单细胞蛋白范文（精选12篇）
单细胞蛋白 第1篇
1 单细胞蛋白的概念
单细胞蛋白 (SCP) 是指利用各种基质大规模培养酵母菌、细菌、真菌和微藻等而获得的微生物蛋白。SCP的蛋白含量高达40%~80%。
酵母是最早广泛用于生产单细胞蛋白的微生物。酵母中含蛋白质45%~55%, 是一种接近鱼粉的优质蛋白。
细菌蛋白的蛋白含量占干重的3/4以上, 在补充含硫氨基酸以后, 它的营养价值与大豆分离蛋白相近。用于生产单细胞蛋白的细菌较多, 研究较多的细菌为光合细菌和自养产碱杆菌。自养产碱杆菌的菌体蛋白质含量高达60%~80%。应用较多的真菌有曲霉和青霉。主要利用糖蜜、酒糟、纤维类农副产品下脚料生产单细胞蛋白。霉菌丝体蛋白质占干物质的30%~50%。利用水域培养藻类获得蛋白质也是很好的途径。开发利用较多的是小球藻和螺旋藻, 产品蛋白含量可达55%~70%。
2 单细胞蛋白饲料的特点
2.1 生产效率高
比动植物高成千上万倍, 这主要是因为微生物的生长繁殖速率快。在适宜条件下细菌0.5~1h、酵母1~3h、微型藻类2~6h即可增殖1倍。
2.2 原料丰富
工农业废物、废水, 如秸秆、蔗渣、甜菜、木屑、废糖蜜、废酒糟水、亚硫酸纸浆废液等;石油、天然气及相关产品, 如原油、柴油、甲烷、甲醇、乙醇、CO2、H2等, 都可作为基质原料。
2.3 可以工业化大量生产
设备简单, 容易生产;需要的劳动力少, 不受地区、季节和气候的限制。如年产10万吨SCP的工厂, 以酵母计, 一年可产蛋白4000多吨;以大豆计, 一年所产蛋白相当于50多万亩大豆所含蛋白。
2.4 营养丰富
产品中含有丰富的维生素, 必需氨基酸含量较高、组成齐全, 包含了人体必需的8种氨基酸, 而且消化利用率高, 一般高于80%。
2.5 核酸含量较高
如酵母为6%~1l%、细菌为10%~18%。核酸在畜体内消化后形成尿酸, 因家畜无尿酸酶, 尿酸不能分解, 随血液循环在家畜的关节处沉淀或结晶, 可引起痛风症或风湿性关节炎, 使用时应控制用量[1]。
3 单细胞蛋白的开发利用
单细胞蛋白在饲料和食品工业中有着重要的作用。20世纪20年代, 荷兰、德国和英国就已公布了SCP的生产专利。
单细胞蛋白可直接食用。干酵母蛋白含量高、热量低, 可作为食品的添加剂。有的国家在婴儿食品中掺入酵母蛋白以提高食品的营养性能。酵母的浓缩蛋白有显著的鲜味, 已广泛用于食品的增鲜添加剂。
单细胞蛋白应用最多和最普遍的是动物饲料。
早在20世纪20年代, 就有人用饲料酵母作反刍动物的蛋白补充料。1967年在美国麻省理工大学召开了第一次世界单细胞蛋白饲料会议, 确认开发生产单细胞蛋白是解决饲料粮短缺的重要途径之一。随后, 世界各国广泛开展单细胞蛋白饲料生产的研究, 特别是利用现代化发酵工程技术手段以多种非食用资源和废弃资源作为基质料, 以工业化的方式大规模生产单细胞蛋白饲料。
用于生产单细胞蛋白的细菌较多, 研究较多的细菌为光合细菌和自养产碱杆菌。国外对于大量培养光合细菌生产SEP的研究是20世纪70年代后期才开始的, 日本生产的PSB菌液作为鱼类的饲料添加剂已形成商品化生产。自养产碱杆菌是氢细菌中被研究最多的SCP生产菌, 这种菌体蛋白质含量高达70%~80%。目前, 主要进行这方面研究工作的有美国、俄罗斯、德国和日本。
目前已实现藻类蛋白质商品化生产的国家和地区有10多个, 年产干藻粉1万吨以上, 其中墨西哥占85%。墨西哥的Sosa Texacoeo公司拥有目前世界最大的螺旋藻生产工厂, 年产330吨。日本在冲绳也成立了2个小球藻生产有限公司, 其中一个公司拥有17个培养池, 每月产8~10吨饲用干藻粉。
我国SCP的主要产品是饲料酵母。单细胞蛋白饲料的生产与发达国家比较还存在一定差距, 生产技术和产品技术有待进一步研究和提高。近些年, 我国先后以石油、石蜡、甲烷、甲醇、乙醇、棉籽壳、糖糟渣、蔗渣、木屑、秸秆、纸浆纤维及食品、发酵工业等废液为原料, 研究生产菌体蛋白, 取得了不少研究成果。我国蛋白饲料年需要量在500万吨以上, 每年都要大量进口鱼粉和豆粕, 因此单细胞蛋白在我国的发展空间很大。
4 SCP生产工艺
生产单细胞蛋白饲料的工艺流程一般可以概括为菌种+培养基+氮源+微量元素-菌种扩大培养-发酵罐培养-培养液-分离菌体-洗涤或水解-干燥-动物饲料。
菌种的选择非常重要。菌种之间可互相补偿缺陷, 协同互生。因此生产不同的生物蛋白饲料选用的复合菌株不同。目前生产SCP的工艺主要有两大类:固态发酵和液体深层发酵。
4.1 固态发酵
固态发酵是指某些微生物生长需水很少, 可利用疏松而含有必需营养物的固体培养基进行需氧、厌氧或兼性发酵生产。固态发酵工艺是很古老的技术, 从远古时代人们就已利用固态发酵制造食品、干酪和堆肥。
固态发酵工艺的缺点是机械化程度低、生产效率低、劳动强度大、易染杂菌, 优点是无或少有环境污染、投资少、操作容易、原料易得。发酵原料一般为富含营养物质的工农业副产品和废弃物, 如麸皮、薯粉、棉籽饼粕、菜籽饼粕、大豆饼粉、血粉、羽毛粉、高粱和玉米粉等[2]。
4.2 液体深层发酵
液体深层发酵是指在液体培养基表面及内部进行的微生物培养过程, 是在第二次世界大战后发展起来的。液体深层发酵工艺产量大、易控制、机械化程度高, 但投资大、能耗大、污染多。液体深层发酵可以实现连续发酵, 而固体发酵却不能。
随着世界能源危机的出现和环保意识的加强, 已被忽视的古老固体发酵工艺重新引起人们的兴趣。因为这种方法对利用大量农业和森林废弃物很方便, 但固态发酵技术水平还比不上液体深层发酵技术水平, 设备和工艺都需要改进[3]。
参考文献
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[2]张日俊.现代饲料生物技术与应用[M].北京:化学工业出版社, 2008.
单细胞蛋白 第2篇
脑红蛋白和细胞红蛋白:携氧蛋白质家族2个新成员
脑红蛋白(neuroglobin,Ngb)和细胞红蛋白(cytoglobin,Cygb)是新发现的2个携氧蛋白家族的成员.脑红蛋白主要存在于脑中,而细胞红蛋白在全身各个组织都含有,它们和另外2个携氧蛋白--血红蛋白和肌红蛋白的同源性＜25%,但它们在种属之间的同源性很高(＞95%).脊椎动物脑红蛋白基因定位于14q24,细胞红蛋白基因定位于17q25,都含有4个外显子和3个内含子.2种蛋白在生理条件下含有6个配位键,不同于血红蛋白和肌红蛋白的5个配位键结构.这2种新蛋白和氧都具有很高的.亲和力,在缺氧条件下其基因及蛋白表达都有明显的提升,对细胞的存活有一定保护作用.对于脑红蛋白和细胞红蛋白的功能研究,有助于更好地了解机体氧代谢和氧利用过程,并为临床在缺氧损伤时的治疗提供新的观点和途径.
作 者：杨立涛 刘爽 于常海 YANG Li-Tao LIU Shuang YU Albert Cheung-Hoi 作者单位：北京大学神经科学研究所,神经科学教育部重点实验室,北京大学医学部神经生物学系,北京,100083 刊 名：中国生物化学与分子生物学报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY 年，卷(期)： 22(4) 分类号：Q5 关键词：脑红蛋白 细胞红蛋白 缺氧单细胞蛋白 第3篇
文章编号:1003-1383(2009)04-0492-03
中图分类号:R 338
文献标识码:A
doi:10.3969/j.issn.1003-1383.2009.04.069
氧是机体新陈代谢和维持生存的必要因素,人们很早就知道血红蛋白(Hb)和肌红蛋白(Mb)是机体氧的转运与储存、线粒体耗氧产能及清除多余氧等过程中的关键物质。而对高耗氧的脑组织,人们一直都未能发现能够促进神经系统氧利用的关键分子。脑红蛋白(Ngb)是德国科学家Burmester T等[1]在2000年首次发现的存在于人和小鼠脑组织内,功能上类似于肌红蛋白的携氧球蛋白。含量虽低,仅占脑组织蛋白的0.01%左右[1],但与脑的氧供应密切相关,在分子水平上调节脑组织氧的供应状态,近年来逐渐成了神经科学研究的热点。国内外学者对其做了较为深入的研究,现就脑红蛋白的分子结构、在机体中的分布及功能和相关研究进展作一简要介绍。
一、脑红蛋白的结构
脑红蛋白主要以单体形式存在,由151个氨基酸组成,相对分子量为17KD,有少量脑红蛋白为多聚体,主要为二聚体,极少为四聚体,二聚体以二硫键相连。在生理状态下Ngb以还原状态即脱氧形式(F8His2+-E7His)存在,其结构为6配体,人和小鼠 Ngb是球蛋白当中第一个具有6个配体的单体蛋白[2]。Ngb与Hb、Mb均为含铁卟啉的蛋白,但在基因组成和蛋白结构等方面与Hb、Mb有较大差异。Ngb基因在高级脊椎动物中是一种高度保守的基因,序列同源性分析表明,大鼠和小鼠Ngb基因序列同源性为96%,与人类Ngb同源性为88%,但与脊椎动物其他球蛋白则有很低的同源性,与Mb序列一致性<21%,与Hb一致性<25%。国内张成岗等[3]用RTPCR法首先克隆了Ngb基因,人Ngb基因约长8041bp,放射原位标记发现人Ngb位于14q24染色体上。Ngb具有独特的外显子和内含子结构,有4个外显子和3个内含子,其中3个内含子分别位于B122、E110、和G70,与 Hb、Mb比较,E110为其独特的内含子,该基因的启动子区域含有几个潜在的转录因子SP1的结合位点。同时Ngb还具有经典螺旋三折叠结构特性[4],基本结构是一个血红素结构和蛋白质肽链。
二、脑红蛋白的分布
脑红蛋白广泛存在于动物器官组织中。在哺乳动物中,目前已经在小鼠、大鼠和人中发现了Ngb,Burmester等[1]用Northern杂交和原位杂交技术证实脑红蛋白在小鼠和人脑组织中脑前叶、下丘脑和丘脑等处表达最强。邓美玉等[5～6]用原位杂交及免疫组化技术分析发现,Ngb mRNA阳性细胞广泛存在于大鼠脑内各个区域,定位于神经元细胞质内。Ngb免疫反应物质在脑中不同区域表达水平不同,大脑皮质表达水平较高,海马区、丘脑、下丘脑均有散在分布。小脑中阳性细胞较强,主要分布于浦肯野细胞。在脑干、脑桥中也观察到阳性细胞分布,但较少。Schmidt等[7]还观察到Ngb在小鼠的视网膜中大量表达,其密度大概是大脑中的100倍,主要分布在视网膜中耗氧最多的视细胞外网层、内网层及节细胞层中,提示Ngb参与了高耗氧的视觉感受和视觉形成过程。王航雁等[8]研究发现,人体不同组织中除脑组织中表达相对较高外,在多种组织中都有表达,胎肾、人肝等组织Ngb mRNA表达甚至大于大脑皮质、全脑和小脑,说明Ngb基因并不是神经系统特异性的,可能在机体许多组织、脏器中广泛区域发挥作用,这很可能与多种组织氧利用有密切关系。此外,内分泌系统如垂体、胰岛的Langerhans细胞、肾上腺中也有表达。
三、脑红蛋白的生物学功能
脑红蛋白的生物学功能目前尚不完全清楚,可能与下面几方面有关:①在氧代谢方面有类似Mb的功能。储存氧气和促进氧气向线粒体扩散或直接介导氧气向线粒体的传递,促进ATP的产生,从而维持正常神经元的功能。Ngb 能够可逆性地结合氧,与氧气有很高的亲和力,半饱和压力(P50)约为2托(torr),高于哺乳动物Hb(约为26托),低于Mb(约为1托),该特性使得即使血氧浓度较低,也十分有利于转运氧气通过血脑屏障,提高高耗氧的脑组织中氧的利用率。实验表明Ngb在缺血缺氧状态下表达增加,且高度表达的Ngb能够使培养的神经元在缺氧情况下存活率升高和急性缺血状态下大鼠脑梗死体积缩小[9],提示Ngb在脑缺血缺氧性损伤中对神经元有保护作用。目前缺氧诱导Ngb表达上调的机制仍未阐明,可能与缺氧诱导转录因子HIF1有关[10]。②氧气感受功能。结合配体时6配位珠蛋白血红素袋的构象变化较大,提示Ngb可能作为氧气感受器,根据氧气浓度的变化参与细胞内信号传导通路调节[11]。③NADH氧化酶作用。在半缺氧条件下促进糖酵解,产生ATP供给能量,有助于维持神经元的正常功能。④作为活性氧和NO基团的清道夫,参与NO的代谢过程,从而减轻其对神经系统的损伤。
四、脑红蛋白与缺血缺氧性疾病
目前较多研究表明Ngb对脑缺血缺氧有保护作用,这方面研究可以分为两大类,一类是在缺血缺氧条件下观察到在体或离体神经细胞脑红蛋白的表达升高,因此推测它起到脑保护作用。另一类是在缺血缺氧条件下人为增强或降低脑红蛋白的表达,观察到在体或离体神经细胞损伤减轻或增加,这类实验被认为具有较强的说服力。Sun等[9]通过向大鼠脑室注入脱氧核苷酸,中动脉闭塞后脑梗死面积增加,再给予表达Ngb的腺病毒载体后与对照组比较梗死灶体积减少50%,而利用反义寡核苷酸技术减少其Ngb的表达时,脑梗死体积较对照组增加了60%。另外,用NgbTAT治疗培养的大鼠皮质神经元细胞可以降低细胞对氧的敏感性[12],说明其可能在氧化应激诱导细胞损伤中起保护作用。过分表达Ngb的转基因小鼠实验也发现可以降低脑梗死体积[13]。还有实验将小鼠大脑中动脉结扎90 min后再灌注4～24 h,发现神经元胞质内Ngb的表达量也增加。以上实验表明Ngb在缺血缺氧情况下对脑组织具有保护作用。张成岗[14]等采用RTPCR技术对大鼠缺血缺氧损伤时脑组织中 Ngb mRNA水平的变化进行动态研究,发现该基因表达显著升高,并呈时相变化,双侧总动脉夹闭1 min后脑组织中Ngb mRNA迅速增至高峰,5 min时仍然保持高水平,15 min时迅速降低,此后又缓慢升高,提示Ngb可能在脑缺氧适应性调节中起到重要作用。以往Ngb的研究主要集中在模型和动物实验方面,在临床应用研究方面目前还处于探索阶段。最近国内王航雁等[15～16]用ELISA方法检测新生儿血清Ngb,观察新生儿和早产儿动脉血清中Ngb表达的变化,并探讨其临床意义,发现Ngb表达无性别差异,并初步确定了足月健康新生儿血清Ngb的参考范围。研究还发现宫内窘迫新生儿血清Ngb表达水平显著高于健康对照组,认为新生儿脐动脉血清 Ngb水平作为HIE的早期检测指标具有临床应用价值,该实验为Ngb在临床应用方面的研究提供了新的思路。Ngb在成人神经系统性疾病的临床应用研究尚未见报道。
五、脑红蛋白与创伤性脑损伤
目前多个研究显示在脑缺血缺氧时Ngb的表达升高,表明了Ngb对缺血缺氧性脑损伤有保护作用,是否对创伤性脑损伤也有保护作用呢?近年来也有学者在这方面做了一些研究。国内周定标等[17]通过体外培养原代神经元损伤模型的建立,采用免疫组化和图像分析技术观测损伤前、后不同时间点神经元Ngb免疫组化反应物和阳性信号值,结果发现,12 h后Ngb阳性信号开始增加,16 h达到高峰,随后逐渐下降,128 h后恢复正常水平,表明机械损伤可以诱导神经元Ngb在一定时间段内表达上调,Ngb可能参与了机械损伤后神经元的修复过程。研究还表明,大鼠弥漫性颅脑损伤后Ngb mRNA的表达呈双峰型,提示其可能参与神经元损伤后应激及继发性脑缺血缺氧性脑损伤的应答机制[18]。同样,大鼠脑外伤后在伤灶周围皮质神经元内也观察到Ngb表达明显升高[19]。以上研究表明,Ngb可能参与了脑外伤后神经元的保护作用。众所周知,继发性脑损伤的实质是脑组织的缺血缺氧,尸检发现,脑外伤死亡的病人90%都存在脑缺血,改善脑外伤病人预后的关键在于抑制原发性脑损伤后的继发性脑缺血缺氧损伤,脑红蛋白的发现,为继发性脑损伤的研究与防治提供了新的思路。
六、脑红蛋白与其他疾病
作为一种新发现的携氧球蛋白,因为脑红蛋白的特殊分子结构和其对氧有很高的亲和力,以及Ngb的神经元定位和可能的内源性神经保护因子的功能,为神经系统氧的利用及神经元保护等方面的研究提供了一条新的途径,目前成为神经内科、神经外科以及机体组织氧利用方面研究的热点,并取得了一定的成果。对其他疾病也具有保护的作用,有研究认为,脑红蛋白在视网膜、生殖系统中的高浓度表达,为视神经缺氧性病变如高原眼底病、男性不育的治疗方面指出了新的方向,具有重要的临床意义[20]。近来研究还发现脑红蛋白在神经系统退行性变中具有保护作用,与某些老年神经系统疾病的发生和发展有着某种联系[21],这些发现为帕金森氏综合征、阿尔茨海默病等的治疗带来了新的希望。Fordel等[22]研究发现Ngb还可以保护细胞免受非缺氧性损伤,提示它可能还有更为广泛的内源性作用。虽然Ngb已成为目前神经科学研究的热点,并在基因序列、定位、蛋白结构等方面进行了较为深入的研究,但当前仍然存在几个问题:①Ngb的生理功能目前还存在争议;②Ngb到底是通过何种方式、如何对神经元实施保护;③Ngb受缺氧诱导所涉及的信号传导途径仍然不明了;④Ngb的相关临床应用研究少见有报道。
综上所述,Ngb是一种新的内源性神经保护因子,在神经系统疾病及组织氧利用等方面的研究具有重要的应用价值,对于Ngb保护神经细胞机制的研究及在临床上如何加以利用是未来Ngb研究方向。
参考文献
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(收稿日期:2009-04-20 修回日期:2009-07-09)
巢蛋白与神经干细胞 第4篇
1 巢蛋白的一般概述
Nestin蛋白又名神经上皮干细胞蛋白(Neuroepithelialstem cellprotein),于1985年由Hockfield和Mckay[1]首先发现,1990年Lendahl等[2]分离并鉴定了大鼠Nestin基因,该基因的结构具有一般中间丝的特征,具有形成和维持特定的组织细胞形态功能,主要在胚胎神经干细胞呈一过性表达,当神经干细胞完成迁移和分化后便停止表达,并逐渐被胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经丝蛋白(NF)等中间丝蛋白所代替。它定位于细胞质,可被抗巢蛋白抗体(rat 401)特异性识别,是未分化状态多能神经干细胞的抗原标志,而Nestin阳性细胞也被看作为神经前体细胞[3]。Nestin蛋白在神经干细胞(NSC)内呈现一种波形分布模式,有核周围聚集现象,形成轻微弯曲的纤维,以放射状形式从核周围发散出去。
巢蛋白在多器官、多细胞均有分布,尤以胚胎期分布为广泛,目前已可在胚胎干细胞可分化的几乎所有类型的组织细胞中发现表达,如神经系统、胰腺、肝脏、心肌、骨骼肌、牙齿、肾上腺、发囊、皮肤、睾丸和胃肠道及多系统肿瘤均有分布。
2 巢蛋白基因结构及表达的调控
巢蛋白基因定位于1号染色体q23区,小鼠Nestin的cDNA全长5983bp,编码一个含有1821个氨基酸的蛋白质,包含一个较短的6个氨基酸组成的N-末端、α-螺旋杆状区及一个由近1500个氨基酸组成的C-末端;由4个外显子和3个内含子所组成,相对分子量为240kb,在+127和+160位置上存在两个潜在的起始密码子[2]。巢蛋白基因具有三个转录起始位点,该基因5′上游区具有启动子活性,启动子主要位于-11/+183的非编码区;该104bp序列中含有顺式作用元件及两转录起始位点,两相邻Sp1结合位点对Nestin基因启动子的转录活性非常重要,转录因子Sp1和Sp3通过结合两相邻Sp1位点激活了该基因的转录。
研究发现,Nestin基因的第一内含子具有明显的肌肉细胞特异性增强子活性。该内含子具有肌肉细胞特异性增强子的一些通用特性,包括含有多个E-box顺式元件,在肌肉细胞分化过程中活性增强,能够被MyoD激活等。而决定Nestin在中枢神经系统表达的结构元件存在于其第2个内含子3′端保守区[4,5],在Nestin的第二个内含子中,其增强子中30个碱基长的结构域(Nes30)有核心控件的特性[6],Nes30结构域包含有转录因子SOX和转录因子POU的结合位点。目前发现,Nestin基因第2内含子中含有2个增强子,分别决定Nestin在中枢神经系统和中脑表达,两者独立发挥功能。在第2内含子中含有与激素受体家族蛋白、POU转录因子家族、核受体蛋白结合的位点以及cAMP应答性元件(CRE)[7~9]。Nestin基因不仅在CNS和肌肉的发育过程中表达,还在其它一些组织的发育过程中瞬时表达;而且在多种组织损伤后,Nestin的表达也瞬时上调。另外,Nestin在许多肿瘤中表达异常升高。
3 Nestin在肿瘤中的表达
近几年来,有种新观点认为肿瘤是由肿瘤干细胞形成的,而Nestin作为干细胞的标记蛋白,可在各系各级别肿瘤中表达,但在不同病理级别中表达水平有显著性差异。Singh等[10]已从纤维型星形细胞瘤、髓母细胞瘤和神经节细胞胶质瘤等多种神经肿瘤组织标本中分离到了类似于神经干细胞能表达Nestin的克隆球体,并将其命名为肿瘤干细胞。Strojnik等[11]对87例原发性胶质瘤标本进行免疫组化检测,其中95.8%的病人Nestin表达阳性。1992年Dahlstrand等[12]就发现Nestin在中枢神经系统的表达和颅内肿瘤的恶性程度一致。2002年,Ehrmann等[13]发现可根据在肿瘤中Nestin免疫组化表达的数量和强度来判断胶质瘤的恶性程度。研究发现,人脑胶质瘤中Nestin在mRNA水平的表达明显高于正常脑组织,而在不同病理级别间其表达水平也存在着显著性差异,肿瘤恶性程度越高,其表达水平越高,两者呈正相关(P<0.01)。不同生存期病人的Nestin基因表达水平亦存在显著性差异,胶质瘤病人的生存时间随着Nestin表达水平升高而下降(P<0.05)。表明Nestin表达水平可能与预后相关。人脑胶质瘤中神经上皮细胞(NSC)标志物Nestin的表达水平与病理级别及预后关系密切,为进一步进行分子病理分类、判断预后和指导治疗等奠定了基础。
另外在肿瘤研究中发现,Nestin在神经外胚层肿瘤、室管膜瘤、胶质瘤和横纹肌肉瘤及其它肿瘤中都有高表达;如GIST和胃肠道ICC[14,15]、转移性黑色素瘤组织[16]、肝癌血管内皮细胞[17]上均可表达Nestin,且表达率明显高于癌旁组织。Jin等[18]发现大鼠的Nestin基因在多能的胚性癌细胞表达,而在分化的细胞上没有表达,这提示Nestin可用于检测起源于非成熟细胞的恶性肿瘤。故又可认为Nestin可作为诊断低分化肿瘤的指标,且可预测病人预后。
4 Nestin与颅脑损伤
近年研究证实,成年哺乳动物包括人的中枢神经系统中的绝大多数的神经干细胞处于静止状态。当发生脑缺血或其它脑损伤时可诱导神经干细胞增殖、定向迁移及分化,对受损的脑组织结构进行修复和重塑。Nestin作为未分化状态多能神经干细胞的抗原标志,被中枢神经系统和周围神经系统大多数增殖活跃的前体细胞所表达。在机械性脑损伤、脑缺血及兴奋性毒性脑损伤等应激刺激下神经细胞可出现胚胎期的逆转,特异性及一过性表达Nestin,Nestin表达明显上调,并表达于反应性星形胶质细胞。Janette等[19]在脑损伤模型中发现损伤区周围反应性胶质细胞表达Nestin,Nestin阳性细胞突起出现在紧靠伤口边缘,术后3~4天最明显并一直持续到14天。术后28天,无论Nestin还是NestinmRNA均消退。Nestin的表达不仅见于损伤局部,在距损伤较远的部位,如灰质(皮质、海马、丘脑)及白质(胼胝体和内囊)也可见到。Staffan等[20]在脑挫伤动物模型中用双重标记的方法同时观察到损伤灶附近和室管膜下区均出现Nestin和GFAP共表达细胞,并发现Nestin+/GFAP+双标记细胞的突起方向为从室管膜下区伸向损伤部位。同样Frisen等[21]在脊髓损伤实验中也观察到在脊髓损伤后48小时内,无论是损伤灶还是退化纤维束中的反应性星形细胞,均表达了Nestin,这种表达可至少持续13个月。与此同时,在脊髓中央管周围也发现了Nestin阳性细胞,而且在随后的时间里,Nestin阳性细胞逐渐离开中央管向损伤部位迁移。以上研究表明,脑损伤后存在神经干组织细胞向损伤灶迁移。Nestin的表达其实就是来源于神经干细胞的反应性星形胶质细胞重演胚胎发育过程。神经生物学家Rkai提出,神经细胞可以沿着辐射状排列的胶质细胞进行迁移。有研究在大鼠局灶性脑缺血模型中,缺血组织的Nestin在再灌注后2小时开始表达,6小时轻度升高,第7天达高峰,之后逐渐下降,持续表达可达28天[22]。Neil等[23]观察到,Nestin阳性反应性星形细胞密集存在并形成隔离带,将缺血梗死区包裹起来,使正常脑组织和缺血梗死区明显分开,这种现象也可能暗示了Nestin阳性反应性细胞限制了缺血梗死区炎性细胞和有毒分子向周围扩散,最大限度地确保神经元存活。表明Nestin的表达增加有利于脑重塑和修复过程,对神经干细胞的增殖起到了支持作用。因此,如何通过Nestin的研究,有效激活内源性神经干细胞,使其成为颅脑损伤、脑缺血、神经变性疾病中有效治疗手段的研究成为当今的热点。
5 Nestin的表达调节
Nestin受诸多因素调控,一类是内部因素,即巢蛋白基因调控元件及核激素、转录因子等信号分子对巢蛋白表达的调控;另一类就是外部因素,如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子家族、脑源性生长因子、神经生长因子、神经营养素3、白细胞抑制因子、血小板源性生长因子等。有报道称,甲状腺转录因子1(Thyroid TranscriptionFactor-1,TTF-1)、生长激素(Growthhor-mone,GH)、整合素(Intergrin)、神经营养因子(Neuro-trophin)、促红细胞生成素EPO等均可对Nestin的表达起到正向调控作用。体外培养实验显示:碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)可促进胚胎和成年的神经前体细胞分裂增殖[24]。2002年,Martnes向小鼠的第四脑室注射EGF和FGF-2,结果发现,其第四脑室和脊髓中央管周围的BdrU阳性细胞和Nestin阳性细胞出现了最大的增殖效应。这说明EGF和FGF-2可以促进神经干细胞的增殖[25]。
值得一提的是,丰富外环境可促进Nestin的表达。有研究显示,水迷宫训练、跑步及对丰富外环境的学习等因素能够提高脑内神经干细胞的增殖[26~28]。Mali等[29]的研究结果证明了这一点,他们发现处于丰富环境的大鼠,其SVZ区NSCs的增殖能力明显增强。Briones等[30]研究发现,复杂环境可作为一种独立影响因素,促进缺血损伤区附近的海马神经元突触及树突生长,提示在脑缺血治疗期间,对患者进行功能训练可以促进损伤区周围神经环路恢复,有助于其神经功能的恢复及重建。这些研究结果都提示我们,环境因素对神经发生同样有着重要的作用。因而在临床上,康复治疗已经成为神经系统治疗的重要组成部分,其目的是预防和矫正患者的运动、感觉、言语和认知等各种功能障碍。通过康复治疗,可以明显提高神经系统疾病患者的生活质量,减少致残率。
6 结语与展望
巢蛋白作为神经干细胞的标志物可用于分离、鉴别、培养神经干细胞,通过跟踪巢蛋白的表达来分析神经系统的发生过程。目前也在角膜缘干细胞、胰腺干细胞等研究中,Nestin蛋白被采用为相关干细胞标记物,通过筛选胰腺巢蛋白阳性细胞进行体外增殖、诱导分化,形成胰岛样结构,而用于治疗糖尿病。巢蛋白为主要在胚胎特定阶段表达的中间丝蛋白,肿瘤细胞及反应性星形胶质细胞又再现其表达,因而巢蛋白可被作为前体细胞的标志物或诊断低分化肿瘤的指标;也可作为神经系统病变和损伤的快速诊断指标之一。通过巢蛋白的荧光组化,可以检测巢蛋白的表达情况,确定病变发生的部位。巢蛋白可作为疾病的诊断指标。
单细胞蛋白 第5篇
亲环蛋白的结构、细胞定位和生物学功能
亲环蛋白(cyclophilin, CyP)家族是一类广泛存在于原核和真核生物体内, 并在结构上高度保守的多功能蛋白质.该家族属于具有催化含脯氨酸的寡肽底物顺反异构作用的肽脯氨酰顺反异构酶(peptidyl-prolyl cis-trans isomerases, PPIase).CyP通过催化含肽脯氨酰的顺反异构而帮助蛋白质折叠和组装.此外, CyP还起着分子伴侣的`作用, 在应激反应中参与调节信号转导途径, 并影响RNA的剪接过程.自最初CyP作为免疫抑制剂环孢素A (cyclosporin A , CsA)的细胞受体被发现以来, 目前大约有130种CyP同源异构体被发现和克隆.CyP家族各成员间不仅分子量不同, 而且在细胞分布及功能上也存在着差异.现从CyP的结构、细胞定位及其功能等3个方面对其作一阐述.
作 者：周波 罗玉萍 龚熹 李思光 Bo Zhou Yu-Ping Luo Xi Gong Si-Guang Li 作者单位：南昌大学生命科学学院,南昌,330031刊 名：细胞生物学杂志 ISTIC英文刊名：CHINESE JOURNAL OF CELL BIOLOGY年，卷(期)：30(3)分类号：Q2关键词：亲环蛋白 肽脯氨酰顺反异构酶 环孢素A
单细胞蛋白 第6篇
Ⅱ型胶原免疫组化法鉴定软骨细胞。体外培养到第2代软骨细胞，分别用0，50，100，200 μg·mL-1的ABPS对软骨细胞进行干预。干预后，Western blot检测各组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖的表达变化，免疫荧光观察空白组与加药组Ⅱ型胶原的表达变化。结果：第2代软骨细胞的形态学表明软骨细胞的典型特征：软骨细胞含有丰富的Ⅱ型胶原。Western blot检测结果显示，ABPS促进软骨细胞Ⅱ型胶原表达，并且在
100 μg·mL-1时表达最高，差异有统计学意义（P < 0.05）。同时100 μg·mL-1的ABPS干预软骨细胞后，软骨细胞中的蛋白聚糖表达增加，但差异无统计学意义（P > 0.05）。与空白组的Ⅱ型胶原荧光表达相比，ABPS干预后软骨细胞的Ⅱ型胶原荧光表达更强。结论：ABPS促进了软骨细胞Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达。
【关键词】 骨关节炎；牛膝多糖；Ⅱ型胶原；蛋白聚糖；软骨细胞；大鼠
Effect of ABPS on the Expressions of TypeⅡCollagen and Proteoglycan of Cartilage Cells
MA Yu-huan，ZHENG Wen-wei，CHEN Hou-huang，SHAO Xiang，CHEN Da，YE Hong-zhi，LI Xi-hai
【ABSTRACT】 Objective：To investigate the effect of Achyranthes bidentata polysaccharides（ABPS） on the expressions of typeⅡcollagen and proteoglycan in cartilage cells.Methods：Ten 4-week-old healthy SD rats were used to isolate the knee joints，scrape cartilaginous tissue off the surface of the knee joint，and get knee joint cartilage cells with the mechanical typeⅡcollagenase digestion method.An in vitro culture system was established and the cell morphology was observed with an inverted phase contrast microscope.TypeⅡ immunohistochemistry method was used to identify the chondrocytes.By the second generation of in-vitro-cultured chondrocytes，ABPS（0，50，100，200 μg·mL-1 respectively）was used to interfere in the cartilage cells.After intervention，Western blot was used to detect the expression changes of typeⅡcollagen and proteoglycan of each group，and immunofluorescence was used to observe the expression changes of typeⅡcollagen respectively in the blank control group and the dosing group.Results：The morphology of the second generation chondrocytes showed that cartilage cells contained rich typeⅡcollagen.Western blot showed that ABPS promoted chondrocyte typeⅡcollagen and the expression of typeⅡcollagen was the highest when there was 100 μg·mL-1 ABPS，the difference being statistically significant（P < 0.05）.After intervention with 100 μg·mL-1 ABPS，the expression of proteoglycan in cartilage cells increased，but the difference was not statistically significant（P > 0.05）.Compared with the blank control group，the expression of intervened collagen typeⅡcollagen was stronger.Conclusion：ABPS promotes the expression of typeⅡcollagen and proteoglycan.
【Keywords】 osteoarthritis；achyranthes
bidentata polysaccharide；typeⅡcollagen；pr-oteoglycan；cartilage cell；rats
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牛膝多糖（ABPS）是从苋科类植物牛膝的干燥根中提取出来的有效成分。牛膝具有补肝肾、强筋骨、逐瘀通经、引血下行之功效[1-2]，被广泛应用于治疗骨关节炎（osteoarthritis，OA）。OA是一种常见于中老年人的慢性、进展性关节疾病，其最典型的病理特征是软骨退变，以Ⅱ型胶原与蛋白聚糖破坏丢失、软骨胶原表型改变为主要病理变化[3-4]。关节软骨主要由软骨细胞和细胞外基质（ECM）组成[5-6]，构成ECM的主要成分是Ⅱ型胶原和蛋白聚糖。课题组前期研究表明，ABPS促进了软骨细胞的增殖，因此，本文将探讨ABPS对软骨细胞Ⅱ型胶原及蛋白聚糖表达变化的
影响。
1 实验材料
1.1 实验动物 健康SD大鼠10只，雄性，4周龄，体质量200～300 g，由上海吴氏实验动物公司提供。实验动物合格证号：0001319。许可证号：SCXK（闽）2012-0001。大鼠分笼饲养，自由饮水，颗粒饲料喂养。
1.2 药 物 按照参考文献[7]研究方法提取。提取的ABPS溶解在培养液中。
1.3 主要试剂 RIPA裂解液（强）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所）；PVDF膜（美国Millipore公司）；TBST、转膜液、电泳液（北京普利莱基因技术有限公司）；一抗Ⅱ型胶原、一抗蛋白聚糖（Abcam）；二抗羊抗兔（北京中杉金桥生物技术有限公司）；DAB检测试剂盒（北京博士德公司）；DyLight 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（艾美捷科技有限公司）。
1.4 实验仪器 超纯水装置（美国MILIPORE公司）；LX-800酶标仪（美国Bio-tek公司）；化学发光成像系统（美国Bio-RAD公司）；64R型低温高速离心机（美国BECKMAN公司）；激光共聚焦显微镜（德国ZEISS公司）。
2 方 法
2.1 关节软骨细胞的分离和培养 将10只SD大鼠脱颈法处死，无菌条件下刮下双侧膝关节表面软骨组织，1×PBS缓冲液漂洗3次，用眼科剪剪碎至1 mm3大小；移至培养皿中，加入质量分数为
0.2%的Ⅱ型胶原酶5 mL，置于37 ℃培养箱中消化2 h；接着用200目尼龙网筛过滤；然后放入1000 r·min-1离心机离心5 min，弃上清液，将沉淀的细胞团块用培养液制成细胞悬液；再将未消化完全的组织如此操作2次。将3次所得的细胞悬液质量分数为1×105·mL-1，接种于培养瓶中，放入体积分数为5%的CO2培养箱中培养。每2～
3天更换1次培养基，倒置相差显微镜观察细胞生长情况，待80%的细胞融合后进行传代培养。细胞生长单层铺满培养瓶后，用质量分数为0.25%的胰蛋白酶消化2～3 min，待镜下细胞圆缩时，用尖吸管吹打细胞使其悬于液体中，加质量分数为10%的FBS培养液终止消化，分瓶，加质量分数为10%的FBS培养。第2代（P2）软骨细胞分为空白组和ABPS组，空白组不加ABPS干预，ABPS组分别加入50，100，200 μg·mL-1的ABPS干预48 h[8]。
2.2 软骨细胞鉴定 P2软骨细胞接种于细胞爬片上，培养48 h，PBS冲洗，丙酮固定10 min，浸入质量分数为0.75%的H2O2-PBS 37 ℃处理30 min，PBS振洗2次，每次3 min；加入封闭血清，37 ℃
封闭30 min，弃去血清，加入Ⅱ型胶原一抗，37 ℃孵育2 h，PBS振洗3次，每次3 min，生物素化山羊抗兔IgG 37 ℃作用20 min，PBS冲洗
2 min，3次；链霉亲和素-过氧化物酶复合物置于室温30 min，PBS冲洗5 min，4次；DAB显色，水洗
5 min，浸入苏木素染液2 min，水洗，脱水，透明，
封片。阴性对照组不加入Ⅱ型胶原一抗孵育。
2.3 Western blot 参照试剂说明书，分组提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。①质量分数为12%的SDS-PAGE胶每孔加20 μg变性后蛋白，60 V恒压至电泳超过浓缩胶后，90 V恒压至电泳结束。②PVDF膜无水甲醇活化10 min，PVDF膜、胶、滤纸，转膜液平衡10 min。③由下到上：滤纸-胶-PVDF膜-滤纸顺序，制作“三明治”夹，100 V恒壓条件转膜。④转膜完成的PVDF膜，TBST荡洗后质量分数为5%的脱脂奶粉室温封闭2 h，相应一抗孵育，4 ℃摇床摇动过夜。⑤TBST洗3次，每次10 min，加入相应二抗，室温摇床孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min。⑥PVDF膜蛋白面朝上放置，加入适量ECL显色液，反应2 min，
分析得出结果。
2.4 免疫荧光染色 将软骨细胞分为空白组及ABPS组，ABPS组中加入含ABPS 100 μg·mL-1的完全培养基。干预48 h后，去除培养基，PBS洗3次；多聚甲醛室温固定10 min，PBS洗3次；质量分数为1%的Triton X-100室温通透10 min，PBS洗3次；质量分数为5%的羊血清室温封闭1 h，Ⅱ型胶原抗体4 ℃孵育过夜；PBS洗3次，羊抗兔荧光二抗37 ℃孵育1 h，DAPI染色5 min，PBS洗5～6次。
2.5 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料以表示，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）或Student's t-test。以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结 果
3.1 体外培养的软骨细胞形态 从大鼠膝关节经多次酶消化分离所得成骨细胞在倒置相差显微镜下观察，原代（P0）的软骨细胞具有小而圆的特征，经过2 d的培养，细胞的体积变大，少量的细胞开始拉长；3 d后，细胞具有梭型或者椭圆形的特征；到第5天细胞簇开始生长。第1代（P1）及P2细胞生长更为迅速。见图1。
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3.2 體外培养的软骨细胞的鉴定 P2软骨细胞的形态学表明软骨细胞的典型特征：软骨细胞含有丰富的Ⅱ型胶原。与阴性对照组比较，干预后的软骨细胞中细胞质染色棕色，这表明软骨细胞具有丰富的Ⅱ型胶原蛋白表达。见
图2。
3.3 Western blot检测结果 与空白组比较，ABPS组中的Ⅱ型胶原表达量增加，其中以
100 μg·mL-1ABPS对软骨细胞干预时Ⅱ型胶原的表达最高，差异有统计学意义（P < 0.05）（图3、
意义（P > 0.05）。
3.4 免疫荧光结果 2组软骨细胞核DAPI染色明显，呈蓝色（图6A1-A2），软骨细胞Ⅱ型胶原染色明显，呈绿色（图6B1-B2），细胞核与Ⅱ型胶原的合成图，结构清晰（图6C1-C2）。与空白组比较，ABPS组的细胞核染色明显，Ⅱ型胶原的荧光表达更强。可以说明100 μg·mL-1 ABPS干预的软骨细胞的活性、Ⅱ型胶原的表达都得到了增强。
4 讨 论
氨基葡萄糖是治疗OA的常用药物，具有一定的疗效。研究发现，氨基葡萄糖可以促进蛋白多糖的合成，抑制蛋白多糖及胶原的降解，延缓OA的进程[9]。然而近年来发现，长时间使用氨基葡萄糖会造成长链脂肪酸及过氧化物的积聚，对OA的治疗产生相反的作用[10]。而ABPS是一种具有广泛生物活性的高分子多糖，因在治疗疾病中具有重要作用而引起广泛的关注。课题组前期的结果表明，ABPS可以促进软骨细胞的增殖[8，11]。因此，ABPS可能是一种潜在新型的治疗OA的药物。
关节软骨的胶原蛋白主要以Ⅱ型胶原为主，占软骨胶原总量的90%～95%。Ⅱ型胶原经过多次聚集，在软骨内形成三维网状结构，同时与蛋白多糖链接、缠绕，形成了使软骨具有伸缩力的纤维网，起到固定蛋白多糖以及维持组织结构和张力恒定的作用。Ⅱ型胶原蛋白形成的网状结构遭到破坏被认为是OA的重要环节，软骨的这种结构框架遭到破坏从而引发软骨生物力学、生物化学等一系列变
化[12-14]。因此促进Ⅱ型胶原表达，在一定程度上可以缓解OA进程。本实验Western blot的结果表明，ABPS促进了软骨细胞Ⅱ型胶原的表达，并且
100 μg·mL-1时表达最高。免疫荧光结果表明，ABPS可以明显增加软骨细胞中Ⅱ型胶原的
表达。
蛋白聚糖是关节软骨ECM的主要大分子成分，在维持软骨正常功能及ECM的结构上具有重要作用[15]。在OA中，蛋白聚糖的过度降解和丢失是软骨代谢失衡中最早发生的代谢变化。随着OA病理改变出现，蛋白聚糖的降解持续存在，则会进一步引起关节软骨胶原的过度降解及细胞表型的改变。而软骨细胞的表型改变，又能导致蛋白聚糖代谢的异常增加，随着细胞功能的丧失，蛋白聚糖的分解加快，并且多于合成，最终导致蛋白聚糖的大量丢失。因此，促进蛋白聚糖的表达对治疗OA具有重要作用[16]。本实验研究结果发现，ABPS在100 μg·mL-1时可以促进蛋白聚糖的合成，表明ABPS可通过促进蛋白聚糖的表达抑制软骨退变。
本实验通过对大鼠软骨细胞进行ABPS干预发现，ABPS具有促进大鼠软骨细胞Ⅱ型胶原与蛋白聚糖表达的作用，提示ABPS可以通过促进软骨细胞ECM分泌来抑制软骨退变。
5 参考文献
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收稿日期：2016-07-13；修回日期：2016-08-29
单细胞蛋白 第7篇
细胞移行 (cell migration) 是一种十分重要的生物学现象, 比如说, 在创伤修复过程中。aPKC-Par3与PATJ是2种重要的极性蛋白, 参与调控上皮细胞的移行行为。但是2种极性蛋白是如何聚集到需移行的细胞周围的, 却一直不清楚。
研究人员鉴别了一种特殊的蛋白, 在外界刺激环境下具有吸引aPKC-Par3与PATJ蛋白聚集在上皮细胞周围的功能。 Occludin是一种存在于细胞连接处的细胞膜蛋白。最近的研究发现, Occludin还有鲜为人知的一种新功能。这种功能体现在创伤愈合过程中的肾上皮细胞中。研究人员发现, Occludin在17h内能促进90%的细胞完成创口愈合过程。而对Occludin进行功能性缺失研究发现, 只有28.6%的细胞能完成创口愈合过程。Occludin被发现存在于细胞连接处, 促进细胞移行。
单细胞蛋白 第8篇
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2000年2月～2010年5月我院外科手术切除的HCC标本58例,临床和病理资料完整。患者均未经过任何抗肿瘤治疗,其中,男46例,女12例;年龄23～86岁,中位年龄60岁;Edmondson病理分级:1～2级16例,3级以上42例。47例AFP增高,伴有门静脉癌栓18例,腹腔淋巴结及远处转移9例。所有组织标本均经10%甲醛固定,石腊包埋,5μm连续切片。
1.2 方法与试剂
HBx蛋白抗体和人生存素(FL-142)单抗及S-P试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。免疫组化采用S-P方法,操作步骤如下:石蜡切片脱蜡至水;3%H2O2室温孵育5～10 min;微波抗原修复;正常山羊血清封闭,室温15 min,滴加p53和生存素抗原工作液,冰箱内4℃过夜;PBS冲洗,滴加第二代生物素,标记二抗工作液,室温20 min;PBS冲洗,滴加第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液,室温20 min;PBS冲洗,DAB显色,自来水冲洗,苏木素复染,封片。已知的肝癌HBx及生存素阳性切片为阳性对照,磷酸盐缓冲液(PBS)作为空白对照。
1.3 结果判断
观察每张切片至少有5个具有代表性的高倍视野,不少于1 000个细胞,HBx和生存素均以胞质或胞核出现棕黄色颗粒为阳性染色,这样的细胞大于或等于100个为阳性,对免疫组化结果进行评估。HBx阳性表达定位于细胞核(图1),生存素阳性表达定位于细胞质(图2),均呈棕黄色。
1.4 统计学方法
采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,计数资料用百分率表示,采用χ2检验,相关分析采用spearman等级相关系数,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肝细胞癌组织中乙型肝炎病毒X蛋白及生存素的表达及关系
HBx的阳性表达信号多为核型,生存素的阳性表达定位于细胞质,均呈黄色颗粒。HBx的阳性率为46.6%(27/58),生存素的阳性率为69.0%(40/58),差异有统计学意义(χ2=5.365,P<0.05);HBx阳性的HCC组织生存素的阳性率为70.4%(19/27),HBx阴性的HCC组织生存素的阳性率为27.5%(11/40),差异有统计学意义(χ2=8.673,P<0.05)。等级相关分析表明,HCC组织中HBx和生存素的表达呈正相关(r=0.413,P<0.05)。见表1。
2.2 乙型肝炎病毒X蛋白及生存素表达与肝细胞癌临床病理参数的关系
HBx在HCC组织中的阳性表达率与Edmondson分级相关(r=0.432 7,P<0.05);Ⅰ～Ⅱ级阳性率为18.8%,≥Ⅲ级阳性率为57.1%。有门静脉癌栓者的阳性率(66.7%)明显高于无门静脉癌栓者(37.5%),差异有统计学意义(P<0.05);AFP增高者HBx的阳性率明显高于正常者,差异有统计学意义(P<0.05);HBx的表达与有无转移无关(r=0.235 4,P>0.05)。生存素在病理分级差、有门脉癌栓及转移和伴有AFP高的HCC组织中的阳性表达率明显高于病理分级好、无门脉癌栓及转移和不伴有AFP高的HCC组织的阳性表达率。见表1。
3 讨论
嗜肝病毒科的来源于哺乳动物的正嗜肝DNA病毒具有表达X蛋白的功能,X蛋白的结构与宿主细胞DNA糖基化酶功能结构域具有同源相似特点,而DNA糖基化酶是DNA复制时碱基切除修复的主要酶[3]。在乙型肝炎病毒诱发的肝细胞癌的过程中X基因经常与肝细胞DNA整合,HBX促进细胞周期进程,使抑制细胞生长的调节因子失活,与p53及其他肿瘤抑制因子及衰老相关因子结合并抑制其功能。近年研究表明,HBX调节转甲基酶转录,使DNA局部甲基化导致抑癌基因沉默或者使DNA全部甲基化造成染色体不稳定,从而在肝癌发生中起作用。抗凋亡作用与p53抑制有关,促进凋亡作用机制不明。HBX能够增加端粒酶逆转录酶的表达及端粒酶的活性从而延长肝细胞寿命有利于恶变,羟基末端去除的HBX失去了抑制细胞增殖及促进凋亡性能,增强了其调控癌基因的功能,使胰岛素样生长因子调节异常,促进增殖及凋亡抑制,使细胞生长失控[4]。
生存素是人类基因组中的肿瘤特异性基因,正常的成人组织罕有表达,在大部分人类肿瘤中高表达。生存素含有特征性的锌指结构称为BIR结构域,属于凋亡抑制蛋白(IPA)家族成员之一,其他凋亡抑制蛋白家族成员的凋亡抑制是直接与细胞内半胱天冬酶结合抑制其活性,生存素不能直接与半胱天冬酶结合,乙肝病毒X蛋白相互作用蛋白(HBXIP)作为辅助因子在生存素引发的凋亡抑制起一定作用[5]。HBX蛋白的C末端与HBXIP结合再与生存素结合形成复合物,该复合物可以与前半胱天冬酶-9结合,从而阻止其募集到凋亡前酶活化因子(Apaf-1)上,使生存素借助细胞色素C介导的凋亡途径选择性地抑制半胱天冬酶的蛋白酶活性,在细胞凋亡中发挥桥梁作用[6]。
本研究显示,HBX上调生存素的表达,提示肝细胞癌发生凋亡抑制。另外,HBx蛋白可与p53蛋白结合并使其失活,而生存素基因是一个被野生型p53基因抑制的基因[7],HBx蛋白上调生存素在肝细胞癌中的表达形成凋亡抵抗,本研究结果证明了这一点。病理分级分化差,伴有门脉癌栓及AFP增高有转移者HBx及生存素表达上调,表明HBx及生存素表达与肝细胞癌的恶性程度疾病进展有关。HBx上调生存素表达使细胞周期调控失常,凋亡障碍增殖过度,可能是乙型肝炎病毒感染引起肝细胞癌原因之一。
摘要：目的:探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)与生存素在肝细胞癌(HCC)表达发生中的作用。方法:采用免疫组织化学测定58例患者的HCC组织中HBx蛋白和生存素蛋白表达,用含有辣根过氧化物酶底物的试剂合(DAB)显色,已知的肝癌组织HBx及生存素阳性切片为阳性对照,磷酸盐缓冲液(PBS)作为空白对照。结果:HCC组织HBx和生存素的表达率分别为46.6%(27/58)和69.0%(40/58),HBx蛋白阳性的HCC组织中生存素蛋白阳性表的阳性率为70.4%(19/27),HBx蛋白的阴性的HCC组织中生存素蛋白阳性表的阳性率为27.5%(11/40),差异有统计学意义(P<0.05);HBx蛋白与生存素蛋白表达与HCC分化程度、转移及甲胎蛋白(AFP)相关。结论:在HCC的发生过程中HBx蛋白可上调生存素蛋白的表达,促进肝细胞癌的发生发展。
关键词：肝细胞癌,乙型肝炎病毒X蛋白,肝炎病毒,生存素,凋亡
参考文献
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人单核细胞表达蛋白酶激活受体 第9篇
1 材料与方法
1.1 材料及仪器
Ficoll-Paque Plus购自Amersham公司。牛血清清蛋白和EDTA购自Sigma公司。CD14微珠标记、磁性细胞分离器MidiMACS和LS分离柱购自Miltenyi公司。RPMI 1640培养液购自GIBCO公司。PE标记的小鼠抗人PAR-1和PAR-2单克隆抗体、兔抗人PAR-3和PAR-4多克隆抗体购自Santa Cruz公司。PE标记的小鼠IgG1和IgG2a、FITC标记的羊抗兔多克隆抗体购自BD PharMingen公司。TRIZOL试剂购自Invitrogen公司。RT-PCR试剂盒购自TAKARA公司。SYBR GreenⅠ核酸凝胶染料购自BMA公司。ACS Calibur流式细胞仪购自BD公司。PCR扩增仪PTC-200购自MJ Research公司。
1.2 方法
1.2.1 分离单核细胞
采用密度梯度离心法分离人外周血单核细胞。用磁激活细胞分选法(MACS)按说明书分离纯化人CD14阳性的单核细胞。用于RT-PCR的单核细胞,采用MACS纯化2次。
1.2.2 流式细胞术分析
经MACS纯化后的单核细胞浓度调整至5×106~1×107/ml,按说明书分别加入120 PE标记的抗PAR-1、抗PAR-2小鼠抗人单克隆抗体、抗PAR-3、抗PAR-4兔多克隆抗体IgG及相应的同型对照抗体,4℃避光孵育30 min,含1%牛血清清蛋白PBS洗2次;PAR-3、PAR-4管加入FITC标记的羊抗兔Ig二抗,4℃避光孵育30 min,含1%牛血清清蛋白PBS洗2次,最后加入500μl 1×PBS悬浮细胞,使用流式细胞仪FACS Calibur检测单核细胞PARs的表达情况。
1.2.3 RT-PCR
经MACS纯化的单核细胞,经过第2次纯化后用1×PB液洗涤3次,用TRIZOL试剂提取细胞总RNA,具体操作步骤按试剂说明书进行。RNA经1%琼脂糖电泳后,按TAKARA RT-PCR试剂盒说明书进行cDNA合成。逆转录的条件:oligo-d(T),42℃30 min,99℃5 min,5℃5 min。PAR-1、PAR-2、PAR-3、PAR-4和β-actin的特异性引物均由上海博亚生物技术有限公司合成,引物序列见表1。β-actin的PCR扩增条件:94℃2 min,94℃30 s,55℃30 s,72℃1 min,72℃10 min,35个循环;PAR-1、PAR-2、PAR-3和PAR-4的PCR扩增条件:94℃2 min,94℃30 s,67℃30 s,72℃1 min,72℃10 min,35个循环。PAR-1和PAR-2扩增的目的片段分别为500 bp、461 bp、403 bp和401 bp。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶进行电泳,在凝胶成像分析系统下进行拍照和图像分析,PCR扩增片段测序验证。RT-PCR中PAR基因的引物序列见表1。
2 结果
2.1 PARs蛋白质在单核细胞上的表达
采用流式细胞术分析检测PARs蛋白质在单核细胞上的表达。结果显示,人外周血单核细胞表达PAR-1、PAR-3和PAR-4,但不表达PAR-2蛋白质。见图1。
2.2 PARs mRNA在单核细胞上的表达
采用RT-PCR方法检测PARs mRNA在单核细胞上的表达。经过两次MACS纯化的单核细胞RNA经RT-PCR后,琼脂糖凝胶电泳显示,单核细胞表达PAR-1和PAR-3,但是不表达PAR-2和PAR-4 m RNA,见图2。PAR-1和PAR-3基因测序显示与GenBank中的序列相同(结果未显示)。在没有逆转录酶时进行RT-PCR试验,发现未能扩增出任何条带,说明PCR产物没有DNA污染(结果未显示)。
3 讨论
PARs是新的G蛋白偶联受体,能够被凝血酶、胰蛋白酶、类胰蛋白酶、弹性蛋白酶等以十分巧妙的机制将一个细胞外蛋白水解事件转变为跨膜信号,这些受体是带着它们在被切割前一直隐蔽着的配基[1]。凝血酶可激活PAR-1,PAR-3和PAR-4,而PAR-2可被胰蛋白酶、肥大细胞类胰蛋白酶和活化的凝血因子X所激活[6,7,8]。另外,这些受体还可被相应的PARs激动肽所激活。其中PAR-1是凝血酶的高亲和力受体,而PAR-4只能被高浓度凝血酶激活。有研究表明,凝血酶通过PAR-1和PAR-4途径协同互补介导血小板的活化,而PAR-3作为PAR-4的辅助因子,在血小板的活化中也起着一定作用[9],除参与凝血外,多种细胞类型PARs的广泛激活还参与血管损伤反应[10,11]。几乎所有的造血细胞上均有PARs表达,如血小板、肥大细胞、嗜酸粒细胞等,从而参与凝血、炎症和变态反应等生理和病理过程[1,12]。
本研究利用MACS获得高度纯化的人外周血单核细胞后,用流式细胞仪、RT-PCR检测4种PARs在单核细胞上的表达。结果发现,人外周血单核细胞表达PAR-1、PAR-3、PAR-4 蛋白质和PAR-1和PAR-3 mRNA,但不表达PAR-2蛋白质和PAR-2、PAR-4 mRNA。Colognato等[4]和本研究结果均显示人外周血单核细胞不表达PAR-2蛋白质,而Johansson等[3]研究显示单核细胞表达PAR-2蛋白质,可能与他们采用的单核细胞纯化方法不同所致。Johansson等采用的是阴性选择法纯化人单核细胞,而本文采用的是阳性选择法,因此所得到的单核细胞纯度不同;单核细胞不是均一的细胞群,表型和功能都表现出高度异质性[13]。本文还发现人外周血单核细胞表达PAR-4蛋白质,可能与Colognato等采用的单核细胞纯化方法不同所致。Colognato等采用黏附法纯化单核细胞,而本研究采用的是MACS法,而黏附法分离单核细胞时可能对于单核细胞有激活作用,而下调其细胞膜表面的蛋白质表达[14]。虽然本实验流式细胞仪发现人外周血单核细胞表达PAR-4蛋白质,但采用RT-PCR方法发现单核细胞不表达PAR-4 mRNA。单核细胞不表达PAR-4 mRNA的原因有待进一步研究。
单细胞蛋白 第10篇
1.1 材料
本论文以温室盆栽黄芩根诱导的愈伤组织为材料, 进行细胞悬浮培养。标准品购于昆明风山渐医药研究有限公司。
1.2 主要的仪器设备
超净工作台苏州净化设备有限公司
电子天平北京赛多利斯天平有限公司
电热恒温鼓风干燥箱山东潍坊医药集团股份有限公司
UV 755B型紫外可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司
1.3 培养基的配制a.配制各种母液
b.p H值的测定
接通电源、校准、先将选择旋钮指向“p H”, 温度旋钮指向“20”, 斜率旋钮指向最小值, 将电极插入准备PH值为6.68的试剂中, 调节“定位”旋钮, 使数据显示为6.68时固定。再将电极取出放入蒸馏水中。B将待测液体准备好后, 插入电极, 此时精密p H计上所显示的数字即该液体的PH值。
c.培养基的灭菌处理将定容后的培养基分装, 加塞密封后放入高压灭菌锅内。在120℃下灭菌20分钟。
2 方法
2.1 悬浮细胞培养体系的建立
在BCM-1000型生物净化工作台上进行无菌操作。取继代培养5~6次的黄芩根诱导的愈伤组织, 选取结构疏松、生长迅速的淡黄色愈伤组织, 接种于500m L容量的三角瓶中每三角瓶200ml液体培养基中。置THZ-82B气浴恒温振荡器中振荡培养。培养条件: (25±1) ℃、暗培养。转速110±10r/min。
培养6到9天生长旺盛时分装到100ml容量的三角瓶中, 每个三角瓶装入30ml培养液, 接种量约为相同质量的细胞。
2.2 实验操作
以第一天分装开始为第0天, 分别测定细胞悬浮系中的细胞质量、细胞的蛋白质含量以及过氧化物酶的活性。培养物蛋白质含量及过氧化物酶活性测定采用考马斯兰G-250法, 以牛血清蛋白为标准蛋白质;在755-紫外光分光光度计λ470nm下比色, 酶活性以0.01ΔOD470/min·g (鲜重) 为单位表示, 设3个重复。
2.2.1 细胞悬浮系中的细胞质量的测定
取一瓶培养中的细胞悬浮系, 细胞悬浮系经减压滤取悬浮培养细胞, 蒸馏水洗涤数次, 抽滤后称重。干重则将抽干后的鲜培养物于60℃下烘干称重, 设3个重复。
2.2.2 细胞悬浮系的细胞蛋白质含量的测定
考马斯亮蓝G-250 (Coomassie brilliant blue, G-250) 法是利用蛋白质-染料结合的原理, 定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。
a.标准蛋白质溶液 (100μg/m L牛血清白蛋白) :称取牛血清蛋白25mg, 加水溶解并定容至100m L, 吸取上述溶液40m L, 用蒸馏水稀释至100m L即可。b.考马斯亮蓝试剂。称取60mg考马斯亮蓝G-250, 溶于100m L3%过氯酸溶液中, 滤去未溶解的燃染料, 贮于棕色瓶中。常温下可保存一个月。c.标准曲线的绘制。取6支试管, 摇匀, 向各管中加入5m L考马斯亮蓝试剂, 摇匀, 并放置5min左右, 以0号试管为空白对照, 在620nm下比色测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标, 以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。d.样品测定。 (1) 样品提取:称取细胞质量1克, 用5m L蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后, 4000r/min离心15min, 上清液备用。 (2) 吸取样品提取液1.0m L (视蛋白质含量适当稀释) , 放入试管中 (每个样品重复2次) , 加入5m L考马斯亮蓝试剂, 摇匀, 放置2min后在620nm下比色, 测定吸光度, 并通过标准曲线查得蛋白质含量。
3 结果与分析
3.1 黄芩细胞悬浮系的细胞蛋白质含量的动态变化
蛋白质是细胞中重要组成成分, 在细胞生命活动中起着重要作用, 随着悬浮培养细胞的生长、分裂和分化, 细胞中可溶性蛋白质含量也发生一定的变化。在细胞生长过程中, 可溶性蛋白质含量在第6天最高, 之后蛋白质含量逐渐的减少, 而在第12天之后有小幅度的回升, 到第18天之后又减少。蛋白质含量的变化可能与细胞生长速度等因素有关, 也可能与蛋白质的合成、分泌、利用及细胞分裂有关。
3.2 黄芩细胞悬浮系的细胞POD活性的动态变化
过氧化物同功酶普遍存在于各种植物的组织中, 具多种生理功能, 同时它也是植物体内的一种适应性酶, 它的差异反应了作物品种生长发育特点、体内代谢状况及对外界环境的适应性不同。
随着悬浮培细胞的生长、分裂和分化, 培养细胞的过氧化物酶活性发生相应的变化, 看出在悬浮培养过程中, 其过氧化物酶活性有一个峰值。峰值出现在第12天。Galtson等人认为损伤能使合成该酶的基因抑制被解除, Rigde等人则认为损伤使过氧化物酶合成抑制物渗漏, 导致酶活性增强.这与我们实验中接种初期酶活性上升相一致, 另外也与可溶性蛋白质含量变化相关, 也与细胞的生长和分化程度有关。
4 结论
4.1 细胞的增长分3个时期:
延迟期 (0~6天) 小幅度上升;指数期 (6~18天) 大幅度上升、静止期 (18~21天) 有微量的增长接近于静止。
4.2 悬浮细胞的蛋白质含量随培养时间呈波浪型变化。
具有1个较为明显的峰值, 在第6天。而另1个较为不明显的峰值在第18天。在培养的第1天至6天, 一直呈上升趋势直到顶峰蛋白质含量达到3.3375mg/g。随后下降, 到第12天出现了小幅度的回升现象, 直到第18天开始较为缓慢的下降。
4.3 悬浮细胞的过氧化物酶活性随培养时间呈抛物线型曲线变化。
在细胞生长的前期, 随着细胞的生长, 过氧化物酶活性下降, 在第3天后开始上升, 到第12天出现顶峰, 活性为4.07u/ (min·g鲜重) , 之后缓慢下降。
摘要：临床上黄芩具有清热、泻火、解毒、止血、安胎等作用, 药理作用广泛。主要作用是抗氧化、清除自由基、抗炎、抗肿瘤、阻止钙离子通道、抑制醛糖还原酶、抗病毒、抗过敏等, 并对免疫、心脑血管、消化、神经系统有保护作用。
关键词：黄芩,悬浮培养,蛋白质含量,过氧化物酶,活性
参考文献
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单细胞蛋白 第11篇
关键词：甜蜜素；蛋白糖；蚕豆根尖细胞；微核率；染色体畸形率
中图分类号：R155.5+1；S643.601文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0061-02
甜蜜素和蛋白糖是食品加工中常用的2种甜味剂，属于高倍甜味剂。甜蜜素主要成分是环己基氨基磺酸钠，甜度是蔗糖的30倍，口感极似蔗糖，是目前我国食品应用最多的高倍甜味剂之一；蛋白糖别称阿斯巴甜，甜度是蔗糖的200倍，由阿斯巴甜（天门冬酰苯丙氨酸甲酯）等复配而成，可用于食品、饮料及餐饮，但对酸及热的稳定性较差，不宜用于焙烤食品[1-2]。本试验利用不同质量浓度的甜蜜素和蛋白糖对蚕豆根尖进行处理，同时采用阳性对照组和阴性对照组，观察甜蜜素和蛋白糖对蚕豆根尖细胞微核率和染色体畸变的影响[3-5]，了解其致突变作用，为其安全使用提供一定的理论依据。
1材料与方法
1.1材料
蚕豆（ViciafabaL.），为陕西省西安市市场上销售的当年新种子；甜蜜素（sodiumcyclamate）、蛋白糖（proteinglucose），購于陕西省西安市市场。
1.2溶液配制
阳性对照NaN3溶液：称取分析纯NaN3256mg定溶于1L蒸馏水中，配成256mg/L原液，再稀释成64、16、4mg/L等3个浓度梯度。阴性对照为蒸馏水。
甜蜜素最大剂量为8000mg/L，利用梯度稀释配制成最大剂量的1/2、1/4、1/8，分别为4000、2000、1000mg/L；同样方法蛋白糖最大剂量为800mg/L，分别稀释成400mg/L（1/2）、200mg/L（1/4）、100mg/L（1/8）。
1.3试验方法
试验方法参照孔志明的方法[6]。按试验方法采用配置的各浓度蛋白糖和甜蜜素处理蚕豆根尖。常规制片，用改良的石炭酸品红染液染色[7-8]，压片镜检。每组观察5个根尖，每个根尖观察2000个细胞、200个分裂相，分别按下列公式计算每个根尖的微核率、染色体畸变率和微核指数：
微核率（FMN）=微核数/1000个细胞×1000‰；
染色体畸变率（AF）=染色体畸变数/分析的染色体总数×100%[9]；
微核指数（MI）=样本的微核率/阴性对照的微核率[10]。
微核指数在0～1.50间为基本没有污染，1.51～2.00之间为轻污染，2.01～3.50之间为中污染，>3.50为重污染[11]。将样本的蚕豆根尖微核指数>1.50定为开始产生致突变作用[12-14]。
1.4统计学分析
应用SPSS13.0进行方差分析，采用新复极差法进行多重比较。
2结果与分析
2.1甜蜜素对蚕豆根尖细胞微核率和染色体畸形率的影响
从表1可看出，NaN3各处理组微核率和染色体畸形率与阴性对照相比多差异显著，说明NaN3作为阳性药物作用明显。从对蚕豆根尖细胞微核率的影响上看，甜蜜素1000、2000mg/L组与阴性对照组和NaN34mg/L组间差异不显著；甜蜜素4000、8000mg/L组间差异不显著，这2组与NaN34mg/L组差异不显著，但与NaN316、64、256mg/L组差异显著。从对蚕豆根尖细胞染色体畸形率的影响上看，甜蜜素1000、2000、4000mg/L组与NaN34mg/L组差异不显著，甜蜜素8000mg/L组与NaN316mg/L组间差异不显著，但与NaN364、256mg/L组间差异显著。综合上述分析，甜蜜素1000mg/L无致突变效应，甜蜜素2000mg/L致突变效应较弱，甜蜜素4000、8000mg/L致突变效应较强。
2.2蛋白糖对蚕豆根尖细胞微核率和染色体畸形率的影响
由表1还可看出，对蚕豆根尖细胞微核率的影响，蛋白糖100mg/L组与阴性对照组差异不显著，蛋白糖100、200、400mg/L组与NaN34mg/L组差异不显著，蛋白糖800mg/L与NaN316、64、256mg/L组差异不显著；对蚕豆根尖细胞染色体畸形率的影响，蛋白糖100、200、400mg/L组与NaN34mg/L组差异不显著，蛋白糖800mg/L组与NaN316mg/L组差异不显著，但与NaN364、256mg/L差异显著。
综上所述，蛋白糖100、200、400mg/L致突变效应较弱，蛋白糖800mg/L致突变效应较强。
2.3不同质量浓度甜味剂对蚕豆根尖细胞微核指数的影响
从表2可以看出，甜蜜素1000mg/L的微核指数低于1.50，属于无污染；甜蜜素2000mg/L和蛋白糖100mg/L微核指数在1.51～2.00之间，属于轻度污染；甜蜜素4000、8000mg/L和蛋白糖200、400mg/L的微核指数在2.01～3.50之间，属于中度污染，蛋白糖800mg/L微核指数在3.50以上，属于重污染。NaN3各组的微核指数都>2.00。因此，甜蜜素1000mg/L是安全的，甜蜜素2000mg/L和蛋白糖100mg/L具有较低的致突变性，其余各组产生致突变效应。
nlc202309012111
2.4甜味剂致蚕豆根尖细胞染色体畸形类型
甜蜜素和蛋白糖能诱导染色体产生多种类型的畸形[15]，包括染色体断片、染色体桥、染色体环、染色体游离、染色体滞后、染色体粘连等，其中以染色体粘连为主（图1）。
3结论与讨论
本试验结果表明，不同质量浓度的甜蜜素和蛋白糖均能诱导蚕豆根尖细胞产生微核，较低浓度的甜味剂对蚕豆根尖细胞的微核率影响作用较弱，但随着浓度升高，其微核率逐渐升高，致突变效应增强。蛋白糖各处理组的微核率高于甜蜜素各处理组，与阳性对照组NaN3相比，最大剂量蛋白糖的微核率介于NaN364mg/L组和256mg/L组之间，甜蜜素最高剂量的微核率介于NaN34mg/L组和16mg/L组之间。不同质量浓度的甜蜜素和蛋白糖产生的染色体畸形率相差不大，但在同一种甜味剂中随着浓度升高，染色体畸形率增大。由此可见，高浓度的甜蜜素和蛋白糖具有一定的致畸作用，且蛋白糖的致畸效应大。根据微核率和微核指数的分析可知，甜蜜素1000mg/L无致突变效应，甜蜜素2000mg/L、蛋白糖100mg/L致突变效应低，甜蜜素4000、8000mg/L和蛋白糖200、400mg/L致突变效应较强，蛋白糖800mg/L致突变效应最强。
经研究，甜蜜素水解后能形成有致癌作用的环乙胺，环乙胺的主要排泄途径是尿，因此对膀胱致癌的危险性最大。尽管大量研究证明甜蜜素无致癌、致畸作用，但因美国国家科学研究委员会和国家科学院1986年报告有促进和可能致癌性问题，因此至今在美国联邦法规中仍规定“禁止直接加入或用于食品”[16]。蛋白糖中的阿斯巴甜在人体内分解时产生天门冬氨酸和苯丙氨酸，产生氨基酸并不代表是蛋白质，同样也没有蛋白质的特性和营养价值，因而蛋白糖是安全的。在我国的食品卫生使用标准中，阿斯巴甜是唯一一种未加限制使用量的人工合成的甜味剂。从试验结果可以看出，我国市场上销售的蛋白糖的致突变性比甜蜜素高，可能是因为现在市场上很多低价位的蛋白糖是用糖精钠和甜蜜素复配而成的。
大使用范围及用量的公告（卫生部公告2012年第1号）规定：可在糕点、饼干、面包中使用甜蜜素的最大使用量为1.6g/kg。根据本试验结果，甜蜜素这一用量是安全的，市场上销售的蛋白糖的安全用量范围可参考定在0.1～0.2g/kg之间。
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单细胞蛋白 第12篇
1 材料与方法
1.1 材料
收集2008年2月至2010年1月间山东省肿瘤医院手术切除的卵巢上皮性肿瘤组织和正常卵巢组织标本, 其中卵巢癌65例 (其中浆液性腺癌42例, 黏液性腺癌15例, 透明细胞癌、移行细胞癌和子宫内膜样腺癌8例) , 卵巢交界性肿瘤18例, 正常卵巢组织24例。组织学分级:高分化13例, 中-低分化52例。FIGO分期:Ⅰ～Ⅱ期22例, Ⅲ～Ⅳ期43例。患者年龄35～74岁, 中位年龄53岁。所有患者术前均未接受过放、化疗及免疫治疗。标本均为10%甲醛固定, 石蜡包埋。
1.2 试剂
鼠抗人gelsolin单克隆抗体、鼠抗人cyclinD1单克隆抗体 (美国Sigma公司) , 工作浓度1∶50;SP试剂盒购自上海中达医学应用研究所 (丹麦Dako公司) 。
1.3 方法
常规石蜡包埋, 连续切片, 厚约5μm, 免疫组化SP法染色。具体操作步骤按试剂盒说明进行。用PBS取代一抗做阴性对照, 已知阳性切片做阳性对照。
1.4 结果判断
gelsolin阳性表达主要位于细胞浆, 以胞浆中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞, 以阳性细胞占全部细胞的百分数定为:阳性细胞<30%为阴性表达, 阳性细胞≥30%为阳性表达。cyclinD1的阳性产物呈棕黄色, 位于细胞核内。综合细胞染色强度和阳性细胞计数进行半定量分析, 判断标准为:背景清晰无色为阴性, 阳性细胞 <10 %为弱阳性, 10 %～< 50 %为阳性, ≥50 %为强阳性。以阳性和强阳性为过表达。
1.5 统计学处理
χ2检验。
2 结 果
2.1 gelsolin和cyclinD1的表达情况
gelsolin阳性表达率在正常卵巢组织为75.0%, 卵巢交界性肿瘤为33.3%, 卵巢癌为16.9%, 见图1, 图2, 图3。正常卵巢组织gelsolin阳性表达率分别与卵巢交界性肿瘤及卵巢癌的阳性表达率比较, 差异均有高度统计学意义 (P<0.01) , 见表1;而卵巢交界性肿瘤与卵巢癌的gelsolin阳性表达率之间的差异无统计学意义 (P>0.05) 。cyclinD1过表达率在正常卵巢组织为8.3%, 卵巢交界性肿瘤为38.9%, 卵巢癌为67.7%, 3者之间的过表达率的差异具有高度计学意义及统计学意义 (P<0.01, P<0.05) 。见图4, 表1。
2.2 gelsolin、 cyclinD1的阳性表达与卵巢癌临床病理之间的关系
经卡方检验, gelsolin的阳性表达与患者的年龄、组织学类型、组织学分级及临床分期等临床病理因素均无统计学相关性 (P>0.05) 。cyclinD1的过表达与患者的年龄、组织学类型、组织学分级及临床分期等临床病理因素无关 (P>0.05) 。见表2。
2.3 gelsolin与cyclinD1的表达的关系
经卡方检验, gelsolin的表达与cyclinD1的过表达之间无统计学相关性 (P>0.05) 。见表3。
3 讨 论
gelsolin是一种重要的细胞骨架蛋白, 可调节肌动蛋白的重组, 参与多种与细胞骨架重排相关的细胞进程[2]。细胞骨架actin微丝结构的破坏是肿瘤细胞的一个重要特征之一。而gelsolin在肿瘤的发生过程中起负调节作用。gelsolin可以抑制磷脂信号传递, 抑制磷脂酶C (PLC) 水解PIP2产生三磷酸肌醇 (IP3) 和二酯酰甘油 (DG) 二种胞内信使, 从而阻断下游信号传导途径[3]。gelsolin还与细胞凋亡有关。Caspase-3可将gelsolin切断, 断裂产生的末端在没有Ca2+的情况下就可以活化, 发挥gelsolin断裂actin微丝的作用, 导致细胞形态发生改变, 促进细胞的凋亡[4]。
Noske等[5]发现, 与正常组织相比, gelsolin在卵巢的癌变组织中的表达量降低, 而转染凝溶胶蛋白到卵巢癌细胞后, 细胞集落形成减少, 说明了gelsolin具有抑制癌细胞生长的功能, 推测其可能在调控卵巢癌细胞的生长过程中起到一定作用。本实验中, gelsolin在正常卵巢组织、卵巢交界性肿瘤、卵巢癌中的表达呈显著下降趋势 (75%、33.3%、16.9%) , 且其差异具有高度统计学定义 ( P<0.01) , 在卵巢癌组织中, gelsolin的表达明显降低, 失去了调节细胞周期、调节细胞凋亡的作用, 使得肿瘤细胞生长失控, 从而促进了肿瘤的发生发展。
许多研究发现, gelsolin在多种肿瘤中 (肠癌细胞、膀胱癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞及前列腺癌细胞) 表达明显降低, 其表达下调与肿瘤恶性分化相关, 而与其他临床病理学标记或患者存活率并无明显关联[6]。Asch等[7]的研究表明, 乳腺癌细胞中gelsolin的表达明显减少, 在不典型增生、原位癌、浸润癌中, 其表达显著下降。且与肿瘤的大小、病理分级等因素无关。本实验中gelsolin的表达与患者的年龄、组织学类型、组织学分级及临床分期等因素均无关 (P>0.05) , 但交界性肿瘤和正常卵巢组织的gelsolin的表达的差异具有高度统计学意义 ( P<0.01) , 而与卵巢癌的gelsolin的表达差异无统计学意义 (P>0.05) , 即gelsolin的表达在交界性肿瘤时就已降低, 明显低于正常卵巢组织gelsolin的表达水平, 表明gelsolin的表达下调可能出现于卵巢癌形成的早期阶段, 对卵巢上皮性肿瘤由良性向恶性转化发挥某种重要作用, 因此, 它或可作为一个癌前监测和治疗的观察指标。而在肿瘤侵袭生长过程中, gelsolin的表达与交界性肿瘤的表达差异无统计学意义, 且在不同组织学类型、组织学分级及临床分期中, gelsolin的表达均无明显差异, 或可表明, gelsolin可以作为一个卵巢上皮性肿瘤的独立的预后因素。
cyclinD1主要在细胞周期的G1期发挥作用, 促进细胞增殖。此过程是通过对pRb的调控实现的。pRb在G1期以磷酸化的形式与E2F等相结合使细胞停滞于S期。当cyclinD1与相应的CDK结合使后者活化, 进而作用于以低磷酸化型与转录因子E2Fs结合的pRb, 使之磷酸化并释放出转录因子E2F, E2F脱离pRb蛋白后发挥转录调节作用, 促使细胞越过G1/S限制点进入S期[8]。cyclinD1 作为一个原癌基因, 在肿瘤发生发展中起重要作用。当某些因素造成cyclinD1的基因突变而使其过度表达, 促进细胞周期进展, 造成细胞增殖失控, 最终导致癌变[9]。本实验中, cyclinD1在正常卵巢组织、卵巢交界性肿瘤、卵巢癌中的过表达呈显著上升趋势 (8.3%、38.9%、67.7%) , 且其差异具有高度统计学意义及统计学意义 ( P<0.01, P<0.05) 。随着cyclinD1的表达强度增高, 肿瘤细胞生长失控, 从而促进了肿瘤的发生发展。
本实验中, 经统计学分析, cyclinD1的过表达与患者的年龄、组织学类型、组织学分级、临床分期等临床病理因素无关 (P>0.05) 。但随临床分期及组织学分级的增高, cyclinD1的过表达率升高, 是否表明cyclinD1的过表达提示患者预后不良, 尚需进一步研究。Dimova等[10]对1006例卵巢癌进行研究, 发现cyclinD1的表达与卵巢癌的组织学分级及临床分期均无关, 认为cyclinD1异常表达可能是卵巢肿瘤发生的早期事件。
实验显示, 相对于正常卵巢组织, gelsolin在卵巢交界性肿瘤、卵巢癌中的表达明显降低, 而cyclinD1的过表达明显增高, 且与多种临床病理因素无关。二者的表达异常, 可能是肿瘤发生发展过程中的早期事件。gelsolin的表达降低、cyclinD1的过表达, 使细胞周期调控异常, 细胞异常增殖, 导致肿瘤的发生发展。但对gelsolin、cyclinD1的表达的相关性进行统计学分析, 二者无统计学相关性, 表明gelsolin与cyclinD1的表达异常, 可能作用于卵巢癌发生发展过程中的不同通路。对卵巢癌的gelsolin、cyclinD1进行检测, 可以对患者的诊断治疗及预后提供一定依据。
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