食管癌细胞范文（精选8篇）
食管癌细胞 第1篇
我国传统医学对肿瘤治疗有悠久历史。近年来, 其功能多、药效持久、提高免疫力的优势逐渐为人们所重视。有些中药本身就具有杀肿瘤细胞的作用,如白花蛇舌草、获术。蟾蜍灵存在于蟾蜍耳后腺分泌的白色浆液中,是药蟾酥的的毒性成分之一,因具有解毒、强心、止痛的药理作用,被临床广泛应用。 近年来临床观察提示,含有蟾蜍毒素的中药制剂对肺癌、肝癌、白血病等具有显著的抑制作用。但其对食管癌的作用机制研究甚少。
细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regu lated protein kinases,ERK)是丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase,MAPK) 超家族中的一员,通过瀑布样的三级酶促级联反应,即Ras→ Raf→MEK→ERK将细胞外刺激转导至细胞核内, 从而参与并调节细胞生长、发育及分裂。多数研究发现,ERK信号通路的异常在恶性肿瘤的发生和肿瘤侵袭转移过程中起重要作用。Raf-1是Ras/Raf/ MEK/ERK信号途径中的重要一员,磷酸化并活化Raf1可进一步活化MEK,MEK又可磷酸化并活化ERK,ERK继续磷酸化不同的胞浆及胞核蛋白,最终将生物信号传导至细胞核。通路中任何一个基因出现异常,都可能导致ERK的异常活化,这与肿瘤的生长、转移、预后及治疗密切相关。
本实验通过研究蟾蜍灵对食管癌细胞株的迁移、趋化运动和ERK上游Raf蛋白激酶表达及活化水平的影响,进一步探讨蟾蜍灵在ERK通路中抗肿瘤作用机制,为食管癌的治疗方案提供新的思路。
1材料与方法
1.1材料
食管鳞状细胞癌TE13细胞株由河北省四院肿瘤研究所惠赠。细胞常规培养,实验组为含有10、25、 50和100 nmol/L蟾蜍灵培养液的细胞。对照组为无药物培养液的细胞。
1.2试剂
胎牛血清购自杭州四季青公司,胰蛋白酶购自美国Sigma公司,青霉素、链霉素购自华北制药,蟾蜍灵购自上海源叶生物科技有限公司,RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司,噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)、 二甲基亚 砜 (dimethyl sulfoxide,DMSO) 购自碧云天生物技术研究所,兔抗Raf-1多克隆抗体、兔抗磷酸化Raf-1 (p-Raf-1)多克隆抗体购自北京博奥森生物有限公司,辣根过氧化物酶标记羊抗兔Ig G、聚偏氟乙烯 (polyvinylidene fluoride,PVDF) 膜购自美国Santa Cruz公司,预染蛋白分子量marker、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)、苯甲磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒、十二烷基磺酸钠(sodium dodecylsulfate,SDS)、甘氨酸(glycine,Gly)、Tween 20、丙烯酰胺、过硫酸铵购自上海生工生物工程有限公司, DAB显色试剂盒、通用性二抗购自北京中杉生物技术有限公司。
1.3方法
1.3.1细胞培养与传代食管鳞状细胞癌TE13细胞在含有10%胎牛血清的细胞培养瓶中,置于5%二氧化碳CO2,37℃培养箱内培养,传代1次 /2~3 d。
1.3.2 MTT法检测取对数生长期细胞接种于96孔板,温箱中孵育。待细胞铺满孔板后,分别加入0、 10、25、50、100、200、400和800 nmol/L的蟾蜍灵。使用无药培养液(无细胞)为对照组,每种浓度均设3个复孔。加入MTT 10μl(终浓度为0.5 mg/ml),放入培养 箱中培养4 h。 离心之后 , 加入DMSO 100μl,37℃振荡10 min。在492 nm波长下,用酶联免疫检测仪检测每孔样本的吸光度(optical density, OD)。每个样本设3个孔,重复4次,取平均值定为最终结果。计算增殖抑制率、半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)值、药物最大无毒浓 度和半数 中毒剂量 (median toxic dose, TD50)。TD50(%)=(蟾蜍灵组OD值 / 对照组OD值)×100%,>50%的药物浓度即TD50。
1.3.3细胞划痕实验将高压灭菌后的载玻片置于6孔板内,调整细胞浓度为每孔2×104个,常规培养待细胞长到约90%时,用20μl移液器枪头比着灭菌后的直尺做“一”字划痕,PBS冲洗。每孔加入含1 ml含10%牛清的RPMI 1640培养基培养,然后分别加入浓度为0、10、25、50和100 nmol/L的蟾蜍灵存储液。温箱中常规培养24 h后,甲醛溶液固定6孔板内的细胞20 min,进行HE染色,在显微镜下观察细胞的迁移。
1.3.4 Boyden小室实验将载玻片置于6孔板内, 调整细胞浓度为每孔2×104个,加入不同溶度的蟾蜍灵(0、10、25、50和100 nmol/L),培养后取600μl分别接种于6孔板的改良Boyden小室内,常规孵育24 h后,甲醛固定20 min,进行HE染色。400倍光镜下分别取上、下、左、右、中心5个视野,对滤膜下室面进行细胞计数,取均数,重复5次。
1.3.5免疫组织化学检测取对数生长的细胞,以2×104个 /ml接种于载玻片的6孔板中,温箱中培养。 当6孔板内培养的细胞生长至80%~90%融合状态时,换用无牛清的RPMI 1640培养基,常规培养12 h。 加入不同溶度(0、10、25、50和100 nmol/L)的蟾蜍灵, 继续培养2 h。取出载玻片滴加Raf-1及p-Raf-1一抗,室温孵育4 h。滴加生物素化二抗,滴加DAB,显微镜下控制DAB显色,400倍光镜下观察结果,每张切片随机观察5个视野,阴性对照用PBS替代一抗, 共记数100个细胞,计算阳性细胞百分率。
1.3.6 Western blot检测用细胞裂解液裂解各组细胞,50μg/ 孔取样本,经电泳分离后电转移至PVDF膜上。将PVDF膜浸入5%脱脂奶封闭3 h,加一抗4℃ 孵育过夜,二抗室温置摇床平缓摇动2 h。TBS洗膜1次,5 min后DAB显色。通过Alphaease凝胶成像系统分析产物,对各个条带的灰度值进行测量,结果以目的条带的IDV与相对应的 β-action扩增条带的IDV比值表示。
1.4统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,用方差分析,计数资料用 χ2检验、非参数的秩和检验,P <0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1MTT法检测比较
0、10、25、50、100、200、400和800 nmol/L蟾蜍灵干预24 h后,平均OD值分别为0.991、0.869、 0.735、0.561、0.499、0.371、0.265和0.258,TE13细胞的增殖抑制率随蟾蜍灵浓度的增加而逐渐升高(见图1)。IC50为107.20 nmol/L,TD50为100.00 nmol/L。
2.2不同溶度蟾蜍灵对TE13细胞株迁移能力的影响
划痕后加入血清,细胞迁移能力显著加强。加入蟾蜍灵后,细胞迁移受到抑制,表明蟾蜍灵对TE13细胞株的迁移能力有影响,其迁移能力随着蟾蜍灵浓度的增加而降低。见图2。
2.3不同浓度蟾蜍灵对TE13细胞株趋化能力的影响
Boyden小室实验可以通过检测癌细胞穿透滤膜的能力,间接反映癌细胞的侵袭能力。0、10、25、50和100 nmol/L蟾蜍灵处理后的食管癌细胞穿过滤膜细胞数分别为 (164.23±3.15)、(160.75±5.46)、 (131.84±4.12)、(83.39±2.41)和(54.36±3.19)。结果显示,蟾蜍灵组(25、50和100 nmol/L)穿过滤膜细胞数与对照组比较差异有统计学意义(P <0.05)。说明蟾蜍灵对食管癌细胞的趋化能力有抑制作用。25、 50和100 nmol/L蟾蜍灵组的穿过滤膜细胞数比较, 差异有统计学意义(P<0.05)。说明蟾蜍灵在抑制TE13细胞株的趋化能力上存在着一定的剂量依赖关系。
2.4不同浓度蟾蜍灵对TE13细胞Raf-1、p-Raf-1蛋白表达的影响
Western blot结果表明,0、10、25、50和100 nmol/L蟾蜍灵作用后,TE13细胞中Raf-1蛋白的表达量分别为(0.74±0.06)、(0.75±0.04)、(0.75±0.04)、 (0.75±0.04)和(0.75±0.06),蟾蜍灵组Raf-1蛋白的表达量与对照组比较差异无统计学意义(P >0.05)。 0、10、25、50和100 nmol/L蟾蜍灵作用后,TE13细胞中p-Raf-1蛋白的表达量分别为 (0.75±0.01)、 (0.73±0.06)、(0.68±0.16)、(0.46±0.08)和(0.36± 0.02),蟾蜍灵组(25、50和100 nmol/L)p-Raf-1蛋白的表达量与对照组比较差异有统计学意义(P <0.05)。 25、50和100 nmol/L蟾蜍灵组p-Raf-1的表达量与对照组比较明显减少(P <0.05)(见图3、4)。
2.5通过免疫组织化学检测TE13细胞Raf-1、pRaf-1蛋白表达的影响
镜下观察免疫组织化学检测结果,Raf-1、pRaf-1蛋白阳性表达于TE13细胞的胞浆,呈棕黄色颗粒。0、10、25、50和100 nmol/L蟾蜍灵处理细胞后,Raf-1的阳性率分别为80.31%、80.23%、80.16%、 80.05%和80.01%,蟾蜍灵组和对照组的阳性细胞数及棕黄色颗粒数未见明显减少,差异无统计学意义 (P >0.05);p-Raf-1的阳性率分别为80.23%、78.67%、 52.22%、49.28%和47.59%,25、50和100 nmol/L蟾蜍灵组与对照组比较,差异有统计学意义(P <0.05)。 25、50和100 nmol/L蟾蜍灵组的p-Raf-1阳性细胞数及棕黄色颗粒数与对照组比较明显减少(P <0.05)。
3讨论
Ras/Raf/MEK/ERK是ERK通路的主要途径[1], Raf-1介导Ras/Raf/MEK/ERK通路活化,促进细胞形态的改变及细胞运动能力、迁移能力的增加[2]。多数研究表明,Raf-1蛋白在肿瘤形成及细胞迁移过程中起重要作用[3,4]。LEICHT等[5]研究表明,Raf-1在多种肿瘤的早期存在异常激活,如小细胞肺癌[6]、白血病[7]、肝癌等[8]。恶性肿瘤中的新生血管是促使肿瘤生长迅速和转移的另一重要条件,新生血管的数量与肿瘤细胞生长和转移速度呈正相关,Raf-1激活ERK1/2在调节内皮细胞渗透性的过程中起重要作用[9]。国外研究发现,抑制肝细胞癌中Raf-1的活化可以影响肿瘤的生长和血管的形成[10]。近年来研究表明,蟾蜍灵可以通过多种信号转导途径抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制血管生成、放射增敏等作用。WATABE[11]和KUROSAWA等[12]认为,蟾蜍灵可以诱导细胞凋亡,蟾蜍灵处理U937细胞6 h后,MAPK活性显著增加,Ras、Raf-1和MAPKK1先于MAPK瞬间激活。蟾蜍灵抑制肿瘤的发生、发展涉及多个分子生物学机制。翟笑枫等[13]研究显示,蟾蜍灵对人脐静脉内皮细胞ECV304的生长具有抑制作用,进一步研究发现蟾蜍灵可抑制血管生成,从而抑制肿瘤的生长和转移。蟾蜍灵抑制肿瘤发生、发展的机制是相互联系的。有研究证实,蟾蜍灵可以抑制肝癌细胞迁移[14]。本研究采用划痕实验,比较不同浓度蟾蜍灵对食管癌TE13细胞迁移运动的影响。 结果显示,在划痕实验24 h后,对照组TE13细胞的愈合面积比蟾蜍灵组多,由此推断蟾蜍灵具有抑制食管癌TE13细胞迁移的趋势,并在一定药物浓度内存在剂量依赖关系。采用Boyden小室实验进一步研究蟾蜍灵对食管癌TE13细胞株趋化能力的抑制作用。实验结果表明,食管癌TE13细胞穿过滤膜的细胞数随药物浓度的增加而减少,这说明蟾蜍灵可以抑制TE13细胞的趋化能力,并在一定药物浓度内存在剂量依赖关系。以上实验说明蟾蜍灵可能通过抑制食管癌TE13细胞的运动而抑制其转移,但具体的相关机制并不清楚。
食管癌细胞 第2篇
[关键词] 食管鳞状细胞癌；FEZ1；免疫组化
[中图分类号] R735.1???[文献标识码] B???[文章编号] 2095-0616（2012）10-132-02
食管癌在我国发病率比较高，在我国恶性肿瘤死亡率中占第4位，也是世界上常见的十种恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康。食管癌的癌变机制至今不是很清楚，近年来随着分子生物学的进展，已发现与食管癌的发生或演进有关的多个可能相关基因或相关的未知基因片段。近期很多资料也表明，亮氨酸拉链肿瘤抑制基因（fasciculation and elongation protein zeta-1，FEZ1）是抑癌基因，并且FEZ1基因的异常表达在人类多种肿瘤中均可检测到。本研究通过采用免疫组化法，分析FEZ1基因在食管鳞状细胞癌中的表达情况，探讨其在食管癌进展中所起的作用及与患者病理指标间的关系，为临床判断预后提供新的依据。
1 材料与方法
1.1?标本来源
120例标本均来自承德医学院附属医院病理科2007年1月~2009年12月手术切除食管鳞状细胞癌石蜡包埋标本，选取20例食管癌远端病理证实的正常黏膜。所有标本术前未经放疗、化疗及免疫治疗，均常规固定后规范取材，将患者的性别及年龄、肿瘤长度详细记录，有经验的病理医师通过双盲法进行复诊，镜检肿瘤组织学类型、浸润深度及淋巴结转移情况。将4 μm厚的相应的常规石蜡包埋组织制成的切片用于免疫组织化学染色。
1.2?资料分组
食管癌患者年龄划分为：年龄＜40岁4例、40~60岁93例、＞60岁23例；食管癌长度划分：肿瘤长径＜3 cm 45例，≥3 cm 75例；根据肿瘤病理的浸润深度分为早癌组5例、浅肌层及深肌层组21例，纤维膜及周围软组织组94例。
1.3?SP免疫组化染色
小鼠抗FEZ1单克隆抗体购自Cell signaling公司，采用免疫组化SP法，FEZ1单克隆抗体稀释倍数为 1︰50，实验步骤按说明书进行，DAB显色，苏木素复染，分化，返蓝，常规脱水、透明、中性树胶封片。PBS代替一抗作为阴性对照，已知肺癌阳性切片作为阳性对照。
1.4?结果判断标准
FEZ1结果评价，以细胞浆出现背景清晰的黄色或棕黄色颗粒为阳性。参照文献[1]， 在高倍视野下（400×）随机选取5个视野（每个视野观察不少于200个细胞），按阳性细胞所占的百分比及着色强度进行结果判定：按着色强度评分： 0分为无着色，1分为浅黄色，2分为黄色，3分为棕黄色；按阳性细胞数占同类细胞数的百分比评分：0分为阴性，1分为阳性细胞数10%，2分为11%~50%，3分为51%~75%，4分为＞75%。取两项评分的乘积作为总积分，0~3分为阴性，3分以上为阳性。
1.5?统计学处理
应用SPSS17.0统计软件包，蛋白表达与临床病理指标之间的关系采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
２?结果
2.1?FEZ1蛋白在不同食管组织中的表达
FEZ1阳性表达可见于食管黏膜上皮及鳞癌细胞中胞浆内出现棕黄色颗粒，呈灶状或弥漫分布，大小不一，着色轻重不等。120例食管鳞癌中FEZ1阳性率为36.67%（44/120），明显低于正常食管黏膜60.00%（12/20），差异有统计学意义（P＜0.05）。食管癌组织中FEZ1阳性与阴性表达见图1、2。
2.2?FEZ1的表达与食管鳞癌临床病理参数的关系
鳞癌中早癌组、肌层组外膜组FEZ1蛋白的阳性率分别为80.00%、47.62%、31.91%，阳性率随浸润深度的增加呈降低趋势（P＜0.05）；实验结果显示淋巴结转移组FEZ1蛋白表达缺失，与无转移组差异明显；随着食管癌患者年龄的增长及肿瘤长度的增加，该蛋白表达亦呈降低趋势。见表1。
３?讨论
食管癌是常见的消化道恶性肿瘤，食管癌发病机制及预后的相关性研究，亦是国内外研究的热点。Ishii[2]在8p22 的D8S261位点附近分离出FEZ1基因，研究证明，该基因在正常组织中表达较高，而在许多人类肿瘤中存在异常表达。原志庆等[3]发现甲状腺组织中FEZ1 蛋白和mRNA 的表達均显著高于甲状腺腺瘤和PTC 组织，Vecchione 等[4-5]检测了胃癌、膀胱移行细胞癌中FEZ1 蛋白的表达，结果发现所有的细胞系中几乎均不能检测到该蛋白的表达。本实验中120例食管鳞癌中FEZ1阳性率明显低于正常食管黏膜，差异有统计学意义（P＜0.05），与以上研究结果一致，提示FEZ1蛋白可能对食管鳞癌的发生、发展起抑制作用。本实验亦研究了FEZ1表达与食管癌临床指标之间的关系，表明其表达与浸润深度及淋巴结转移呈负相关，李娜等[6]研究发现食管癌中淋巴结转移组FEZ1 mRNA的阳性表达率和表达水平显著低于无淋巴结转移组。陈刚等[7]研究表明，肺癌中恶性度较高的小细胞癌中FEZ1表达水平明显高于低分化鳞状细胞癌，均与本实验结果一致。迄今为止，人们对FEZ1基因了解较少，一般认为在细胞周期中FEZ1通过cAMP 依赖激酶高磷酸化，阻滞细胞产生G2/M期，细胞的生长抑制，肿瘤的发生受到抑制。还与微管组分有关，通过S- G2/M期与P34cdc2的相互作用抑制生长，通过调节有丝分裂异常进而细胞生长失控。随着深入的对FEZ1基因和其他食管癌相关基因研究，从分子生物学水平阐明食管癌的发生发展机制，为食管癌的早期诊断和基因治疗提供理论依据和技术手段，具有一定帮助。
[参考文献]
[1] 许良中，杨文涛.免疫组织化学反应结果的判断标准[J].实用癌症杂志，1996，4（6）：229-231.
[2] Ishii H，Baffa R，Numata SI，et al.The FEZ I gene at chromosome 8p22 encodes aleucine - zipper p rotein， and its exp ression is altered in multip le human tumors[J].Proc Natl Acad Sci USA，1999， 96 （7）：3928-3933.
[3] 原志庆，陈晓磊，李娜，等.FEZ1基因在甲状腺乳头状癌中的表达及其意义[J].重庆医科大学学报， 2011，36 （4）：437-439.
[4] Vecchione A，Croce CM，Baldassarre G，et al.Fez1/Lzts1 a newmitotic regulator implicated in cancer devel-opment[J].Cell Div，2007，24（2）：24.
[5] Vecchione A，Ishii H，Baldassarre G，et al.Fez1/LZTS1 is down- regulated in high- grade bladder cancer，and its restoration suppresses tumorigenicity in transitional cell carcinoma cells[J].Am J Pathol，2002，160（4）：1345-1352.
[6] 李娜.FEZ1基因在食管鳞癌组织中的表达及其意义[J].中国现代医学杂志，2008，18（20）：2955-2957.
[7] 陈刚，王小玲，刘月平，等.FEZ1 Survivin 在肺小细胞癌及低分化鳞状细胞癌蛋白表达及其在凋亡中的作用[J].中国肿瘤临床，2007，34（21）：1209-1211.
食管癌细胞 第3篇
1 材料与方法
1.1 细胞株
食管癌干细胞株由甘肃省消化系肿瘤重点实验室惠赠;该实验室利用DNA荧光染料Hoechst33342和流式细胞技术对食管癌EC9706细胞进行分离, 获得肿瘤起始细胞 (SP细胞) [4]。分化抑制培养体系 (包含小鼠胚胎成纤维细胞和分化抑制因子) 由兰州大学基础医学院遗传研究所提供。
1.2 试剂
艰难说菌毒素A (北京普华仕科技发展有限公司) , 细胞裂解液 (2.5 mol/L Na Cl, 100 mmol/L ED-TA-Na2, 10 mmol/L Tris-HCl, 10 g/L肌氨酸钠, p H10) ;碱性电泳缓冲液 (1 mmol/L EDTA-Na2和300mmol/L Na OH, p H>13) , 中性缓冲液 (0.4 mol/L Tris-HCl, p H 7.5) 。
1.3 细胞培养
解冻SP细胞, 分别接种于分化抑制培养体系的24孔板;每孔约2×105个细胞;在37℃、5%二氧化碳培养箱中、饱和湿度条件下常规培养, 每3天半量换液, 7 d后收集细胞并计数;台盼蓝染色活细胞98%以上进行实验。
将细胞分为两组, 实验组加入400 ng/m L Tcd A处理;空白对照组只加培养液, 每孔总体积100μL。37℃、5%二氧化碳培养箱分别培养24 h, 将细胞分为两份, 一份采用单细胞凝胶电泳技术检测;另一份用于荧光染色观察。
1.4 单细胞凝胶电泳检测细胞DNA损伤
单细胞凝胶电泳技术 (SCGE) 即彗星实验, 是一项快速、敏感的检测有核细胞DNA损伤的方法, 不受细胞类型的影响。细胞DNA受损后, DNA分子断裂而致分子量减少;碱性条件下, 损伤的DNA断链及片段会在DNA解螺旋后释放出来;在电泳过程中, DNA断链及片段会离开细胞核向阳极移动, 形成彗星状的图像;而DNA迁移距离 (彗星尾长) 和DNA含量 (荧光强度) 与DNA损伤程度呈线性相关[5]。
将100μL, 1%正常熔点的琼脂糖预热后涂在同样预热的载玻片上, 迅速加盖玻片轻压, 4℃下凝固10 min制成第1层胶;37℃下将50μL的细胞悬液与150μL, 0.5%低熔点琼脂糖混合均匀后取100μL迅速铺在第l层胶上, 加盖玻片轻压, 4℃下凝固10 min制成第2层胶;37℃下取0.5%低熔点琼脂糖100μL涂在第2层胶上并加盖玻片轻压, 凝固后制成第3层胶。去掉盖玻片, 将包埋了细胞的胶板浸入预冷4℃的细胞裂解液中 (用时加入1%Triton X-100, 10%二甲基亚砜) , 置于4℃下裂解2h。取出胶板, 紧密排列于水平电泳槽中, 加入新配置碱性电泳缓冲液盖过胶面0.5 cm左右, 4℃下解旋20 min。在电压25 V、电流300 m A、4℃电泳40 min。电泳后小心将胶板浸于中性缓冲液中15 min 2次。在暗光下使用20μg/m L溴化乙锭染色, 400倍荧光显微镜 (日本尼康E800) 下观察。
1.5 荧光染色观察细胞凋亡的形态学变化
细胞荧光染色是鉴别肿瘤细胞坏死和凋亡的一种简便易行的方法[6];分别离心收集Tcd A处理组和空白对照组细胞, PBS洗1次, 离心弃去上清, 以PBS液重悬细胞, 最终体系约50μL液体;固定15min后涂片, 待稍晾干后均匀滴上100μL Hoechst33342染色液, 避光染色5 min, 弃去Hoechst液, PBS洗2次后, 用荧光显微镜 (日本尼康E800) 观察细胞形态。
2 结果
鉴于SP细胞的筛选和保存条件苛刻, 在实验前使用采用流式细胞技术对SP细胞进行分选纯度检测;纯度≥98%时进一步开始实验。
2.1 单细胞凝胶电泳技术实验结果
A:实验组;B:对照组
图1显示, 实验组和对照组比较, “彗星尾长”变长, 荧光强度明显增高;表明400 ng/m L Tcd A对食管癌SP细胞的细胞核具有明显杀伤作用;但无法明确细胞受损类型;对Tcd A的作用机制及信号传导途径的研究意义有限。
2.2 Tcd A诱导食管癌SP细胞的形态学变化
400 ng/m L Tcd A作用于食管癌SP细胞24 h后, 荧光显微镜下可见典型凋亡细胞形态:细胞体积变小, 核内或胞质内可见致密浓染颗粒, 部分细胞出现核碎裂, 伴凋亡小体形成。而正常细胞大小及染色均匀。见图2。
实验表明Tcd A作用于食管癌SP细胞后主要引起细胞凋亡;张杰等的研究表明:针对细胞凋亡的靶向细胞毒药物有望提高食管癌患者的生存期[7];为深入研究Tcd A对食管癌SP细胞作用机制和评价其临床应用价值提供了方向。
3 讨论
食管癌现已成为全球发病率第7的恶性肿瘤, 全世界每年有30万人死于此病;目前食管癌的治疗模式仍是以外科为主的综合治疗;但多数国家限于经济和医学水平的限制;仍不能达到早期发现及诊断, 使得食管癌的手术切除率较低;而对于不能手术的III期和IV期患者, 化疗和放疗已成为改善其生活治疗和延长生存期的主要方法[8,9]。同时, 围术期的辅助化疗也在食管癌的综合治疗中起着举足轻重的低位。令人遗憾的是, 无论是以铂类药物为基础的化疗方案 (DDP+5-Fu/紫杉醇) 或基因靶药物的应用, 食管癌仍未获得满意的远期生存[10,11]。干细胞的耐药性可能是化疗失败和食管癌复发的根本;寻找针对食管癌干细胞的靶向化疗药物, 成为突破食管癌治疗和延长患者生存期的瓶颈。
食管癌细胞无特异的标志物给食管癌干细胞的分离和鉴定带来很大的困难;利用DNA荧光染料Hoechst 33342和流式细胞技术筛选的食管癌SP细胞, 因其在生物学特性和基因表达谱方面与肿瘤干细胞密切相关而被多数学者肯定为食管癌干细胞[4]。肿瘤干细胞的培养条件要求较高, 为防止食管癌干细胞在培养和传代过程中发生分化;该研究采用了分化抑制培养体系对细胞进行培养[12]。
食管癌细胞 第4篇
1 材料与方法
1.1 主要试剂和药品
通道化噎丸：80 g/瓶，为复方中药制剂，河南中医学院第二临床医学院制剂中心提供（批号20070716）。端粒酶PCR-ELISA检测试剂盒（Telo TAGGG Telomerase PCR ELISA ILUS，德国Roche公司产品）。
1.2 主要器材及仪器
NO-11型PCR扩增仪（德国Biometra公司）。
1.3 细胞系
人食管癌Eca-109细胞由河南省医学科学研究所提供。
1.4 方法
1.4.1 动物含药血清的制备
取雄性200 g Wistar大白鼠，随机分成空白血清组（空白组）6只，通道化噎丸低剂量组（5%）、通道化噎丸中剂量组（10%）、通道化噎丸高剂量组（15%）各6只。每鼠以4 ml/d通道化噎丸合药血清灌药，空白组给予等量生理盐水灌胃，于给药第7天，麻醉后剖腹经腹主动脉无菌采血，离心10 min(1 500 r/min），无菌分离血清。用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，置-20℃冰箱保存备用[1,2,3,4,5]。
1.4.2 实验方法与操作
取对数生长期人食管癌Eca-109细胞，经0.2%胰酶消化后，计数，以2×105/ml接种于小培养瓶中，培养48 h备用。
取三种浓度的通道化噎丸含药血清加入24孔板中。每个浓度设5个复孔，每孔加入2×104/ml细胞，以生理盐水、5-FU(100μg/ml）分别作阴性和阳性对照，依次在12、24、48、72、96 h分别取3孔收集细胞（约5×105个），PBS洗2次，加入200μl裂解液，4℃裂解30 min,1 500 r/min离心10 min，将上清（约150μl）置-70℃保存备用或即用[6,7,8,9]。
1.4.3 TRAP-PCR-ELISA实验
取上述提取液3μl，加入25μ反应混合物，在PCR扩增仪上运行。取2.5μl PCR产物加入10μl变性液反应，洗涤后加入耦联过氧化物酶的地高辛抗体100μl，室温孵育30 min，最后加入100μl POD的底物TMB，显色10 min，在酶标仪上测吸光度A值，波长为450 nm和630 nm，吸光度差值△A=A450 nm-A630 nm，△A代表细胞端粒酶活性[10,11,12]。
1.5 统计学处理
数据以均数±标准差表示，用统计软件SPSS 15.0分析，计量资料比较采用t检验，P<0.05表示有显著性差异。
2 结果
含药血清培养后的食管癌Eca-109细胞端粒酶活性表达情况见表1。
与空白组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01
空白组食管癌Eca-109细胞端粒酶活性较高，通道化噎丸中、高剂量组及5-FU组与空白组比较，端粒酶活性表达明显降低，有非常显著差异性（P<0.01）；通道化噎丸低剂量组与空白组比较，有显著差异性（P<0.05）。
3 结论
大量研究表明，绝大多数的恶性肿瘤中发现有端粒酶活性，而且其活性水平与肿瘤的进展程度一致[12,13]。因此，抑制端粒酶活性就有可能成为治疗癌症的有效途径[14,15]。通道化噎丸组方为熟地、山药、茯苓、山茱萸、泽泻、丹皮、山豆根、天南星、半夏、郁金和三七等，方中以六味地黄汤补肾阴并循经顾护食管以扶正，佐以化痰散结、行气散瘀之药以涤邪，共奏滋阴润燥、扶正抗癌之效。本研究切合噎膈病机，开展本方对端粒酶活性影响的实验，结果表明，正常大鼠血清培养的食管癌细胞端粒酶活性水平较高，通道化噎丸中、高剂量组与空白组比较，端粒酶活性水平均大幅度降低，有非常显著差异性（P<0.01），说明中药通道化噎丸制备的中、高含药血清具有显著的抗癌和促进癌细胞向正常细胞转化的作用。其中，中、高剂量组疗效较低剂量组好，显示了一定的量效关系。通道化噎丸含药血清中、高剂量组疗效突出，较空白组有明显的
·短篇论著·
疗效，表明中药配合在放、化疗增效减毒、改善患者生存质量方面具有显著的优势，有待进一步开发研究和应用。
摘要：目的:观察通道化噎丸含药血清对食管癌Eca-109细胞端粒酶活性的影响,探讨该药抑瘤诱导凋亡的作用机制。方法:以不同浓度的含药血清孵育体外培养的人食管癌Eca-109细胞,检测其端粒酶的活性变化。结果:通道化噎丸含药血清可显著降低食管癌细胞端粒酶的表达,低、中、高剂量组与空白组比较,有显著性差异(P<0.05和P<0.01)。结论:通道化噎丸可下调Eca-109细胞的端粒酶活性,从而诱导食管癌细胞凋亡,抑制转移,改善肿瘤预后。
食管癌细胞 第5篇
关键词：钒化钠,食管癌,细胞凋亡,Caspase-3
钒是化学元素周期表中VB族的过渡元素,现己被确认为人体必需的微量元素,参与人体许多不同的生理过程。随着对钒研究的深入,其抗癌作用也引起人们的注意。Ray等[1]研究显示钒化钠可以促进乳腺癌MCF7细胞凋亡,抑制其增殖,显示了钒化钠作为有效的化疗制剂的潜能。但关于钒化钠对食管癌细胞方面的研究尚未见报道。
本研究在体外实验中观察钒化钠对食管癌细胞系EC109的作用,揭示钒化钠抗肿瘤作用的分子机制,扩大其抗肿瘤谱,为钒化钠进一步发展成一种新型的抗肿瘤药物提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 药品及抗体 钒化钠购买于北京化学试剂公司(分析纯),抗actin兔多克隆抗体、抗Caspase-3兔多克隆抗体、辣根酶标记的山羊抗兔IgG均购自Santa Cruze公司。
1.2 细胞株 人食管癌细胞系EC109购于中国科学院上海生物科学院细胞资源中心。
1.3 免疫蛋白印迹实验(Western-Blot) 常规培养人食管癌细胞系EC109细胞,按实验分组分别加入不同浓度的钒化钠,对照组不加药物。采用10 % SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,将蛋白电转到硝酸纤维膜上,加一抗稀释液4 ℃过夜,结合辣根过氧化物酶标记二抗,用ECL化学发光试剂在X光胶片上曝光、显影、定影。以actin为内参照,应用凝胶成像分析系统进行条带扫描分析结果,结果以蛋白条带的面积积分值与actin的面积积分值比值表示。实验重复3次。
1.4 统计学处理 采用SPSS11.0软件包对数据进行单因素方差分析,统计数据以均数±标准差(
2 结果
在50.0~200.0 μmol/L的浓度范围内随着药物浓度的增加和药物处理时间的延长,Caspase-3激活的量呈现逐渐升高的趋势。见图1、表1。
*与对照组比较P<0.05,**与对照组比较P<0.01
3 讨论
食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,寻找有效的化疗药物成为食管癌治疗领域研究的热点。Bishayee等[2]报道了一系列钒制剂对动物模型系统的抗肿瘤活性。生长细胞对钒化钠的毒性作用更敏感,通过皮下注射,钒化钠很有效地抑制了小鼠肿瘤生长,抑制癌细胞生长增殖[3]。本研究利用Western-Blot研究方法,分析钒化钠对肿瘤细胞生长的抑制作用及其分子机制。为进一步将钒化钠研发成一种新的化疗药物提供理论基础。
肿瘤的发生、发展与凋亡有密切关系。肿瘤不仅有细胞增殖和分化的异常,亦有细胞凋亡的异常。细胞凋亡的分子机制研究表明,凋亡是多基因参与的级联反应过程,其中Caspase-3是凋亡的执行器之一[4]。Caspase-3为凋亡的效应分子,是凋亡途径下游进行底物酶解的关键蛋白酶,被称为凋亡的“执行者”[5]。Caspase-3是多种凋亡途径共同作用的因子,其蛋白表达水平的高低决定着细胞凋亡程度[5]。
目前,以诱导凋亡为目标的肿瘤治疗战略主要是通过各种因子活化Caspase-3前体而实现的。本实验结果显示,不同浓度钒化钠作用食管癌细胞系EC109后,低浓度钒化钠组对Caspase-3蛋白的表达无明显影响,高浓度组Caspase-3蛋白的活性增加。提示一定浓度的钒化钠可能通过激活Caspase-3而发挥其促进食管癌细胞系EC109细胞凋亡的作用。这一结果为钒化钠防治食管癌的临床应用奠定理论基础。由于细胞凋亡是一个极其复杂、涉及多步骤、多因子参与的过程,故钒化钠诱导肿瘤细胞凋亡的详细机制仍需进一步研究。
参考文献
[1]Ray RS,Rana B,Swami B,et al.Vanadium mediated ap-optosis and cell cycle arrest in MCF7 cell line[J].ChemBiol Interact,2006,(163):239-247.
[2]Bishayee A,ChaLterjee M.Inhibitory effect of vanadiumon rat liver carcino genesis initiated with diethyl nitrosa-mine and promoted by Phenobarbital[J].Br Cancer,1995,(71):1214-1220.
[3]Cruz TF,Morgan A,Min W.In vitro and in vivo antine-oplastic effects of orthovanadate[J].Mol Cell Biochem,1995,153(1-2):161-166.
[4]林春龙,张珍祥.FAK反义寡核苷酸促进人肺动脉平滑肌细胞凋亡[J].中国病理生理杂志,2006,22(2):288-291.
食管癌细胞 第6篇
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药物与试剂
人食管癌细胞株Eca-109,由北京医科大学科研中心引入,后经我校中心实验室传代。LBP由本校实验中心从宁夏优质枸杞子中分离提取,纯度超过99%。RPMI 1640、Trizol及RT-PCR酶混合物为美国GIBCO公司产品。四甲基偶氮唑盐(MTT)、碘化丙啶(PI)、二甲亚砜(DMSO)及兔抗人Survivin单克隆抗体为美国Sigma公司产品,Survivin及β-actin引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。
1.1.2 细胞株及其培养
人食管癌细胞株Eca-109置于RPMI 1640培养液中(含10%胎牛血清和青霉素、链霉素各100 U/ml),在37 ℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养。待细胞进入对数生长期后,经0.25%胰蛋白酶消化,收集,调配成相应的细胞浓度。
1.2 方法
1.2.1 分组及处理
实验设空白对照组、溶剂对照组和3个不同质量浓度实验组,分别为LBP 200、400和800 μg/ml。取对数生长期的Eca-109细胞1×104个/ml接种于25 ml的培养瓶中培养,24 h后加入前述不同质量浓度的LBP,作用48 h后,胰酶消化离心,将细胞悬浮于磷酸盐缓冲液(PBS)中,调质量浓度为1×106个/ml细胞悬液,备用。
1.2.2 LBP对人食管癌细胞株Eca-109周期和凋亡的影响
取实验组和对照组细胞样品,1000 r/min离心10 min,收集细胞,PBS洗涤2次,配成1×106/ml细胞悬液,75%冷乙醇(-20 ℃)固定24 h,上机测定前,离心去乙醇,用PBS洗涤2次,加入不含Dnase的RNA酶及EB染液,室温反应30 min,上流式细胞仪测定细胞凋亡率。
1.2.3 原位末端标记法(TUNEL)
由武汉博士德公司提供TUNEL检测试剂盒。光学显微镜下,胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞,即凋亡细胞。随机计数200个细胞,算出阳性细胞率。
1.2.4 RT-PCR检测Survivin mRNA表达
细胞分组及处理同方法1.2.1,按Trizol试剂说明提取细胞总RNA,进行RT-PCR扩增,扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,应用gel-pro凝胶分析软件对电泳谱带进行分析。引物序列及扩增条件见表1。
1.3 统计学方法
所有的数据均用undefined表示,采用SPSS软件包分析数据,各组间指数的比较采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 LBP对人食管癌细胞Eca-109生长的影响
3组不同质量浓度的LBP对体外培养的Eca-109细胞均有抑制作用,且呈明显的剂量-效应关系,最大抑制率达65.49%。200 μg/ml组与溶剂对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);400及800 μg/ml组与溶剂对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),见表2。
注:与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
2.2 流式细胞仪检测LBP对Eca-109细胞凋亡的影响
不同剂量的LBP对Eca-109癌细胞有显著的促进细胞凋亡作用,呈剂量依赖关系。在DNA直方图的G1期峰前出现明显的细胞凋亡峰。LBP对Eca-109细胞周期产生明显影响,G2/M期细胞明显增多,G0/G1期细胞比率明显减少,多数细胞阻滞在G2/M期。见表3。
注:各试验组与对照组相比,*P<0.05,**P<0.01。
2.3 LBP对Eca-109细胞Survivin mRNA表达的影响
结果见图1,经不同浓度(200、400、800 μg/ml)LBP处理48 h后,Eca-109细胞Survivin mRNA表达水平的校正值(survivin/β-actin)分别为0.725±0.11、0.317±0.04和0.204±0.04,LBP浓度增加Survivin mRNA表达水平逐渐降低。400和800 μg/ml处理组显著低于对照组(0.873±0.04)μg/ml。P<0.01。见图1。
M:DNA分子标准;1:对照组;2～4:依次为200 400和800 μg/ml 枸杞多糖作用48 h组
3 讨论
细胞凋亡又称为细胞程序性死亡。通过细胞凋亡可保持机体组织的动态平衡,是机体自我调控的重要机制。目前认为,许多肿瘤的发生就是由于该肿瘤细胞凋亡通道受阻而引起的。因此,诱导肿瘤细胞凋亡成为抗肿瘤药共同的新靶点。甚至有学者认为细胞凋亡是不同作用机制抗癌药物殊途同归的结果[3,4]。
LBP可显著抑制肿瘤细胞Eca-109的生长,其抑制率可达65.49%,有明显的剂量依赖关系。流式细胞仪检测结果显示,LBP处理的细胞,其DNA直方图上可见G1期峰前出现明显的细胞凋亡峰。最大剂量组的凋亡率可达18.1%。肿瘤细胞都有其自身的生长周期规律,一般G0/G1期时间最长,故G0/G1期细胞比率最高,而G2/M期时间较短,处于G2/M期细胞比率最低。不同的抗肿瘤药可能对不同增殖周期具有选择性。流式细胞仪检测结果显示,LBP对人食管癌Eca-109细胞增殖周期有明显影响,药物使G2/M期细胞比率明显增加。这表明肿瘤细胞被阻止于G2/M期,更多的细胞损伤过重,超过了自身修复能力,难以通过G2期限制点而发生凋亡[5]。
为了探讨LBP诱导Eca-109细胞凋亡机制,本实验研究了不同浓度LBP(200、400和800 μg/ml)作用后Eca-109细胞Survivin基因的表达变化。Survivin是细胞凋亡抑制基因,编码的蛋白属于凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosisp rotein,IAP)家族成员,是迄今发现的最强的凋亡抑制因子。Survivin主要表达于胚胎及分化未成熟的组织中,在成人体内除胸腺、生殖腺中有微量表达外,所有分化成熟的组织,均无表达,但在许多人类肿瘤组织中表达水平升高[6,7]。Survivin通过直接抑制caspase-3和caspase-7,使二者分离,从而抑制caspase蛋白酶活力[8,9]。本实验结果显示,LBP作用后,Eca-109细胞的Survivin mRNA表达减少,同样,Survivin蛋白表达也明显减少。
摘要：目的 研究枸杞多糖(LBP)诱导人食管癌细胞Eca-109的凋亡作用及其作用机制。方法 体外培养的人食管癌细胞Eca-109,细胞经不同剂量LBP处理后,采用MTT法测定细胞的增殖情况,流式细胞仪分析LBP对Eca-109细胞周期和凋亡的影响,用RT-PCR技术检测Eca-109细胞Survivin mRNA的表达。结果 LBP可明显抑制人食管癌细胞Eca-109的生长,并能诱导Eca-109细胞凋亡,凋亡率(%)分别为6.20±0.62、12.80±0.47和18.10±0.70,与对照组(0.78±0.91)%比较,差异有统计学意义(P<0.01);各剂量药物处理组的肿瘤细胞SurVivin mRNA表达水平均明显降低(P<0.01)。结论 LBP可抑制Eca-109细胞增殖,诱导细胞凋亡,该作用可能与下调细胞Survivin表达有关。
关键词：食管癌,枸杞多糖,细胞凋亡,基因表达
参考文献
[1]薛立文,李以暖.枸杞子的营养和保健功能[J].广东微量元素科学,2000,7(6):124.
[2]甘璐,张声华.枸杞多糖的抗肿瘤活性和对免疫功能的影响[J].营养学报,2003,25(2):200-202.
[3]范京惠,左玉柱,李一经.细胞凋亡的研究进展[J].东北农业大学学报,2005,36(6):804-807.
[4]季字彬,高世勇,张秀娟.羊栖菜多糖诱导肿瘤细胞凋亡的研究[J].中国中药杂志,2004,29(3):245-247.
[5]张泰松,程树仓,臧恒昌,等.去甲斑蝥素诱导细胞凋亡的研究进展[J].海峡药学,2005,17(3):125-127.
[6]Han J.Highlights of the cancer chemoperevention studies in chian[J].PrevMed,1993,22:712.
[7]Gamick MB.Prostate cancer:screening,diagnosis,and management[J].Ann InternMed,1993,118:804-8181.
[8]Vauxt DL,Cory S,Adram JM.Bc122gene promotes haemoietic cell survival andcooperates with c2myc to immortalize pre2B cells[J].Na-ture,1988,335:440.
食管癌细胞 第7篇
1 一般材料
1.1 药材
兖州卷柏全草购于福建省三明市宁化县草药市场,并经泉州市医药研究所苏齐主任医师鉴定为卷柏科,卷柏属,兖州卷柏植物。
1.2 试剂
人食管鳞癌细胞株(EC-9706)购自天呈科技生物公司。胎牛血清、PBS、DMSO、RPMI1640培养基(赛默飞世尔科技公司)。生理盐水(NS,福州海王福药有限公司),环磷酰胺(CTX,江苏恒瑞医药股份有限公司)。二氧化碳培养箱(HF90,上海力申科学仪器有限公司),生物安全柜(BSC-1500IIA2-X,济南鑫贝西生物技术有限公司),倒置显微镜(XG-202,南京江南永新光学有限公司),高压灭菌锅(HAV-50,日本平山制作所株式会社),电热恒温水槽(DK-600,上海精宏实验设备有限公司),天子天平(BSA1245,德国赛多利斯有限公司),台式低速离心机(L500,湖南湘仪实验仪器开发有限公司)。
1.3 实验动物
SPF级BALE/c裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司[动物合格证号SCXK(沪)2012-0002],4~5周龄,雌雄不限,体重16~19 g,SPF级环境饲养5 d后用于实验。
2 方法
2.1 兖州卷柏乙醇提取物的制备
兖州卷柏全草用粉碎机粉碎2~4 min,过100目筛备用。称取20 g兖州卷柏干粉末,放入圆底烧瓶中,然后加入80%乙醇溶液200 m L。60℃回流提取3次,每次处理60 min。提取液过滤,旋转蒸发仪蒸发,得到1.6 g乙醇提取物浸膏。
2.2 人食管癌小鼠移植瘤动物模型的构建
人食管鳞癌细胞(EC-9706)用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养液(含青霉素和链霉素各100 U/m L)中,于37℃、5%CO2、饱和湿度条件恒温常规培养。0.25%胰蛋白酶消化对数生长期的EC-9706细胞,用RPMI培养液将细胞密度稀释为1×108个/m L。BALB/c裸鼠右前肢腋部皮下接种0.2 m L肿瘤细胞,观察7 d,选择肿瘤直径1 cm左右的裸鼠进行实验。
2.3 分组、给药与处理
将50只裸鼠按随机数字表法分为兖州卷柏乙醇提取物高、中、低3个剂量实验组,并设置阳性对照(环磷酰胺,CTX)组和阴性对照(生理盐水,NS)组。分别灌胃给药等体积的兖州卷柏乙醇提取物高、中、低剂量组(400、200、100 mg/kg),阳性对照(CTX,5 mg/kg)组和阴性对照(NS,0.2 m L/只)组。每天给药1次,连续给药20 d。给药过程中观察裸鼠生长状况和体重变化。治疗后第4天开始测量瘤长(L)和瘤宽(W),根据公式:肿瘤体积(V)=0.5×L×W2mm3计算肿瘤体积。20 d后,用吸入二氧化碳的方法处死裸鼠,并称量肿瘤、裸鼠肝脏和脾脏的重量。根据以下公式计算抑瘤率和脏器指数。
2.4 统计学方法
采用SPSS 11.5软件,实验数据用均数±标准差(±s)表示,采用t检验,组间率的比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 兖州卷柏乙醇提取物对裸鼠移植瘤体积的影响
给药16 d后,兖州卷柏乙醇提取物高、中剂量组的肿瘤体积均比阴性对照组小且差异有统计学意义(P<0.05);实验结束后,低剂量组的肿瘤体积比阴性对照组小且差异有统计学意义(P<0.05);而高、中剂量组的肿瘤体积均小于阴性对照组且差异有统计学意义(P<0.01)。
给药12 d后,兖州卷柏乙醇提取物低剂量组和阴性对照组的肿瘤体积均比阳性对照组大且差异有统计学意义(P<0.05)。给药16 d后,中、低剂量组的肿瘤体积均比阳性对照组大且差异有统计学意义(P<0.05)。实验结束后,高、中剂量组的肿瘤体积均比阳性对照组大且差异有统计学意义(P<0.05);而低剂量组的肿瘤体积大于阳性对照组且差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。
注:与阴性对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;与阳性对照组比较,#P<0.05,##P<0.01;CTX:环磷酰胺;NS:生理盐水
3.2 兖州卷柏乙醇提取物对裸鼠食管癌肿瘤重量及抑瘤率的影响
实验结束后,兖州卷柏乙醇提取物高剂量组食管癌肿瘤的重量小于阴性对照组且差异有统计学意义(P<0.01),其抑瘤率为30.51%;中、低剂量组食管癌肿瘤的重量均比阴性对照组小且差异有统计学意义(P<0.05),其抑瘤率分别为18.12%和9.25%。
高、中剂量组食管癌肿瘤的重量均比阳性对照组大且差异有统计学意义(P<0.05);而低剂量组食管癌肿瘤的重量大于阳性对照组且差异有统计学意义(P<0.01)。
兖州卷柏乙醇提取物各剂量组实体瘤的重量呈剂量与效应关系,提示兖州卷柏乙醇提取物对裸鼠食管癌移植瘤的生长有明显的抑制效果。见表2。
注:与阴性对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;与阳性对照组比较,#P<0.05,##P<0.01;“-”:无数据
3.3 兖州卷柏乙醇提取物对人食管癌移植瘤裸鼠肝、脾的影响
实验结束后,兖州卷柏乙醇提取物高剂量组肝脏指数小于阴性对照组且差异有统计学意义(P<0.01);而中剂量组肝脏指数比阴性对照组小且差异有统计学意义(P<0.05)。中、低剂量组肝脏指数均比阳性对照组大且差异有统计学意义(P<0.05)。
高剂量组脾脏指数比阴性对照组小且差异有统计学意义(P<0.05);而中、低剂量组脾脏指数与阴性对照组比较差异无统计学意义。中剂量组脾脏指数比阳性对照组大且差异有统计学意义(P<0.05);而低剂量组脾脏指数大于阳性对照组且差异有统计学意义(P<0.01)。见表3。
注:与阴性对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;与阳性对照组比较,#P<0.05,##P<0.01;“-”无数据
4 讨论
食管癌是一种常见的消化道恶性肿瘤,发病年龄多发生在40岁以上,且男性发病率高于女性。其早期诊断率低,就诊时的食管癌患者有70%~80%属于晚期症状。食管癌病死率高达90%,成为近来年日益威胁人类身体健康的高危疾病。中国是世界上食管癌高发地区之一。在我国,食管癌发病率和死亡率分别占全部恶性肿瘤的第5位和第4位,每年平均约有15万人死于此病。与大部分肿瘤类似,食管癌的早期症状不明显,因此大多数患者确认时已失去治疗的最佳时期。目前治疗食管癌的主要方法有手术治疗、化学治疗、放射疗法等。由于肿瘤容易发生转移,食管癌患者的5年生存率为20%左右[5]。中晚期食管癌患者一般易发生肿瘤外侵或大面积肿瘤细胞转移等症状,不适宜用手术治疗,故一般采取保守治疗,即用化学治疗与放射治疗相结合,并辅助内科等综合学科疗法。但化学治疗和放射疗法容易对患者的自身免疫系统和正常的组织细胞产生某种程度的伤害,进而影响其治疗效果,也可能刺激肿瘤细胞的增殖,或者导致其他并发症的发生[6,7]。随着近年来对分子靶向药物治疗肿瘤效果研究的发展,由于分子靶向药物具有特异性强、疗效大、毒副作用小等特点,因而分子靶向疗法在食管癌的治疗方面也得到广泛的关注[8]。然而,其临床应用效果目前还在探索之中,还需要有更多的大样本研究试验对分子靶向药物治疗食管癌效果进行评估。因此,分子靶向药物在治疗食管癌的应用方面还有很大的局限性[9]。
食管癌早期确诊患者只有少部分适合进行手术治疗,而单纯采用化学疗法所取得的疗效往往不尽人意。目前,每种治疗食管癌的方法都各有优劣。近年来的药理研究试验提示多种中医药在治疗胃癌、食管癌、肝癌等恶性肿瘤方面有一定的疗效[10,11,12]。在治疗食管癌方面,中医药疗法有毒副作用较小、疗效明显等特点。外科手术治疗、化学治疗或放射治疗食管癌后,中医药疗法可以具有减缓术后不良反应、减弱放化疗毒副作用、增加患者免疫功能及其增强放化疗耐受程度等功能[13,14]。随着现代临床医学及其科学深入研究,发现中草药在预防癌症的发生、发展,及其联合医疗过程中减少毒副作用有独特的优势,并取得较好的效果。我国有着深厚的中医药理论、实践基础和丰富的天然药物资源[15]。积极开发可以促进肿瘤细胞凋亡和对肿瘤有抑制效果的中医药,将是今后治疗食管癌新方法的一个发展方向和必然趋势。
兖州卷柏,为卷柏科植物兖州卷柏的全草,广泛分布于我国的福建、浙江、广西、广东、江西、台湾等地。充州卷柏具有消炎、止痛、抗病毒、抗肿瘤及其提高免疫功能等功效[16,17]。林美珍等[18]用充州卷柏作为民间中草药治疗肝炎患者,具有显著疗效。韩国东洋科学研究所利用卷柏提取物研发出一种新药用于治疗骨质疏松症[19]。近年来,运用现代中药分离制备技术提取兖州卷柏活性成分,并对其有效成分进行药理、毒理研究取得了一定的成效。兖州卷柏中提取出一些有效成分,分别具有抗氧化、抗菌、降血压、抗肿瘤、抗病毒等效果。Seong等[20]研究表明兖州卷柏提取物具有抑制一氧化氮(NO)的功能,可以下调i NOS/IL-1β的表达,进而对痤疮细胞有一定的治疗效果。Gayathri等[21]研究发现兖州卷柏能抑制脂质过氧化反应和羟自由基活性,并且可以提高成年小鼠的免疫活性。张昊等[22]研究发现兖州卷柏的四种黄酮类化合物可以抑制人肝癌细胞Hep G2的生长,并提示与甲氨蝶呤阳性对照组比较,这四种黄酮类化合物具有更强的抑制癌细胞活性。邱丹缨等[23]研究发现兖州卷柏生物碱可以有效抑制小鼠H22肝癌细胞的生长。谢永华等[24]研究表明兖州卷柏水提物具有一定的抗氧化能力,并对人食管癌细胞有一定的抑制效果。对人食管癌细胞的抑制效果随其水提物的浓度增加而提高。谢永华等[4]研究表明兖州乙醇提取物对人食管癌细胞有一定的抑制效果。对人食管癌细胞生长的抑制效果随兖州卷柏乙醇提取物浓度增大而增强。同时研究表明兖州卷柏乙醇提取物具有保护小鼠肝细胞损伤的功能。
本研究表明不同浓度的兖州卷柏乙醇提取物对人食管癌移植瘤均有一定的抑制作用,且各剂量组抑瘤效果呈剂量-效应关系。结果提示,兖州卷柏乙醇提取可以抑制人食管癌裸鼠移植瘤细胞的生长,对今后兖州卷柏的开发应用和肿瘤防治有重要的意义。
摘要：目的 探讨兖州卷柏乙醇提取物对人食管癌裸鼠移植瘤细胞的抑制作用。方法 构建人食管癌裸鼠移植瘤模型,随机分成5组,每组各10只,分别灌胃给药等体积的兖州卷柏乙醇提取物高、中、低剂量组(400、200、100 mg/kg),并设置阳性对照(环磷酰胺,5 mg/kg)组和阴性对照(生理盐水,0.2 mL/只)组。每天给药1次。给药4 d后,开始测量并计算肿瘤体积。给药20 d后,处死裸鼠,称瘤重,并计算抑瘤率,肝脏、脾脏指数。结果 实验结束后,兖州卷柏乙醇提取物高、中剂量组的肿瘤体积均比阴性对照组小且差异有统计学意义(P<0.01),但均比阳性对照组大且差异有统计学意义(P<0.05);低剂量组比阴性对照组小(P<0.05)。高剂量组食管癌肿瘤的重量比阴性对照组小(P<0.01),其抑瘤率为30.51%,但比阳性对照组大(P<0.05);中、低剂量均比阴性对照组小(P<0.05),抑瘤率分别为18.12%和9.25%。高剂量组肝脏指数比阴性对照组小(P<0.01);中剂量组肝脏指数也比阴性对照组小(P<0.05)。高剂量组脾脏指数比阴性对照组小(P<0.05)。结论 兖州卷柏乙醇提取可以抑制人食管癌裸鼠移植瘤细胞的生长。
食管癌细胞 第8篇
关键词：胸腔镜腹腔镜联合治疗,食管癌,血清细胞因子
食管癌的微创治疗方式中胸腹腔镜联合治疗的效果较受肯定, 其具有手术创口较小等优势, 且随着本术式的不断发展完善, 其对于病灶的治疗效果也基本达到与开胸手术一致的效果, 但是对于本术式对机体整体状态的影响研究十分不足, 而细胞因子作为有效反应机体整体炎性及其他应激状态的指标[1], 其变化的研究价值较高。本文中我们即就胸腔镜腹腔镜联合治疗对食管癌患者血清细胞因子的影响进行观察, 观察结果分析如下。
1 资料与方法
1.1 临床资料:
选取2012年8月至2014年2月于本院进行传统开胸手术治疗的27例食管癌患者为对照组, 同时选取同时间段进行胸腔镜腹腔镜联合手术治疗的27例患者为观察组。对照组的27例手术患者中, 男性18例, 女性9例, 年龄41~76岁, 平均年龄 (62.0±8.4) 岁, 病灶部位:中段20例, 其他7例;分期:Ⅰ期5例, Ⅱ期12例, Ⅲ期10例。观察组的27例手术患者中, 男性17例, 女性10例, 年龄42~76岁, 平均年龄 (62.1±8.2) 岁, 病灶部位:中段19例, 其他8例;分期:Ⅰ期5例, Ⅱ期11例, Ⅲ期11例。两组手术患者的性别、年龄、肿瘤病灶部位与疾病各个分期所占比例之间比较, P均>0.05, 具有可比性。
1.2 方法:
对照组的27例食管癌患者按照传统的开胸手术对疾病进行治疗, 患者进行全麻后于左后外侧第六肋间做弧形手术切口, 分离各层组织肌肉等, 对病灶进行探查, 游离食管, 然后将膈肌切开, 并将胃部进行有效处理, 然后进行食管胃吻合处理, 最后进行其他后期手术处理。观察组的27例食管癌患者则以胸腔镜腹腔镜联合治疗的房还是进行处理, 患者麻醉后取左侧卧位, 第7肋间做胸腔镜的手术入口, 根据情况可加手术操作孔, 入胸后进行常规的病灶探查, 有效处理血管及食管等组织, 有效处理后取平卧位, 建立二氧化碳气腹, 并置入腹腔镜对胃部及周围其他组织等进行有效处理, 全部基础情况处理完毕后进行食管胃的有效吻合, 进行手术的其他后期处理。然后将两组患者术前1 d和术后1 d、3 d、5 d的血清细胞因子 (IL-1β、IL-6、TNF-α及IFN-γ) 检测水平进行比较。
1.3 统计学处理:
本文中的数据处理选用软件包SAS5.0, 其中的年龄、血清细胞因子检测水平等计量资料进行t检验, 男女比例、肿瘤病灶部位与疾病各个分期所占比例等计数资料进行卡方检验, P<0.05为比较项目间存在显著性差异。
2 结果
手术前1 d对照组的血清IL-1β、IL-6、TNF-α及IFN-γ水平分别为 (4.15±0.48) pg/m L、 (8.76±1.14) pg/m L、 (3.45±0.50) ng/m L及 (64.24±6.10) pg/L, 观察组分别为 (4.20±0.46) pg/m L、 (8.81±1.10) pg/m L、 (3.47±0.48) ng/m L及 (64.27±6.08) pg/L。两组术前1 d的检测结果之间均无显著性差异, P均>0.05。
手术后3 d对照组的血清IL-1β、IL-6、TNF-α及IFN-γ水平分别为 (6.69±0.57) pg/m L、 (12.98±1.39) pg/m L、 (7.49±0.75) ng/m L及 (88.98±8.29) pg/L, 观察组分别为 (4.97±0.52) pg/m L、 (10.20±1.22) pg/m L、 (5.20±0.64) ng/m L及 (75.23±7.64) pg/L;手术后5 d对照组的血清IL-1β、IL-6、TNF-α及IFN-γ水平分别为 (9.45±0.83) pg/m L、 (15.45±1.64) pg/m L、 (5.41±0.61) ng/m L及 (70.59±5.91) pg/L, 观察组分别为 (6.53±0.56) pg/m L、 (10.15±1.33) pg/m L、 (3.23±0.47) ng/m L及 (61.46±5.88) pg/L手术后1 d、3 d与5 d观察组的检测水平均显著地低于对照组的检测水平, P均<0.05。
3 讨论
食管癌的胸腔镜腹腔镜根治术是临床常用的一类微创性手术方式, 其临床效果日益受到肯定, 对于本手术方式的相关治疗性研究也较为多见, 其中关于手术患者围术期疾病相关血液指标的研究也并不少见[2,3], 但是对于手术对机体整体影响的研究却相对不足, 因此对此类患者进行围术期机体整体状态相关指标的变化研究极为必要。细胞因子是临床中与疾病及手术创伤均有密切关系的指标, 且是有效反应机体整体受到的应激的重要方面[4,5], 因此对其变化的研究价值较高。
本文中我们即就胸腔镜腹腔镜联合治疗对食管癌患者血清细胞因子的影响进行观察研究, 研究结果显示, 两类腔镜联合应用治疗的患者其血清IL-1β、IL-6、TNF-α及IFN-γ等细胞因子检测结果显著地低于传统开胸手术, 说明机体受到的手术创伤应激相对较小, 疾病控制治疗效果也较好。
综上所述, 我们认为胸腔镜腹腔镜联合治疗对食管癌患者血清细胞因子的影响较大, 说明其对机体的综合不良影响相对更小。
参考文献
[1]王晓骏, 张铸, 孙清超.胸腹腔镜联合下食管癌切除术与开放手术疗效对比的Meta分析[J].世界华人消化杂志, 2014, 22 (3) :375-382.
[2]彭江洲, 陈柏深, 刘德纲, 等.经单一切口腹腔镜手术系统 (SI LSPort系统) 胸、腹腔镜联合在食管癌根治术中的应用[J].中国微创外科杂志, 2014, 14 (1) :60-62.
[3]董泽清, 魏斐.胸腹腔镜联合食管癌切除术与左颈、左胸食管癌手术颈部吻合口瘘的观察[J].中国伤残医学, 2014, 22 (1) :61.
[4]袁卫东, 王勇, 吴奇勇, 等.胸、腹腔镜联合手术治疗食管癌的可行性和疗效观察[J].广东医学, 2013, 34 (23) :3.