蜂胶的指纹图谱研究

蜂胶的指纹图谱研究（精选6篇）

蜂胶的指纹图谱研究 第1篇

1 仪器、试药与材料

1.1 仪器:

Waters 1525型高效液相色谱仪 (美国Waters公司, 包括:2487紫外检测器, 2707自动进样器, Empower-2色谱工作站) ;CQ-250超声波清洗器 (上海船舶电子设备研究所) ;Simplicity TM型超纯水系统 (美国Millipore公司) ;Mettller Tkledo AG135双量程电子天平 (十万分之一) 。

1.2 试样:

对照品:白杨素对照品 (批号111 7 0 1-2 0 0 5 0 1) , 高良姜素对照品 (批号111699-200501) , 乔松素对照品 (批号100080-200707) , 蜂胶对照药材 (批号121324-200301) , 对照品均由中国药品生物制品检定所提供。所用试剂甲醇为色谱纯, 其他均为分析纯。样品:蜂胶为课题组收集云南 (样品编号16、17) 、四川 (编号35、37、38) 、江西 (编号90、99、103, 104, 106) 、湖南 (编号111, 117, 119) 、山东 (编号128、129) 、河南 (编号27、43, 45, 47) 、山西 (编号50、52、57) 、内蒙 (编号130、134、136) 、辽宁 (编号138) 、陕西 (编号2、4) 、甘肃 (编号10、15) 、新疆 (编号31) 、浙江 (编号86、87、88、89) 等地, 经江西省中医药研究院副研究员余良忠鉴定为蜜蜂采集植物树脂等分泌物与其上颚腺、蜡腺等分泌物混合形成的胶黏性物质。杨树胶:58、59、62、63、64、65、66、153~159 (购于河南) 。

2 方法和结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液的制备:

取蜂胶样品粉末 (52号) 约60 mg, 精密称定, 置50 m L容量瓶中, 加入甲醇30 m L, 超声处理30 min, 放冷, 再用甲醇定容至刻度, 摇匀。

2.1.2 对照品溶液的制备:

分别取白杨素、乔松素、高良姜素对照品各适量, 精密称定, 加甲醇使溶解并稀释, 摇匀, 分别制成每毫升含乔松素8.523μg, 高良姜素34.576μg, 白杨素18.36μg。

2.2 色谱条件:

色谱柱为YMCC18 (250 mm×4.6 mm, 5μm) ;流动相:A:甲醇-B:0.1%磷酸溶液进行梯度洗脱, 梯度洗脱程序为:0~20 min由30%A升至45%A, 20~50 min由45%A升至55%A, 50~90 min维持55%A;柱温:35℃;检测波长:285 nm;进样量:10µL。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度考察:

取蜂胶样品, 按2.1.1项制备方法制成供试品溶液, 连续进样6次, 测定, 采用国家药典委员会推荐用的中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版计算得到相似度。结果表明:各色谱峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均小于1%, 相似度大于0.98, 仪器精密度较好。

2.3.2 稳定性考察:

取上述供试品溶液, 分别在0、2、4、8、12、24 h进样测定, 计算10个主要色谱峰面积并计算相似度。结果表明:各色谱峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均<2%, 相似度>0.99, 说明样品在24 h内稳定。

2.3.3 重复性考察:

取同一批蜂胶样品6份, 按照2.1.1项制备方法制备供试品溶液, 进样测定, 结果表明:各色谱峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均<1%, 相似度在0.99以上, 表明本测定方法重复性较好。

2.4 蜂胶对照指纹图谱的建立:

取10批蜂胶按2.1.1制备方法制成供试品溶液, 进样测定, 记录色谱图。分别在waters色谱工作站设定积分参数, 进行积分, 逐个以cdf数据文件的形式, 导出谱图的AIA文件, 再分别导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版 (国家药典委员会) 。对其中10个主要色谱峰进行色谱峰匹配, 结果见图1, 采用自动匹配生成对照指纹图谱见图2。

2.5 蜂胶指纹图谱相似度测定:

取以下蜂胶样品按2.1.1项制备方法制成供试品溶液, 进样测定, 所得的AIA色谱图文件与蜂胶对照指纹图谱分别导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004年B版 (国家药典委员会) , 进行多点校正, 并计算相似度, 蜂胶相似度计算结果见表1。

经计算机相似度计算, 35批蜂胶供试品色谱图与蜂胶对照指纹图谱进行比较, 相似度结果均>0.9, 目前的数据说明蜂胶批与批之间有较好的均一性。

2.6 杨树胶HPLC指纹图谱研究:

取不同批次的杨树胶按2.1.1项制备方法制成供试品溶液, 进样测定, 记录色谱图, 导出图谱如图3所示。结果表明:杨树胶均无1、2号共有峰, 多数样品无9号共有峰。

3 讨论

3.1 本实验对色谱条件的确定进行了优化选择, 通过对不同流动相、色谱柱、柱温和检测波长比较, 优化了色谱条件, 确定了梯度洗脱比例, 达到了有效分离, 色谱信息量大, 主要色谱峰分离度均>1.5, 通过耐用性试验证明该方法稳定性, 重现性好, 可用来评价蜂胶的质量。

3.2 蜂胶是蜜蜂从植物芽孢或树干上采集的树脂, 混入其分泌物加工而成的一种物质。研究结果表明, 我国蜂胶以采集杨树树脂为主, 蜂胶指纹图谱与杨树胶基本相同, 由于蜂胶混入了蜂蜜的分泌物, 在分泌物中酶等作用下, 蜂胶指纹图谱与杨树胶又有差别, 特别是杨树胶不具备蜂胶指纹图谱中的1、2、9号色谱蜂。因此, 指纹图谱对鉴别蜂胶和杨树胶具有重要意义。

3.3 不同地域植物差异较大, 蜂胶采集其树脂分泌物得到的蜂胶差异也大, 指纹图谱研究结果显示, 巴西蜂胶与我国蜂胶指纹图谱完全不同, 共有蜂及共有峰峰面积差异较大, 证明了巴西蜂胶植物来源与国产蜂胶存在较大差异[9], 而乌拉圭蜂胶指纹图谱与我国产蜂胶指纹图谱基本相同, 与区域植物资源相关[10]。

3.4 指纹图谱显示松属素 (6号峰) 、白杨素 (8号峰) 、高良姜素 (10号峰) 为蜂胶和杨树胶中主要化合物, 杨树胶几乎无1、2号峰化合物或9号峰化合物, 而巴西蜂胶主要成分在前端2、3号峰。因此, 指纹图谱对蜂胶的真伪、来源鉴别具有重要意义, 但对蜂胶掺假及不合格蜂胶的鉴别有待于进一步研究。

参考文献

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[2]杨琴, 朱美玲.蜂胶提取物及蜂胶保健食品的质量标准探讨及质量安全控制[J].蜜蜂杂志, 2008, 28 (1) :10-14.

[3]蒋春红, 吕武清.蜂胶的药理作用研究概况[J].中国医药指南, 2011, 9 (17) :42-43.

[4]朱磊, 李君.蜂胶的药理作用研究[J].中国当代医药, 2012, 19 (22) :24-25.

[5]吕武清, 文萍.蜂胶提取物制备工艺研究[J].中草药, 2014, 45 (6) :791-794.

[6]姚剑平, 文萍.蜂胶提取物总黄酮含量测定方法研究[J].中华中医药学刊, 2013, 31 (11) :2414-2416.

[7]范婷婷, 文萍.蜂胶总共同酮含量测定方法的探讨[J].中国医药指南, 2013, 11 (13) :63-64.

[8]文萍, 范婷婷.RP-HPLC测定蜂胶中乔松素、白杨素和高良姜素的含量[J].中国实验方剂学杂志, 2013, 19 (19) :108-110.

[9]周梦遥, 徐瑞晗.世界主要蜂胶的植物源及多酚类化合物的研究进展[J].中国蜂业, 2010, 61 (3) :5-10.

蜂胶的指纹图谱研究 第2篇

利用电喷雾质谱(ESI-MS)法建立龙胆质谱指纹图谱,研究其中代表性裂环烯醚萜苷类成分的`ESI-MS规律.采用甲醇超声法提取龙胆中裂环烯醚萜苷类成分,在正离子方式检测模式下直接进样,应用一级全扫描质谱建立其特征图谱.运用化学模式识别方法对图谱数据进行分析,发现秋季龙胆样品的聚集程度优于春季龙胆样品,根据春季、秋季药材样品的差异,可以对采收期进行区分;裂环烯醚萜苷类成分在二级质谱中易发生脱水、乙酰基、葡萄糖基等.电喷雾质谱法的精密度、稳定性、重现性均符合要求,且具有特征性强、分析速度快、样品用量少等优点.

作 者：齐静静 苑桂鑫 宋凤瑞 刘志强 王琦 刘淑莹 QI Jing-jing YUAN Gui-xin SONG Feng-rui LIU Zhi-qiang WANG Qi LIU Shu-ying  作者单位：齐静静,QI Jing-jing(中国科学院长春应用化学研究所,吉林,长春,130022;吉林农业大学,吉林,长春,130118)

苑桂鑫,宋凤瑞,刘志强,刘淑莹,YUAN Gui-xin,SONG Feng-rui,LIU Zhi-qiang,LIU Shu-ying(中国科学院长春应用化学研究所,吉林,长春,130022)

不同产地人参指纹图谱研究对比 第3篇

目前中药指纹图谱中应用最多的方法是高效液相色谱法，因为其对样品挥发度和热稳定性限制小，兼具高柱效、高选择性、灵敏度高的优点，比较适合中药材复杂体系的分析。所以，在参考前人的研究基础上，利用高效液相色谱法对人参药材进行多维谱图条件研究，寻找不同产地人参之间的识别因子以及通过人参药材与制剂指纹图谱的相关性分析，能科学评价及有效控制人参质量。

仪器与试剂

仪器。美国Agilent 1200 高效液相色谱仪；德国sartorius CP224S电子分析天平；天津奥特赛恩斯AS20600BDT超声波清洗仪；上海菲恰尔TDL-5A离心机。

试剂。乙腈（色谱纯，美国TEDIA公司）；磷酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；甲醇（分析纯，广州化学试剂厂）；乙醇（分析纯，广州化学试剂厂）；人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Re、Rf、Rg1（中国药品生物制品检定所）；Rc、Rd、Rh1（北京恒元启天化工技术研究院）

样品。本实验共收集人参药材26批，其中吉林12批，辽宁10批，北京、山东、加拿大、东北各1批。药用部位均为人参主根。

实验方法

色谱条件。色谱柱：phenomenex Kinetex C18 100?（100×4.6mm，2.6μm）；检测波长：203nm；柱温：25℃；流速：1.0mL/min；流动相：以乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，洗脱程序：0～17.5min，乙腈

19%，17.5～22.5min，乙腈变化到29%，22.5～35min，乙腈保持在29%，35～50min，乙腈变化至40%；分析时间：50min；进样量：5μL。

对照品溶液的制备。精确称取人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rh1、Rf、Rg1对照品适量，加甲醇溶解分别制成0.2mg/mL的对照品溶液。

供试品溶液的制备。取粉末（过四号筛）2g，精密称定，置具塞离心管中，加入70%甲醇20mL，超声提取（功率500W，频率40kHz）60分钟，3000转离心10分钟，上清液转移至50mL量瓶中，滤渣再加入70%甲醇20mL，再超声提取60分钟，离心，上清液转移至50mL量瓶中，用70%甲醇分次洗涤离心管，合并滤液，定容至刻度。经0.45μ m微孔滤膜滤过，取续滤液备用。

方法学考察

指纹图谱分析与建立。精密吸取对照品溶液和吉林供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，记录60分钟的色谱图。根据多批样品的指纹图谱给出的相关参数，所有组分在60分钟全部出峰。选取分离度以及峰形均较好的5～60分钟比较供试品谱图，其中19个峰为共有峰。根据保留时间确定5号峰为人参皂苷Re，是人参的指标成分之一，将其作为内参比峰。

精密度试验。精密称取吉林人参药材，按方法操作，制备供试品溶液。在色谱条件下，连续进样5次，记录指纹图谱。计算各共有峰相对于内参比峰的相对保留时间和相对峰面积比值。试验数据见表1。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和其相对峰面积比值的RSD均小于3.0%，表明方法精密度良好，符合指纹图谱技术要求。

稳定性试验。精密称取吉林人参药材，按方法操作，制备供试品溶液。在色谱条件下，分别在0、2、4、8、16小时进行分析，记录色谱图。计算各共有峰相对于内参比峰的相对保留时间和相对峰面积比值。试验数据见表2。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和其相对峰面积比值的RSD均小于5.0%，符合指纹图谱技术要求。

结果

辽宁人参药材HPLC指纹图谱中共有指纹峰的标定与技术参数的设定。将10批产自辽宁的人参指纹图谱中各共有色谱峰的相对保留时间、相对峰面积，及其指纹图谱输入国家药典委员会指定的中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）中，进行图形匹配及其数据匹配后，建立了供试品指纹图谱的共有模式，当中含有共有峰22个。取下对照品溶液，在色谱条件下，分别注入液相色谱仪，根据保留时间确定以上各种人参皂苷在谱图中的位置，可确定22个共有峰中，5、6、9、12、13、14、16、17、20号峰分别为人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rh、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd。

讨论

提取方法的选择。根据人参药材的主要成分特性，结合文献资料，实验对索氏除杂后超声提取、加热回流提取法、超声振荡法、加热回流后液液萃取、超声提取后液液萃取等多种方法进行了考察。结果显示，超声振荡法操作简便易行，便对这种方法作进一步优化。采用70%甲醇和70%乙醇为提取溶剂，不同提取时间进行对比，结果表明，70%甲醇的样品峰面积较70%乙醇的样品峰面积大，并且随着提取时间增加，峰面积也随之增加。浸泡过夜后超声与直接超声处理相比较，浸泡过夜稍好，但差异并不明显。因此，本文采用70%甲醇直接超声提取2次，每次60分钟作为人参药材提取方法。

流动相的选择。实验对乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.5%磷酸溶液3种溶剂系统进行梯度洗脱，以乙腈-0.1%磷酸溶液系统所得图谱的峰形较好、分离度大。所以选用乙腈-0.1%磷酸溶液流动相系统为本实验的流动相系统。

色谱柱的选择。分别采用phenomenex Kinetex C18 100A（100×4.6mm，2.6μm）、phenomenex Luna 5μ C18（2） 100A（150×4.6mm，5μm）、phenomenex Synergi 4μ Hydro-RP 80 A（250×4.6mm，4μm）、Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（150×4.6mm 5μm）、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（150×4.6mm 5μm）进行洗脱。结果表明：phenomenex Kinetex C18 100A柱洗脱出的色谱峰基本平稳，峰数多且分离度好，所以选用phenomenex Kinetex C18 100A柱作为本实验的色谱柱。

柱温的选择。分别选用25℃、30℃、35℃、40℃等4种柱温进行试验。结果表明：25℃时分离效果最好，所以选用25℃作为本实验的柱温。

不同产地人参指纹图谱的比较。各产地的人参药材的HPLC指纹图谱存在较大差异，北京、山东、加拿大均不含有人参皂苷Rf，但此3个产地的人参皂苷Rb1、Re、Rc的含量则比东北、吉林、辽宁的高。这说明以上 6个产地的人参药材由于生长的地理环境、纬度和气候的不同而导致主要化学成分含量差别很大。

指纹图谱相似度。本实验建立的指纹图谱分析方法预处理简单，色谱条件优越，出峰数量多且大多数组分达到了基线分离，指纹图谱相似度均在0.90～1.00之间，在分析未知样品时，凡未知样品与标准样本间的相似度达到以上标准，其他项目均符合质量标准时，均可作为合格药材入药。

指纹图谱HPLC条件：色谱柱：phenomenex Kinetex C18 100A（100×4.6mm，2.6μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脱）；检测波长：203nm；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；分析时间：50min。

结论

产地为吉林的人参指纹图谱共标示出19个共有峰；产地为辽宁的人参指纹图谱共标示出22个共有峰。利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，测得12批吉林的人参指纹图谱相似度结果均在0.90～1.00之间；10批辽宁的人参指纹图谱相似度结果均在0.90～1.00之间。

该人参指纹图谱分析方法预处理简单，色谱条件优越，出峰数量多且大多数组分达到了基线分离，可为有效控制人参药材的质量提供可靠的依据。

（作者单位：无限极（中国）有限公司）

蜂胶的指纹图谱研究 第4篇

建立了一种能同时测算中药中主要成分的油水分配系数Pow的功能化中药指纹图谱.采用微乳液电动色谱,以中药女贞子为例,对运行缓冲液浓度、pH值、十二烷基硫酸钠浓度等参数进行了优化.利用SPSS程序对磺胺等从女贞子中提取的6种标准化合物组分的迁移时间tm与其log Pow文献值进行非线性拟合,得到女贞子提取组分的标准方程线性关系良好(r=0.988 0).在相同的实验条件下测得化合物的log Pow与文献报道值较好的符合,证明该方法可靠.获得了能代表组分疏水化学特征的中药指纹图谱,测得女贞子的主要有效成分齐墩果酸的.log Pow为3.63.该指纹图谱较为可靠地提供了女贞子中各种成分的log Pow,直观地反映出各组分油水分配性质的分布,对中药有效成分提取溶剂的选择、剂型的设计及制剂工艺的改进具有指导意义.

作 者：颜磊 龚萍 袁林 蒋雪梅 夏之宁 YAN Lei GONG Ping YUAN Lin JIANG Xuemei XIA Zhining  作者单位：颜磊,YAN Lei(重庆大学化学化工学院药学系,重庆,400044)

龚萍,GONG Ping(重庆医药高等专科学校,重庆,400030)

袁林,YUAN Lin(烟台大学化学生物理工学院,山东,烟台,264005;重庆大学生物工程学院,重庆,400044)

蒋雪梅,JIANG Xuemei(重庆大学生物工程学院,重庆,400044)

蜂胶的指纹图谱研究 第5篇

【关键词】生化指纹图谱；品种鉴定；种子纯度

指纹图谱是指能够鉴别生物个体之间差异的电泳图谱，此电泳图谱多态性丰富，具有高度的个体特异性和环境稳定性，像人的指纹一样，因而被称为“指纹图谱”。它是鉴别品种、品系的有力工具，指纹图谱技术具有可靠方便、准确快速、不受环境影响等特点，反映了个体间的内在差异，因而极其适合于品种的鉴定工作。

目前在品种鉴定中应用较多的指纹图谱主要有两种：一类是较早开始研究的生化指纹图谱，包括同工酶电泳指纹图谱和蛋白电泳指纹图谱。另一类是九十年代之后发展起来的DNA指纹图谱，目前用于作物品种鉴定的主要有四种：RFLP、RAPD、SSR、AFLP。本文就两种生化指纹图谱技术的研究和应用进行综述，以期为农业生产服务。

1.同工酶电泳指纹图谱

同工酶差异主要是由决定酶蛋白本身的等位基因和非等位基因的差异造成，同工酶谱是基因表达后分子水平的表型，通过其谱带的分析能快速简便的识别出编码这些谱带的基因位点和等位基因。由于几乎25％的基因位点具有多态性,一般不同同工酶酶谱的差异表现为同一基因位点上的等位基因的差异，在分离群体中能区分所有可能的基因型，因而可用作指纹图谱。

从1959年Market和Moller首次提出同工酶的概念以来，同工酶研究得到了迅猛发展。70年代初期，同工酶电泳技术就应用于种子纯度鉴定。1973年，Singh利用酯酶同工酶、亮氨酸氨肽酶及磷酸酶同工酶的淀粉凝胶电泳，对10个燕麦品种进行鉴定，结果表明，每个品种都具有其特有的酶带，证明了利用同工酶电泳鉴定种子纯度的可靠性。1976年，Woods对抱球甘蓝进行了同工酶的淀粉凝胶电泳鉴定。

80年代以后，电泳方法不断改进，分析技术越来越精确，逐渐采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。Nielsen（1986）综合分析了1979-1986年间不同同工酶和不同电泳方法在大麦品种纯度上的鉴定后，认为聚丙烯酰胺凝胶电泳法是最具有潜力的品种纯度鉴定方法。利用这一技术，Freeman（1991）对早熟禾种子纯度进行了鉴定，并制作了一系列早熟禾品种的酯酶同工酶酶谱，以便于对照比较。国内，最早将这项技术应用于种子纯度鉴定的陆士伟[1]利用酯酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳测定了杂交水稻种子的纯度。颜启传[2]利用这一技术检测了杂交水稻及其三系种子的真实性和品种纯度，研究证明此方法具有灵敏度高、准确、经济、易于操作等优点。张春庆[3]利用过氧化物同工酶电泳鉴定了玉米自交系及其杂交种的纯度，取得较好的效果。

90年代以后，同工酶电泳技术广泛应用于作物品种纯度鉴定上，许多工作者在水稻、玉米、大白菜等作物品种纯度鉴定方面做了大量的工作，取得了良好的经济效益。

同工酶电泳酶带的显现灵敏，较易获得成功，一次可进行多种酶的分析，从而大大提高了种子纯度检测的功效，具有速度快、费用低、准确度高等优点[4]，因此一度应用于作物纯度检测。然而，同工酶的表达在时间和空间上的特异性又影响着同工酶在不同组织或器官中的分布与活性。酶的提取和电泳技术的实验条件要求严格，可利用的同工酶非常有限,并有酶谱不纯的现象，因而在生产实践中未得到推广应用。

2.蛋白电泳指纹图谱

蛋白质作为基因的直接稳定產物，能反映生物DNA组成上的差异，但适合鉴定品种的基因产物必须在品种间存在较高的多态性，且易于检测出来。植物胚乳（种子）贮藏蛋白就是符合要求的一类基因产物，这些蛋白的组成由遗传决定，不受环境影响，其组分上的差异可反映出基因型的不同，因而可作为品种的“生化指纹”。

自70年代以来，蛋白质电泳作为鉴定品种的一种方法引起了人们的极大兴趣。Ellis（1977）利用淀粉凝胶电泳分析了29个英国小麦品种的醇溶蛋白，除极个别外，这些品种都能被区分开。他们认为，每品种分析50粒种子，既不需花费很多时间，又能保证结果统计的准确性。Shewry（1978）利用SDS-PAGE技术对大麦种子醇溶蛋白进行了分析，成功地将88个大麦品种分为29个种类，显示了醇溶蛋白电泳技术在品种鉴定上的巨大价值。Lookhart（1982）建立了一种标准化的麦醇溶蛋白鉴定技术。1986年，国际种子检验协会将大麦、小麦品种醇溶蛋白电泳鉴定技术列入国际种子检验规程。Cross对玉米的胚蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，成功区分了自交系和杂交种。Anisimova（1989）对53个向日葵品种的球蛋白电泳图谱进行比较，表明球蛋白多态性丰富，可用于品种、自交系同质性和遗传纯度的鉴定。Varier（1992）利用球蛋白的SDS-PAGE技术对向日葵的4个杂交种及其亲本自交系进行了研究，总共检测到了27条带，除3条共有带外，其他带的有无可以决定品种间基因型的不同。

此后，蛋白质电泳鉴定种子纯度技术迅速发展起来，广泛应用于小麦、玉米、番茄等作物。同时电泳技术也日臻完善，在品种鉴定和纯度分析中主要有以下两种方法，即根据蛋白质等电点不同来分离的等电聚焦电泳法（IEF）和根据蛋白质分子量不同来分离的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。此外，毛细管电泳技术（CE）、超薄等电聚焦电泳技术（UTLIEF）、酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（Acid-PAGE）、双向电泳技术（2-D）、高效液相色谱技术在蛋白质分离方面也有很多应用，并显示了强大的优势。

蛋白质电泳技术是目前种子纯度检验中广泛适用的方法。蛋白质提取容易，无需低温，需时较短，成分数量稳定，具有较高的准确性和广泛的适应性[5]。但值得注意的是，由于基因表达有时会受到器官、发育阶段甚至环境条件的影响，故进行电泳鉴定时，除了电泳条件的适当选择外，试验材料的采集也直接影响了鉴定的准确性。另外对于某些遗传组成非常接近的品种，如保持系和不育系，不易找到特异蛋白，采用蛋白质电泳难以发现特征带。此外，蛋白质电泳图谱易受种子发育阶段及表达器官的影响，有时不够稳定，影响了电泳图谱的分析，从而影响了鉴定结果的准确性[6]。并且，随着近几年杂交组合的不断推陈出新，品种之间的差异甚微，亲缘关系较近，鉴定更加困难。

3.结语

纯度是种子重要的质量指标，也是种子分级的主要依据。低纯度、真实性差的种子给农业生产带来极大的损失。再者，在短期经济利益的驱动下，一些不法分子常以牺牲种子纯度为代价来获取高额利润，损害消费者的利益，严重影响了正常的农业生产，成为全国良种推广、总产提高的一大潜在障碍。指纹图谱标记是近年来发展快、应用面广、准确性较高的种子纯度鉴定方法，它在分子水平上对不同遗传特性的种子给予辨别，有准确、可靠、快速和不受外界环境条件影响的特点。采用指纹图谱技术建立一套主要作物的标准指纹图谱，对防止伪劣种子流入市场，提高种子市场规范化具有重要意义。

参考文献

[1]陆士伟,黄炳权,邝章标等.应用酯酶同工酶测定杂交水稻杂种纯度的研究.中国农业科学,1982,(15):10

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[3]张春庆等.NAV-PAGE技术与玉米种子纯度测定.中国农业科学,1995,（6）：20-24

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[6] 管晓春,刘康.浅谈种子纯度及真实性室内鉴定.种子,1998,(3):74-76

巴西橡胶树主栽品种指纹图谱构建 第6篇

关键词 橡胶树 ；SSR标记 ；聚类分析 ；品种鉴别

分类号 S794.1

巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）属大戟科（Euphobiaceae）橡胶树属（Hevea），是生产天然橡胶胶乳的主要树种。天然橡胶不仅是重要的工业原料，而且是一种重要的战略资源，在国民经济的发展中发挥着重要作用[1]。准确地鉴别巴西橡胶树品种或无性系，建立可靠的巴西橡胶树品种或无性系分类和鉴定体系具有重要意义。以往巴西橡胶树品种或无性系的分类与鉴定，仍延用1963年创立的以蜜腺、大叶枕、小叶柄、叶脉、叶形、株形等形态特征为基础的形态学鉴定方法，但形态鉴定易受形态性状的数量限制，多态性差、时间长，且容易受环境影响的特点[2]。特别是天然橡胶树栽培种质遗传基础狭窄，经50多年的近亲繁殖和选择育种，目前生产上使用的主栽品种形态差异较小，多数是全同胞或半同胞品种，仅用形态学很难进行区分。因此，建立一种快速、准确、有效的方法，用于橡胶树主栽品种鉴定，将有助于解决生产中品种鉴定难的问题。

DNA分子标记反映的是遗传本质上的差异，用于品种鉴定时具有周期短、不受环境条件影响、真实可靠等优点。随着分子生物学的不断发展，出现了多种DNA分子标记技术，如RAPD、RFLP、SSR、ISSR、AFLP等，其中SSR被认为是一种十分有效的分子标记技术，已被应用于评价遗传多样性、指纹图谱和绘制遗传图谱等各类巴西橡胶树研究中。华玉伟等[3]利用11 809条橡胶树ESTs，检索到258个SSR位点，最终筛选到40对具有多态性的SSR引物。谢黎黎等[4]从88对SSR标记中筛选5对，用于构建87 份橡胶树无性系的指纹图谱。冯素萍等[5]以热研88-13×IAN873 的94 个F1群体，建立了91个SSR标记的共18个连锁群，覆盖橡胶树基因组1 937.06 cM。李维国等[6]利用19 对引物对41 份橡胶树材料进行多态性检测，共获得92 个多态性位点， 每对引物检测到的等位基因数为2～7 个，平均为4.84 个。龙青姨等[7]利用25 对EST-SSRs 引物， 对中国热带农业科学院橡胶研究所国家橡胶树种质资源圃中保存的来自6 个国家的278 份魏克汉种质进行遗传多样性和遗传分化分析。Gouvêa等[8]对来自包括亚洲，非洲和亚马逊等60个橡胶树基因型遗传多样性， 利用68个多态性SSR标记，可将这些种质分为6组。Souza等[9]利用284个SSR标记构建23个连锁群，总长度为2 688.8 cM。

笔者利用已有的SSR分子标记对我国现有橡胶树主栽品种资源筛选高效SSR标记，构建指纹图谱并进行亲缘关系分析，以便为快速准确鉴定橡胶树品种提供技术支撑，对育成新品种进行有效保护具有十分重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验24个橡胶树主栽品种均取自中国热带农业科学院橡胶研究所国家橡胶树种质资源圃，材料具体名称见表1。

1.2 方法

1.2.1 总DNA的提取与检测

取变色期叶片，总DNA提取参照改良CTAB法[9]。取1 μL样品于1%的琼脂糖凝胶电泳检测，利用紫外分光光度计检测DNA纯度。

1.2.2 PCR扩增与检测

本研究所用的标记均来自于前人已开发的SSR标记，合成75对SSR引物[3-4，9]、PCR产物扩增、6%聚丙烯酰氨凝胶电泳、染色方法见Creste等[10]的研究。

1.2.3 数据分析与处理

SSR引物扩增每条多态性带视为1个等位基因位点，将观察到的每条带视为一个性状，有带时赋值为“1”，无带时赋值为“0”，建立数据库；用NTSYS-pc 2.10 e分析软件进行遗传相似性系数计算，并按UPMGA法进行聚类分析，构建树状系谱图。计算SSR位点的多态性信息量（PIC）。PIC=1-∑Pi2，其中Pi表示i位点的基因频率，利用Popgene软件计算香农指数（I）和基因多样性（GD）。

1.2.4 指纹图谱构建

将每个品种的SSR扩增产物所有谱带按扩增片段从小到大的顺序编号，用二位代码描述（依次为01、02……），对照参照品种的谱带确定待测样品的基因型。纯合位点的等位变异数据记录为XX，其中X为该位点谱带的代码；杂合位点的等位变异数据记录为XY，其中X、Y为该位点上2个不同的谱带。小片段在前，大片段在后。

2 结果与分析

2.1 SSR标记多态性分析

根据SSR扩增结果，每对引物检测的扩增位点数为2～10个，多态性位点数为2～5个，多态性比例为44.4%～100.0%（图1为标记SSR 39电泳图）。平均香农信息指数为0.95；基因多样性变幅为0.12～0.76，平均值为0.54；PIC值变幅为0.11～0.71，平均值为0.48。见表2。

2.2 指纹图谱构建

记录24个品种的SSR分子指纹图谱（表3）。

2.2 种质资源的遗传相似系数及聚类分析

根据SSR分子标记，统计不同基因型数据结果，利用NTSYS-pc V 2.10软件，采用UPGMA计算24个主栽品种两两间的遗传相似系数，得到相似系数矩阵。结果表明，24个主栽品种遗传相似系数次数分布图可知（图2），遗传相似性主要集中在0.55～0.80，占80%，近20%分布于两侧，说明天然橡胶的遗传性状差异较小，多样性较低。

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根据24个主栽品种遗传相似系数矩阵，对品种进行聚类分析并建立聚类性状图（图3）。

以0.68为阈值，24份橡胶树品种可分为3类：第一类包括18份材料，第二类包括5份材料，第三类包括1份材料。通过对24个品种聚类分析发现，具有相同来源的多数品种聚为一类，如第一类中的多数品种（热研7-20-59、热研7-33-97、文昌11、保亭235、热研78-3-5、热研88-13、热研6-231）含RRIM600的遗传背景，与RRIM600聚在一起。含有GT1背景的云研77-2与GT1聚为一起，但也有例外，如含有PR107背景的湛试327-13，并未与PR107聚为一类。总之，遗传相似系数聚类分析结果基本上反映了品种之间的亲缘关系。

3 讨论

微卫星标记（SSR）由于具有多态性高、共显性、重复性好和特异性强等特点，已成为研究种质资源遗传多样性、指纹图谱构建的首选标记。刘冠明等[11]对南方花生主产区20个品种进行了SSR分析，并构建其指纹图谱，该图谱能将19个品种相互区分。Bredemeijer等[12]用20个SSR引物构建了500个马铃薯品种的DNA 指纹图谱，能准确地将其中的纯合品种鉴定出来。郭海林等[13]用2对引物建立了11个结缕草优良品系的DNA指纹图谱。本研究利用14对多态性SSR标记，对24份橡胶树主栽品种进行分析，这24份橡胶树主栽品种几乎涵盖了中国目前生产上使用的主栽品种。本研究建立的指纹数据库对橡胶树品种鉴定和品种保护具有理论和现实意义。

此外，遗传相似性次数分布图未呈正态分布，绝大部分遗传相似性集中在0.55～0.80，另有将近20%的相似性次数分布在两侧，说明橡胶树主栽群体遗传信息较为狭隘，遗传差异较小。橡胶树栽培种质都起源于魏克汉从原产地亚马逊河流域引种的野生种质，经过驯化形成了栽培品种，且育种工作者又往往选用生产性状比较优良的品种作亲本，这样，使很多品种之间的亲缘关系比较近，也使得橡胶树品种的遗传基础变得越来越狭窄。本实验的结果也恰恰证明了这一点。当遗传基础比较狭窄的群体遭遇较大自然灾害时，容易大面积受害。因此，深入了解橡胶树种质资源的遗传多样性，利于有针对性地选择杂交亲本，从而在实际选育种中选择亲缘关系较远的亲本

进行组配，有望获得较大的杂种优势，育成高产、抗寒的橡胶树新品种。

参考文献

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[3] 华玉伟，卢 轶，龙青姨，等. 橡胶树EST-SSRs发掘研究[J]. 热带作物学报，2008，29（5）： 583-588.

[4] 谢黎黎，黄华孙，安泽伟，等. 基于SSR 标记的橡胶树无性系鉴定方法的建立[J]. 热带作物学报，2009，30（9）：1 314-1 319.

[5] 冯素萍，李维国，于 飞，等. 巴西橡胶树SSR 遗传图谱的构建[J]. 遗传，2010，32（8）：857-863.

[6] 李维国，冯素萍，郑学项，等. 用EST-SSR 标记分析巴西橡胶树的遗传多样性[J]. 热带作物学报，2009，30（12）：1 711-1 719.

[7] 龙青姨，华玉伟，高 战，等. 利用EST-SSRs标记分析巴西橡胶树魏克汉种质的遗传多样性及遗传分化[J]. 热带作物学报，2010，3（6）： 873-880.

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[13] 郭海林，刘建秀，高 鹤，等. 结缕草属优良品系SSR 指纹图谱的构建[J]. 草业学报，2008，16（2）：53-59.