蛋白修饰范文

蛋白修饰范文（精选9篇）

蛋白修饰 第1篇

在细胞里,DNA以染色质的形式存在,核小体是染色质的基本组成单位[1,21,22,23]。从进化的意义上说组蛋白是极端保守的,在各种真核生物中它们的氨基酸顺序,结构和功能都十分相似。虽然如此,组蛋白仍可被修饰,如甲基化、乙酰基化、磷酸化和泛素化,这些修饰都是可逆性修饰[2,21,22,23]。细胞对外在刺激做出的每一个反应几乎都会涉及到染色质活性的改变—通过修饰组蛋白,变换组蛋白密码实现。组蛋白基化修饰DNA碱基功能,进而调控基因转录和DNA修复,而且组蛋白基化作为一种记号,控制表观遗传水平[21,22,23]。

1 组蛋白甲基化、组蛋白去甲基化与基因调控

1.1 组蛋白甲基化与基因调控的关系

组蛋白的甲基化属于表型遗传学的研究范畴,由不同的特异性组蛋白甲基转移酶(Histonemethylt ransferases,HMT)催化形成。主要发生在赖氨酸(Ly s)和精氨酸(Arg)的残基上[1,3]。催化赖氨酸Lys和精氨酸Arg残基的甲基转移酶有3个主要的蛋白家族:PRMT家族、SET域家族和非SET域家族的蛋白质。识别组蛋白甲基化的3个蛋白基元:染色域(C hromodomain)、TUDOR域和WD40重复域(WD-r epeat domain);它们能够与甲基化的赖氨酸残基作用,这些基元被特定的甲基化位点招募并且对不同生物发育起到一定的作用。组蛋白甲基化是一个动态的过程。它是通过组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶的相互作用,动态地调节组蛋白的甲基化状态,及其与其他功能蛋白的相互作用,来调控基因转录的激活和抑制的生物学过程[4,5,6,7,8,9]。

1.2 组蛋白去甲基化与基因调控的关系

2004年,组蛋白赖氨酸去甲基化酶LSD1(Lys ne Specific Demethylase)被首次发现[27,28];同时Ra min等人也报道,BHC复合物可使甲基化的组蛋白H3K4去甲基化[24,27,28,29]。LSD1又叫KIAA0601,pl10b,BHC110,NPAO,稳定存在于一些组蛋白去乙酰化酶复合物中。序列分析显示LSD1含有一个N端S WIRM(Swi3p、Rsc8p and Moira)结构域,很多与染色体相互作用的蛋白都含有SWIRM结构域,一个C端FAD依赖的胺氧化酶结构域,从小分子胺到蛋白质都可能是胺氧化酶的底物。根据序列同源性分析和功能结构域预测的结果以及LSD1存在于组蛋白去乙酰化酶复合物中的现象,哈佛医学院的Yang Shi和他的同事认为LSD1可能是组蛋白赖氨酸的去甲基化酶。否定了组蛋白赖氨酸甲基化是永久性的表观遗传标记这一概念[30,31]。

2 组蛋白乙酰化、组蛋白去乙酰化与基因调控

乙酰化是最早被发现的与转录有关的组蛋白修饰方式。乙酰化由组蛋白乙酰基转移酶(HAT)催化,去乙酰化由组蛋白去乙酰基酶(HDAC)催化。由于体内存在组蛋白乙酰化和去乙酰化的平衡关系,所以组蛋白乙酰化发生频率很低[2]。在真核细胞中,DNA与组蛋白是染色质的主要成分。染色质的结构与基因活性密切相关,通过组蛋白的乙酰化和去乙酰化来修饰染色体的结构,在DNA复制、基因转录及细胞周期的控制等方面有重要作用。

研究发现,染色体组蛋白的乙酰化修饰与活跃的基因表达密切相关,而相应基因调节区的乙酰化程度不足通常引起基因沉默[12]。组蛋白乙酰化/去乙酰化修饰是基因转录调控的关键机制之一[37]。最新研究发现乙酰化修饰大多在组蛋白H3赖氨酸的9、14、18、23和H4赖氨酸5、8、12、16等位点[12]。组蛋白乙酰化是可逆的动态过程[2,21,22,23],因此组蛋白乙酰化可以激活特定基因的转录过程。组蛋白去乙酰化酶则移去组蛋白赖氨酸残基上的乙酰基,恢复组蛋白的正电性,带正电荷的赖氨酸残基与DNA分子的电性相反,增加了DNA与组蛋白之间的吸引力,使启动子不易接近转录调控元件,从而抑制转录[12]。

3 组蛋白磷酸化、组蛋白泛素化与基因调控

3.1 组蛋白磷酸化与基因调控的关系

染色体凝集和转录起始都要发生染色质的形态结构变化,而组蛋白H3的第10位丝氨酸(Ser)的磷酸化对转录起始和有丝分裂期染色体凝集时形态结构改变都有重要作用[2]。磷酸化修饰,特别是组蛋白H1和H3的磷酸化,长期以来被认为与有丝分裂相关。早期实验演示组蛋白H1的磷酸化的主要增加发生在各种真核生物的有丝分裂期间,且这种修饰也依赖Cdc2激酶活性。因此认为在有丝分裂染色体凝集中组蛋白Hl的磷酸化起重要作用[13]。

3.2 组蛋白泛素化与基因调控的关系

蛋白质的泛素化修饰就是蛋白质的赖氨酸残基位点与泛素分子的羧基末端相互结合的过程[15]。泛素作为一种含有76个氨基酸高度保守的蛋白质广泛存在于真核生物中,泛素-蛋白水解酶作为决定体内众多生化反应系统,具有快速、一过性、单向进行的特点,在细胞周期、凋亡、代谢调节等生命科学众多领域起到了中心的作用[16]。由于泛素分子本身有7个赖氨酸残基位点,并且泛素本身的赖氨酸残基也可以与泛素分子相互结合,因此底物蛋白的一个赖氨酸残基可能结合多个泛素分子,这样就形成了蛋白质的多泛素化修饰[15]。泛素化调节途径共有三类酶催化:泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme,E1),泛素接合酶(ubiquitin-conjugating enzyme,E2),泛素-蛋白质连接酶(ubiquitin protein ligase,E3)。多聚泛素化需要以上三种酶的共同作用,而单泛素化一般仅需要前两种酶[16]。

像乙酰化和磷酸化一样,组蛋白泛素化是可逆转的调控。因此,组蛋白泛素化的动态平衡过程由两个因素决定:细胞内可以利用的游离泛素和可以对组蛋白添加或移除泛素的酶的活性。将泛素加到组蛋白需要一系列酶E1、E2、E3的作用。泛素部分的移除需要肽酶(isopeptide)的活性[15]。因此组蛋白泛素化与基因有着密不可分的关系。类似的结论还有组蛋白泛素化与基因的沉默和转录有关[16]。

4 组蛋白修饰间相互作用与基因调控

上述各种组蛋白修饰方式都与相应的基因活化或抑制状态相联系。这些修饰方式及其作用的发挥并不是相互独立的,很多时候它们通过协同或拮抗来共同发挥作用。研究发现,组蛋白的乙酰化能够破坏核小体核心颗粒的稳定性[15]。另外,H2A、H2B的泛素化能够减弱染色质中H2A-H2B二聚体与H3-H4四聚体之间的相互作用。不同组蛋白修饰组蛋白活动相互作用,形成多亚基复合物,可能与核小体重修饰复合物(Nu Rcs,如Swi/Snf、RSC、NUR F)相互作用,重修饰染色质[13]。有证据表明,这些重修饰复合物通过组蛋白尾部由这些复合物所调节的启动子处不同乙酰化方式的因子募集和识别而联合起作用。

不同位点及状态组蛋白甲基化与乙酰化间也有一定关系。组蛋白H3-K4的双甲基化和三甲基化,H3的第36、79位赖氨酸的双甲基化与高乙酰化和基因的激活相关,而组蛋白H3-K9双甲基化及三甲基化与组蛋白的低乙酰化相关。组蛋白H4-R3的甲基化促进P300催化H4-K8和H4-K12发生乙酰化,导致相应基因转录激活,但H4上的4个赖氨酸中的任何一个发生乙酰化都会抑制H4-R3甲基化的发生[3]。

5 展望

蛋白修饰 第2篇

1、掌握从原料物中提取活化分离菠萝蛋白酶的方法。

2、学习酶活力测定的方法。

3、了解某些因素对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性的影响。

4、掌握用聚乙二醇对菠萝蛋白酶进行化学修饰的原理。

5、比较修饰酶与未修饰酶的活力。

二、实验原理

1、本实验先从新鲜的菠萝汁中使用单宁沉淀法提取出菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶将酪蛋白水解产生酪氨酸，通过测定吸光度的变化，可以测得菠萝蛋白酶的活力。

2、以陶瓷层析结合超滤法纯化菠萝蛋白酶，吸附材料化学性质好，可用于柱层析。

3、温度恒定时,菠萝中菠萝蛋白的热失活遵循一级蜕变规律dE/dt=-Kd*t,失活半寿期是常数，可以用作衡公菠萝蛋白酶热稳定性的指标。

本实验应用动力学方法，以菠萝蛋白酶的热失活半衰期为热稳定性的指标，定量研究了梭酸盐和Ca2+,Zn2+士对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性的影响，以期找到一种高效、可行的增强菠萝蛋白酶热稳定性的方法。

4、修饰的菠萝蛋白酶对温度和pH值的稳定性均比天然酶有很大程度的提高。菠萝蛋白酶是一种巯基蛋白酶,但它的稳定性较差,影响了它的应用。此外,菠萝蛋白酶易受有关因素的影响而失活。聚乙二醇(PEG)为一种无毒且具亲水性的免疫惰性大分子，本实验采用聚乙二醇对菠萝蛋白酶进行修饰,提高了其对环境的稳定性,使其半衰期延长。实验材料 试剂和材料

1、新鲜菠萝(0.735kg)、0.1mg/ml牛血清蛋白

2、柠檬酸钠、单宁、0.1%EDTA溶液、1.5%氯化钠溶液、1%酪蛋白溶液、1mol/L氢氧化钠溶液、0.05mol/L磷酸缓冲液、激活剂

3、Brolain试剂、牛血清白蛋白、0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液、PEG活性酯。

（二）实验仪器

1、榨汁机；

2、离心机；

3、紫外可见分光光度计（1cm石英比色皿）；

4、恒温水浴锅（37℃）；

5、试管、试管架；

6、烧杯、容量瓶；

7、移液管；

四、试验方法

（一）从菠萝中提取菠萝蛋白酶 操作步骤：

将菠萝切碎→加柠檬酸钠，榨汁→菠萝汁→纱布过滤→澄清液→2000r/min，7min离心→上清液→加Vc,0.2%单宁溶液搅拌15min,静置40min4200r/min,5min离心→沉淀物→加100ml0.1%EDTA溶液，200ml1.5%氯化钠液→4200r/min,5min离心→酶复合物→加适量1.5%氯化钠溶液，4000r/min,7min离心→酶复合物沉淀→冻存备用 菠萝蛋白酶活力的测定

1、取酶制品溶解于0.05mol/L磷酸缓冲液（PH7.0)至10ml,离心得上清液；

2、取5支试管，分别标号1、2、3、4、5，各加1ml溶液酶和0.9m激活剂；

3、另取5支试管，分别对应标号1、2、3、4、5，各加1ml缓冲液和0.9ml激活剂；

4、将10支试管置于37℃水浴；

5、然后按下表操作

试管号 1 标准酪蛋白

（0.1mg/mL）

0

0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0 待测酶蛋白

（mL）0

0

0

0

0

0

0

1.0 磷酸缓冲液

（mL）1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0

0 考马斯亮蓝

（mL）4 通过测定不同试管中菠萝蛋白酶的吸光度A的值，进而确定酶活力的大小。

（三）聚乙二醇对菠萝蛋白酶的化学修饰 1.1修饰酶的制备

60gPEG6000溶于400mL干燥吡啶,加入1.01g琥珀酸酐后60℃保温2h,然后在60℃减压蒸馏除去溶剂。加入苯直至残余物溶解,再加100mL冷己烷,4℃振荡2h过滤,残渣溶于蒸馏水后透析。PEG活性酯和菠萝蛋白酶按摩尔比50：1投料,加入到0.1molPL柠檬酸盐缓冲液中,4℃反应4h。产物在pH4.6的柠檬酸缓冲液中透析,冻干后得到白色的PEG-菠萝蛋白酶(修饰酶)。1.2 TNBS法测定修饰率

取1mL蛋白酶溶液(1mgPmL),加入1mL4 %的碳酸氢钠溶液,1mL10%的十二烷基磺酸钠溶液,20min 后加入1mL0.1%的TNBS 溶液,40℃保温2h ,用0.5mL 1mol/L的盐酸终止反应。325nm测光吸收值。同样浓度蛋白酶溶液在修饰后与修饰前的光吸收值之比即为残留氨基率。修饰率=1-残留氨基率

（四）某些因素对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性 1.1 菠萝蛋白酶热稳定性实验方法

新鲜菠萝榨汁100mL加人到55℃预保温的一定浓度梭酸盐溶液中，不同保温时间测定菠萝蛋白酶活力，按热失活遵循一级蜕变规律dE/dt=-Kd*t方法求出菠萝蛋白酶的半衰期。1.2 有机羧酸盐对菠萝蛋白酶热稳定性的影响。

pH7.0时草酸钠对菠萝蛋白酶有明显稳定作用，100 mmol/l草酸钠使tl/2延长6倍，丁二酸、酒石酸甲钠也有一定的保护作用。醋酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠都有一定程度的保护作用，且浓度变化对保护作用的影响不大。结果与讨论

1、修饰率的测定

测定结果按下式进行计算:修饰率= 1修饰后的光吸收值P修饰前的光吸收值= 113.2、章佩芬,郭勇,罗焕敏.菠萝蛋白酶的研究与应用进展[J ].华西药学 杂志,2002 ,17(2):1286.（五）结果讨论

从上述结果可知菠萝蛋白酶的比活力较低，可能的原因有：

1、所加入的有机酸单宁的量对菠萝蛋白酶沉淀有的影响；

2、在实验中是否把单宁溶液弄混而导致菠萝蛋白酶很少沉淀析出；

3、菠萝蛋白酶对热不稳定，试验中温度的控制是否合理；

4、在活力测定的步骤中所加入的酪蛋白的量不足，导致结果偏低；

5、在活力的测定步骤中，设置了几个梯度，最后的结果中应该有至少两支试管中的溶液的吸光度的值相同，但本组实验没有得到这种结果。

蛋白修饰 第3篇

关键词缺血修饰蛋白冠心病心肌缺血

心肌缺血是指心脏的血液灌注减少，导致心脏的供氧减少，心肌能量代谢不正常，不能支持心脏正常工作的一种病理状态。冠状动脉粥样硬化导致的冠脉狭窄或闭塞是引起心肌缺血最主要、最常见的病因，进而导致心肌缺血缺氧，成为冠心病。心肌缺血时，血液中的白蛋白氨基末端被氧化修饰，从而产生结构改变，因其仅发生于心肌缺血时，称为缺血修饰蛋白(IMA)。常规AMI检测项目多为心肌坏死后产物，往往出现比较晚，阳性时患者往往失去第一救助时间。在怀疑心肌缺血患者入院即行心肌缺血修饰蛋白检测，对心肌缺血诊断和治疗起到了良好的效果。

资料与方法

2007年5月～2011年5月收治心肌缺血患者以及体检正常人228例，年龄57～88岁，平均67.36±11.12岁，其中男124例，女104例。所有心肌缺血患者至少具有下列症状其中两项：①劳累或精神紧张时出现胸骨后或心前区闷痛，或紧缩样疼痛，并向左肩、左上臂放射，持续3～5分钟，休息后自行缓解，时伴有大汗；②体力活动时出现胸闷、心悸、气短，休息时自行缓解；③出现与运动有关的咽喉痛及烧灼感、紧缩感，牙痛等；④饱餐、寒冷、饮酒后出现胸痛、胸闷；⑤夜晚睡眠枕头低时，感到胸闷憋气，需要高枕卧位方感舒适，熟睡、或白天平卧时突然胸痛、心悸、呼吸困难，需立即坐起或站立方能缓解；⑥用力排便时出现心慌、胸闷、气急或胸痛不适；⑦突发的心动过缓、血压降低或晕厥_［1］。两组年龄、性别差异无统计学意义。心肌缺血患者115例为观察组；正常人113例为对照组。两组年龄、性别差异无统计学意义。

方法：入院后抽取静脉血(分别在胸痛后1、6、12小时各抽取1次)，应用缺血修饰白蛋白ACB法试剂盒通过白蛋白钴结合(ACB)试验(微量蛋白离心超滤)终点比色法测定心肌缺血修饰蛋白水平。进行心电图及胸片检查以排除自发性气胸和已明确的心肌梗死等情况。心肌缺血修饰蛋白≥85U/ml为阳性判定标准_［2］。

统计学处理：所有数据均使用SPSS13.0软件分析，，多样本均数之间的比较采用方差分析。显著性标准采用P=0.05。

结果

对照组心肌缺血修饰蛋白水平均为正常。分别分析心肌缺血患者在胸痛后1、6、12小时时心肌缺血修饰蛋白水平，并分析其与疾病发展的关系，见表1。

其中8例发生心肌梗死，3例心肌缺血修饰蛋白水平正常，5例心肌缺血修饰蛋白水平异常升高。

讨论

心肌缺血早期发现可以实现早期处理使疾病的发生停止或逆转，但心肌缺血早期症状不明显，常以胸痛为主要症状前来就医，但胸痛原因很多，从众多胸痛患者中鉴别心肌缺血困难较多。依靠传统的心电图检测，由于其在心肌缺血早期表现不典型，可能延误影响疾病的诊断。本研究发现在心肌缺血早期心肌缺血修饰蛋白表达水平较高，且随着疾病的发展逐渐降低，差异有统计学意义，认为心肌缺血修饰蛋白可作为心肌缺血早期诊断的重要依据。心肌缺血修饰蛋白是美国FDA批准的第一个早期诊断心肌缺血的生化标志物_［3］。

缺血修饰白蛋白是由于血液流经缺血组织时人血白蛋白产生的，心肌缺血时局部心肌细胞因血流灌注不足而发生缺氧、酸中毒、自由基损伤，使流经缺血部位的白蛋白与钴离子结合力明显下降，末端氨基酸序列发生N乙酰化或缺失而形成心肌缺血修饰蛋白_［4］。

有研究发现缺血修饰蛋白对心肌缺血和心肌梗死鉴别诊断无意义。因此判断疾病的发展和转归需要联合检测缺血修饰蛋白和其他生化指标，鉴别诊断需要结合心电图等其他检查。

参考文献

1中华医学会心血管病学分会.急性心肌梗死诊断和治疗指南［J］.中华心血管病杂志,2001,29(12):710-725.

2郭玮,宋斌斌,苏曦,等.心肌标志物在急性心肌梗死诊断时的临界值分析［J］.上海医学检验杂志,2003,18(1):12-14.

3CollinsonPO,GazeDC.Biomarkersofcardiovasculardamageanddysfunctionanoverview［J］.HeartLungCirc,2007,16(3):71-82.

酵母氧化还原修饰蛋白质的鉴定 第4篇

1 试验方法

1.1 酵母菌株的活化与扩大培养

1.1.1 活化与扩大培养。

挑取试管中的少量酵母菌株2399于100mL YPD培养基中, 28℃, 180rpm振荡培养过夜。然后按1∶50扩大培养, 28℃, 180rpm振荡培养6h。

1.1.2 H2O2处理。

用30%H2O2将试验组2个样品H2O2的浓度调至5mmoL/L。然后将试验组和对照组各2个100mL的三角瓶放在摇床上, 28℃, 180rpm培养1h。取出试验组和对照组的材料于4℃, 8 000rpm分别离心15min。并将离心后的材料分别集中到1个Beckman管中, 液氮速冻, -80℃冷冻保存。

1.2 酵母蛋白的提取与浓度的测定

1.2.1 酵母蛋白的提取。

用研磨法, 将保存的试验组和对照组的材料分别放入冷却的瓷钵中, 液氮冷冻研磨, 按1.0∶1.5的比例 (v/v) 加入蛋白提取液研磨。然后10 000rpm离心2min, 保留上清。

1.2.2 蛋白浓度的测定。

准确吸取0.1mg/mL牛血清蛋白标准溶液0mL、0.02mL、0.04mL、0.06mL、0.08mL、0.10mL, 分别加入6只10mL试管中, 然后用双蒸水补充至0.1mL, 各试管分别加入5mL考马斯亮蓝G250试剂, 混合均匀后, 即可依次在595nm处测定吸光度。以浓度为横坐标, 吸光度为纵坐标绘制标准曲线。然后取待分析的试验组和对照组的蛋白溶液 (均稀释200倍) 1mL, 再加入5mL考马斯亮蓝G250显色液, 混匀, 放置2min, 在595nm波长下测定吸光度。

1.3 对角线电泳

1.3.1 第一向non-reducing SDS-PAGE。

先配制分离胶20mL, 浓缩胶8mL, 小心倒入垂直的板中, 并插好梳子, 防止产生气泡。之后上样, 试验组和对照组的上样量均要求为400μg、35μL, 试验组材料的处理方法为:259.7μL样品+20.3μL双蒸水+70μL 5×上样缓冲液;对照组材料的处理方法为:232.6μL样品+47.4μL双蒸水+70μL 5×上样缓冲液。将处理后的试验组和对照组材料分别混合均匀后沸水中煮5min, 然后1 000rpm离心2min。处理完毕后各取试验组和对照组的样品35μL点样, 其他上样孔点入35μL上样缓冲液。进行第一向电泳, 按照浓缩胶20mA, 2h, 分离胶30mA, 约4h的要求进行电泳。

1.3.2 胶条的切取与平衡。

根据上样孔的宽度切取有试验组和对照组材料的胶条, 立即放入平衡缓冲液中平衡。取50mL平衡缓冲液, 加入1moL/L DTT (平衡缓冲液Ⅰ) 2.5mL, 混匀, 使DTT浓度为50mmoL/L, 将胶条放入平衡管中, 每管中放入1根胶条, 封口, 在水平摇床上振荡平衡15min, 倒掉平衡缓冲液Ⅰ。取50mL平衡缓冲液加入0.369 9g碘乙酰胺 (平衡缓冲液Ⅱ) , 使碘乙酰胺浓度为100mmoL/L, 封口, 在水平摇床上振荡平衡15min, 倒掉平衡缓冲液Ⅱ[2]。

1.3.3 第二向reducing SDS-PAGE。

按照分离胶的溶液配比配制40mL浓缩胶, 倒入竖直板中, 灌胶后加入少量的去离子水, 以形成平整的胶面。室温下聚合3h, 聚合完毕后倒掉去离子水。进行胶条的转移, 用去离子水冲洗一下胶条, 以洗去多余的平衡缓冲液。将试验组和对照组的胶条分别放在位于玻璃板之间的凝胶面上, 用一薄尺将胶条轻轻地向下推, 使整个胶条下部边缘与板胶的上表面完全接触。确保在胶条与板胶以及玻璃板之间无气泡产生[3]。蛋白marker纸片放在凝胶的一侧。最后用低熔点琼脂糖密封液进行封顶, 使胶条被完全覆盖住。参数设置为20mA, 过夜电泳。当溴酚蓝迁移到胶的底部边缘即可结束电泳。电泳完毕的胶条转移到染色盒里固定准备染色。

1.3.4 染色及脱色。

用至少5倍于凝胶体积的染色液浸泡电泳后的凝胶, 水平摇床摇动, 室温染色3h后弃染液, 换入染色液体积相同的脱色液, 脱色4～8h, 直至凝胶背景清晰。

1.3.5 图像采集。

ImageScannerⅡ扫描仪扫描, 模式为透射, 分辨率为300dpi, 存储为TIF格式。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的制作

标准蛋白 (BSA) 与考马斯亮蓝G250反应后, 于595nm处测反应液的吸光度。绘制标准曲线如图1。

2.2 样品蛋白浓度的测定

对照组3个样品的吸光度分别为0.460、0.487和0.538, 其平均值为0.495, 根据标准曲线得对照组的蛋白浓度为17.2mg/mL;试验组2个样品的吸光度分别为0.458和0.428, 其平均值为0.443, 根据标准曲线得试验组材料的蛋白浓度为15.4mg/mL。

2.3 H2O2处理下酵母氧化还原蛋白质的分析

H2O2处理1h后, 提取酵母细胞总蛋白进行对角线双向电泳分析。图2中左边的图像为经过5mmoL/L H2O2处 (上接第349页) 理过的试验组, 右边的为对照组, 其中水平方向为nonreducing SDS-PAGE, 竖直方向为reducing SDS-PAGE。从图2可以看出, 试验组和对照组均有蛋白质经对角线电泳后偏离了对角线, 有些蛋白点位于对角线的下方, 而有些位于对角线的上方。在第一向的非还原性电泳条件中, 经H2O2的氧化胁迫处理后, 有相应的蛋白质通过蛋白质间或蛋白内二硫键的形成而做出应答, 在进行第二向电泳之前, 用带有还原剂DTT的平衡液处理, 二硫键被打开, 马上用碘乙酰胺处理封闭起新形成的巯基。这样在第二向电泳中, 如果蛋白质分子间或分子内的二硫键被打开, 则参与形成二硫键的蛋白质将偏离对角线。比较试验组图与对照组图发现, 偏离对角线的蛋白质点在图像中的相对位置大致相同, 且表达量也无明显的差别。可能是由于H2O2的浓度偏低, 氧化胁迫的效果不明显, 蛋白质分子内和分子之间的巯基—二硫键修饰不明显, 因此试验组中没有明显出现对照组中所没有的偏离对角线的点, 也可能是电泳的上样量400μg偏大, 降低了分辨率, 从而没有出现明显的结果。

3 结论

细胞内氧还电势的增高可以引起细胞内蛋白分子之间和分子内部二硫键的广泛形成。细胞内氧还电势的状态可以从根本上作为巯基的氧化电势的状态指标, 这种氧还电势在一个细胞的生命周期中是不断变化的。通过试验发现酵母蛋白被H2O2处理后的对角线电泳图谱与对照组相似, H2O2的氧化胁迫效果不明显, 这可能是由于上样量过大, 降低了分辨率。但由于蛋白质间二硫键的可逆形成是一种非常普遍的现象, 在调节细胞内的氧还电势中发挥重要的作用, 并参与调节真核和原核细胞内各种蛋白质的活性[4]。可以通过对偏离对角线的蛋白质做进一步的质谱分析, 做进一步的研究。

摘要：运用两向线性非还原-还原SDS-PAGE (对角线电泳) 来分离经过氧化胁迫处理的酵母细胞内形成二硫键的蛋白质, 结果表明试验组电泳图谱对照组无明显差别, 这可能是由于上样量400μg偏大, 降低了分辨率。

关键词：酵母,对角线电泳,氧化胁迫,蛋白质,鉴定

参考文献

[1]陈夫义, 彭宣宪.蛋白质组学研究中的对角线电泳[J].生命科学, 2006, 18 (1) :32-36.

[2]孙志宾.盐芥Th TRXh功能分析和盐芥不同生态型的比较蛋白质组学初步研究[D].济南:山东师范大学, 2006.

[3]中国疾病预防控制中心传染病预防控制所诊断室.蛋白质组 (pro-teomics) 的相关技术及应用[J].生物技术通讯, 2003, 14 (3) :1-2.

[4]LARS I LEICHERT, URSULA JAKOB.Protein Thiol ModificationsVisualized In Vivo[J].PLOS Biology, 2004, 21 (11) :1723-1732.

[5]万行成.大豆叶片蛋白组学双向电泳技术的改进试验[J].现代农业科技, 2008 (23) :181-182.

蛋白修饰 第5篇

1化学修饰剂的类型及聚乙二醇的优点

化学修饰剂与蛋白质的反应主要有酰化反应、烷基化反应、氧化和还原反应、芳香环取代反应等。有代表性的修饰剂有乙酰咪唑、卤代乙酸、N-乙基马来酰亚胺、碳化二亚胺、焦碳酸二乙酯、四硝基甲烷、N-卤代琥珀酰亚胺、羧甲基纤维素、多聚唾液酸、聚氨基酸、葡聚糖、聚乙二醇等。与其它修饰剂相比, 聚乙二醇类修饰剂毒性小, 无抗原性, 具有良好的两亲性, 且生物相容性已经得到FDA的认证[4], 是应用最多的一类修饰剂。聚乙二醇 (PEG) 修饰技术, 又称PEG化, 是一项利用聚乙二醇衍生物对蛋白质进行修饰的技术。目前, 美国FDA已批准了5个PEG化的蛋白质药物, 同时国外还有28种PEG化的蛋白质药物正处于不同的临床试验期[5]。目前, 安科生物工程股份有限公司已经成功建立了聚乙二醇修饰蛋白质药物的技术平台[6,7]。PEG为一种亲水、不带电荷的线性大分子, 当其与蛋白质的非必需基团共价结合时, 可作为一种屏障挡住蛋白质分子表面的抗原决定簇, 避免抗体的产生, 或者阻止抗原与抗体的结合而抑制免疫反应的发生。蛋白质经PEG修饰后, 相对分子量增加, 肾小球的滤过减少;PEG的屏障作用保护了蛋白质不易被蛋白酶水解, 同时减少了抗体的产生, 这些均有助于蛋白质类药物循环半衰期的延长, 从而达到提高药效, 减少用药次数的目的。

2聚乙二醇修饰对蛋白药物生物活性的影响

1977年, Abuchowski等[8]证明, 修饰后蛋白比未修饰蛋白更加有效。普遍认为, 经PEG修饰后, 大多数蛋白质的性质会发生以下变化: (1) 免疫原性与抗原性降低; (2) 循环半衰期延长; (3) 溶解性增加; (4) 耐蛋白酶水解; (5) 生物利用度提高; (6) 毒性降低; (7) 热稳定性及机械稳定性增加; (8) 等电点、电泳行为、动力学性质等改变。另外, 修饰作用还体现在体内活性提高而体外活性降低。一般与PEG偶合的大分子, 与未修饰的分子相比, 其物理与化学性质会发生改变, 这些改变的性质包括构象、空间位阻、静电结合性质、疏水性等。与受体连接的亲和力经常受到这些物理、化学性质变化的影响而降低。而修饰后蛋白在生物体内循环半衰期延长这一特性在体外活性检测时不能被体现, 故而修饰后蛋白体外活性降低。

3聚乙二醇化后检测与分析

要从三方面来分析PEG对蛋白质的修饰: (1) 蛋白的平均修饰度, 即平均有多少个PEG被偶联到蛋白分子上Stocks用荧光胺来测定, 荧光胺与未偶合PEG的赖氨酸ε2氨基反应生成荧光衍生物, 通过测定蛋白混合物的激发荧光值来计算其平均修饰度。这种方法不会受到未反应的PEG干扰, 仅需要纳克级的蛋白质。也能用氨基酸分析仪来分析PEG修饰蛋白质。 (2) PEG修饰的特定位点以及特定位点的修饰程度蛋白质经修饰后, 为了确定PEG的偶联位点, 可使用Edman降解法来进行分析。过去对PEG化的蛋白降解并不完全, 最近用含有蛋氨酸基团的两种特殊PEG衍生物与蛋白质上的氨基酸残基共价结合后, 以CNB r处理将PEG从蛋白质分子上去除, 并将其降解后通过质谱分析、核磁共振法等检测可识别修饰位点。 (3) 偶联有不同数目修饰剂的偶合物的各自相对含量, 即偶合物的均一性问题利用液相色谱法、SDS-PAGE法等将偶合不同数目PEG的偶合物分离开, 并可计算出各成分的含量。毛细管电泳是新发展起来的分析生物大分子的有效手段, 有可能成为既能定性又能定量分析PEG修饰蛋白的方法。近年来, 基质辅助激光解吸电离质谱法被成功用于PEG修饰蛋白组分的定量定性分析。该方法的原理是将样品与基质溶液混合后滴于探针表面, 在室温干燥后, 放入质谱仪内, 用高强度的激光照射探针, 使样品气化为特定质荷比的带电粒子, 从而进行测定。

4蛋白质聚乙二醇化技术的研究现状

PEG修饰蛋白药物可以延长药物的半衰期、降低免疫原性, 同时最大限度地保留其生物活性。自1991年第一种用PEG修饰的蛋白药物PEG-ADA被FDA批准上市后, 一些国际知名制药公司, 如:Enzon、Roche、Schering-Plough、Amgen、Pharmacia等公司积极推进PEG修饰药物蛋白的技术, 近几年上市的产品有PEG-干扰素、PEG-粒细胞集落刺激因子、PEG-生长抑素等。目前, 尚有几十种的PEG修饰的蛋白药物处于研究或临床试验阶段。国外的研究, 包括聚乙二醇衍生物的制备以及聚乙二醇化药物的开发均处于领先地位。目前, 美国FDA已批准了五个PEG化的蛋白质药物, 同时国外还有28种PEG化的蛋白质药物正处于不同的临床试验时期。在全部授权和公开的专利中, 国外制药公司掌握了大部分专利 (共计20个) , 涉及的范围包括聚乙二醇干扰素的制备, 促红细胞生成素、脑神经生长因子BDNF多肽、巨核细胞生长发育因子MGDF多肽和聚乙二醇衍生物的制备方面。

关键词：蛋白药物,聚乙二醇化,进展

参考文献

[1]姜国勇, 李思经, 翁曼丽, 等.天花粉蛋白结构、核苷酸序列及基因表达研究进展[J].山东农业科学, 1999, 37 (2) :52-54.

[2]姜国勇, 李思经, 翁曼丽, 等.天花粉蛋白基因转化番茄的研究[J].植物学报, 1999, 48 (41) :334-336.

[3]李建国.核糖体失活蛋白的研究进展[J].分子植物育种, 2005, 3 (4) :566-570.

[4]姜忠义, 高蓉, 许松伟, 等.药物蛋白的聚乙二醇修饰[J].中国药学杂志, 2002, 37 (6) :409-411.

[5]李力, 郑意端.蛋白质药物聚乙二醇化的研究进展[J].中国临床药理学杂志, 2003, 19 (3) :226-229.

[6]宋礼华, 戎隆富, 王荣海.聚乙二醇化天花粉蛋白药物及其生产工艺[P].中国专利:公开号CN1631435A.

[7]宋礼华, 王荣海, 戎隆富.聚乙二醇化重组人生长激素药物及其生产工艺[P].中国专利:公开号CN1565624.

蛋白修饰 第6篇

关键词：氧化修饰低密度脂蛋白,动脉粥样硬化,影响因素

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是导致冠心病、脑梗死及外周血管病的主要原因。其病变特点是一个惯续的病理生理过程:内膜受累的动脉血管,在其内膜下有脂质、复合糖类聚集,以及出血或血栓形成,进而造成纤维组织增生、钙化,并使动脉中层逐步增厚钙化,最终,导致动脉壁增厚变硬、动脉管腔狭窄。一旦进展到阻塞动脉管腔,则造成该动脉供血区域器官、组织缺血或坏死,严重威胁人类健康。冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)便是动脉粥样硬化导致的一种最常见的疾病。其发病原因是冠状动脉因血管粥样硬化乃至血管内斑块形成致血管狭窄或堵塞,最终导致心肌缺血缺氧的综合征。目前,冠心病已经成为全球各地威胁人类生命与健康的“头号杀手”[1]。在动脉粥样硬化的发生发展过程中,受到各方面因素的影响。如血管炎症反应,血小板聚集,血管痉挛,微血管功能紊乱,内皮细胞功能紊乱等。在其中,血管炎症反应可谓是首要影响因素,这一生理病理过程由始至终贯穿于冠心病这一疾病过程。而当冠状动脉血管内膜受损存在血管炎症反应时,血浆中的血脂,尤其是低密度脂蛋白(LDL),将通过受损的内皮进入管壁内膜下,并经过氧化修饰形成氧化修饰低密度脂蛋白(ox-LDL),与此同时,单核细胞和淋巴细胞表达将出现改变,形成巨噬细胞再通过清道夫受体,吞噬ox-LDL,转变为泡沫细胞,即形成最早的动脉粥样病变脂质条纹。

氧化修饰低密度脂蛋白,参与了动脉粥样硬化的发生和发展,并在形成动脉粥样硬化这一病理的过程中,起着无可替代的作用。在近十余年的研究中发现,ox-LDL不仅能够启动动脉粥样硬化,并且能够加速其后的发展。从其发现至今,国内外对其进行过深入的研究,已取得了长足的发展,但因其作用机制复杂,有些方面还存在一定的争议。本文综合近年来国内外相关研究进展,概述如下。

1 氧化修饰低密度脂蛋白(ox-LDL)在体内的产生机制

氧化修饰低密度脂蛋白(ox-LDL),是指天然的低密度脂蛋白(LDL)经过氧化修饰后而形成的脂蛋白。血浆中LDL的来源有两个途径:(1)主要途径是由VLDL异化代谢转变而来;(2)次要途径是肝脏合成后直接分泌到血中。低密度脂蛋白的代谢能经过LDL受体进行代谢,LDL表面覆膜上存在受体,人体血浆内65%-70%的LDL是经过受体代谢的,少数是被周围组织摄取异化,其中包括血管壁。并且在LDL受体存在缺陷时,VLDL将大部分转变为LDL,使血浆中LDL浓度明显升高。高胆固醇血症是动脉粥样硬化形成的主要风险之一,最近十余年,经过国内外研究表明,低密度脂蛋白在体内的含量与动脉粥样硬化的形成呈正相关,而其中,经过氧化修饰后的低密度脂蛋白对动脉粥样硬化的形成作用更加显著[2]。

2 氧化修饰低密度脂蛋白(ox-LDL)导致动脉粥样硬化(AS)的机制

2.1 内皮损伤及细胞毒性作用

血管内皮损伤还受到脂质过氧化物或ox-LDL的影响。Ox-LDL能促进内皮细胞、巨噬细胞、肥大细胞等分泌白细胞介素-1、肿瘤坏死因子-α等一系列因子,从而导致内皮细胞的损伤,以及影响其代谢[3]。并且,导致ox-LDL生成过多的高脂血症状态,同样具有以上的作用。人体内ox-LDL水平的增高,会引起内皮细胞变性、坏死,并从主动脉壁上分离。[4]大量实验证明,各种脂质氧化的衍生物对血管内皮细胞存在损伤作用,如多不饱和脂肪酸(PUFA)的衍生物、氧化磷脂、溶血磷脂等,且泡沫细胞的衍生物羟基壬烯醛被证明能加速内皮细胞衰老。ox-LDL的细胞毒性作用,最初是在观察在无血清的内皮细胞培养过程中发现,产生ox-LDL的过程中的介质中含有过渡金属离子。当细胞吸收ox-LDL时,便会产生细胞毒性作用;同时细胞的培养状态也决定了oxLDL对细胞的影响程度,如ox-LDL可以选择性的作用于细胞增殖周期中的S期,从而造成毒性作用,于此时加入细胞增殖抑制剂则可减轻ox-LDL的细胞毒性作用。[5]并且另有近年大量国内外研究表明,ox-LDL可使人内皮细胞中的抗氧化酶-还原性谷胱甘肽、前列环素等生成减少且活性下降,而氧化的脂质产物却明显增多。并且,在目前已知的与AS发病相关的细胞,如巨噬细胞、泡沫细胞、血管内皮细胞等均发现存在多种ox-LDL受体,大多数为清道夫受体,如CD68、CD36、链接域清道夫受体(link domain-containing scavenger receptor)、内皮清道夫等等[6]。

2.2 泡沫细胞的形成

Ox-LDL能够直接被巨噬细胞吞噬,并且能加强巨噬细胞的吞噬作用,而吞噬了ox-LDL的巨噬细胞,通过清道夫受体将转变为泡沫细胞并通过存在内膜损伤或炎症的内膜,进入到动脉内膜下聚积[7]。并且,有研究表明,ox-LDL可刺激单核细胞粘附因子的表达,同时促进分泌单核细胞趋化(MCP-1)和巨噬细胞克隆因子(M-CSF)。MCP-1促进单核细胞在血管内的迁移,M-CSF则促进单核细胞向巨噬细胞的转化,而成熟的巨噬细胞又可吞噬ox-LDL形成泡沫细胞,构成了一个促进泡沫细胞形成的循环圈,从而加速了动脉粥样硬化的形成与发展。

2.3 与易损斑块的关系

目前,已知在人类血小板表面存在着脂蛋白的特异性结合位点,低密度脂蛋白(LDL)及ox-LDL能与这些位点结合,从而促进血小板的释放及粘附作用。而且,有研究表明ox-LDL对血小板的活化作用明显强于其他脂蛋白。其对血小板的作用可归纳为以下三个方面[8]:1.血小板聚集增加,并且能增加ADP和凝血酶的作用;2.血小板释放物质增加,可促进血小板膜糖蛋白CD62p,CD63的表达,此外还可促进血栓塞A2生成及降低血小板的膜流动性;3.使血小板寿命缩短。至于ox-LDL如何激活血小板并加速血栓的形成,具体明确的激活途径尚不明确,Magwenzi S[9]指出,当ox-LDL激活血小板活化的过程中,需要活性氧(ROS)作为媒介,其研究表明,oxLDL及高脂血症通过CD36-PCK途径刺激NOX2衍生的ROS生成,或者通过调整c GMP信号促进血小板活化。

3 各种影响氧化修饰低密度脂蛋白形成的生化及生理因素的研究进展

抗氧化剂是一种能够抑制其他分子被氧化的物质,限制氧化剂的有害影响,但不阻止氧化还原反应所需的新陈代谢,如能量代谢,信号传导和其他细胞功能。抗氧化剂可通过减少ROS的产生或清除ROS及其他氧化剂。传统的抗氧化剂对抑制LDL的氧化修饰过程具有一定的作用,如维生素C、还原性谷胱甘肽、前列腺素等等,这些物质均通过调节人体内的氧自由基从而减少低密度脂蛋白的氧化修饰过程。一些内源性蛋白质通过清除自由基或结合金属离子,同样起到抗氧化剂作用(如乳铁蛋白、转铁蛋白、铁蛋白、珠蛋白等等)。另外,一些酶同样具有抗氧化作用(如超氧化物歧化酶、抗氧化蛋白等)[10,11,12]。许多药物,如他汀类、血管紧张素转化酶抑制剂、脂氧合酶抑制剂等,均表现出抗氧化作用,其能抑制LDL的氧化过程[13,14]。近年来许多研究表明,很多非抗氧化剂物质或特殊的生理过程,亦能影响ox-LDL的形成,或影响其病理作用。

水溶性的维生素C以及维生素E,早在多年以前便被证明具有抗氧化能力,这在对抗ox-LDL形成上,有着许多理论及实验的依据[15]。而作为脂溶性的维生素A,Mahmoudi MJ[16]的研究指出,维生素A可降低ox-LDL的细胞毒性作用,并提升外周血单核细胞(PBMC)的生存能力。且维生素A的保护作用并不是通过抗氧化机制,可能是由于细胞内凋亡保护机制或诱导细胞增殖。高浓度的维生素A可提高PBMC的易感性。此项研究,给出我们一个新的观念,对抗ox-LDL的形成,不仅仅只能依靠抗氧化这一途径。

人内皮祖细胞(h EPC)是血管内皮细胞的前体,目前已得到证实,其在心脑血管疾病、外周血管疾病等等方面均发挥重要的作用。人内皮祖细胞成体干细胞位于骨髓和外周血,骨髓中的含量占主要地位,当出现血管损伤时,h EPC便从骨髓中进入体循环促进内皮修复和新生血管形成。他汀类药物亦可通过动员作用,达到上述效果。过度表达的LOXIN能够保护内皮细胞,减轻ox-LDL针对内皮细胞及人内皮祖细胞(h EPC)诱导的细胞凋亡[17]。

很多正常或非正常的生理变化,均可引起oxLDL在血浆内含量水平的变化。妊娠期妇女血浆中的ox-LDL会升高。正常妊娠时,于孕9~13周时,血浆中ox-LDL含量将开始升高,此后逐渐升至高峰,一直维持到产后24小时才逐步下降[18]。虽然,许多研究表明,妊娠期ox-LDL的升高水平与健康未孕人群的差异无统计学意义(P>0.05),但有国内外研究表明,其与妊娠期心血管疾病存在一定的相关性。

最近Sakamoto R等[19]的研究指出,青藏高原地区老年人血液中的ox-LDL水平高于低海拔地区的汉族老年人,但该作者也指出还需要进行进一步的研究来确定,在高海拔地区,氧化应激反应是通过何种因素来影响该地老年人的健康状况。通过这项研究,又能引申出许多关于ox-LDL与环境关系的猜测。

4 ox-LDL与动脉粥样硬化关系研究的不足与展望

综上所述,国内外大量研究表明,氧化修饰低密度脂蛋白在AS的发生发展过程中有着重要的作用,并且还能促进血栓的形成,这些病理过程在心血管疾病中有着无比重要的影响。近年来,大批研究者针对ox-LDL的生成与致病理改变作用机制及其影响因素上做了大量的研究,得到了诸多抑制ox-LDL形成及阻断其作用机制的思路,部分如抗氧化剂、信号通路、竞争结合受体等,但尚有许多思路未得到实验数据证实,更有大量的未知途径等待着被发现。如脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2),是近年来引起广泛关注的一种与动脉硬化和缺血性心脑血管疾病密切相关的磷脂酶A2超家族、一种新的炎性标记物、还是一种独立危险因子。因其具有促炎症的作用,所以Lp-PLA2在炎症细胞中产生及释放,可以视作一种极佳的前炎症反应表现。尤其是在中晚期动脉粥样斑块或破裂斑块周围的巨噬细胞中,Lp-PLA2被大量的表达。Dylan L.Steen等[20]的研究表明,使用Lp-PLA2抑制剂,能显著降低心血管事件的发生率。更重要的是,有研究已经证明,在其介导的局部炎症反应中,与ox-LDL有着直接关系。当局部炎症反应启动后,Lp-PLA2能将ox-LDL水解成脱磷酸卵磷脂(Lyso-PC)和游离的氧化脂肪酸(ox-FA)。这些代谢产物,又将促进炎症介质,如白介素等等的释放。而炎症介质又会促进ox-LDL的形成,以及产生更多Lp-PLA2,最终形成一个恶性循环。对于LpPLA2与ox-LDL这两者之间的研究,对动脉粥样硬化的临床治疗具有非凡的指导意义。在基因治疗AS方面,She Z G等[21]指出,人类对氧磷酶(Paraoxonase)基因簇,有望成为治疗人类AS的目标基因。

蛋白修饰 第7篇

关键词：特征吸收峰(谷),波长

0.前言

缺血修饰白蛋白(IMA)是一种新的较为理想的缺血标志物,它是第一个被美国食品药品管理局(FDA)批准销售的心肌缺血标志物。利用白蛋白-钴结合试验检测缺血修饰白蛋白含量,作为检测早期心肌缺血的指标。多方面研究证明,IMA可敏感地反映心肌缺血状况,在急性冠状动脉综合征的早期诊断、危险分层、指导治疗等方面有重要意义,是目前较为理想的检测心肌缺血的生化标志物。

1. 试验过程

1.1 缺血修饰白蛋白检测试剂盒说明

上海微银生物技术有限公司生产的缺血修饰白蛋白检测试剂盒[沪食药监械生产许20061411号],批号为11060150。

试剂盒里试剂为双试剂,主要组成成分:R1(氯化钴溶液Co Cl2·6H2O)、R2(偶氮显色剂)。

1.2 试验原理

正常对照组血清样品中的白蛋白以活性形式存在,在和R1已知过量的钴离子溶液混合后,混合液中未与白蛋白结合的钴离子的数量较少;而缺血病人含有较多的缺血修饰白蛋白(IMA),由于IMA与钴离子结合的能力弱,混合液中存在较多数量的未与白蛋白结合的钴离子,然后加入R2偶氮显色剂显色,缺血病人比正常对照组颜色深。在650nm或最接近650nm处检测样品的吸光度,所得数值与IMA标准曲线进行对照,即可得出IMA值。

1.3 操作说明

1.3.1 试验依据:

采用缺血修饰白蛋白(IMA)检测试剂盒说明书进行试验。

1.3.2 试剂:

a)空白试剂:试剂盒里现有的配套使用的空白试剂。

b)应用试剂:按说明书配制,R1:R2=1:10

c)试验试剂:质控血:R1:R2=1:1:10

1.3.3 试验仪器:

紫外分光光度仪(TU-1901)

1.3.4 试验步骤

1.3.4. 1 分别以空气、空白试剂、应用试剂调零,

在190nm~900nm对试验试剂进行扫描,检出特征吸收峰(谷);

1.3.4. 2 分别以空气、空白试剂、应用试剂调零后,按照产品说明书中的比色条件(光径1cm,波长650nm):测定试验试剂的OD值,平行测定3次。

2.试验结果

2.1以空气、空白试剂、应用试剂调零,检出试验试剂的特征吸收峰(谷)分别为580nm、586nm、646nm,光图谱分别见图1、图2、图3。

2.2试验试剂的OD值(见表1)。

3. 对试验结果的分析

3.1 从特征吸收峰(谷)的光谱图(图1~图3)可看出,图1检出的特征吸收峰为580nm,图2检出的特征吸收峰为586nm,即以空气调零和以空白试剂调零所检出的特征吸收峰完全一样,而以应用试剂调零检出的光谱图,其特征吸收峰为545nm,谷为646nm,与图1、图2相比校,光谱图存在差异,一是峰值相差35~41nm,二是有波谷的出现。

3.2 从表1得出,以空气和空白试剂分别调零后所得出的OD值几乎一样,两者与以应用试剂调零后所得出的OD值完全不一样。图3会出现波谷(646nm),以及在650nm的OD值为负值,皆因为反应原理是显色剂结合了剩余的钴离子(即以R1和R2发生反应后的吸光度值A1来调零,测定质控血里的白蛋白和R1发生反应后,R1中剩下的钴离子与R2发生反应所得的吸光度值A2,因A1>A2,所以A2为负值)。

4. 结束语

现目前市场上生产的缺血修饰白蛋白(IMA)检测试剂盒的原理大致相同,主要基于白蛋白钴结合试验,但由于试剂盒主要成分(大多为Co Cl2·6H2O、显色剂等)的配比及试验环境(即酸碱性)的不同,使得不同的生产厂家对其测定波长的设定有所不同,分别有470nm、505nm、510nm等。

此次试验的目的,第一,通过紫外分光光度仪检出特征吸收峰(谷);第二,按试剂盒说明书的要求,在指定波长下检测吸光度,比较吸光度的差异。对图1和图2进行比较,可看出,从吸收峰(580nm/586nm)到650nm这一波长范围内,吸光度是呈下降趋势,企业将试验试剂吸光度呈下降趋式中的某一点(650nm)设置为检测波长,不知意义何在,为何不直接将检测波长设置在特征吸收峰的波长范围内,且企业在做该产品的研发时,是否做过相关性试验的对比及研究。比较图2与图3,用不同的试剂调零,得出的光谱图完全不一样,由此可得出试剂盒里现有的配套使用的空白试剂与应用试剂的成分有差别。根据试验操作的平行原则,笔者认为在消除试验空白时,应以应用试剂来消除试验空白,而不是以空气或空白试剂来消除空白;按照产品说明书的检验要求,虽整个试验过程都是平行操作进行,但通过试验证明,用不同的方式进行测试,所得的试验结果完全不同,而这种存在差异的结果是否能为临床医生提供真实可靠的数据,又是否会影响到IMA在临床上的诊断意义呢?

参考文献

[1]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会.GB/T26124-2011临床化学体外诊断试剂(盒)[S].2011。

[2]史连义,吴宝水,张继领.缺血修饰白蛋白临床应用研究进展[J].医学综述2009年11月第15卷第21期3239-3241。

[3]贾克刚,韩雪晶,唐红霞,南芳,张淑菊.应用全自动生化分析仪测定缺血修饰白蛋白[J].检验医学2007年第22卷第3期。

[4]梁宏.缺血修饰白蛋白-心肌缺血标志物研究进展[J].中国实验诊断学2006年10月第10卷第10期。

[5]叶应妩,王毓三,申子瑜.全国临床检验手册[M].3版.南京.东南大学出版社2006452-456。

[6]陆永绥,李清华,张伟民.临床检验自动化分析标准操作规程[M].浙江大学出版社.2006.9。

蛋白修饰 第8篇

1实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器:电化学工作站 (美国普林斯顿公司) , 工作 (月桂酸、大豆卵磷脂和胆固醇修饰的玻碳电极) 、辅助 (大面积的铂片电极) 、参比电极 (Ag/AgC1电极) 组成的三电极体系。

试剂:牛血红蛋白, 月桂酸, 大豆卵磷脂, 胆固醇、氯化钾, 氯仿等。0.02mol/L磷酸二氢钾和磷酸氢二钠 (pH=5～8) 为缓冲溶液.所用试剂均为分析纯。

1.2 实验设计

以血红蛋白在磷酸二氢钾和磷酸氢二钠缓冲溶液中, 玻碳电极依次经丙酮、稀硫酸 (1.00mol/L) 、去离子水超声洗涤。用Al2O3粉末抛光, 再用去离子水清洗电极, 最后用滤纸将电极表面吸干。将已抛光的玻碳电极倒立且固定在干燥的烧杯内, 用微量注射器取成膜液 (月桂酸、大豆卵磷脂、胆固醇) 5μL均匀滴加在电极表面, 盖好玻璃罩待溶剂挥发后测定血红蛋白浓度, 溶液PH, 电势扫描速率等对峰电流的影响。

2结果与讨论

2.1 循环伏安图谱的直观信息

2.1.1 不同电势扫描速率下的循环伏安响应谱

由图可知, 无阳极氧化峰出现, 阴极呈现出单一的还原峰, 且电势扫描速率越高该还原峰电势越小, 故可认为血红蛋白在该膜修饰的电极电催化还原反应为不可逆。

2.1.2 连续多次循环伏安扫描测试

连续多次伏安扫描测试中, 血红蛋白还原峰电流先增加后减小, 因而可认为血红蛋白在该膜修饰电极的电催化还原反应有弱吸附现象。

(图1不同扫描速率下的循环伏安曲线, 血红蛋白浓度:1.01×10-6mol/L, pH=5.00。

响应曲线1—6所对应的电扫描速率分别为, 10、20、40、60、80和100mV/s)

2.2 信息数据的解析与拟合

2.2.1 血红蛋白的undefined数据集的线性回归处理

undefined

(表1 不同溶液pH条件下ip对undefined对V的回归处理血红蛋白浓度:1.00×10-6Mol/L;电势扫描速率ν在10～100mV/s.)

模型拟合, 见表1 (F为误差平方和) , 线性相关系数R≥0.917, 但其回归直线截距k0不为零 (与峰电流相比太大) , undefined的数值都随电势扫描速率增大而变大, ip～V的数值都随电势扫描速率增大而减小, 不能视为常数【3】, 故不能确定是吸附还是扩散控制。

2.2.2 血红蛋白的undefined二元线性回归处理

对涉及电活性质粒吸附反应体系来说, undefined

(表2 不同溶液PH条件下ip对undefined二元线性回归处理血红蛋白浓度:1.00×10-6Mol/L, 电势扫描速率ν在10～100mV/s。)

采按照undefined模型进行回归处理结果F (误差平方和) 值明显增大。

综上, 对undefined所得出数据并不理想, 即该扩散和吸附行为与电化学理论中常规模型并不相同。

2.2.3 血红蛋白的undefined数据集的回归处理

图2中ip～C曲线类似Michaelis-Menton【4】方程, 可表示为undefined, 考虑到吸附态活性物质对电流有显著影响, 对 (4) 式进行修正得undefined

表3可见, F值更大些, 且K0参数大于undefined数据集中最小浓度对应的ip值 (2.17×10-7A) 。故对 (4) 和 (5) 式施以分形修正, 给出如下模型

undefined

由于α=2-D=1.34, 因而求出分维D=0.66。

3结论

经月桂酸、大豆卵磷脂和胆固醇修饰的玻碳电极的微孔粗糙程度不一, 且血红蛋白微粒表面凹凸不平, 而电催化反应一般是在一系列孤立的点上进行, 即该电极/溶液界面结构类似于Cantor集合, Hausdorff维数D=0.66, 处于0和1之间Hausdorff维数 (D=0.66) 偏离1的程度较大, 故可推断血红蛋白在经月桂酸、大豆卵磷脂和胆固醇修饰的玻碳电极上的电催化还原机制比较复杂[5], 可进一步研究讨论。

参考文献

[1]袁倬斌, 张玉忠, 赵红。分析化学, 2001, 29:1332-1335

[2]何亚楠, 李根喜, 史海蓉等。分析化学, 1997, 25 (1) :49-51

[3] (美) A.J.巴德, L.R.福克纳著, 谷林锳等译。《电化学方法原理及应用》, 化学工业出版社, 1984, 616-620

[4]李后强, 赵华明。自然杂志, 1999, 13 (6) 327-330

蛋白修饰 第9篇

组蛋白乙酰化是解除核小体抑制作用的主要机制, 受组蛋白乙酰基转移酶 (histone acetyltransferases, HATs) 和组蛋白去乙酰化酶 (histone deacetylases, HDACs) 的调控。HAT包括核内的A型与胞质的B型, 其中A型包括酵母菌的GCN5、脊椎动物的p300/CBP、P/CAF (p300/CBP相关因子) 、TAFl1 250、HBO1、SRC-1 (steroid receptor coactivator-1) 、MYST家族 (包括人单核细胞性白血病锌指蛋白MOZ, 单核细胞性白血病锌指蛋白相关因子MORF) 、hTFⅢC90、p160蛋白家族 (NCOA1-3) 、Tat相互作用蛋白 (Tip60) 等。目前已知的B型HATs有酵母菌的HAT1和HAT2。而HDACs则分成四类Ⅰ类包括HDAC1、2、3、8;Ⅱ类包括HDAC4、5、6、7、9、10;Ⅲ类HDAC即沉默信息调节因子2 (Sir2) -相关酶类;IV类是HDAC11[4]。HATs能把乙酰辅酶A的乙酰基转移到组蛋白N端特定赖氨酸残基的一个氨基上, 中和它所带的正电荷, 增加其疏水性, 降低组蛋白与DNA的亲和性, 使染色质疏松, 转录因子易于结合DNA链, 故组蛋白高乙酰化有利于基因转录[5]。HDACs能水解乙酰化赖氨酸, 使其脱乙酰基, 恢复所带的正电荷, 因此与带负电荷的DNA紧密结合, 抑制基因转录, 组蛋白去乙酰化常使染色质失去转录活性[6]。组蛋白乙酰化和去乙酰化失衡与肿瘤发生发展密切相关, ING家族因其独特的作用而影响到其在肿瘤发生发展中的作用。现对生长抑制因子家族成员参与组蛋白乙酰化修饰的作用做一总结。

1 生长抑制因子家族参与组蛋白去乙酰化作用

许多研究显示各种HDACs的生物功能是必要且不同的。HDACs底物包括参与基因调控、细胞周期演进和细胞死亡的组蛋白以及非组蛋白, HDACs不直接结合DNA, 而是通过参与构成多种蛋白复合物与DNA作用, 其中ING家族发挥了重要的作用[3]。

有研究报道, Sap30与ING1相结合可能是HDAC1的靶点, 它们将HDAC1募集形成ING1-Sap30-HDAC1复合物, 而该复合物的存在会降低其作用位点的组蛋白乙酰化的水平[6]。ING1分子中的PHD结构域让其可以与特定修饰的组蛋白相互作用是这一分子模式发挥作用的基础。有研究表明ING1的主要存在形式是构成mSin3-HDAC复合物的一部分[6]。在实验中ING1-mSin3-HDAC复合物通常有四种作用, 一是重建异染色质臂间的区域, 二是促进DNA甲基化, 三是促进组蛋白的去乙酰化, 四是促进H3K9组蛋白的甲基化, 同时该复合物也是转录抑制的标志物[7]。此外, ING1能够识别修饰过的组蛋白残基如H3K4me3与H3K9me3, ING1还有募集其他组蛋白或修饰基因的能力, 但这需要依赖像转录因子这样的复合物或者局部水平的组蛋白密码、DNA甲基化和染色质结构来完成募集及修饰的能力。因此, ING1有活化与抑制靶基因的双重作用。

有实验证明人体中ING2蛋白与多肽类相互作用, 这个多肽与在哺乳动物中发现的Sin3-HDAC复合物非常相似, 包括染色体结构域 (chromodomain-containing) RBP1及其同源蛋白[2]。ING2是mSin3A-HDAC复合物中的组成部分, mSin3A-HDAC复合物中包含了BRMS1 (breast cancer metastasis suppressor-1) 蛋白。BRMS1抑制了多种人类及鼠类的癌症细胞的转移, 并且在mSin3 HDAC复合物中发现它与RBP1相互作用[8]。故推测ING2可以在mSin3A HDAC复合物中通过与RBP1之间的作用进而影响BRMS1的功能。除此之外, ING2-HDAC1-mSin3A复合物在体外通过加强MMP13的表达来增加癌细胞的侵袭能力。由于MMP13可以降解基底膜[9]与细胞外基质[10], 故其在癌细胞侵袭过程中扮演了重要的角色, 除此之外, 以siRNA下调ING2能够抑制MMP13的表达。因为HDAC-mSin3A复合物主要抑制基因的转录, 所以MMP13的诱导形成可能是该复合物间接作用的结果。然而, ING2可能通过与SIRT1作用间接抑制HDAC-mSin3A的活性, 对于此, 另一种解释ING1和ING2蛋白募集SIRT1, 并且SIRT1抑制了RBP1-相关的mSin3A-HDAC1转录抑制活性[11]。ING2可能将RBP1-mSin3A-HDAC复合物与MMP13启动子相结合, 并募集SIRT1抑制RBP1-相关m Sin3A-HDAC转录抑制活性, 进而上调MMP13。这个结果意味着ING2在癌症进程中起推进作用。

2 生长抑制因子家族参与组蛋白乙酰化作用

组蛋白乙酰化与转录活性有密切关系:高乙酰化组蛋白特异地聚集于活性染色质功能区;低乙酰化组蛋白聚集在无转录活性的非功能区。体外将核心颗粒中H2A·H2B二聚体乙酰化[12]或 (H3·H4) 2四聚体乙酰化[13]后, 组蛋白对转录的抑制作用大大减弱, RNA合成效率提高。

ING3是NuA4-Tip60 HAT复合物的一员, 该复合物可将H4和H2AN端的组蛋白乙酰化, 并同其他生长抑制因子家族成员一样与H3K4me3结合[2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14]。由于组蛋白乙酰化和H3K4me3与转录的启动相关联, 所以ING3可能是转录的活化因子。除此之外, Tip60及其相关的蛋白是转录因子p53、NF-κB、Myc、E2F1发挥作用的辅因子[15], 并且在核受体依赖的转录活性调节、细胞内DNA损伤、细胞凋亡和肿瘤转移中发挥着作用[14,15,16]。笔者猜测ING3在上述过程中同样扮演了重要的角色, 但其如何通过复合物的形式在转录和抑癌的过程中发挥的作用还需要进一步的研究。

ING4被提出作为肿瘤抑制物是因为在人类癌症中ING4表达降低, 并且随不同癌症ING4的基因有突变的现象。ING4乙酰化复合物包括HBO1[17]。HBO1是HAT酶MYST家族中的一员, 在人类和蝇类中高度保守, 它在DNA复制和转录的过程中发挥了重要的作用[18], 同时HBO1所形成的HBO1-JADE-ING4-HEAF6四聚物在高等真核生物中组蛋白H4乙酰化的过程中是必不可少的成分, 且在体外实验中, JADE1的过度表达增加了组蛋白H4的乙酰化水平[19]。ING4-HBO1复合物使组蛋白H4K16乙酰化, 而Tip60-ING3复合物并不会使该组蛋白残基乙酰化, 这意味着每一个生长抑制因子家族成员在转录调节的过程中通过拥有不同的组蛋白密码来发挥不同的精细调节作用。但是ING4需要经过正常的S期使体内大部分组蛋白H4乙酰化才可与HBO1-HAT相结合。生物化学分析得出ING4与甲基化的组蛋白H3相互作用[20], 与此同时ING4也与HB01-JADE-h EAF6组蛋白乙酰基转移酶相互作用[2]。上述四聚体复合物中起到了活化作用, 但同时也具有类似p53的作用, 可以下调HBO1-HAT复合物的活性, 这就需要进一步的分子和遗传学的研究来解释这一矛盾。

有两种不同的HAT复合物包含ING5, 一种复合物是ING5-MOZ/MORF-EAF6与BRPF相互作用从而结合于组蛋白H3[2]。BRPF蛋白是ING5-MOZ/MORF-EAF6四聚体之间作用的桥梁, 但是由于ING5的存在会增加EAF6与BRPF之间的亲和力, 使得BRPF不仅拥有促进核内组蛋白H3乙酰化的能力, 同时还能够促进处于游离体的H3与H4乙酰化, 这样的组蛋白异常乙酰化可能会导致白血病的发生。另一种是通过ING5、HBO1和JADE相互作用结合于组蛋白H4, 与ING4相似[2];HBO1-JADE-ING5 HAT复合物与MCM复合物相互作用的期间发挥着重要的作用, MCM复合物是组成DNA复制前体复合物的重要部分, 在DNA的复制过程中发挥了重要的作用。然而将MCM复合物组装到的染色质发挥作用需要HBO1的存在, 这是DNA复制前体复合物组装和DNA复制标志形成的关键步骤。据此, 笔者推断ING5可能通过促进DNA的复制来达到致癌的作用。综上所述, ING5在癌症过程中的双面作用及机制还需要进一步的证实。

3 结语