血浆降钙素基因相关肽

血浆降钙素基因相关肽（精选7篇）

血浆降钙素基因相关肽 第1篇

1 资料和方法

1.1 一般资料

选择2010年6月～2011年1月在湖北宜昌市第一人民医院择期行全麻下鼻内镜手术的老年患者,ASAⅠ、Ⅱ级,术前心、肺、肝、肾功能正常,无水电解质紊乱和酸碱失衡,无高血压和控制性降压禁忌证。以下情况排除:(1)内分泌疾病史者;(2)可疑气管插管困难者;(3)药物或酒精依赖史者;(4)近期服用心血管活性药物者。共收集86例,男58例,女28例;年龄65～73岁。随机分为前列腺素E1组(P组)和硝酸甘油组(N组),每组43例。实验经院医疗伦理委员会同意并备案,所有纳入实验的患者均已签署知情同意书。

1.2 麻醉方法

两组患者均于麻醉前30 min肌内注射盐酸戊乙奎醚8μg/kg(不超过1 mg)。入室后连接多功能监护仪,持续监测心电图、血压和脉搏血氧饱和度。以地塞米松10 mg、咪唑安定0.06 mg/kg、依托咪酯0.2 mg/kg、顺阿曲库铵0.15 mg/kg、雷米芬太尼1μg/kg(注射时间≥60 s)顺序静注麻醉诱导,气管插管后行间歇正压通气(IPPV),监测呼气末CO2分压,使其维持在33～38 mm Hg,并行一侧足背动脉穿刺置管,测动脉压。麻醉维持采用靶控输注(TCI)丙泊酚(血浆靶浓度1.5～2.5μg/m L)和雷米芬太尼(靶浓度2.0～4.0 ng/mL),泵注顺阿曲库铵1.0μg/(kg·min),并调整丙泊酚和雷米芬太尼血浆靶浓度使脑电双频指数(BIS)维持在40～60之间。术中输注林格液和10%羟乙基淀粉液,调整循环血容量,维持血压和心率平稳。

1.3 降压方法

麻醉平稳后开始降压,血压稳定于目标血压基本在麻醉后15 min左右。P组前列腺素E1(凯时,北京泰德制药,批号5061E)以0.1～0.4μg/(kg·min),N组硝酸甘油(北京益民药业,批号20100125)以0.5～5.0μg/(kg·min),调整降压药入血速度使平均动脉压(MAP)下降25%～30%,但MAP不低于55mm Hg,手术结束前停止降压。不使用其他拮抗剂或催醒剂。

1.4 监测指标

分别记录在麻醉前(T0)、降至目标血压时(T1)、降至目标血压后30 min(T2)、停降压时(T3)及停降压后30 min(T4)的MAP和HR;以上4个时点静脉采血4 m L,置于含有抗凝试管中离心分离血浆,-20℃保存用于测定ET和CGRP。采用放射免疫分析法,操作按说明书要求进行。

1.5 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示,组内比较采用配对t检验,组间比较采用重复测量资料方差分析,计数资料采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

两组患者的性别、年龄、体质量、麻醉时间、降压时间等差异均无统计学意义,见表1。降压前两组患者MAP、HR差异无统计学意义;T1～T3两组MAP均稳定在降压目标水平,较降压前下降(P<0.05);P组HR与降压前比较减慢但差异无统计学意义(P>0.05),而N组HR较降压前增快且P组HR慢于N组,差异有统计学意义(P<0.05)。T4时两组MAP均回升至降压前水平;P组HR仍维持复压前水平,而N组HR较复压前减慢(P<0.05),两组比较差异无统计学意义。LAC两组各时点及组间比较差异无统计学意义。见表2。

降压后,ET值两组均升高,P组虽升高但降压前后差异无统计学意义,N组自T2起与T0比较差异有统计学意义,且高于P组(P<0.05);P组CGRP自降压后开始升高,T1～T4与T0比较差异有统计学意义,N组CGRP在降压完成时升高但随即开始下降,T2～T4低于P组,差异有统计学意义(P<0.05);P组ET/CGRP在降压前后变化不明显,而N组随着降压时间延长开始上升,T2～T4高于T0且高于P组(P<0.05)。见表3。

注:1)与T0比较,P<0.05;2)与T3比较,P<0.05;3)与P组比较,P<0.05

注:1)与T0比较,P<0.05;2)与P组比较,P<0.05

3 讨论

老年患者自主神经的退行性变使其对心血管的调控能力下降,神经体液因素调节血管的功能减退,老年人血管活性物质(如儿茶酚胺类等)产生和分泌减少,α、β等肾上腺素能受体下调,使调节功能减退,在麻醉或手术刺激时容易引起血压反射性地升高,导致血液流变学不稳定。控制性降压理想的方法和药物应具备降压迅速、低血压水平容易维持、心输出量无明显减少,组织灌注良好、重要器官氧耗不增加、停药后血压回升快而无反跳等特点。目前临床用的几种降压药,如硝普钠、硝酸甘油等存在明显的缺陷[2],有些药物可能不适合老年患者。前列腺素E1可以扩张血管、抑制血小板聚积、松弛支气管平滑肌;主要松弛阻力血管而降压,增加肾脏血流,对冠状血管有扩张作用,减轻心脏前后负荷,无明显心率增快[3]。

ET和CGRP分别作为体内作用最强的收缩血管和扩张血管的生物活性多肽,对维持血压的动态平衡具有十分重要的意义。ET主要在内皮细胞中表达,内皮细胞损伤时释放,广泛地分布于全身各组织,它通过收缩血管,增加血管对其他缩血管物质如去甲肾上腺素和5-羟色胺的缩血管反应,增加外周血管阻力而升高血压[4,5];参与循环系统的调节,并刺激一些舒血管物质释放,共同影响循环的稳定;ET还可以增加微血管通透性,使蛋白外渗,激活炎症细胞,引起炎症反应。CGRP主要分布在中枢和周围神经,广泛存在于心血管系统、内分泌、消化系统等各个组织内,CGRP通过强烈舒张血管降低血压,增加血流量来对抗组织损伤,对血管内皮细胞起重要的保护作用,并与其他激素相互作用共同维持循环功能的稳定;CGRP对ET具有生物学拮抗作用,是内源性ET拮抗剂[6,7,8]。国内外的研究己证实ET与CGRP参与了围手术期血流动力学稳定的调节,是创伤与应激时病理生理改变的重要组成部分[9,10]。

在笔者的研究中,麻醉诱导使用对血流动力学干扰较小的依托咪酯和顺阿曲库铵,维持采用血药浓度较稳定的靶控输注,减少对检测指标的影响。乳酸是无氧酵解的代谢产物,其含量可反映组织灌注情况,即组织是否缺氧及缺氧程度,笔者实验中监测到两组均未发生乳酸积聚,表明两组在降压期间均能提供良好的组织灌注。P组使用前列腺素E1降压期间心率并无明显变化而N组出现心率增快,两组心率的变化差异有统计学意义(P<0.05),对于老年患者可能氧耗增加而出现相应并发症,见表2。P组在降压后,ET值有所升高,但降压前后差异无统计学意义,而N组自降压稳定30 min起ET升高,且高于P组(P<0.05)。ET强烈的心血管毒性作用,使老年人手术麻醉中潜在危险性增加,而PGE1具有扩张血管,抑制血小板凝集,增强红细胞变形能力,防止再灌注损伤及稳定溶酶体膜等作用,在功能上对ET有拮抗作用,因此在需要降压时PGE1能提供相对稳定的血管阻力;P组CGRP自降压后即明显升高,至复压后仍维持较高水平,N组CGRP在降压完成时升高但随即开始下降,低于P组;反映血管舒缩性能的ET/CGRP,P组在降压前后变化不明显,而N组随着降压时间延长开始上升,高于降压前且高于P组(P<0.05),复压后仍未恢复,ET/CGRP的失衡表明硝酸甘油在降压时,机体神经内分泌系统对血管的调节功能很难适应,而PGE1降压时ET/CGRP更稳定,更容易维持血管的舒缩性能和机体对血管的调节功能。

综上所述,老年患者应用前列腺素E1控制性降压,与硝酸甘油比较,能较好地抑制血浆内皮素的作用,促进降钙素基因相关肽的释放,维持ET/CGR P的稳定,有利于维持老年患者在降压和复压期间对血管的调节功能。

摘要：目的 研究前列腺素E1用于老年患者控制性降压时对血浆内皮素(ET)和降钙素基因相关肽(CGRP)的影响。方法 86例择期全麻下行鼻内镜手术的老年患者随机分为前列腺素组E(1P组,43例)和硝酸甘油组(N组,43例)。两组分别以前列腺素E1和硝酸甘油持续输注,使平均动脉压(MAP)下降25%～30%。以麻醉前(T0)、降至目标血压时(T1)、降压后30 min(T2)、停降压时(T3)及停降压后30 min(T4)为时点,记录两组MAP、HR和血乳酸(LAC)及ET、CGRP和ET/CGRP值。结果 在T1、T2和T3时间点N组HR较降压前增快,P组与降压前接近,N组高于P组(P<0.05)。N组在T2、T3和T4时间点ET值较T0时升高(P<0.05),P组降压前后结果相似,且N组高于P组(P<0.05);P组CGRP自降压后开始升高,T1～T4与T0比较差异有统计学意义,N组CGRP在降压完成时升高但随即开始下降,T2～T4低于P组(P<0.05);P组ET/CGRP在降压前后变化不明显,而N组T2～T4高于T0且高于P组(P<0.05)。结论 前列腺素E1用于控制性降压能维持ET/CGRP的稳定,有利于维持老年患者在降压和复压期间血管的正常调节功能。

关键词：血浆内皮素,降钙素基因相关肽,前列腺素E1,控制性降压,老年患者

参考文献

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血浆降钙素基因相关肽 第2篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择我院2005年9月~2009年12月收治的经确诊的Ⅰ、Ⅱ期原发性高血压病患者60例,其中,男38例,女22例,平均年龄(44.2±5.9)岁;所有患者均无严重的心、脑、肝、肾病及糖尿病病史。将60例患者设为观察组,使用硝苯地平缓释剂治疗,治疗期间禁用其他影响血压的药物。另外随机选择我院同时期门诊健康体检者60例为对照组,其中,男33例,女27例,平均年龄(54.7±5.7)岁。两组在性别、年龄及病史上无明显差异。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法

观察组给予硝苯地平缓释片(扬子江药业集团江苏制药股份有限公司,批号:H32026198),开始剂量20 mg,每日2次,2周后如果未达到治疗目标血压(<140/90 mm Hg),则增至20 mg,每日2次,服用4周。

1.2.2 检测方法

本文两组患者均采用放射免疫法进行检测,取两组患者晨空腹外周静脉血2 ml置入含10%EDTA-Na230μl和抑肽酶40μl(400 IU)的塑料试管中,4℃,3 000 g离心10 min,取上层血浆置入-30℃冰箱中保存以备测定血浆ET和CGRP浓度。使用解放军总医院的ET和CGRP试剂盒,应用美国ATL-Ultramark 9彩色多普勒超声心动图(UCG)测定左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室后壁和室间隔厚度以及左心房内径(LAD)。

1.3 统计学方法

数据由SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理,方差分析数据以均数±标准差表示,组间计量资料采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

本组60例EH患者经硝苯地平缓释片治疗前后ET及CGRP含量变化与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

由表1可见,观察组治疗前ET水平明显高于对照组,而CGRP明显降低(P<0.05)。观察组使用硝苯地平缓释剂治疗后ET水平降低,而CGRP升高(P<0.05)。

对60例EH患者进行彩色多普勒超声心动图测定,比较ET和CGRP含量,见表2。

与左室壁正常者比较,*P<0.01;与LVEDD正常者比较,△P<0.05,*P<0.01;与LAD正常者比较,*P<0.01,△P<0.05

硝苯地平缓释片治疗前后对EH患者血浆ET、CGRP浓度和血压的影响,见表3。

由表3可见,硝苯地平缓释剂治疗后EH患者血压各指标较治疗前明显降低(P<0.05)。

3 讨论

内皮素(ET)广泛存在于人体的组织和细胞中,ET作为人体调节心血管功能的重要因子,主要作用于维持基础血管张力和心血管系统稳态。ET-1是迄今为止发现的作用最强的缩血管物质,其引起的血管收缩、心肌缺血、代谢紊乱和细胞增殖是与血管损伤有关疾病的共同致病因素[3]。

本研究发现EH患者的血浆ET浓度较对照组显著升高,CGRP浓度显著降低,并且随疾病程度加重而明显变化。DBP与ET呈显著正相关,与CGRP呈显著负相关,ET与CGRP呈显著负相关。可见,EH患者存在着血管舒缩功能障碍,缩血管物质的明显升高和扩血管物质的显著降低,导致血管收缩和血压升高,血压升高反过来进一步加重血管内皮细胞损伤和交感神经兴奋,使ET更加升高,CGRP更趋降低,继而造成恶性循环。

硝苯地平缓释片(心痛定)现已用于多种疾病的治疗。该种药品能较好地改善心、脑、肾等器官功能,在人体内有着广泛的生物效应,不断为人们所认识,长期服用不产生耐药性,与其他药物合用,能互补不足起协同作用,使用方便,疗效显著,毒副作用小,是目前临床应用较广泛较理想的钙拮抗药。对于高血压的治疗,可以解除血管平滑肌痉挛,降低外周血管阻力,降低血浆内皮素,降低血管收缩力,降低血压,可治疗各种高血压,并能逆转高血压所致的左心室壁肥厚,是目前治疗高血压的首选药物[4]。本研究还显示,EH伴左心肥大者的血浆ET浓度明显高于无肥大者,CGRP浓度明显低于无肥大者,提示ET浓度升高和CGRP含量下降与心脏肥大有着密切的联系。硝苯地平缓释片能同时舒张正常供血区和缺血区的冠状动脉,拮抗自发的或麦角新碱诱发的冠状动脉痉挛,增加冠状动脉痉挛患者心肌氧的逆送解除和预防冠状动脉痉挛,并可抑制心脏收缩、降低心肌代谢、减少心肌耗氧量。硝苯地平能舒张外周阻力血管,降低外周阻力,使收缩压和舒张压降低,减轻心脏负荷[5,6]。该药可延缓离体心脏的窦房结功能和房室传导,延长窦房结恢复时间和减慢窦房节律的作用,是临床应用较广泛较理想的治疗EH的常用药物。

参考文献

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血浆降钙素基因相关肽 第3篇

1 降钙素基因相关肽一般生物学特征

降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)是Amara和Rosenfeld等于1982年应用DNA基因重组和分子生物学技术首先发现的一种生物活性多肽。它与降钙素(CT)同源,二者来自同一个单拷贝基因,定位于第11号染色体(11p15.4),由2 800个碱基对组成,其中含5个内含子和6个外显子,基因全长7.6kb。该基因经转录、多聚腺苷酸化及选择性RNA拼接等加工过程,在甲状腺C细胞形成CT mRNA,在神经组织形成CGRP mRNA,后者进一步形成包括CGRP在内的三种肽段,发挥生物效应[1,2]。CGRP由37个氨基酸组成,分子量3 786.91。人和鼠的CGRP有α和β两种基因,两者具有类似的生物活性,但氨基酸组成仅在3、22、25位有所不同。研究发现CGRP广泛分布于中枢及外周神经系统,在脊髓背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)、三叉神经节内初级小型感觉神经元、脊髓和脑干的投射纤维中密度较高[3],其中α-CGRP主要分布于中枢神经系统,而β-CGRP则主要位于周围神经系统。

2 CGRP可能介导的信号转导途径

大量实验证实,CGRP与受体特异性结合后,可激活腺苷酸环化酶(AC),分解ATP,产生cAMP,进而表现出高度多样的生物学活性[4]。Edoff等[5]在体外培养幼鼠膝盖骨细胞中加入10-10~10-6M CGRP,10分钟时cAMP水平明显增加,但是同时加入CGRP与CGRP受体1拮抗剂时cAMP水平无变化。将脐静脉平滑肌细胞暴露于CGRP,引起剂量依赖性cAMP增加,应用CGRP8-37或cAMP依赖性蛋白激酶抑制剂(RP-cAMPS)后可逆转cAMP增加[6]。Hosaka等[7]发现低-中浓度(1~100nM)的CGRP,通过激活百日咳毒素敏感的G蛋白藕联CGRP受体,使内皮细胞释放NO,减少了几内亚猪淋巴管的收缩;而高浓度(500nM)的CGRP则可直接舒张平滑肌细胞,两种情况均导致PKA调节的ATP敏感的K+ 通道开放,出现超极化,说明CGRP能够促进cAMP的生成。Bivalacqua等[8]用腺病毒介导的CGRP转移基因(AdRSVCGRP)转导老年大鼠阴茎海绵体,与对照组比,5天后实验组CGRP增加3倍,而且提高了老年大鼠海绵体内cAMP水平。在上述诸多试验中均未观察到cGMP的任何变化,提示CGRP与肾上腺髓质素(AM)[9]一样,能使cAMP浓度上调,但不影响cGMP的水平。

CGRP介导的其他信号转导途径尚不十分清楚。也有人在三叉神经节、咽喉及颈静脉周围发现Ca2+/CaM依赖性蛋白激酶-Ⅱ(CaMK-Ⅱ)与CGRP或VR1的共同表达[10]。

3 CGRP与神经病理痛的研究进展

神经病理性疼痛是指由中枢或外周神经系统损伤或疾病引起的疼痛综合征,可由感染、创伤、手术、射线、代谢性疾病、肿瘤化疗、神经毒性药物、神经受压缺血、炎症和肿瘤侵袭等原因诱发,时间常超过3个月,呈慢性状态或过程。国际疼痛研究会(IASP)将其定义为“原发于或原发病灶引发的或神经系统功能障碍引起的疼痛”。慢性疼痛导致痛觉过敏的形成涉及许多复杂机制,但归结起来主要表现为2个方面:(1)外周机制:组织损伤、炎症反应以及神经损伤所释放的炎症介质,如K+、5-羟色胺、缓激肽、组织胺、花生四烯酸代谢产物等组织因子,可激活高阈值的Aδ和C纤维,使伤害性感受器的阈值下降,称之为末梢敏化;(2)中枢机制:伤害性刺激传入增多,可使脊髓后角神经元感受区扩大,同时神经元兴奋阈值下降,对阈上刺激反应增强、反应时间延长,对阈下刺激亦可产生兴奋,称之为中枢敏化。

3.1 CGRP在脊髓水平与疼痛的关系

现已知道,疼痛信号在进入高位神经中枢以前已在脊髓受到调控,即对疼痛信息的量、性质和时速进行调节、转换或控制。脊髓的这种功能主要集中在脊髓背角,脊髓背角是躯体和内脏传入的第一个驿站及传入输出相互作用的重要场所。在神经病理性疼痛状态,背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)及脊髓背角内的CGRP表达显著增加。在佐剂性关节炎慢性炎性疼痛时可见DRG神经元中CGRP生物合成增加,经体外冲击波治疗后疼痛减轻,同时可见DRG神经元CGRP表达减少[11]。在L5神经损伤(L5SNL)模型中,缩足阈值(PTW)出现持续性(>42天)下降,若先切断L5脊神经根,PTW出现短暂性的下降(<6天)。如果在L5SNL之前在试验鼠患侧后足神经鞘膜内注入神经激肽(NK1)和CGRP1拮抗剂,则可推迟PTW下降2~4天;但如果在L5SNL之后注射两种拮抗剂,则只有CGRP1拮抗剂可缓解PTW推迟105分钟。可见CGRP在神经损伤后大量释放,并自起始至维持阶段均有效[12]。也有人通过压迫背根神经节观察到术后5天到4周,大鼠脊髓背角内的CGRP明显持续升高,并与慢性痛行为时程一致[13]。Kanai等[14]在建立CCI(chronic constriction injury)模型中发现术后7~14天TRPV1蛋白水平显著上升,14天后,CGRP样免疫阳性(CGRP-LI)明显增强。在大鼠坐骨神经压榨伤模型中,两侧DRG和脊髓前、后角内的CGRP表达同时增强,且伤侧高于对侧[15]。在甲醛致痛实验中发现,投射到脊髓背角浅层的初级传入神经末梢中CGRP样免疫活性物质明显增多;佐剂性关节炎痛时,DRG神经元内CGRP2 mRNA表达明显增强;镇痛药可使DRG内CGRP免疫活性物质含量和脊髓内释放CGRP明显减少,并可使痛觉过敏程度减轻[16]。以上资料提示,疼痛时脊髓DRG神经元内CGRP2 mRNA表达上调,CGRP合成增加,在脊髓内释放增多,因而推测CGRP可能参与痛觉信息传递及痛觉过敏的形成。为进一步证明内源性CGRP在痛觉传递及痛觉过敏形成中起作用,研究者应用CGRP竞争性受体阻断剂CGRP8-37,发现可以部分逆转辣椒素诱导的痛觉过敏和异常性疼痛[17]。采用基因敲除技术获得的实验结果[18]也进一步支持这一推测:给予CGRP基因缺失大鼠伤害性刺激不表现出痛觉反应;在角叉菜胶诱导的关节炎模型中,动物不出现第二期痛觉过敏现象,热板实验的潜伏期不缩短且反而延长;免疫组织化学结果显示,在慢性炎症性痛时,CGRP基因缺失大鼠的脊髓背角和DRG内均缺乏CGRP样免疫活性物质的表达。可见CGRP是痛觉及痛觉过敏产生所必需的物质。应用外源性CGRP观察大鼠痛阈和脊髓背角神经元兴奋性的变化,也证实CGRP有促进伤害性信息传递和痛觉过敏形成的作用[19]。

3.2 CGRP在脊髓以上水平与疼痛的关系

在脊髓以上水平,CGRP及其受体出现在多个与痛觉密切相关的脑区,比如中脑导水管周围灰质(PAG)、伏核(NAc)、杏仁核等。Pecile等最早发现大鼠脑室内注射CGRP有镇痛效应。此后,在小鼠福尔马林模型上也取得相似结果[20]。有研究报道,中脑导水管周围灰质(peria-oueductal gray matter,PAG)内注射CGRP可剂量依赖地增加大鼠因热及机械刺激引起的缩爪反射的潜伏期(hindpaw withdrawal latency,HWL)[21],说明CGRP在脑内有镇痛作用。CGRP在PAG中的镇痛作用,是通过PAG到脊髓的下行痛觉抑制通路,激活脊髓内的阿片肽系统(尤其是μ型阿片受体)发挥镇痛作用。

4 结语

血浆降钙素基因相关肽 第4篇

1 降钙素基因相关肽 (CGRP) 简述

1982年, Amara等[1]发现, 人降钙素 (Calcitonin CT) 基因可产生两种不同的m RNA, 分别合成CT类激素和另外一种激肽, 由于其来源与CT基因有关, 将其命名为降钙素基因相关肽 (CGRP) 。1983年, Rosenfeld等[2]通过基因重组技术在小鼠甲状腺髓样癌细胞中首次分离出CGRP, 并提出了CGRP来源的模型。1984年, Morris等[3]证实, 人体中也存在有CGRP, 而且两者生物活性具有相近似性。

CGRP是由37个氨基酸残基组成的一种生物活性肽, 主要有CGRPRI和CGRPR2两种受体, 它们结合CGRP发挥生物学效应。CGRP在不同部位作用不同, 如CGRP分布于气道平滑肌具有支气管收缩效应, 而分布于气道血管则具有血管舒张作用, 分布于气道上皮可诱导上皮分化。CGRP自身分泌以及相关神经递质之间的失衡, 则会导致呼吸系统疾病乃至哮喘疾病的发生。

2 CGRP与哮喘

2.1 CGRP与气道炎症

有证据显示, 由体内ECE-1介导的CGRP降解可促进炎症向气道浸润, 导致肺部炎症向纤维化过渡[4]。另外, CGRP降解的产物可以引起嗜酸性粒细胞浸润, 同时刺激肥大细胞脱颗粒并释放多种活性物质, 进而导致血管通透性增加, 引发气道炎症。研究还发现, CGRP可促进T淋巴细胞与纤维连接蛋白粘附, 促进其向炎症部位迁移及浸润, 增加肺微血管通透性及氧化应激, 从而引起肺缺血再灌注损伤[5]。此外, Norihisa Mikami等[6]一项最新研究证明, CGRP还可以通过体内c AMP/PKA信号途径促进NFATC2激活PKA依赖性糖原合成酶激酶-3β失活, 产生IL-9, 而IL-9是由TH9细胞这种新颖的Th细胞亚群产生, 参与I型超敏反应引发气道炎症导致哮喘发生。

Xu, C.W.等[7]研究发现, 儿童急性哮喘发作期的血浆CGRP含量明显高于缓解期和正常对照组, 且血浆CGRP水平的升高与病情严重程度成平行关系。CGRP基因敲除的小鼠, 抗原诱导的气道炎症性明显低于CGRP野生型小鼠, 这说明了CGRP在支气管哮喘发病机制中具有重要作用。Kandace Bonner等[8]研究显示, CCL17可通过CCR4诱导呼吸道上皮细胞释放表达CGRP引发哮喘和过敏性疾病。以上实验证明, CGRP参与了慢性哮喘的气道炎症。

2.2 CGRP与气道高反应性

目前认为气道高反应性程度与气道炎症密切相关, 但两者并非等同。CGRP在肺内复杂的生理病理中起着神经免疫内分泌网络共同介导物的作用, 通过参与收缩支气管平滑肌、舒张血管、分泌粘液等途径, 引发气道高反应性, 影响哮喘的发病。Voedisch, S等证实, CGRP可通过调节肺部神经元树突状细胞 (DC) 信号的影响, 从而改变气道中的免疫调节机制, 引发气道变应性炎症[9]。

CGRP是目前已知最强的舒血管物质。体外实验证实, CGRP能够舒张肺血管, 有效增加肺循环血容量。CGRP通过抑制血管平滑肌细胞内Ca2+信号, 导致释放烟碱受体激活的负性变时作用降低, 从而发挥舒张血管效应[10]。但是CGRP本身并不能直接影响气道微血管通透性, 由于它能显著增加肺内气道血流量, 从而使其它促炎介质 (如P物质) 放大促进毛细血管后微静脉血浆渗出的效应, 因此, 哮喘发作时CGRP的释放增加可在一定程度上促进气道血浆渗出, 引发气道高反应性。

此外, 豚鼠等动物实验表明, CGRP刺激下, 粘膜粘液分泌量随着腺体血流量的增加而间接增加;Li, Y等[11]实验证实, CGRP可诱导分泌出不同类型细胞, 尤其是杯状细胞在动物气道上皮的分布, 促进其生物学和上皮免疫整合, 引起粘液分泌增多。由此说明, CGRP可促使细胞粘液分泌, 引发气道高反应, 加剧哮喘的伴随症。

CGRP对没有上皮覆盖的气道平滑肌产生收缩效应, 导致气道痉挛, 管腔狭窄, 诱发气道高反应性。由此可见, CGRP诱导肺内气道收缩与局部炎症使CGRP对气道的收缩作用成正比关系。最近, Mapp, P.I等[12]研究表明, CGRP可在体内通过激活CGRP受体刺激血管, 诱导内皮细胞增殖, 而且随着支气管内皮细胞CGRP免疫反应性的增加, 细胞增殖也大大增加, 收缩气道平滑肌的反应也随之显著。所以, 哮喘可以引发炎症使CGRP对气道的收缩作用加强, 导致气道高反应性, 这是哮喘的重要病理改变。

2.3 CGRP与气道重塑

CGRP可能参与了慢性哮喘的气道重塑。病理学和形态学研究证明, 分型不同的哮喘都存在着不同程度的腺体增生、纤维化, 促进气道壁增厚、管腔狭窄。由此可见, CGRP可能在结合其受体过程中发挥了生物学效应, 参与了哮喘患者气道结构的改变, CGRP及其受体的过度表达, 会加重支气管平滑肌收缩、血管通透性增加、粘液分泌增多及气管周围胶原沉淀, 导致气道重塑。CGRP常与多种神经递质共存, 在气道传入神经, 释放神经冲动, 不仅引起神经源性炎症, 还可致气道平滑肌收缩、增殖, 引起哮喘气道重塑及气道高反应性。另外, NANC神经调节失衡, 加重了哮喘气道粘液腺及上皮细胞增生、肥大, 加剧气道痉挛、促进管腔狭窄、气道壁增厚, 导致气道重塑而不可逆。

目前, CGRP拮抗剂已在人类和动物临床试验中显示出一些功效。Bonner, K.等[13]研究发现, CGRP受体拮抗剂CGRP (8-37) 能够抑制由RAMP1和IL-6产生的CGRP诱导的内分化, 从而减少CGRP对上皮细胞的连续刺激。Rochlitzer, S等[14]研究也证实, CGRP受体拮抗剂CGRP (8-37) 可以调节DC的成熟和变应原特异性T细胞应答, 减少体内的过敏性气道炎症和气道高反应性, 降低气道阻力, 改善气道重塑, 从而缓解哮喘症状。以上结果表明, CGRP参与气道重塑引发哮喘发病。

3 问题与展望

血浆降钙素基因相关肽 第5篇

关键词：脑梗死,神经功能缺损程度,降钙素,降钙素基因相关肽

脑梗死(cerebral infarction,CI)是我国中老年人的常见病。发病原因是脑部血供障碍使局部脑组织发生不可逆性损害,导致脑组织缺血缺氧性坏死[1]。降钙素(CT)基因相关 肽 (calcitonin gene-related peptide,CGRP)是一种生物活性多肽 ,有α-CGRP和β-CGRP两种,能够扩张脑血管、保护和恢复损伤的神经元和介导神经免疫系统调节的功能,对中枢神经系统产生多种影响。CGRP m RNA是细胞核CGRP DNA转录产生的核糖核苷酸链,其在细胞的核糖体内翻译生成CGRP。由于CGRP对CI患者诸多方面有利 ,笔者对CI后神经功能缺损程度与CGRP相关指标的关系进行前瞻性观察性研究,现报道如下:

1 资料与方法

1.1一般资料

选择2012年1月~2013年12月在济宁市第一人民医院(以下简称“我院”)急诊内科住院的CI恢复患者120例,其中男72例,女48例,年龄42~75岁,平均(57.2±4.6)岁。颈内动脉系统梗死72例,椎基底动脉系统梗死48例。Adams分型:大梗死(>5 cm,超过1个颞叶)31例,中梗死(>3.0~5 cm,小于1个颞叶)47例,小梗死(1.6~3 cm)25例,腔隙性梗死 (<1.6 cm)17例。所有患者经影像科头颅MRI确诊。根据神经功能缺损程度,将患者分为轻、中、重型三类:轻型CI28例 , 男17例 , 女11例 , 平均年龄 (56.1±6.3) 岁 ; 中型CI 63例,男38例,女25例,平均年龄(57.3±5.6)岁;重型CI 29例,男17例,女12例,平均年龄(58.0±2.6)岁。我院伦理委员会批准此项研究 ,所有研究对象签署知情同意书。

1.2 纳入标准

诊断符合1995年全国第四届脑血管病学术会议制订的CI诊断标准[2];发病为0.5~2个月;为CI恢复早期(0.5~1个月)至恢复中期(>1~2个月);意识清晰。

1.3 排除标准

不符合诊断标准和纳入标准者;研究期间死亡者;短暂性脑缺血发作、可逆性神经功能缺损、脑出血、蛛网膜下腔出血、非原发脑血管病导致CI者;妊娠或哺乳期妇女;合并严重内分泌疾病、精神疾病;资料不全者。

1.4 健康对照

从体检科纳入60名健康对照,其中男36名,女24名,年龄42~75岁,平均(57.5±3.6)岁。统计学分析结果显示:健康对照和神经功能缺损轻、中、重型四组间的年龄、性别比较,差异无统计学意义(F = 1.342、0.735,均P > 0.05),具有可比性。

1.5 检验科指标检测

1.5.1 CGRP和血Ca2+检测所有研究对象凌晨空腹采肘静脉血。CGRP检测采EDTA抗凝血取血浆,用CGRP试剂盒(美国REAGEN公司,批号:2013120083)基于酶联免疫法原理检测。采集不抗凝血,取血清检测血清Ca2+水平,在生化仪(美国YSI2900生化分析仪)上进行。CGRP最低能检测到0.7 pg/m L。这两项指标由我院检验科负责。

1.5.2血清CT的检测免 疫荧光分 析法 (PentagastrinTM, Cambridge Laboratories Ltd , Newcastle , UnitedKingdom)检测CT。本实验基于两个抗Ca2+的单克隆抗体,其中1个在固定相,有特异的11~23个氨基酸序列(E1P10),另一个生物素化,有特异的17~32氨基酸区(J1P9)。本实验最低检测到1 pg/m L,男性正常上限18.4 pg/m L,女性正常上限7.8 pg/m L。

1.6 实验室指标检测

1.6.1 m RNA阴阳性对照试验TT是一种MTC细胞系,来自于ATCC(编号CRL-2005,Riode Janeiro CellBank),是CT和CGRP m RNAs的阳性对照。细胞生长于Dulbecco改良Eagle培养基 (Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA),加入10%胎牛血清(Invitrogen)、100 U/m L青霉素和100μg/m L链霉素。置于潮湿、含有5%CO2、37℃的细胞培养箱中。滤泡细胞癌的弥散组织作为阴性对照[1]。

1.6.2定量RT-PCR检测CGRP m RNA每个患者采血4 m L置入EDTA管内,全RNA分离以及c DNA合成,用3.5μg全RNA合成c DNA。c DNA通过Nano VuePlus分光光度计(GE Healthcare,Buckinghamshire,United Kingdom) 定量 , 当A260/A280比例为1.8和2.0时认为实验数据可以采用。全RNA用TURBO DNAfree kit(Ambion,Austin,TX)的DNase处理,使用oligo(d T)12 ~18引物 (Invitrogen) 和1U的R Nase OUTTM,通过Super -ScriptⅢReverse Transcriptase试剂盒(Invitrogen)逆转录为c DNA。重组核糖核酸酶抑制剂(Invitrogen) 原为30μL, 用超纯去DNase/RNase的蒸馏水(Invitrogen)稀释到60μL。新合成的稀释的c DNA 2μL用于20μL PCR扩增 (含有10μL SYBRGreen PCR Master Mix,以及2个特异m RNA靶(CT或CGRP ) , 每个引物200 n M ) 。所有引物用Primer 3software合成 ,避免引物结合位点和相似转录物的单核苷酸多态性。引物如下:CTF,5′-ATCTAAGCGGTGCGGTAATC-3′;CTR,5′-CTTGTTGAAGTCCTGCGTGT-3′ ;CGRPF,5′ -CCCAGAAGAGAGCCTGTGACA 3′;CGRPR,5′-CTTCACCACACCCCCTGATC-3′;RPS8,5′ -AACAAGAAATACCGTGCCC -3′ ; 以及RPS8 ,3′GTACGAACCAGCTCGTTATTAG -5′。每个标本序列RT-PCR(q RT-PCR)扩增3倍 ,40个循环 ,使用7500RT -PCR系统 (Applied Biosystems,Foster City,CA),根据操作手册进行。所有样本(3倍)在相同的PCR循环条件下进行。循环阈值(Cq,formerly Ct)通过Applied Biosystems软件获得 , 用均值和SD≤1表示。CGRP m RNA表达通过CI治愈患者 血液样本 标准化。CGRP m RNA的相对表达(relative expression,RE)=2 (Cs -Rs)/2 (Cn -Rn) 进行计算 ,Cs是CT或CGRP样本的Ct循环数,Rs是每个标本RPS8的Ct值,Cn是健康对照的CT或CGRP Ct平均值,Rn是同一个体RPS8 Ct值。

1.7 脑梗死后神经功能缺损程度评分

参照1995全国第四届脑血管病学术会议通过的《脑卒中患者临床神经功能缺损程度评分标准》[2]。脑卒中临床神经功能缺损程度评分量表主要包括意识(最大刺激,最佳反应 )、水平凝视功能、面肌、言语、上肢肌力、手肌力、下肢肌力和步行能力。最高分45分,最低分0分。轻型0~15分,中型16~30分,重型31~45分。

1.8 CGRP m RNA 分组

根据临床经验和研究数据,将重型神经功能缺损者分为CGRP m RNA低表达(<1000,20例)和CGRPm RNA高表达(>1000,9例)两组进行分类研究。

1.9 随访情况

在研究初期 (CI后2周内)、随访3个月(依据《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014》进行治疗 )、随访6个月时进行神经功能缺损程度、CGRP、CGRPm RNA、Ca2+和CT检测。

1.10 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析,计量资料数据 用均数±标准 差 (x±s)表示 ,CGRP m RNA(RE)、CGRP m RNA和CT转变为对数,经计算方差齐性后进行统计学分析。方差齐性时,组间比较使用多个样本均数比较的方差分析方法(ANOVA)。计数资料用率表示,组间比较采用χ2检验。以神经功能缺损程度为因变量,以各型神经功能缺损的CGRP相关指标得值为自变量进行对数线性回归模拟,分析CGRPm RNA与CGRP变化趋势是否一致 ,描述CGRP相关指标的变化趋势。ROC曲线下面积(AUC)分析法分析指标的诊断价值、切点、灵敏度和特异度。采用Pearson相关性检验进行相关性分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经 功能 缺损程度评分 与 CGRP 相关指标 的 相关性

120例患者及60例健康对照血液中均能检测到CGRP、CGRP m RNA、CT。CGRP的变化趋势与CGRPm RNA (RE)一致 (P = 0.000),均是在健康及轻型、中型神经功能缺损患者中处于较低值,在重型神经功能缺损中处于较高值,见表1。由于CGRP和CGRPm RNA(RE)的变化趋势较为一致,笔者对两个指标中的CGRP m RNA(RE)进行重点分析。

神经功能缺损程度与CGRP m RNA(RE)呈正相关(r = 0.508,P < 0.01)。ROC曲线的CGRP m RNA(RE)分布分析预测CGRP m RNAs的RE切点为8.3,AUC为0.964。此外 ,重型神经功能缺损的患者比轻型神经功能缺损的患者有更高的CGRP m RNA(RE)均值。见表1、图1。

血Ca2+及CT水平在神经功能健康及轻型和中型缺损者之间差异无统计学意义(P > 0.05)。血Ca2+在重型神经功能缺损与健康者之间差异有统计学意义(P< 0.05)。在重型神经功能缺损者CT水平与其他三组比较,差异均有统计学意义(P < 0.05)。神经功能缺损程度与CT呈正相关(r = 0.510,P < 0.05),见图2。在重型神经功能缺损CGRP m RNA(RE)低表达的患者中,Ca2+水平、CT均值都较低;CGRP m RNA(RE)高表达的患者中,Ca2+水平、CT均值都较高,差异均有高度统计学意义(t = 3.453、839.334,P = 0.001、0.000)。

注:与健康对照比较,★P < 0.05;与轻型比较,#P<0.05;与中型 比较,*P < 0.05;CT:降钙素 ;CGRP:降钙素基因相关肽

Y=0.23+0.76+X;R2=0.51

2.2 CGRP m RNA 与降钙素的相关性

神经功能缺损患者的CGRP m RNA(RE)表达范围变化很大(0~320 551.38)。笔者对CGRP m RNA(RE)低表达和高表达与CT的相关性进行分析发现,CT与CGRP m RNA(RE)呈正相关(r = 0.946,P < 0.0001),CT的AUC为0.923。见图3、4。

2.3 不同的 CGRP m RNA 表达与神经功能缺损程度

6个月的随访过程中 ,9例高表达CGRP m RNA(RE)患者研究初期均为重型神经功能缺损 , 随着病情的逐渐恢复,6个月内逐渐转变至中型和轻型神经功能缺损,神经功能缺损程度改善良好(χ2=18.760,P =0.000)。特别是高表达CGRP m RNA(RE)到10 000以上者,随访3个月内,都能恢复到中型神经功能缺损,之后恢复到轻型神经功能缺损。轻型神经功能缺损的所有患者均为CGRP m RNA(RE)低表达。重型神经功能缺损者恢复到轻型神经功能缺损时CGRP m RNA(RE)表达也降低,成为CGRP m RNA(RE)低表达者。

Y=-0.001+0.968-X;R2=0.896

重型神经功能缺损患者在随访3个月时,有4例患者(4/20)从CGRP m RNA(RE)低表达转变到高表达,在随访6个月内,有1例患者(1/16)从CGRP m RNA( RE ) 低表达转变到高表达。3个月内转变人数和6个月内转变人数差异无统计学意义 (χ2=0.444,P =0.505)。中型神经功能缺损患者转变为轻型患者前后,患者均处于CGRP m RNA(RE)低表达状态。

3 讨论

3.1 CI 后恢复 早 期 时 ,CGRP 与 CGRP m RNA、Ca2+和 CT 有关

CGRP m RNA合成CGRP蛋白 ,后者是一种免疫连接蛋白,遇到刺激时释放,影响即时反应以及神经系统的信息流。本研究结果证明了CGRP m RNA(RE)与CGRP的表达同步同方向变化,提示了CI后CGRP的表达迅速升高。CGRP由记忆T细胞分泌,调节树突状细胞及其他免疫细胞的功能、淋巴细胞分化和细胞因子生成,参与免疫运动、迁移和黏附。CGRP在很多免疫器官如淋巴结、皮肤、肺等中广泛存在。在神经免疫轴中,CGRP是关键神经递质,具有高表达的特征。研究已经表明,CGRP具有极明显的调节Ca2+和血压的生理功能[3],在CI发病初期就呈现高水平状态[4],以调节机体的神经免疫平衡。CGRP在骨髓中广泛分布,直接与造血祖细胞相连,影响造血细胞集落的分化[5],促进干细胞生长[6],促进伤口愈合[7]。CGRP对肌肉损伤也有积极的作用,能协调化学因子的分泌,诱发肌肉修复[8]。因此 ,CGRP作为神经免疫递质 ,能够改善机体的免疫功能、增加必要的造血、维持血压和离子平衡,以及促进肌力恢复。本研究发现CGRP高表达的CI患者恢复较好,也证实了上述研究结果。

本研究也 发现 : 在重型神 经功能缺 损高表达CGRP m RNA (RE) 患者中 , 患者体内Ca2+较高时 ,CT也较高;患者体内Ca2+较低时,CT也较低。表明CI后恢复早期,CT能调节Ca2+至正常范围。研究表明,细胞内核糖体合成蛋白时,CT m RNA与CGRP m RNA一同被转录[9],CT和CGRP同步合成[3]。因此,CI之后患者机体内CGRP升高的同时,CT也升高。而CT主要功能是降低机体血钙血磷的水平。

综合其他研究及本研究可得出结论:CI后恢复早期,CGRP与CGRP m RNA、Ca2+和CT有关。CGRP与CGRP m RNA(RE)变化趋势一致,细胞内核糖体合成蛋白时,CT m RNA与CGRP m RNA一同被转录,CT和CGRP同步合成。CT主要功能是降低机体血钙血磷的水平。

3.2 CI 后神经功能缺损程度与 CGRP、CGRP m RNA、Ca2+和 CT 有关

神经功能缺损程度量表包含意识、水平凝视功能、面瘫、言语、上肢肌力、手肌力、下肢肌力和步行能力[2]。Liu等[10]研究了颈动脉闭塞的CI沙鼠模型,认为相比与对照组,catalpol显著提高CI沙鼠CGRP及意识状态(P < 0.05或P < 0.01),CGRP和意识状态同步增加。田桦等[11]探讨高压氧联合银杏活脑胶囊治疗CI的临床效果及其对血清中CGRP含量的影响 , 认为随着患者意识的恢复,CGRP也升高。因此,CGRP与意识具有正相关性。Luebke等[12]认为,αCGRP减少导致前庭眼球反射减少,使水平凝视功能降低,CGRP与水平凝视功能密切相关。Matic等[13]通过动态计算层析和正电子发射层析扫描,认为注射肉毒杆菌毒素A增加了CGRP,增加了肌肉血流量和代谢。Yamazaki等[14]认为CGRP-IR NF是神经源性炎症和血液供应的重要介质,可能反映肌肉与疼痛的状态。因此,CGRP与肌力密切相关。笔者的研究结果与上述研究结果具有一致性,同时也补充了上述研究:CI后神经功能缺损程度与CGRP、CGRP m RNA、Ca2+和CT有关。

CT与CI后神经功能缺损程度密切相关。Nakazato等[15]研究表明,日本人群中CT在CI患者中激活修饰蛋白1(RAMP1),人类RAMP1基因具有 单核苷酸多态性(rs3754701、rs3769048、rs7557078、rs1584243、rs10199956、rs7590387)。单体型RAMP1是CI的易感标志物(P = 0.0024)。这与本研究结果一致,即CT与CGRP呈正相关 (相关系数r = 0.946), 并且CT能调节血清Ca2+水平,促进CI后神经功能缺损的恢复。

因此 ,CGRP及相关指 标CGRP m RNA、CT、Ca2 +均与神经功能缺损程度有关,能反映CI后神经功能缺损程度。CI后神经功能缺损程度越严重,CGRP及CGRP m RNA(RE)均值越高 ,重型神经功能缺损时四项指标均达到最高水平。CGRP m RNA(RE)高于1000时,重型CI后神经功能缺损患者预后较好。

3.3 CGRP 能反映 CI 后神经功能缺损的恢复

CI后神经功能缺损程度的恢复一直属于热门的课题。不仅医生关心,患者及其家属更是关心。很多学者建议通过护理方法达到CI恢复的目的[1,2]。通过心理护理、饮食护理、全程护理、个体护理等诸多护理技术,也确实起到了良好的效果。本研究结果提供了新思路,认为可通过CGRP调节CI后早期恢复时的神经功能缺损,以达到恢复的目的。本研究结论与其他研究者的研究结果一致。周亚伟等[16]发现CGRP对CI后恢复非常敏感。Liu等[17]通过研究认为CGRP参与CI进展 ,CGRP可以降低动脉血压 (P < 0.001), 梗死体积(P < 0.05),脑水肿(P < 0.01),血脑屏障通透性(P < 0.05)和水通道蛋白4及其m RNA表达(P < 0.05)。此外,CGRP治疗改善毛细血管内皮细胞超微结构的损伤,增强基底膜,可以防止血脑屏障损伤和局部脑缺血再灌 注引起的 脑水肿。 本研究也 显示CGRPm RNA高表达时,患者神经功能缺损恢复良好。笔者通过研究认为,CGRP m RNA(RE)在10 000以上时,重型神经功能缺损患者几乎都能恢复到中型神经功能缺损,改善良好。CGRP越高,患者恢复得越好。

血浆降钙素基因相关肽 第6篇

1 对象与方法

1.1 病例与分组

创伤组为本院神经外科2007年10月至2008年3月收治的重型颅脑损伤病人格拉斯哥昏迷评分 (GCS≤8) 计29例, 存活者随访6个月以上, 并进行GCS评分;对照组为同期健康体检者36例。受检者均经体检及辅助检查排除心脑血管及周围血管病, 近2周内无服药史。

1.2 标本采集与测定

入选病例均在伤后6 h内、3 d、7 d抽取静脉血5ml, 注入含10%乙二胺四乙酸钠30μL和抑肽酶40μL试管中颠倒混匀。4℃离心 (4 000 r/min) 15 min分离血浆, -40℃保存待测 (ET、CGRP含量测定均由解放军总医院东亚免疫技术研究所提供试剂盒, 采用放免方法由专人严格按说明书操作) 。

1.3 统计学处理

所有资料均经SAS统计软件包计算机处理;数据表达采用均数±标准差 (χ±S) ;多组样本均数比较采用Dunnett检验。

2 结果

2.1 重度颅脑损伤后ET、CGRP含量的变化

重型颅脑损伤后6 h内ET、CGRP含量明显升高, 伤后3 d ET含量有所下降, 而CGRP含量保持较高的水平, 在伤后7 d二者仍高于对照组。ET与CGRP的比值 (E/C) 在伤后6 h内显著升高, 伤后3 d时已恢复正常, 见表1。

2.2 ET、CGRP含量与预后的关系

重型颅脑创伤后预后良好者{格拉斯哥预后评分 (GOS) 3～5分组}, 创伤后早期ET含量及E/C比值均明显低于预后不良者 (GOS) ≤2分组。而预后良好者和预后不良者CGRP含量差异无统计学意义 (P>0.05) , 见表2。

3 讨论

ET和CGRP都是近年来发现的血管活性物质, ET是由21个氨基酸组成的多肽, 在人和动物的脑、脊髓中均有广泛的分布, 通过ET受体 (ETR) 作用于血管平滑肌及内皮细胞, 引起强烈的血管收缩效应;CGRP是由37个氨基酸组成的生物活性肽, 其扩血管作用比乙酰胆碱、三磷酸腺苷等物质强1 000倍以上。

经测定重型颅脑损伤后早期ET含量即急剧升高, 并在1周内始终维持在较高的水平, 升高的原因可能与以下几个因素有关: (1) 脑损伤后颅内压急剧升高, 脑组织灌流量下降, 缺血刺激星型细胞内ET合成增加[2]。 (2) 重型颅脑损伤后, 脑缺血缺氧刺激血管内皮细胞合成ET增加[3], 同时, 由于脑外伤后血脑屏障的完整性遭到破坏, 大量合成的ET得以通过血脑屏障进入外周血。ET含量的大量增加除了引起血管收缩外, 还可以通过作用于小胶质细胞内皮素受体B (ETBR) , 激活二氧化氮 (NO2) , 导致一氧化氮 (NO) 合成增加, NO是神经损害的重要因子[2], 促进花生四烯酸代谢, 增加超氧化物的合成, 引起自由基损害[4]。

实验中发现, 重型颅脑损伤后6 h内伴随ET含量的增高, CGRP含量也大幅度增加。已有报道CGRP可以拮抗ET引起的脑血流量减少, 使脑血流暂时恢复[5]。在脑外伤后ET合成的增加, 机体通过自身调节作用使CGRP分泌增多, 以拮抗ET的缩血管作用, 这无疑具有一定的保护作用。但重型颅脑创伤后早期E/C比值明显高于对照组 (P<0.05) , 说明CGRP增加的幅度要低于ET, 微血管仍呈收缩趋势, 这一结果提示在重型颅脑损伤早期抑制ET的过度增加, 提高CGRP的含量, 有助于减轻继发性脑缺血损害。同时, 通过对重型颅脑创伤早期ET、CGRP含量及E/C比值与预后关系的观察, 我们发现预后不良者 (GOS≤2) ET含量及E/C比值均明显高于预后良好者 (GOS3～5) 。这证实了脑缺血是影响预后的一个重要因素, 而不同预后者CGRP含量则无明显差异, 其原因尚待进一步研究。

总之, 我们认为重型颅脑损伤后ET为代表的血管收缩因子, 对继发性脑损害具有重要的意义, 早期测定ET、CGRP含量有助于判断重型颅脑创伤患者的预后。

参考文献

[1]郭京, 赵雅度.重型颅脑损伤临床治疗的若干问题[J].中华神经外科杂志, 1998 (14) :61-62.

[2]Yamashita K, Kataoka Y, Yamashita YS, et al.Giat endotheli/mitrc oxide eyetem participates in hippocampus CA:neuronal death of SHRSP following transient forebrain[J].Clin Exp Pharmacol Physiol, 1995, 1:277-278.

[3]Highsmith RF, Pang DC, Rappoport RM, et al.Endothcha cell—de—rived vasoconstrictors, mechanism of action in vascular smooth muscle.Jcardiovasc Pharmacol, 1989 (13) :36-44.

[4]盛树力, 张万江, 伍洁, 等.降钙素基因相关肽对脑血管和脑血流量的影响[J].首都医学院学报, 1990, 11:259.

血浆降钙素基因相关肽 第7篇

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

动物人工呼吸机 (DH140型, 浙江医科大学医学仪器实验厂) ;实时荧光定量PCR系统 (Applied Biosystems 7500型, 美国ABI公司) ;核酸蛋白分析仪 (美国BECKMAN公司) ;逆转录仪器 (C1000Touch TM Thermal Cycler, BIORAD) ;微量多功能读板机 (Infinite M200, 瑞士Nano Quant公司) ;数字显示隔水式电热恒温培养箱 (型号PYXDHS500BSII上海跃进医疗器械厂) ;凝胶成像系统 (GENE GENIUS, 英国Syngene公司) ;电泳仪 (型号DYY 11B, 天津泰斯特公司) ;低温高速离心机 (型号Scientific Heraeus Labofuge 400, 德国Thermo公司) ;摇床 (Orbital Shaker, 美国Thermo公司) 。

1.2 主要试剂及药品

芪参益气滴丸 (批号110002, 天津天士力有限公司) ;乌拉坦 (天津光复精细化工研究所) ;羧甲基纤维素钠 (CMCNa, 天津光复精细化工研究所) ;多聚赖氨酸 (北京中杉金桥生物技术有限公司) ;降钙素基因相关肽内源性消耗剂辣椒素 (CAP, Sigma美国) ;CGRP抗体 (sc1060, 美国Santa公司) ;TRIZOL Reagen (美国Invitrogen公司) ;Marker DL2000 (日本TAKARA公司) ;Revert Aid First Strand c DNA Synthesis Kit (美国MBI公司) ;PCR扩增反应试剂盒 (美国MBI公司) ;CGRP ELISA测定试剂盒 (美国R&D公司) 。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组

SPF级健康成年Wistar雄性大鼠36只, 体重230 g±20 g (由天津中医药大学实验动物中心提供) , 合格证号:SCXK (津20090001) 。先适应性喂养3 d, 随机分为6组, 每组6只。正常组 (C组) :自主饮水, 未予其他干预。缺血再灌注组 (I/R组) :术前每日按100 g体重灌服0.5%CMC Na溶液1 m L, 连续7 d, 第8天予缺血再灌注损伤模型。芪参益气滴丸预适应组 (QS组) :术前每日按100 g体重灌服芪参益气滴丸27.0 mg/m L, 连续7 d, 第8天予缺血再灌注损伤模型。缺血预适应组 (DPC组) :术前每日按100 g体重灌服0.5%CMCNa溶液1 m L, 连续7d, 第7天予3次短暂缺血预适应, 第8天予缺血再灌注损伤模型。阻断剂加缺血预适应 (DPC+GAP组) :术前每日按100 g体重灌服0.5%CMCNa溶液1m L, 连续7 d。第7天予3次短暂缺血预适应, 第8天术前30 min尾静脉注射CAP溶液50 mg/kg, 而后进行缺血再灌注损伤模型;阻断剂加芪参益气滴丸预适应加缺血预适应组 (DPC+QS+GAP组) :术前每日按100 g体重灌服芪参益气滴丸27.0 mg/m L, 连续7d。而后处理同DPC+GAP组。

实验中所用药物均用0.5%CMC Na配制成混悬液。大鼠灌胃药量比例按照“动物间的剂量换算”中成人70 kg体重系数折算所得[4]。

1.3.2 大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的制备

经12 h禁食, 1 h禁水后的大鼠经称重后予20%乌拉坦溶液 (0.5 m L/100 g) 麻醉, 固定后胸前皮肤备皮。于胸骨左缘0.5 cm处第3~5肋骨间皮肤沿肋骨方向开口, 止血钳钝性分离胸部皮肤肌肉层, 充分暴露3~5肋骨, 用弯头止血钳在心脏搏动最明显的肋间隙撕开胸腔, 垂直肋骨方向轻轻打开止血钳向两侧撑开胸腔, 即可暴露心脏。左手挤压胸腔, 顺应心脏跳动趋势, 将心脏挤出胸腔, 并用左手捏起固定, 在左心耳下方2 mm处用7 0无损伤带线缝合针穿过心肌表层, 穿过左心耳和肺动脉圆锥间的与左冠状动脉伴行的冠状静脉, 从肺动脉圆锥旁出针, 进针深度为1.5mm, 宽度为2mm~3 mm。而后迅速将心脏放回胸腔, 轻压胸腔排除空气, 直头止血钳闭合伤口。10 min左右待大鼠情况稳定后, 打开胸腔, 以双活结结扎左冠状动脉前降支30 min, 之后拉开缝合线两端, 解开活结, 再灌注2 h。

1.3.3大鼠心肌缺血预适应模型的制备

前期手术方法同缺血再灌注损伤模型, 在结扎左冠状动脉前降支后, 用止血钳闭合手术切口, 留缝合线两端于体外备用, 5 min后打开止血钳, 轻拉缝合线两端解开活结, 如若缝合线两端可随意拖动表示活结已完全打开, 再用止血钳闭合伤口5 min。以上操作重复3次以达到3次短暂的心肌缺血过程。逐层缝合肌肉和皮肤, 将缝合线两端穿过胸腔开口处及肌层埋于皮下, 最后缝合皮肤。将庆大霉素滴数滴在手术伤口上以防感染。24 h后逐层打开胸腔, 整理埋在皮下的缝合线, 确保细线未交叉并且可以随意拖动, 迅速打双活结, 结扎左冠状动脉前降支30 min, 夹闭伤口, 之后松开止血钳, 打开活结, 使左冠状动脉再灌注2 h, 期间均用止血钳夹闭伤口。

1.3.4 实时定量聚合酶链反应 (real

time PCR) 技术检测心肌CGRP m RNA的表达总RNA的提取:总RNA的提取按照Invitrogen公司的Trizol kit说明书进行, 多次反复短暂离心提取细胞总RNA, 核酸蛋白分析仪定量, 检测纯度和含量。纯净的RNA的比值应为OD260/OD280≈1.8~2.0, 若低于1.8说明可能有蛋白质污染。逆转录反应:将2μg总RNA进行RT反应, 反转录利用反转录试剂盒MBI Revert Aid First Strand c DNA Synthesis Kit说明书进行, 将得到的c DNA用于PCR扩增。实时荧光定量PCR反应:大鼠CGRP引物序列长度为194bp, 由上海英骏生物技术有限公司合成, F:TCCTGGTTGTCAGCATCT;R:CTCAGCCTCCTGTTCCTC。GAPDH引物序列长度为254bp, 由上海英骏生物技术有限公司合成, F:CT-GATGCCTCCATGTTTGTG;R:GGATGCAGGGAT-GATGTTCT。取逆转录反应产物参考试剂说明书配置如下反应体系详见表1、表2。

各荧光曲线与基线交叉点的循环数即为Ct值。根据以下公式进行计算, Ct=Ct待测基因-Ct内参照基因;△△Ct=△Ct待测基因- (△Ct control-△C内参照基因Ct值) ;基因表达=2-△△Ct。

1.3.5 酶联免疫吸附试验检测血清中CGRP蛋白表达

将分装冷冻的血清常温解冻以后, 按照试剂盒说明书用ELISA法检测血清中CGRP的含量水平。

1.4 统计学处理

所有数据采用SPSS11.5统计学软件进行单因素方差分析, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

与正常组相比, 缺血再灌注损伤组CGRPm RNA表达、CGRP蛋白含量减少;经芪参益气滴丸预适应与短暂缺血刺激后CGRPm RNA表达、CGRP蛋白含量增多, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;与DPC组相比, 加入辣椒素后CGRPm RNA表达下调, 而芪参益气滴丸预适应可以使降低的CGRPm RNA表达、CGRP蛋白含量提高, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。详见表3。

3 讨论

随着IPC研究的深入, 以药物代替缺血损伤刺激而达到预适应的目的已经成为未来临床发展的必然。迄今为止, 内毒素衍生物单磷酰脂A (MLA) 是研究最多的药物, 已用于二期临床试验, 其他同类药物脂多糖 (LPS) 、糖脂RC 552、G+菌壁片段LTA, 以及预适应相关的受体、酶、离子通道激动剂如PKC激活剂等也有一定的研究成果。然而这些药物作用单一, 疗效不如经典预适应, 生产成本偏高, 毒副反应较大, 并不是临床最满意的用药。中药的作用多途径、多靶点, 与预适应是多种因素共同作用的结果相辅相成, 而中医学治病所强调固护“正气”, 正是通过激发人体内源性保护物质, 达到维护自身生理平衡和功能稳定, 这又与预适应调动人体固有的内源性调节机制, 来增强组织器官的生理功能, 调动和发挥机体自身的修复能力的机制不谋而合。因此, 中药预适应是未来药物预适应发展的新方向, 开辟了心脏保护的新领域。

芪参益气滴丸是已经上市的中成药, 由黄芪、丹参、降香、三七构成, 具有益气通脉、活血止痛之功效, 适用于气虚血瘀型胸痹, 并因疗效显著、剂型稳定, 是中医药诊治冠心病特色和优势代表药物之一。故而, 基于DPC理论, 用芪参益气滴丸作为研究药, 研究中药诱导心肌延迟保护效应的机制, 前期工作已经证明芪参益气滴丸预适应可降低缺血心肌再灌注期心律失常发生率、室性心律失常评分, 改善左室心功能、缩小心肌梗死范围及降低血清心肌酶天门冬氨酸氨基转移酶 (AST) 、乳酸脱氢酶 (LDH) 及肌酸激酶 (CK) 活性等途径达到对缺血心肌的延迟保护作用, 本次实验是在此基础上对中药诱导心肌DPC机制的探索。

CGRP是人们利用分子生物学方法发现的第一个多肽, 广泛分布于神经系统, 尤其遍布心血管系统中[5], 是目前已知的最强烈的扩血管物质, 对全身血管特别是心脑血管有不同程度的扩张作用。CGRP强大的舒张作用亦表现在比硝酸甘油、硝普钠强约240倍, 并远远超过P物质、心钠素和异丙肾上腺素[6]。有研究证明, 离体心脏短暂缺血 (5 min) 即可引起CGRP的释放, 经CGRP预处理对心肌具有保护作用, 予以CGRP阻断剂后, 这种保护作用消失[7], 充分说明了IPC现象与CGRP相关联。本实验发现, 芪参益气滴丸预适应后使缺氧再灌注损伤模型血清中CGRPm RNA表达明显升高, 且优于IPC组。使用CAP后预适应产生CGRPm RNA显著减少, 而经芪参益气滴丸预适应可以拮抗这种阻断作用, 使CGRPm RNA含量增多, 对血清中CGRP蛋白含量的检测结果与基因检测相符, 提示芪参益气滴丸可能是通过调节体内CGRP的产生发挥保护心肌的作用。

参考文献

[1]Shi E, Jiang X, Bai H, et al.Cardoprotective effects of morphine on rat heart suffering from ischemia and reperfusion[J].Chin Med J (Eng) , 2003, 116 (7) :1059-1062.

[2]Chai W, Mehrotra S, Jan Danser AH, et al.The role of calcitonin gene related peptide (CGRP) in ischemic preconditioning in i-solated rat hearts[J].Eur J Pharmacol, 2006, 531 (1-3) :246-253.

[3]欧阳伟, 钱学贤, 付向阳, 等.降钙素基因相关肽预适应对在体大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用[J].中国动脉硬化杂志, 1998 (3) :228-232.

[4]徐叔云, 卞如廉, 陈修.药理实验方法学[M].北京:人民卫生出版社, 2002:202.

[5]Ursell PC, Albata A.Nonadrenergic noncholinergic innervation, anatomic ditribution of calcitonin gene related peptide im munoreactive tissue in the dog heart[J].Circ Res, 1991, 68:131-140.

[6]Nozaki K, Okamoto S, Vemura Y.Vascular relaxation properties of Calcitonin gene related peptide and vasoactive intestinal polypeptide in subarachnoid haemorrhage[J].J Neurosurg, 1990, 72 (5) :792-779.