。目前国内外报道,该菌可引起仔猪腹泻[8]、山羊肺炎[9]、鱼类爆发性死亡[10]、马支气管肺炎[11]、猫坏死性筋膜炎[12]等。本研究对发病鸡场中的部分病死蛋鸡剖检,结果发现,其为严重的细菌性感染,因此进行细菌分离,并结合生化试验、特异性基因检测及16S rRNA序列测定对其鉴定,最终确定分离菌为鲍曼不动杆菌。

▲.本试验分离株。

药敏试验结果表明,该分离菌HN01对大多数头孢类和青霉素类抗生素耐药,其中对头孢唑林耐药性最强,而对大多数喹诺酮类抗生素药物敏感,其耐药基因需进一步深入研究。临床治疗应注重抗菌药物的选择,避免耐药性的产生。

OXA-51基因是不动杆菌OXA类碳氢霉烯酶基因的一个亚型,还包括OXA-23型、OXA-24型和OXA-58型。OXA-51基因是鲍曼不动杆菌所特有的基因,可以用其快速鉴定鲍曼不动杆菌[13]。细菌的16S rRNA基因不论结构或功能均高度保守,在细菌系统发育分析方面,可作为重要的分子指标,在临床的快速诊断中起到了重要作用[14]。采用16S rRNA鉴定细菌基本是通过其序列的相似率来判定,大多数学者认为相似率>99%可定义为种[15]。本研究利用DNAstar软件对该分离菌的16S rRNA基因序列进行同源性分析,结果显示,该分离菌与鲍曼不动杆菌参考株的同源性在99.9%以上。系统进化树构建的结果显示,该分离菌HN01与鲍曼不动杆菌处于同一分支上,与分离自北京的人源鲍曼不动杆菌ZW85-1株(CP006768)亲缘关系最近;与莫拉氏菌属自然聚簇,亲缘关系较远;而与大肠杆菌亲缘关系最远。这些结论都进一步表明该分离菌是禽源鲍曼不动杆菌,而且还可能是人畜共患病原体。本次试验从鸡群中分离出的鲍曼不动杆菌,其基因同源性分析显示来源于人类,说明常发于医源性感染人的鲍曼不动杆菌存在于动物体内,并可导致动物发病,应引起重视。此外,我国养殖密度大,人和动物接触频繁,增加了人兽共患病病原互感的可能性。

摘要：为了确定河南某养鸡场鸡只发生细菌性感染死亡的病原,试验对发病蛋鸡的肝脏和脾脏进行细菌分离,并对疑似病原菌进行形态特征、培养特性的观察,以及生化试验、药敏试验、小鼠致病性试验、特异性基因检测、16S rRNA基因序列分析并构建遗传进化树。结果表明:该分离菌是鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii),对阿米卡星等抗生素敏感,且对小鼠有较强的致病性,LD50达到1.4×108cfu/mL;16S rRNA基因序列与鲍曼不动杆菌的同源性达到99.9%,与不动杆菌属其他种的同源性为95.9%~97.9%;遗传进化树分析显示,其与人源的北京参考菌株ZW85-1的亲缘关系最近。

系统发育分析 第8篇

核糖体上的基因为多拷贝、中度重复序列,一个重复单位由5.8S、18S、26S编码区以及一些间隔区组成。ITS(internal transcribed spacer)区位于18S和26S基因之间,中部被5.8S一分为二,即ITS1区与ITS2区。5.8S、18S、26S进化速率慢,常用于探讨科级和科级以上等级的系统发育问题。而间隔区如ITS区进化速率较编码区快,且具有长度保守性和核苷酸序列的高度变异性,该序列很容易在近缘类群间排序,而且丰富的变异可在较低的分类阶元上,解决科内属间及属下种间关系,包括近缘种关系,一般用于研究较低等级如属间、种间甚至居群间的系统关系[5,6]。在本研究中,我们首次测定了盐桦的核糖体DNA(nrDNA)转录间隔区(ITS区)序列,并结合已公布的其它桦木科桦木属植物的ITS区序列,应用clustalx软件分析其系统发育。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

盐桦的落叶及枝条采自新疆阿勒泰地区阿拉哈克盐湖边。

1.1.2 试剂

PCR产物回收试剂盒、DNA maker、EXTaq酶均为Takara公司产品,其它试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 盐桦组织DNA提取

总DNA提取方法采用文献报道的高盐pH法[7]。主要步骤如下:0.2g实验材料加液氮研磨至粉末,加入3.5ml、65℃的提取介质(100mmol/L EDTA,500mmol/L NaCl,2.5%PVP,3%SDS,1%巯基乙醇,pH 5.5)。65℃摇床温育30min;10 000g离心10min,取上清加入2/3体积2.5mmol/L的KAC溶液(pH 4.8),4℃放置15min;上清液用氯仿:异戊醇(24:1)抽提2次,上清液加入1倍体积异丙醇,-20℃放置20min;15 000g离心15min,所得沉淀用70%酒精洗2次,溶于150μl TE(pH 8.0)。

1.2.2 引物设计及选择

在18SrDNA的3′端设计引物P1:5′-AGA AGTCGT AAC AAG GTT TCC GTA GG-3′;在26SrDNA的3′端设计引物P2:5′-TCC TCCGCT TAT TGA TAT GC-3′,以上引物扩增的片段包括ITS-l、5.8SrDNA和ITS-2的序列,引物由Takara公司合成。

1.2.3 ITS的扩增、纯化及序列测定

以提取的盐桦组织DNA为模板,用引物P1和P2进行PCR扩增,PCR扩增参数为:94℃/5min;94℃/60s,50℃/30s,72℃/50s,35cycles;72℃/7min。PCR扩增的产物用0.8%的琼脂糖凝胶电泳进行检测,用PCR片段回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收PCR产物。

1.2.4 ITS序列测定

PCR产物送Takara公司测序,用P1和P2引物分别对正反链进行测定并相互校正。

1.2.5 ITS序列分析及系统发育分析

将获得的盐桦ITS序列在GenBank上进行Blast,获得已公布的桦木科桦木属植物的ITS序列,用clustalx软件对桦木科桦木属植物的ITS序列进行系统发育分析。

2 结果和分析

2.1 盐桦组织DNA提取

提取的盐桦组织DNA用0.7%的琼脂糖凝胶电泳进行检测,结果见图1。

1. DL 15000 DNA marker;2. Genome of Betula halophila.

2.2 PCR扩增ITS

PCR扩增出约600bp的片段(见图2),与预计相符。

1. DL 2000 DNA marker;2. ITS PCR products.

2.3 ITS序列分析及系统发育分析

获得的盐桦ITS序列在GenBank上进行Blast,获得已公布的17种桦木科桦木属植物的ITS序列(见表1)。

2.3.1 ITS序列同源性分析

用clustalx软件对盐桦和已公布的35种桦木科桦木属植物的ITS序列进行同源性分析,结果表明上述ITS序列差别不大,与盐桦ITS序列同源性在99.67%～99.01%之间(见表1)。

2.3.2 桦木科桦木属植物的ITS序列的系统发育分析

对上述18种桦木属植物的序列排列后,取其606bp的ITS序列(含5.8s)用clustalx软件进行系统发育分析,结果表明,18种桦木属植物的ITS序列(含5.8s)的同源性在之间亲缘关系较近。对606个位点进行了分析,其中变异位点20个。构建了桦木属植物的ITS分子系统树,有根分子系统树(见图3)可将18种桦木属植物分为三大支,Betula alnoides、Betula populifolia、Betula pubescens与盐桦同为一亚分支, 与盐桦遗传距离在0.000～0.003之间。

3 讨论

3.1 ITS及5.8SrDNA序列分析在盐桦研究中的价值

盐桦是新疆阿勒泰地区特有的珍稀濒危植物,1997年,阿勒泰地区林科所与新疆农业大学林学院杨昌友教授通过调查发现,在阿勒泰地区的阿拉哈克乡盐湖南北两岸有400株左右的桦树分布,但不能确定就是盐桦。国家林业局于1996年始在全国范围内组织了国家重点保护野生植物资源调查,历时5年,被调查的野生植物共191种(含变种),盐桦、金平桦、秤锤树三树种在此次调查未找到[8]。新疆林科院植物调查队于1998～2001年,对分布在新疆境内的62个县(市)的14种珍稀濒危植物进行了野外实地调查,结果表明,盐桦为唯一一种原生地已绝灭的类型,由于原生地巴尔巴盖被辟为农场而遭毁灭,至今模式标本产地已难找到盐桦[9]。盐桦仅存于中国新疆阿勒泰地区,具有十分重要的科研价值和应用前景,一定要重点保护和开发。由于盐桦材料极为难得,原生地巴尔巴盖被辟为农场而遭毁灭,很难获得盐桦的种子,而叶表皮、花粉和种子形态在桦木科植物的系统发育和分类上有重要的意义[10],致使盐桦分类缺少系统的研究。

近年来,ITS序列分析已经广泛地应用于解决科内不同等级的系统发育和分类问题[11,12,13,14,15,16]。已有文献报道采用ISSR(Inter Simple Sequence Repeat)标记技术和RAPD标记技术对桦树种间亲缘关系进行分析,对8种桦树(Betula)进行了亲缘关系的分析[17,18],但未见盐桦分子系统发育方面的报道。为此,本研究利用盐桦落叶枝条扦插萌发的芽尖及嫩叶为实验材料开展系统发育和分类研究,对探讨盐桦在桦木属中的分类地位及种间关系方面具有重要的参考价值。

3.2 ITS区PCR产物直接测序以避免PCR扩增中的随机错误

在系统发育分析中,ITS区序列的测定可采用PCR产物克隆后测序或PCR全部产物回收后直接测序,那种方法更好尚无定论。由于PCR扩增有一定的随机错误,如果所测克隆刚好是误扩增的序列,就会影响结果的准确性,而PCR产物直接测序则可避免此问题,因为测序中所表现出的信号由处于主导地位的产物所决定。基于以上分析,我们对两次PCR的回收产物分别进行双向测序,四个测序反应的结果互相校准后确定盐桦ITS区序列,已确保其正确性。另一方面,PCR全部产物回收后直接测序也更为快捷,因PCR产生的随机错误可能使各克隆的序列出现差异,必须对多个克隆进行测序。因此,从近几年发表的论文来看,无论所测ITS区的同步进化程度如何,大家基本上都是对PCR产物直接进行测序,这一方法也取得了良好结果。

3.3 盐桦和其它桦木科桦木属植物的关系

系统发育分析 第9篇

DNA条形码技术是具有不受个体形态特征限制、不受个体发育阶段影响、从基因水平上客观区分物种、操作方法相对简便等特点而引起广泛关注[5,6]。该技术是最近几年新兴起来的生物分类新方向,它是采用对一个统一的目标基因片段基因进行分析,进行物种的区分和鉴定,可以发现新种和隐存种[9]。对于真菌来说,2008年中国真菌DNA条形码系统建设研讨会在中国科学院微生物所举行,目的是探讨建设我国的真菌DNA条形码系统工程,并将参与国际生命条形码计划。本实验中使用nr DNA的ITS基因构建地衣的系统发育树,在分子水平上对地衣进行分类研究,同时初步探讨nr DNA-ITS基因片段是否可作为地衣型真菌的DNA条形码的测试片段,为进一步开展真菌DNA条形码研究工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

供试的地衣实验材料共选取了19个属27个种的33份样本(见表1),均采自于黑龙江省五大连池风景区(老黑山、龙门石寨、药泉山、石龙)。

1.1.2 试剂

Buffer、Mg Cl2、Taq酶、引物均购自上海生工生物工程技术服务有限公司,d NTPs、DL2000 Marker则购自北京鼎国生物技术有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取及检测

采用改良的CTAB法提取地衣的总DNA[7,8],用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA的质量,其浓度和纯度通过Genspel检测仪测定。

1.2.2 Pcr的扩增

ITS-PCR反应体系总体积为35μl,体系内含10×Buffer3.5μl,Mg Cl24.3μl,d NTPs 3.4μl,10μmol/L的引物各1.8μl,模板DNA 1.2μl,5u/μl的Taq酶2.0U。引物序列为P1(5'-TCC TCCGCTTATTGATATGC-3')和P2(5'-GGAAGTA-AAAGTCGTAACAAGG-3')[15]。PCR反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s,55℃退火45s,72℃延伸30s,40个循环;72℃延伸5min[10]。PCR扩增反应在GMB2700型PCR仪上进行。

1.2.3 序列的测定与分析

PCR所扩增产物以PCR引物为测序引物进行单向测序,测序反应由北京六合华大基因有限公司完成。所获得的序列利用Clustal X 1.83软件对所得的ITS序列进行多重比对,然后手工校正。用MEGA4.0软件进行分析,采用类平均聚类法构建系统发育树,为进一步检验系统发育树中各分支的支持度,进行了1 000次自展(bootstrap)计算。

2 结果与分析

2.1 地衣的DNA提取结果与分析

图1为所研究的地衣材料的部分DNA电泳图,我们看到提取效果较好,经过琼脂糖凝胶电泳检测,所提取的DNA主条带较清晰,无弥散带,没有明显降解现象,点样孔不发亮,蛋白质、多糖等杂质去除的比较干净,纯度较高。经Genspel检测仪测定其A260/A280的值在1.8左右,说明DNA质量较好。

2.2 地衣的Pcr扩增结果与分析

所研究的地衣材料的ITS序列,其扩增成功率达到了100%。扩增结果的部分电泳图见图2。扩增得到的片段大小在600bp左右,扩增效果较好,条带较亮,没有拖尾现象。

2.3 所得序列的系统发育分析

实验测得的所有样本的ITS序列,使用MEGA4.0软件对其进行了系统发育树的构建,用类平均聚类法进行了系统发育分析,一致性指数CI和维持性指数RI分别为0.5356和0.6602。

广义上的梅衣属地衣迄今已被再分为20多个属,包括黄梅属、皱梅属、梅衣属、星点梅属、扁枝衣属、黄烛衣属、袋衣属、褐梅属地衣等20多个属[11]。依据nr DNA-ITS序列构建的系统发育树(图3)可以看出,梅衣属地衣(Parmelia)的两个样本7和9号与黄梅属(Xanthoparmelia)的3个样本14、24和27号聚类到了一个分支上,其中梅衣属的两个样本7号和9号的遗传距离为0.007,而3号样本则单独分枝,它与7号和9号样本的K-2-P距离分别为0.064和0.063;黄梅属地衣的3个样本14、27和24号之间的K-2-P距离分别为0.007、0.006和0.004;扁枝衣属(Evernia)、皱梅属(Flavoparmelia)及星点梅属(Punctelia)地衣聚类到了一起,其中扁枝衣属与皱梅属地衣间的K-2-P距离为0.067,而星点梅属地衣的两个样本41和46号的K-2-P距离为0.003,它们来自于同一物种,不存在明显的变异,具有相对高的保守性;袋衣属(Hypogymnia)和褐梅属(Melanelia)地衣则聚类到了一起,其K-2-P距离为0.096;黄烛衣属(Candelaria)单独分枝。从广义的梅衣属地衣来看,其所划分的狭义属地衣基本都聚类到了一个大的分枝上,结果表明其亲缘关系较近。

1-4,7-10 Certificate number of speciments,showed in the Table 1.1-4,7-10均为标本凭证号,见表1。

1-4,7-10均为标本凭证号,与表1标本凭证号对应;M为DL2000marker。1-4,7-10 Certificate number of speciments with Table 1’s;M,DL2000marker.

石蕊属(Cladonia)地衣的4个样本也聚类到了一个大的分枝上,其中来自同一物种的33号和10号地衣聚类到了一个分支上,8号和11号地衣则聚类到了另一个分支上,其相互间K-2-P距离范围为0.043~0.062,平均值为0.054;鹿蕊属(Cladona)地衣的两个样本17号和18号也聚类到了一起,它们间的K-2-P距离为0.074,并且石蕊属地衣的四个样本聚类到了一个大的分支上,鹿蕊属与石蕊属地衣间的K-2-P距离为0.086;珊瑚枝属(Stereocaulon)地衣的两个样本1号和2号也聚类到了一起,两个样本间的K-2-P距离为0.056。

双缘衣属(Diplaschistes)地衣的两个样本36号和44号聚类到了一起,并与脐鳞属(Rhizoplacaf)地衣聚类到了一个大的分支上,双缘衣属地衣两个样本间的K-2-P距离为0.017,与脐鳞属地衣间的K-2-P距离为0.084;皮果衣属(Dermatoconpon)、平茶渍属(Aspicilia)与黑蜈蚣衣属(Phaeophyscia)地衣聚类到了一起,相互间的K-2-P距离的平均值为0.365。地卷属(Peltigera)地衣的4个样本16号、20号、22号和31号也聚类到了一起,其样本间的K-2-P距离的平均值为0.012。

哑铃孢属(Heterdermia)地衣则单独分出一个大枝,与其它各属地衣间的K-2-P距离范围是0.900~1.200间,其平均值达到1.052。表明哑铃孢属地衣与其它属地衣间的亲缘关系较远。

3 讨论

DNA条形码(DNA barcoding)作为近年来物种分类进展迅速的学科前沿之一[13]。在大量的实验基础上,结合实际工作认为,DNA片段能否作条形码应符合以下几个特征:片段长度要求足够短,在种的水平上种间变异和分化明显;种内变异足够小,存在保守区,便于使用通用引物扩增;样本DNA的提取和扩增较容易。目前DNA条形码的研究在动、植物中广泛开展,虽然在菌物中的研究相对较晚但也正在陆续地开展,针对目前研究情况,核糖体r DNA-ITS片段成为了菌物DNA条形码的备选片段[12]。

本实验通过合成通用引物成功地扩增了地衣型真菌的核糖体r DNA的ITS序列,利用测序所得的目标序列建立了系统发育树并分析了整个的遗传距离。我们发现以属的水平看,相同属地衣的样本基本都聚类到了一起,自展支持率都在70%以上,例如黄梅属、珊瑚枝属和地卷属地衣;而在不同属地衣之间的样本中,亲缘关系较近的样本间的自展支持率在50%以上,例如黄烛衣属与星点梅属地衣、平茶渍属与黑蜈蚣衣属地衣;亲缘关系较远的样本间的自展支持率基本在50%以下,例如袋衣属和褐梅属地衣。然而从系统发育树来中我们也看到例如梅衣属地衣的3号样本和7、9号样本没有聚类到一起,而脐鳞属与双缘衣属地衣的样本则聚类到了一起。这样就出现了误差,出现误差的原因可能是以下几个方面:(1)序列本身出现了问题;(2)由于实验操作失误引起,例如在提取、扩增或是测序过程中的某个环节发生错误;(3)不小心将样品弄混;(4)扩增出来的这条序列本身就是错的,并非实验所需要的那条目标序列[14]。

4 结论

系统发育分析 第10篇

20-羟基脱皮激素(简称脱皮激素,ecdysone)是无脊椎动物特有的类固醇激素,也是昆虫发育的主要调控因子。脱皮激素涉及到昆虫的许多发育转换过程,包括从幼虫不同龄期间的幼虫脱皮和从末龄幼虫变为蛹和成虫的变态脱皮的发育过程。脱皮激素信号途径与其他发育途径之间存在交联,例如保育激素可能结合超气门蛋白从而下调脱皮激素受体活性［１］;在脱皮激素缺失的条件下,核受体E75A抑制脱皮激素受体基因的表达并且在多个染色体位点取代脱皮激素受体/超气门蛋白［２］。脱皮激素对发育过程的调节效应是通过其核受体,即脱皮激素受体(ecdysone receptor,EcR)与其异二聚体伴侣超气门蛋白(ultraspiracle,USP)所介导［３，４］。EcR/USP复合物在特异的核酸序列上结合到DNA响应元件,促进早期脱皮激素响应基因如E74、E75 的表达从而进一步调节下游的转录级联反应［５］。最近,有文献报道脱皮激素受体能在缺失超气门蛋白USP的情况下调节目标基因的转录［６，７］。

脱皮激素受体属于核受体家族第一亚族类固醇激素受体超家族。脱皮激素受体具有典型的核受体结构,包括转录激活A/B结构域、DNA结合C域、缓和连接的D区铰链结构域、结合配体的E结构域以及高度不保守的F域。六个功能结构域中,转录激活A/B结构域中氨基酸序列保守性低,序列长度和同源性差异较大;C结构域的N端存在固定的锌指结构,可以专门识别DNA;E结构域中存在12个负螺旋反向排列形成的配体结合口袋;仅有少数核受体具有F结构域,它位于负螺旋12的后方,氨基酸序列长度相差很大,推测可能与脱皮激素受体的转录激活功能相关［８］。

到目前为止,一系列脱皮激素受体cDNA全序列已经在昆虫中克隆并研究,如双翅目昆虫［９］、鞘翅类［１０］以及鳞翅类昆虫［１１］。脱皮激素受体基因的表达及其在脱皮过程中的作用已经得到广泛研究。在果蝇中鉴定出三个不同的脱皮激素受体亚型,在不同的目标组织中和不同的发育阶段起主要作用［１２］。在烟草飞蛾(Manduca sexta L)中,脱皮激素受体以两种不同的形式出现,在发育过程中表达也受到调控。在双翅目昆虫和鳞翅类昆虫中,脱皮激素能够通过脱皮激素受体亚型与另外一个受体超家族成员即USP蛋白相结合而发挥作用［１３］。拟黑多刺蚁(Polyrhachisv ic-ina Roger)隶属于昆虫纲(Insecta)、膜翅目(Hyme-noptera)、蚁科(Formicidae)、多刺蚁属(Polyrhachis),是一类典型的营群居生活的社会性昆虫,也是卫生部指定的药食兼用型资源昆虫。拟黑多刺蚁具有高度复杂的神经系统和广泛的多态现象,是研究昆虫发育的常用动物实验材料。本研究采用逆转录PCR方法从拟黑多刺蚁中克隆到脱皮激素受体编码基因PvEcR,通过生物信息学方法对其编码的氨基酸序列进行序列分析,鉴定出脱皮激素受体家族多个典型的保守结构域,通过构建系统发育树对拟黑多刺蚁脱皮激素受体的进化发育关系进行了分析。

1 材料与方法

1.1 材料

PvEcR基因克隆自拟黑多刺蚁,拟黑多刺蚁延边长白山蚂蚁开发研究中心,生长繁殖温度为25~40 ℃,空气湿度40~45%,摄食温度为19~29 ℃,主要食物为蜂蜜和水果等。

1.2 主要仪器和试剂

仪器:DNA电泳仪,DNA凝胶成像系统。

试剂:Trizol Reagent (Invitrogen),Prime-ScriptＴＭ1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara),Pfu DNA聚合酶(Fermentas),Taq DNA聚合酶(Takara),pMD18-T (Takara),RNase-free H２O,DNA胶回收试剂盒(北京全式金公司),氯仿,无水乙醇,异丙醇。

1.3 方法

拟黑多刺蚁取样后冻存于-70 ℃超低温冰箱,加入液氮研磨后用Trizol Reagent提取总RNA。以总RNA为模板,根据PrimeScriptＴＭ1st StrandcDNA Synthesis Kit说明进行逆转录反应得到总cDNA。 以PvEcR-forward (5′-ATGGATAC-CAGCGGCGATTC-3′) 和PvEcR-reverse (5′-CTAGGGCATCACGTCCCAGA-3′)为引物,获得的拟黑多刺蚁总cDNA为模板,进行高保真PCR扩增,扩增程序为:94℃6min;94℃1min,60℃1min,72 ℃ 2min,30个循环;72 ℃ 10min。获得大约1.7kb DNA片段,1%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的条带,DNA片段末端加dATP后再次回收目的片段,连接到pMD18-T后转化到大肠杆菌E.coli DH5,PCR检测阳性克隆后送测序。

2 结果与讨论

2.1 拟黑多刺蚁脱皮激素受体编码基因的克隆及序列

以拟黑多刺蚁总RNA为模板逆转录反应获得的总cDNA为模板,高保真PCR扩增获得1.7kbDNA片段(图1),回收测序,拟黑多刺蚁脱皮激素受体PvEcR编码基因长度为1 737bp。根据起始密码子和终止密码子位置预测开放阅读框及其编码的氨基酸序列(图2),PvEcR共编码578个氨基酸,根据在线生物信息学分析工具(http://web.ex-pasy.org/compute_pi/)预测其分子量大小为63.098×10３,理论等电点为7.41。

注:箭头所指为扩增的目的基因DNA条带Note:Arow indicats the DNA bands of target gene

2.2 拟黑多刺蚁脱皮激素受体蛋白氨基酸序列特征

将拟黑多刺蚁脱皮激素受体蛋白氨基酸序列在NCBI蛋白数据库中进行Blast,搜索保守结构区域,结果鉴定出6 类保守结构区域,包括Zinc bindingsite,ligand binding site,heterodimer interface,putative coactivator recognition site以及DNAbinding site(图3)。对于大多数同源蛋白来说,保守区域即为功能结构域,在蛋白的底物特异性、蛋白相互作用以及其他生化特性上起着非常重要的作用。拟黑多刺蚁脱皮激素受体蛋白与其他昆虫中鉴定的脱皮激素蛋白在氨基酸序列上的同源性高达70%以上。

由于脱皮激素受体蛋白在激素信号途径中起着重要作用,我们也利用在线预测工具(http://www.dabi.temple.edu/disphos/)对PvEcR蛋白序列进行磷酸化位点预测,共检测48个可能的磷酸化位点,包括34个磷酸化serine,8个磷酸化的threo-nine以及6个磷酸化的tyrosine(图4)。核受体蛋白家族一般具有多个磷酸化位点,可以通过蛋白激酶或磷酸酶对位点进行不同程度地修饰,调节RcR活性,进而参与调节体内的多种生化反应,因此这些磷酸化修饰在受体蛋白翻译后调控上具有重要的生物学意义。

将5种不同蚁种来源的脱皮激素受体蛋白序列进行比对,发现脱皮激素受体蛋白N端保守性较低,而C端保守性相对较高(图5)。拟黑多刺蚁脱皮激素受体蛋白与其他4种蚁脱皮激素受体蛋白在氨基酸序列上的同源性在70%以上,蛋白序列上的高保守性提示,蚁类甚至昆虫的脱皮激素受体蛋白调控发育的功能及其信号通路可能具有较大的相似性。

2.3 拟黑多刺蚁脱皮激素受体蛋白的系统发育关系

为了研究脱皮激素受体蛋白系统发育特征,本文采用Mega 4.0软件分析了拟黑多刺蚁脱皮激素受体蛋白PvEcR以及从GenBank上下载的16 个昆虫脱皮激素受体蛋白的全长氨基酸序列的进化关系。利用邻接法构建的无根系统发育树显示蚁类脱皮激素受体蛋白在亲缘关系上与其他蜂类和蚜虫等昆虫的脱皮激素受体蛋白明显分离,形成一个独立的大分支(图6),这个大分支包括来源于广大头蚁、切叶蚁、小黄家蚁、埃氏扁胸切叶蚁、黑毛蚁、毕氏粗角猛蚁、佛罗里达弓背蚁、阿根廷蚂蚁、印度跳蚁以及拟黑多刺蚁的脱皮激素受体蛋白。在蚁类大分支中,尽管bootstrap支持率为48%,拟黑多刺蚁EcR与佛罗里达弓背蚁EcR却表现出最近的亲缘关系。在其他昆虫种类中,熊蜂和云南小蜜蜂EcR形成一个小分支,菜叶蜂和毁侧沟茧蜂EcR形成一个小分支,灰飞虱和美洲大蠊EcR形成一个小分支,而豌豆蚜虫EcR与这些昆虫的亲缘关系最远,形成一个独立的分支。EcR分支系统发育树分析不仅反映脱皮激素受体蛋白来源物种的地理分布特征,还能说明EcR在进化上的遗传相关性。

注：ＰｍＥｃＲ：广大头蚁脱皮激素受体蛋白；ＭｐＥｃＲ：小黄家蚁脱皮激素受体蛋白；ＡｅＥｃＲ：切叶蚁脱皮激素受体蛋白；ＰｖＥｃＲ：拟黑多刺蚁脱皮激素受体蛋白；ＬｎＥｃＲ：黑毛蚁脱皮激素受体蛋白Note:PmEcR:ecdysone receptor fromPheidole megacephala;MpEcR:ecdysone receptor from Monomorium pharaonis;AeEcR:ecdysone receptor fromAcromyrmex echinatior;PvEcR:ecdysone receptor from Polyrhachis vicina;LnEcR:ecdysone receptor fromLasius niger

注:PmEcR:广大头蚁(Pheidole megacephala)EcR;AeEcR:切叶蚁(Acromyrmex echinatior)EcR;MpEcR:小黄家蚁(Monomorium pharaonis)EcR;VeEcR:埃氏扁胸切叶蚁(Vollenhovia emeryi)EcR;LnEcR:黑毛蚁(Lasius niger)EcR;CbEcR:毕氏粗角猛蚁(Cerapachys biroi)EcR;PvEcR:拟黑多刺蚁(Polyrhachis vicina)EcR;CfEcR:佛罗里达弓背蚁(Camponotus floridanus)EcR;LhEcR:阿根廷蚂蚁(Linepithema humile)EcR;HsEcR:印度跳蚁(Harpegnathos saltator)EcR;BtEcR:熊蜂(Bombus terrestris)EcR;AfEcR:云南小蜜蜂(Apis florea)EcR;ArEcR:菜叶蜂(Athalia rosae)EcR;MdEcR:毁侧沟茧蜂(Microplitis demolitor)EcR;LsEcR:灰飞虱(Laodelphax striatella)EcR;PaEcR:美洲大蠊(Periplaneta americana)EcR;ApEcR:豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)EcRNote:PmEcR:Pheidole megacephala EcR;AeEcR:Acromyrmex echinatior EcR;MpEcR:Monomorium pharaonis EcR;VeEcR:Vollenhovia emeryi EcR;LnEcR:Lasius niger EcR;CbEcR:Cerapachys biroi EcR;CfEcR:Camponotus floridanus EcR;LhEcR:Linepithema humile EcR;HsEcR:Harpegnathos saltatorEcR;PvEcR:Polyrhachis vicina EcR;BtEcR:Bombus terrestris EcR;AfEcR:Apis florea EcR;ArEcR:Athalia rosae EcR;MdEcR:Microplitis demolitor EcR;LsEcR:Laodelphax striatella EcR;PaEcR:Periplaneta americana EcR;ApEcR:Acyrthosiphon pisum EcR

3 结论

系统发育分析 第11篇

关键词 植物；雌雄同株；雌雄异株；分子机制

中图分类号：S-3 文献标志码：A 文章编号：1673-890X（2014）15-0-02

植物性别的产生是植物在漫长的进化过程中，随着植物的形态、结构和机能适应自然环境变化和发展，特别是繁殖方式的演变而产生的。植物的性别源于有性繁殖。有性繁殖是植物遗传物质交换、变异以及多样性的主要来源，它导致了植物性器官的产生与形成及两性异型进化。因此，植物的性别决定具有不稳定性和多样性的特点，彻底揭示其机制难度较大，目前已经成为基因组学、染色体组学、进化遗传学和发育遗传学的研究热点。与有性生殖相联系的是生物雌雄性别的分化，包括两个阶段：性别决定和性别分化。植物的性别决定由基因、环境和激素协同调控的动态过程，性别表型决定机制具有多样性。

1 植物雌雄异株的性别决定分子机制

雌雄异株植物，是指在具有单性花的种子植物中，雌花和雄花分别生长在不同植株上。被子植物中有959个属（占7%）有雌雄异株现象，大约有14620个物种（占6%），具有雌雄异株的性系统。

雌雄异株植物是性别决定机制及演化的重要研究材料，而通过现代分子生物学的相关技术，分离出性别决定的相关基因是揭示雌雄异株植物性别决定的关键问题之一。虽然，近年来已经分离出很多性染色体的连锁基因，但还没有发现明确的证据，来证明这些是决定雌雄异株植物性别的关键因素。近10年来，已经分离到的这些基因都存在于性染色体上，但是，对其功能分析发现这些基因并不是性别决定的关键基因，而是其性别决定控制系统中的成员之一。Delichere等利用染色体微分离的方法从白麦瓶草雄花建立的cDNA文库中筛选出了与性别控制相关的基因SLY1。Moore等从白麦瓶草中，还分离得到了另一个染色特连锁的基因DD44（differential display44）。Matsunaga等通过差异筛选雌雄花蕾的cDNA文库，发现了4个MROS基因。它们在植物的雄性器官中特异性表达。Okada等从地钱中也发现了Y染色体上的雄性特异基因，其编码的162个氨基酸的蛋白质包含一个环指区，并且，该基因只在雄性性别器官中特异性表达，且这些序列是独立的。但是，上述基因都缺乏有力证据证明其是植物性别发育的起决定性作用的关键基因。

2 植物雌雄同株的性别决定分子机制

在雌雄同株植物中，黄瓜和甜瓜是其典型代表，也是进行性别决定研究的模式植物，它们的性别受到基因型、环境条件以及植物激素等影响。下面针对黄瓜及甜瓜的性别决定分子机制，进行简要分析。

黄瓜是一种常见蔬菜，不仅是我国首要保护的蔬菜作物，还是农村致富及农民增收的重要产业之一。农作物高产优质的主要原动力，就是新品种的培育，想要达到黄瓜优势育种的目的，一个重要的途径就是全雌系或者强雌系品种。黄瓜具有丰富多彩的性型表现，从而使它成为研究高等植物性别决定的模式植物，其中黄瓜的性型主要有以下几种：雌雄异花同株；纯雌株；两性株；雄花两性花同株；三性株。然而，在葫芦科中，甜瓜是一种重要作物，其性别遗传也相对比较复杂，有以下几种：雄花两性花同株；雌花两性花同株，简称雌全同株；雌雄同花同株；全雌性花株；雌雄异株及三性花同株等。此外，植物性别决定机制有多种因素，即遗传、环境因子、植物生长物质（激素）。比如黄瓜，其遗传因素、长日照以及赤霉素等可促进雄花产生，而短日照、低温和生长素等可促进雌花产生等。

3 甜瓜及黄瓜的性别决定分子机制

3.1 甜瓜性别决定分子机制

甜瓜的性别决定机制主要受到两对基因控制，即Andromonoecious（A/a）和Gynoecious（G/g），两者之间相互作用，进而形成多种多样的性别类型，如雌雄单性同株（A-G-），雄花两性花同株（aaG），全雌株（AAgg），两性花株（aagg）等，Martin等对甜瓜中2个性别决定基因之间的关系进行研究，其中基因为CmACS-7及CmWIPI，结果发现CmWIPI基因能够调控CmACS-7的表达，其中CmACS-7是Boualem等通过相关研究而命名的，即利用图位克隆的方法，在14kb的区段内放入两性花基因A（a），在此区段中仅有一个基因，并且该基因能够编码一个ACC合成酶，此酶是乙烯合成的关键酶，进而将其命名为CmACS-7。在甜瓜性别决定过程中，CmACS-7位于CmWIPI下游，综合相关试验结果，Marin等提出这样一个观点，即一个甜瓜性别决定的调控模型。花原基中心皮的发育可受到CmWIPI抑制，并且CmWIPI也能够间接抑制CmACS-7基因的表达，促进雄蕊的发育，从而使植株产生雄花。此外，甲基化失活的mWIPI基因，或者功能缺失突变的CmWIPI基因，不仅能够促进花原基中心皮的发育，而且也可以将CmACS-7基因的抑制进行解除，而雄蕊的发育也会受到CmACS-7基因表达的抑制，最终使植株产生雌花。然而，根据这种情况，倘若CmACS-7基因出现功能突变现象，则可解除对雄花的抑制作用，进而产生两性花。

3.2 黄瓜性别决定分子机制

3.2.1 基因

影响黄瓜性别的因素主要有基因、植物激素和环境条件等。黄瓜性别不仅受到基因的影响，而且还会决定基因模型。（1）影响黄瓜性别决定因素。其基因主要有F、A、M，其中F基因是半显性的，同时，发挥着重要的作用，即加强雌性，使雌性能够快速发育，并让雌花向低节位发育。而M基因的作用是抑制雄花的发育，但是，M基因在抑制过程中，不会影响花在植株上的排列以及分布。A基因能够增强雄性，抑制雌花的发育，可在F基因上产生上位效应。黄瓜性别决定由于受到F、M、A基因的影响，从而产生各种性别表型，如全雌花基因型为F-M-AA/Aa/aa，雄花两性花为mm ff A-，雌雄异花同株为ff M-A-，纯雄株为ff M/Mm/mm aa。（2）黄瓜性别决定基因模型。对黄瓜性别决定机制的研究，其起步相对比较早，同时早已具有大量研究资料显示其关键的调节因子就是乙烯。据Yin、Quinn及Ya ma saki等将“一种激素调节假说”进行提出，并不断完善，换言之，将全雌性状的F基因进行有效控制，并将植物内源乙烯水平进行调节，进而促进雌蕊原基的发育。显性M基因主要控制单性花性状，即利用乙烯进行抑制雄花原基的发育，当植株以mm作为纯合基因型的时候，则就不能顺利传导乙烯的信号，无法有效抑制雄蕊的发育，进而产生两性花。按照此假说，大多数的人们均认为F基因参与了乙烯的合成途径，同时，也可能成为乙烯合成途径中的一种重要酶基因；而M基因也参与乙烯信号传导过程中，且可能成为乙烯受体。endprint

但是，随着F基因以及M基因相继被克隆，相关研究人员发现其产物均为一种ACC合成酶，两者都参与于乙烯合成过程中。由此可见，这些研究进展给予“一种激素调节假说”带来新的挑战，并提出一些问题，就是两者之间是如何相互作用，从而实现黄瓜性别决定。针对这一问题，Li等进行相关研究，把CsACS2基因转化为烟草，当利用35S启动子过量表达CSACS2基因的时候，则把转化株体内乙烯的产量进行增加，进而使节间缩短以及开花推迟等。但是当利用CsACS2自身启动子连接基因，且成功转化之后，在转化株中，则无法检测出CsACS2转录本，而植株内源乙烯的含量也没有发生任何变化；此外，当利用外源乙烯处理转化株之后，则可以将CsACS2基因的表达进行检测；同理，当利用乙烯处理黄瓜时，也能够将CsACS2基因的表达进行诱导，反之，利用乙烯抑制物AgNO3以及氨基乙氧基乙烯甘氨酸处理黄瓜，能够把CsACS2基因的表达进行降低。据Li等进一步分析CsACS2基因启动子，可知，其包含两个乙烯相应原件，由此可推测出这两个顺式作用元件参与乙烯对CsACS2基因表达调控的概率相当高，且表明黄瓜性别决定基因模型，具体如下：一是F基因和M基因均能编码ACC合成酶，两者之间相互作用，并以此产生雌花、雄花及两性花。二是雌花在发育过程中，当F基因首先被激活后，可产生乙烯，而此乙烯可促进雌蕊原基的发育，并且乙烯能够将M基因进行正反馈调节和激活，同时M基因在表达中产生的乙烯，可抑制雄蕊原基的发育，进而产生雌花。三是在雄花发育过程中，F基因无法被激活，则就不能产生足够的乙烯，同时也不能通过正反馈调节来促进M基因的表达，使雌花原基难以发育，当无法抑制雄花原基时，则可发育成雄花。四是针对F-mm基因型植株，其F基因能够被正常激活和表达，其中产生的乙烯可促进雌花原基的发育。但是，由于m基因发生突变，失去ACC合成酶的功能，进而不能产生足够的乙烯，也就无法抑制雄花原基的发育，最终产生两性花。

3.2.2 植物激素

在黄瓜性别决定过程中，除了基因之外，还有植物激素，植物激素和黄瓜性别之间存在一定的联系。植物的基因型能够受到赤霉素和乙烯或者它们的抑制剂的影响而发生改变，赤霉素主要的作用是促进雄性，而乙烯是促进雌性。利用两性系及雄全同株系黄瓜进行处理不同组合的乙烯与赤霉素，Yin与Quinn认为黄瓜性别决定的主要因素就是乙烯，同时，赤霉素可能是内源乙烯产生的抑制因子之一，如此一来，他们又提出一个性别决定产生的模型，即乙烯不仅能够促进雌性，而且也能够抑制雄性。这种模型的具体内容如下：F基因可能会编码一种物质，而这种物质可将内源乙烯在植株上的生成量和分布进行决定，并且能在植物体上发挥一定的作用，该作用就是促进雌性，然而，M基因也能编码一种物质，这种物质属于乙烯敏感的雄性受体因子，可通过感知乙烯信号而抑制雄蕊的发育。植物的“性激素”实质指乙烯，而其他激素生长素或者油菜素内酯，则被认为是影响乙烯信号传递或者合成的因素，其影响具有直接性和间接性等特点，且也可利用这些激素进行调控植物性别的分化。

4 结语

植物性别发育研究是一门具有生产实践意义的研究方向，也是研究植物性别决定机制的重要思想。如甜瓜和黄瓜等。此外，随着植物性别决定机制的研究不断深入，某些关键基因已经实现克隆，同时也提出性别决定基因互作模型，但是，由于性别决定具有一定的复杂性，所以还需要深入研究。

系统发育分析 第12篇

关键词：盘羊,家绵羊,细胞色素b,系统发育

家绵羊起源于野绵羊,约11000 年前在西南亚开始驯化、迁徙、传播,广泛分布世界各地[1]。现普遍认为与家绵羊亲缘关系较近的野绵羊有摩佛伦羊、盘羊、赤盘羊、东方盘羊等,目前研究证明,仅欧洲摩佛伦羊可能是家绵羊的母系( 世系B) 野生祖先之一[2]。未发现羱羊、盘羊和东方盘羊对家养绵羊有遗传贡献的证据[3]。

JRS Meadows等[4]研究了已发现的5 个单倍型群体( HA、HB、HC、HD和HE) 与野生羊( 摩佛伦羊、乌利尔羊、盘羊) 的遗传关系,结果表明,Mouflon与HB( 土耳其两个品种) 聚在一起。此研究并不支持乌利尔羊和盘羊是现代绵羊的母系祖先,但通过聚类分析盘羊与家养绵羊的遗传距离比乌利尔羊更近,又给科研工作者寻求盘羊对家养绵羊的母系贡献留有一定的希望[5]。

郭军和赵倩君对中国部分绵羊群体mt DNA D- loop研究发现中国绵羊至少有3 个母系起源( A、B和C进化枝) ; 另外发现了一个新的进化枝D,阿勒泰绵羊、晋中绵羊和浪卡子绵羊在D进化枝[6]。

线粒体DNA是动物体内唯一存在的核外遗传信息载体,为双链的闭合环状分子,具有分子量小、结构简单稳定、不与组蛋白结合而裸露、易于提取、母系遗传、进化速度快( 是核基因的5 ~ 10 倍) 、独立复制、基本无重组、基因排列紧凑、无内含子等特性,成为研究动物起源进化、种间和种内系统发生关系的理想分子标记。细胞色素b( cytb) 基因是线粒体内编码蛋白质的重要基因,在呼吸链电子传递过程中发挥重要作用,其进化速度适中低于D - loop,因此被广泛应用于种内到种间甚至科间系统发育研究。

帕米尔盘羊是盘羊所有亚种中最大的一种,又称马可波罗盘羊( O. a. poloi) ,在新疆境内阿勒泰山、天山、昆仑- 阿尔金山和帕米尔高原均有分布[7],与新疆家绵羊存在生态位重叠,为进一步验证假设: 野生绵羊对现代家绵羊有遗传贡献。本文通过非损伤采样( 粪便) 提取盘羊基因组,测定cytb基因全序列,研究帕米尔盘羊对新疆地方家绵羊有无遗传贡献,继而了解它们的遗传多样性及系统进化情况,对今后合理利用和开发野生动物资源,培育杂交新品种等提供基础资料和科学依据。

1 材料与方法

1. 1 材料

1. 1. 1 试验材料

取盘羊( 帕米尔盘羊) 粪便( 采集地点: 喀什市动物园) 于离心管中,冰袋保存立即带回实验室。分装加入无水乙醇,编号后,放进冰箱- 40℃ 中保存。家绵羊共包括4 个品种分别为多浪羊(Duolang、1 -30 样) 、哈萨克羊( Kazakh 31 - 40 样) 、哈萨克羊( 伊宁市) ( Kazakh 、41 - 47 样) 、盘羊( O. a. poloi、48 -53 样,注: 48 - 51 为一只雄性盘羊,52、53 为雌性盘羊) 。柯尔克孜羊( Kerkezi、54 - 75 样)。

1. 1. 2 试剂

粪便基因组DNA快速提取试剂盒购自北京三博远志生物技术有限责任公司; Taq DNA聚合酶、d NTP均为全式金公司产品; 琼脂糖为Biowest公司产品。

1. 2 方法

1. 2. 1 总DNA提取

盘羊总DNA的提取是利用粪便基因组DNA快速提取试剂盒( 北京三博远志生物技术有限责任公司) ,采用苯酚/氯仿抽提法和乙醇沉淀法提取绵羊血液总DNA。

1. 2. 2 PCR扩增及测序

依照文献[8]所用引物PCR扩增cytb基因全序列。引物序列上游: 5' - ACACCCAACCCCACCAC -3'; 下游: 5' - GTGGGTGGTTGTGCTTTTCT - 3'。委托北京三博远志生物技术有限责任公司合成,期望扩增长度约1 625 bp,包含cytb基因的1 140 bp。

PCR反应体系总体积为50 μl: (1) 盘羊总DNA2. 5 μl( 约60 ng / μl) 、6 × buffer( 含Mg2 +) 5 μl、上下游引物各1 μl、2. 5 mmol/L d NTPs 4 μl、Taq DNA聚合酶0. 75 μl、去离子水35. 75 μl。(2)绵羊总基因组4 μl ( 50 ng /μl) 、6 × buffer( 含Mg2 +) 5 μl、上下游引物各1 μl、2. 5 mmol/L d NTPs 4 μl、Taq DNA聚合酶1 μl、去离子水34 μl。

PCR反应条件为: (1) 盘羊: 94℃ 预变性5 min;94℃ 变性30 s,60℃ 退火40 s,72℃ 延伸1 min,35 个循环; 最后72℃ 再延伸10 min,4℃ 保存。(2)绵羊:94℃ 预变性5 min; 94℃ 变性40s,59. 5℃ 退火40 s,72℃ 延伸1 min,35 个循环; 最后72℃ 再延伸10min,4℃ 保存。

将PCR扩增产物经1% 琼脂糖电泳检测后送由北京三博远志生物技术有限责任公司进行测序( 测通) 。

1. 2. 3 数据分析

应用Clustal X( 1. 83) 软件进行序列比对并手工校对。Dnasp5 软件计算单倍型多样度、核苷酸多样度、多态位点、核苷酸总变异位点、简约信息位点和点突变位点等。MEGA6. 06软件分析变异位点,计算碱基组成、转换/颠换比( Ts/Tv) 、核苷酸差异和序列差异,采用邻接法( Neighbour - joining) Kimura双参数模型计算群体间遗传距离并构建系统发育树,对拓扑图进行重复抽样1 000 次的自展检验( Bootstrap) 。

2 结果与分析

2. 1 盘羊基因组DNA琼脂糖电泳

3 个盘羊个体基因组DNA提取经去离子水稀释,1% 琼脂糖凝胶电泳后见图1。

由图1 看出条带较为清晰,无拖带现象,DNA有较高纯度、浓度,可作为PCR扩增模板。

2. 2 盘羊cytb基因PCR扩增琼脂糖检测结果

PCR扩增结果经1% 琼脂糖凝胶电泳检测,结果见图2。

由图2 可以看出各泳道均扩增出目的条带( 第2 条带弱) ,估计大小为1 700 bp,没有杂带产生,可进行测序分析。

2. 3 cytb基因碱基序列分析

经测序比对筛选得到61 条序列,同源比对并去

注:第1泳道为Marker,第2~4泳道分别为盘羊51、52、53。Note:Lane 1 is a Marker;Lane 2-4 is 51,52,53 of O.a.poloi.

除上下游非cytb基因序列后得到1 140 bp的cytb全基因序列,帕米尔盘羊cytb基因A、T、C、G含量分别为31. 7% 、26. 6% 、28. 9% 、12. 8% 。A + T的含量为58. 3% ,明显高于G + C的含量41. 7% ,碱基组成表明了G的相对缺乏。其中密码子第3 位上G的含量最低,仅为2. 5% ; 第3 位的A含量较高,为43. 5% 。

新疆地方家绵羊cytb基因A、T、C、G含量分别为31. 5% 、27. 1% 、28. 5% 、12. 9% 。A + T的含量为58. 6% ,明显高于G + C的含量41. 4% ,碱基组成的百分比也印证了G的相对缺乏。其中密码子第3 位上G的含量最低,仅为3. 2% 。在家绵羊cytb基因中,密码子的使用也存在一定差异,在密码子的第1位上4 种碱基使用较为均衡; 密码子第2 位上碱基T的含量高达42% ,碱基G的含量低至13. 7% ; 密码子第3 位上碱基A的含量高达42. 6% 。

2. 4 cytb基因遗传变异分析

在盘羊中检测到38 个多态位点( 图3) ,均为单态位点,同义突变位点数31,非同义突变位点数7。38 个多态位点被定义为3 个单倍型,单倍型多样度( Hd) 为0. 6 ± 0. 04630,核苷酸多样度( Pi) 为1. 111% ,核苷酸差异数( k) 为12. 667。转换颠换比为36. 81。

在新疆地方家绵羊共检测到43 个多态位点( 图3) ,其中包括27 个单态位点,16 个简约信息位点。同义突变位点数27 个,非同义突变位点数14 个。43 个多态位点被定义为23 个单倍型,单倍型多样度( Hd)为0. 889 ±0. 00102,核苷酸多样度( Pi) 为0. 521% ,核苷酸差异数( k) 为5. 919,转换颠换比为18. 362。

2. 5 系统发育分析

结合Gen Bank上的欧洲摩弗伦羊( HM236184.1) 、家绵羊( NC_001941. 1) 、A世系( HM236174 - 5) 、B世系( HM236176 - 7) 、C世系( HM236178 - 9) 、D世系( HM236180 - 1) 、E世系( HM236182 - 3) 序列,以及本实验所得序列,采用邻接法构建家绵羊、帕米尔盘羊和摩弗伦羊间的系统发育树( 图4) 。

由图4 看出,帕米尔盘羊被聚类到最外侧,欧洲摩弗伦羊与家绵羊B世系聚在一起,表明摩弗伦羊与家绵羊有较近亲缘关系,对世系B有遗传贡献。未发现盘羊对绵羊祖先有遗传贡献的分子证据。但是53 号样品与家绵羊世系B聚在一起,其结果有待进一步重复和验证。新疆地方绵羊至少有4 个世系分别为世系A、B、C、D。世系D在多浪羊中首次被发现。世系A比例最高,与世系A主要分布于亚洲绵羊群体的结论一致。

2. 6 盘羊与绵羊遗传距离分析

利用MEGA6. 06 软件Kimura双参数法估算种间遗传距离( 表1) ,利用MEGA软件中Test Neighbor -joining Tree构建群体间遗传距离发育树( 图5) 。

由表1 可知,盘羊与家绵羊的种间遗传距离为0. 026 ~ 0. 029,家绵羊间的遗传距离为0. 006 ~0. 008。

由图5 可知,盘羊与家绵羊的遗传距离较远,柯尔克孜羊与哈萨克羊关系较近,多浪羊次之。

3 讨论

3. 1 氨基酸变化分析

Kikkawa Y( 1995) 研究发现cytb基因序列51 个核苷酸和11 个氨基酸差异[9]。但是S Hiendleder( 1998) 研究发现cytb基因序列有2 个核苷酸差异,没有发现氨基酸差异[10]。王欣( 2006) 的研究发现第1 095 位点的A转换为G导致编码氨基酸由异亮氨酸变为甲硫氨酸,但本实验未发现此现象。

3. 2 转换颠换比分析

实验所得绵羊、盘羊cytb基因变异发生在第1、第2 和第3 密码子分别为17. 1% 、14. 6、68. 3% ;8. 9% 、6. 7% 和84% ; 此结果与理论相一致,由于密码子第3 位点上的碱基突变因受到较小的选择压力而易突变、易固定,而第1、2 位点上的突变则相反。绵羊和盘羊变异位点转换颠换比分别为36. 81、18. 361,远大于李栋元( 2011 ) 研究兰州大尾羊的2. 8[11],这表明了在亲缘关系近的分类水平上转换对解决进化关系是发挥重要作用。同时在碱基替换中存在转换偏倚; 绵羊、盘羊的转换颠换比大于转换颠换比的临界值2[12],这说明了新疆地方绵羊和帕米尔盘羊cytb基因序列的突变可能未达到饱和状态,随着遗传差异增加,转换趋于饱和。

3. 3 基因多样性分析

绵羊cytb基因核苷酸多样度( Pi) 为0. 521% ,低于赵倩君( 2010) 的0. 805%[13]、王昕( 2006) 的0. 602% 、张传生( 2004) 的0. 85%[14],更低于郭彦斌( 2012) 研究D - loop区的2. 02%[15]、牛华锋( 2011)的1. 475%[16],和笔者( 2014) 的2. 415%[17],高于李祥龙( 2006) 应用RFLP标记研究多浪羊mt DNA的0. 192%[18],可见cytb基因相对D - loop区保守,其结果表明新疆地方绵羊遗传多样性中等。

3. 4 系统进化分析