联合抑菌范文（精选7篇）
联合抑菌 第1篇
鱼腥草、黄连、大青叶均为常用的清热解毒类中药, 具有抗菌或抗病毒作用, 在中医临床中应用广泛, 然而对于这三种中药的联合抑菌活性未见详实报道。本文在比较该三种中药单药抑菌活性基础上, 探讨相互联合使用的抑菌效果, 为新的复方中药研发提供一定的科学依据。现将具体实验结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 药材
鱼腥草为三白草科蕺菜属植物蕺菜 (Houttuyniae cordata) 的全草, 黄连为毛茛科植物 (Coptis chinensis) 黄连的干燥根茎, 大青叶为十字花科植物菘蓝 (Isatis tinctoria) 的干燥叶;以上药材均由宁波市药村公司提供。
1.2 药材提取物制备
以上药材粉碎后称取约20目大小的颗粒50g, 用80%的乙醇水溶液300ml浸泡1小时后于78℃水浴中回流提取2小时, 做3次提取后合并滤液, 置旋转蒸发仪浓缩后用蒸发皿挥干溶剂, 密闭保存于-20℃冰箱备用。
1.3 实验菌株
金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希氏菌ATCC25922、肺炎克雷伯氏菌 (多重耐药株) 、白色念珠菌 (耐氟康唑株) 、酵母菌 (耐氟康唑株) 、肠炎沙门氏菌 (耐环丙沙星株) 、金黄色葡萄球菌 (多重耐药株) 。
1.4 体外抑菌实验
采用药基法按文献[2]略作修改。将药材提取物用少量80%乙醇溶液助溶, 再用蒸馏水配成100mg/ml的药物母液, 过滤除菌后, 将母液按比例加入融化的M.H琼脂 (酵母菌和白色念珠菌用沙氏琼脂) , 混匀铺板, 得到每ml含药量分别为10、5、4、3、2、1、0.5、0.25、0.125mg的含药琼脂平扳。用微量加样器逐个点种菌液 (含菌量约107CFU/ml) 1μl, 形成的菌液圈直径为5mm左右, 菌液干后置37℃孵育18小时, 菌落生长被完全抑制的最低药物浓度为该药对检测菌的MIC值。每个受试药样平行做多次试验, 以不含药的M.H琼脂平板作对照。
1.5 体外联合抑菌实验
根据单药抑菌试验结果, 按棋盘试验祛 (cheeker-boacd titration) 略作改良进行[3]。FIC指数的计算方法为:FIC=A药联用时的MIC/A药单用时的MIC+B药联用时的MIC/B药单用时的MIC。FIC≤0.5, 为协同作用;0.5
2 结果
2.1 三种中药单药抑菌作用
体外抑菌实验结果表明:鱼腥草、黄连、大青叶对7种菌株均有一定的抑制作用, 其中对金葡球菌的抑菌活性最明显, 而且对金葡球菌的标准株与耐药株具有基本同等的抑制效果。相对而言三种中药对革兰氏阳性菌的作用比革兰氏阴性菌强。总体比较抑菌活性顺序为:黄连>鱼腥草>大青叶。但是大青叶对真菌和肺炎克雷伯氏菌的作用略差, 结果见表1。
2.2 三种中药联合抑菌实验结果
鱼腥草+黄连除了对沙门氏菌、酵母菌、肺炎克雷伯氏菌表现为无关作用外, 对其他5种菌株均表现为协同、部分协同或相加作用。鱼腥草+大青叶对沙门氏菌表现为协同, 对金葡球菌、大肠埃希氏菌则为部分协同, 对酵母菌和白色念珠菌表现为无关, 而对肺炎克雷伯氏菌表现为拮抗作用。黄连+大青叶总体上均表现为部分协同或相加效应, 结果见表2。
3 讨论
中草药中的绝大多数清热解毒药具有抗菌或抗病毒的作用, 其中就包括鱼腥草、黄连和大青叶等, 并通过实验证明其具有直接抑菌及促进非特异性免疫反应、增强血中白细胞吞噬功能的作用[4]。
鱼腥草[5]和黄连[6,7]的抗菌作用报道较多, 但大青叶方面的报道较少[8], 作者尚未见到此三种中药联合抑菌方面的报道。
本文观察结果显示鱼腥草、黄连、大青叶对金葡球菌的标准株与耐药株具有基本同等的抑制效果, 说明它们与抗菌素不存在交叉耐药性。三种药相互联用, 除了鱼腥草+大青叶对酵母菌和白色念珠菌表现为无关, 对肺炎克雷伯氏菌表现为拮抗以外, 基本表现为协同、部分协同或相加作用;表明中药联用对各种病原微生物的抑制效果良好。
摘要：目的:探讨鱼腥草、黄连和大青叶的联合抑菌作用。方法:采用药基法测定鱼腥草、黄连和大青叶乙醇提取物对常见耐药菌株的抑制作用, 用棋盘试验法评价鱼腥草与黄连、鱼腥草与大青叶、黄连与大青叶的联合抑菌作用。结果:鱼腥草、黄连、大青叶对7种菌株均有一定的抑制作用, 对革兰氏阳性菌的作用比革兰氏阴性菌强;而且对金葡球菌标准株与耐药株的MIC值基本相同。二联合用时, 鱼腥草+黄连、鱼腥草+大青叶、黄连+大青叶对供试菌株多表现为协同、部分协同或相加作用, 对金葡球菌、大肠埃希氏菌、沙门氐菌的抗菌活性较强。结论:鱼腥草、黄连、大青叶对7种菌株均有一定的抑制作用, 且对金葡球菌标准株与耐药株具有基本同等的抑制效果, 二联配伍使用对耐药菌株有较好的抑制作用。
关键词：鱼腥草/药理学,黄连/药理学,大青叶/药理学,细菌/药物作用,体外研究
参考文献
[1]于嵩.中草药抗细菌感染的研究.北京中医杂志, 2002, 21 (4) :249.
[2]徐叔云, 卞如濂, 陈修.药理实验方法学.北京:人民卫生出版社, 2002:1612.
[3]Shan-Chwen Chang, Yee-Chun Chcn, Kwen-Tay Luh, et al.In vitro activities of antimicrobial agents, alone and in combination, a-gainst acinetobacter baumannii isolated from blood.Diagn Microbiol Infect Dis, 1995, 23:105.
[4]熊南燕, 曹明耀, 于雪玲, 等.鱼腥草对氨苄青霉素和乳糖酸红霉素抗菌途径的影响.时珍国医国药, 2007, 18 (6) :1303.
[5]洪佳璇, 高雅文, 汪柏尧, 等.鲜鱼腥草提取物抗菌作用的实验研究.中国中医药科技, 2007, 14 (6) :418.
[6]王桂红.黄连与药物配伍对抑菌作用影响的研究.中医药学刊, 2001, 19 (4) :400.
[7]姜延伟, 王懿萍, 吴玉娟, 等.黄连多糖抑菌活性初探.时珍国医国药, 2009, 20 (1) :48.
联合抑菌 第2篇
1 材料
1.1 试验菌株
大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌,均由动物科技学院药理实验室提供,系经过鉴定的临床分离株。以大肠杆菌ATCC25922为质控菌株。
1.2 药品
盐酸头孢噻呋(88%),购自中国生物制品检定所;甘氨酸(99.5%),购自天津市博迪化工有限公司;磷酸氢二钠(20110422),购自天津市红岩化学试剂厂;磷酸二氢钠(20110218),购自天津巴斯夫化工有限公司;N-N二甲基甲酰胺(20110611),购自天津市广成化学试剂有限公司。
1.3 主要试剂
麦康凯琼脂,购自北京陆桥技术有限公司;营养琼脂、MH肉汤培养基,均购自青岛高科园海博生物科技有限公司。
1.4 主要仪器
双人双面超净工作台(SW-CJ-2F型),购自苏州净化设备有限公司;电热恒温培养箱(DHP-9272型),购自山东龙口市先科仪器公司;立式压力蒸气灭菌器(B×M-30R型),购自上海博讯实业有限公司;紫外分光光度计(UV-2550型),购自上海奥析科学仪器有限公司;电子分析天平,购自奥豪斯国际贸易上海有限公司;大龙微量移液器,购自上海赛颇生物科技有限公司;微孔滤膜,购自上海兴亚净化材料厂。
2 方法
2.1 菌液的制备
试验前将各菌种培养、复壮并划线分离单个菌落,挑取2~3个单菌落接种到3~5 m L MH肉汤中,37℃培养8~10 h,备用。
2.2 药液的制备
精确称取0.145 g的盐酸头孢噻呋,用N-N二甲基甲酰胺与注射用水的混合液(2∶1)在棕色容量瓶中定容至25 m L,即浓度为5 120μg/m L,用无菌滤器过滤后保存在4℃的冰箱中,备用。
精确称取1.640 g的甘氨酸,用p H值为6.0的磷酸盐缓冲液定容至25 m L,即浓度为65 536μg/m L,用无菌滤器过滤后保存在4℃的冰箱中,备用。
2.3 最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定
2.3.1 抗菌药物的准备
将已制好的盐酸头孢噻呋储备液用p H值为6.0的磷酸盐缓冲液做倍比稀释,稀释成256,128,64,32,16,8,4,2,1,0.5,0.25,0.125μg/m L,共12管,用移液枪将稀释好的盐酸头孢噻呋从高浓度到低浓度依次加入微孔板的小孔内,每孔加50μL,第12孔内加不含抗菌药物的磷酸盐缓冲液,作为空白对照。
将已制好的甘氨酸储备液用p H值为6.0的磷酸盐缓冲液做倍比稀释,稀释成32 768,16 384,8 192,4 096,2 048,1 024,512,256,128,64,32,16μg/m L,共12管,用移液枪将已稀释好甘氨酸的从高浓度到低浓度依次加入到微孔板的小孔内,每孔加50μL各浓度的甘氨酸,第12孔内加50μL不含药物的磷酸盐缓冲液作为空白对照。
2.3.2 菌悬液的制备
将培养好的菌液用MH肉汤调至0.5号麦氏标准管浊度,再稀释200倍,使菌液浓度为5×105cfu/m L,用移液枪将稀释好的菌液从高浓度到低浓度依次加入微孔板的U型小孔内,每孔加50μL,第12孔内加50μL双倍成分的MH肉汤培养基。加完菌液之后,将微孔板盖好,放置在振荡器上振荡1 min,使抗菌药物与菌液充分混匀。
2.3.3 结果判定
在衬有黑底板的光线下观察结果,细菌生长时可看到小孔内呈弥散状浑浊或U型底部有圆形或丝状沉淀。无细菌生长孔内所含最低抗菌药物浓度即为MIC。
将未见细菌生长的各孔内培养物各吸取0.1 m L,均匀涂布于灭菌的营养琼脂培养基平板上,在37℃恒温培养箱中培养18 h,平板上长出的菌落数小于5个的浓度即为该药的MBC。
2.3.4 药物配方的筛选
通过药物的体外抑菌试验确定药物的合理配比。使用试管二倍稀释法,在细菌浓度为5×105cfu/m L的条件下,于37℃培养18~24 h后,测定头孢噻呋∶甘氨酸(1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、16∶1)的MIC。接着吸取各管培养物(肉眼未见细菌生长)0.1 m L涂布于相应的营养琼脂培养基平板上,于规定温度下培养18 h后测得MBC,将不同配比药物的MIC和MBC进行对比,最小值即为最佳配方。
3 结果与分析
3.1 盐酸头孢噻呋与甘氨酸单药的MIC与MBC
见表1。
μg·m L-1
3.2 盐酸头孢噻呋与甘氨酸在不同浓度配比下的MIC和MBC
见表2。
μg·m L-1
盐酸头孢噻呋与甘氨酸联合用药可以明显降低大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的耐药率,盐酸头孢噻呋单药剂量的MIC和MBC是联合用药的数倍,盐酸头孢噻呋与甘氨酸配比为1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、16∶1时MIC为0.25~1.00μg/m L,盐酸头孢噻呋单方用药时要高于联合用药2∶1、4∶1、8∶1配比8倍多,盐酸头孢噻呋与甘氨酸配比为1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、16∶1时的MBC为2.00~16.00μg/m L,盐酸头孢噻呋单方用药时要高于联合用药1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、16∶1配比4倍多。
4 讨论
肉汤稀释法、微量肉汤稀释法和琼脂扩散稀释法是体外抑菌试验常用的三种方法,本试验采用微量肉汤稀释法对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌进行体外抑菌试验,操作简便,可以同时进行多组重复,可以精确测量盐酸头孢噻呋和甘氨酸在不同配比下的相互作用。通过将不同配比药物对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的MIC和MBC进行对比可以明显的看出,8∶1配比时抗菌效力明显比其他浓度配比要好,是最佳配方。
盐酸头孢噻呋与甘氨酸联合使用呈相加和协同作用,无颉颃作用。盐酸头孢噻呋与甘氨酸联合应用在国内外尚未报道,本试验以盐酸头孢噻呋和甘氨酸为主要原料,通过体外抑菌试验确定两种药的最佳配比,为以后临床用药提供指导。
参考文献
[1]武博达.复方头孢噻呋长效注射液的研制及其药动学研究[D].郑州:河南农业大学,2008.
[2]王付民,胡功政,高延玲.头孢噻呋等抗菌药物对4种标准菌株的药效学研究[J].动物医学进展,2005,26(2):95-97.
[3]王付民,胡功政,苑丽,等.头孢噻呋等的体外抗菌活性研究[J].中国兽医杂志,2004,40(9):49-50.
[4]昌莉丽.复方盐酸头孢噻呋混悬液药效评价及其药动学研究[D].郑州:河南农业大学,2010.
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[6]秦霞.甘氨酸的细胞保护作用及机制研究[D].南京:南京医科大学,2009.
联合抑菌 第3篇
鬼针草味苦、性平、无毒[4],具有抗肿瘤[5]、抗炎镇痛[6]、降血糖[7]和血脂等作用,但关于鬼针草血清的抑菌试验未见报道。本试验主要研究了鬼针草血清对产ESBLs和fos A3大肠杆菌的体外抑菌作用,旨在为开发中药治疗多药耐药大肠杆菌感染的疾病提供理论基础。
1 材料与方法
1. 1试验动物
三黄鸡,购自广西大学阜风养鸡场,健康状况良好。
1. 2 主要试剂与药品
营养琼脂、营养肉汤、麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂、MH琼脂,均为杭州天和微生物制剂有限公司产品; 鬼针草全草及其他抗菌药均为国产药,购自杭州天和生物有限公司,抗菌药有头孢曲松钠、阿莫西林( AMC) 、左旋氧氟沙星、磷霉素、黏杆菌素、痢菌净、加替沙星、阿米卡星、头孢噻呋钠、氟苯尼考、氨曲南( AZT) 、头孢他啶( CAZ) 、头孢曲松( CRO) 、头孢噻肟( CTX) 、阿莫西林/克拉维酸( CA) 、头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟/克拉维酸。
1. 3 细菌的分离与鉴定
在无菌操作环境下,从病鸡肝脏分离细菌接种到麦康凯琼脂上,于37 ℃恒温培养16 h; 挑单个菌落接种到营养肉汤中,37 ℃培养16 ~ 18 h; 将菌液接种到麦康凯琼脂和伊红美蓝琼脂上进行纯化,挑取单个菌落接种到营养肉汤中培养; 取菌液涂片,革兰染色镜检; 最后用肠杆菌科生化鉴定管对纯菌液进行鉴定。
1. 4 ESBLs 的初筛和确证
1) 纸片扩散初筛法: 按照美国国家临床实验室标准委员会( NCCLS) 推荐的ESBLs表型筛选方法进行。将受试菌涂布于MH琼脂上,取药敏纸片贴在MH琼脂上,纸片间距大于5 mm,置37 ℃ 温箱中培养16 ~ 18 h; 若以下任一药敏纸片对受试菌的抑菌圈直径满足条件就可以怀疑受试菌产ESBLs,CAZ≤22 mm,CRO≤25 mm,CTX≤27 mm,AZT≤27 mm。
2) NCCLS纸片扩散确证法: 受试菌涂板方法同上,MH琼脂上贴的药敏纸片为CTX、CTX/CA和CAZ、CAZ / CA,37 ℃ 培养16 ~ 18 h; 两组中任一组出现加CA比不加CA的抑菌圈直径≥5 mm,确定为受试菌株产ESBLs。
1. 5 ESBLs 基因型的检测
1. 5. 1引物参照Gen Bank中登录的TEM、SHV、 CTX - M 、fos A3基因序列,分别设计其通用引物,引物序列: TEM - F 5' - AGGAAGAGTATGATTCAA CA - 3' , TEM - R 5' - CTCGTCGTTTGGTATGGC - 3' ; SHV - F 5' - GGTTATGCGTTATATTCGCCTG TG - 3' , SHV - R 5' - TTAGCGTTGCCAGTGCTCGATCA - 3' ; CTX - M - F 5' - GGGCTGAGATGGTGACAAAGAG 3' , CTX - M - R 5' - CGTGCGAGTTCGATTTATTCAAC - 3' ; fos A3 - F 5' - GCGTCAAGCCTGGCATTT - 3' , fos A3 - R 5' - GCCGTCAGGGTCGAGAAA - 3'。 引物均由上海生工生物工程有限公司合成 。TEM型产物扩增长度为520 bp , CTX - M 、SHV型产物扩增长度为876 bp , fos A3型产物扩增长度为250 bp左右 。
1. 5. 2PCR扩增PCR反应体系 ( 总体积为25 μL) : Taq酶0. 25 μL,d NTP 2 μL,10 × PCR Buffer2. 5 μL,DNA模板1 μL,上、下游引物各1 μL,去离子水17. 25 μL。PCR反应条件: 94 ℃ 3 min; 94 ℃30 s,TEM( 52 ℃ ) 、CTX - M( 55 ℃ ) 、fos A3 ( 55 ℃ ) 、SHV( 57 ℃ ) 30 s,72 ℃ 1 min,共循环30次; 72 ℃10 min,同时设空白对照。取PCR扩增产物用1. 0%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,在紫外投射仪下观察结果,并用凝胶成像系统摄像。
1. 6 鬼针草血清的制备
将鬼针草全草洗干净,在通风阴凉处晾干,粉碎,称取200 g,置2 000 m L烧杯中,分别加入中药体积10倍、8倍、5倍的水煎煮3次,过滤浓缩至200 m L,药液浓度为1 g /m L。对三黄鸡进行空腹处理,隔日按体重10 m L/kg给三黄鸡灌服鬼针草水提取液,2次 / d,连续灌服3 d,由于动物的代谢周期约为24h,保证每天灌服的时间相同,用一次性注射器自腋下静脉采血,注入无菌负压采血管中,凝固后离心分离血清,56 ℃ 水浴30 min灭活[8],置 - 20 ℃冰箱中保存,备用( 需要注意的是,当日内使用) 。
1. 7 药敏试验
参照CLSIM31 - A3推荐的二倍微量稀释法测定各抗菌药及鬼 针草血清 对细菌的 最小抑菌 浓度( MIC) 值。
1. 8 中西药联合诱导细菌传代
以鬼针草血清的亚抑菌浓度( 1 /2 MIC) 联合抗菌药诱导耐药菌传代培养,观察鬼针草血清作用前后MIC值的变化,以判断鬼针草血清对各抗菌药作用细菌的效果,同时设一个1 /2MIC浓度的鬼针草血清作为阴性对照。
2 结果与分析
2. 1 细菌的鉴定结果
经培养发现,致病菌在麦康凯琼脂上为玫红色大菌落,在伊红美蓝琼脂上为带金属光泽的菌落,镜检为长杆状革兰阴性菌落,肠杆菌科生化鉴定管鉴定为大肠杆菌。
2. 2 ESBLs 的初筛和确证结果
根据NCCLS标准,对该分离 菌株进行 初筛,CTX、CAZ的抑菌圈直径为17 mm和13 mm,符合初筛标准,确证试验中CTX、CTX/CA和CAZ、CAZ/CA抑菌圈直径分别为17 mm、23 mm和13 mm、17 mm,符合二者其中一对相差值 > 5 mm,确定该分离菌株产生ESBLs耐药基因。
2. 3 PCR 扩增结果
经PCR检测,该分离菌株同时携带ESBLs和fos A3,ESBLs亚型分别为TEM型及CTX - M型。
2. 4 单药及联合药的药敏试验结果
由表1可知: 鬼针草血清与抗菌药联合诱导细菌传代,与阿莫西林、头孢曲松钠、头孢他定、头孢噻呋钠、阿米卡星、氟苯尼考联合作用效果较强; 与左旋氧氟沙星、加替沙星、黏杆菌素联合的效果不理想。
3 讨论
早期文献报道认为,大肠杆菌的多重耐药性与产生ESBLs有密切关系[9,10,11],多重耐药的不同基因型ESBLs的出现,反映了我国由于 β - 内酰胺类药物的大量使用,并且该类耐药基因为质粒介导,携带整合子的大肠杆菌可以整合其他耐药基因后对多种抗菌药耐药,在人的医院中感染爆发流行[12],甚至在屠宰的猪肉中发现产ESBLs的大肠杆菌中携带有其他耐药基因( 如fos A3)[13],这给治疗带来一定难度。本试验也发现,大肠杆菌产生ESBLs基因亚型TEM、CTX - M的同时携带有fos A3耐药基因,几乎无敏感药物,这与参考文献[14]报道的结果一致。
联合抑菌 第4篇
1 试验材料与方法
1.1 材料与试剂
原材料:茶籽粕, 广东泰源农科有限公司提供;供试菌种:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黄曲霉和黑曲霉, 以上菌种均为广东省微生物所提供;培养基:牛肉浸膏蛋白胨培养基, PDA培养基;试剂均为分析纯, 广州卯宁化学试剂公司;蒸馏水为试验室自制。
R201BL型旋转蒸发仪, 上海申生科技有限公司;FD-1PF型立式冷冻干燥机, 北京德天佑科技发展有限公司;TDL-5型台式离心机, 上海安亭科技仪器厂。
1.2 试验方法
1.2.1 茶籽粕中抑菌活性物质的提取
将茶籽粕分别用水、50%乙醇、80%乙醇、乙酸乙酯和石油醚等提取, 上清液在40~50℃浓缩冻干即得茶籽饼粕各个极性粗提物, 备用。
1.2.2 琼脂扩散法测定各个极性粗提物抑菌活性
将各个极性的上清提取物配一定浓度的溶液, 吸取浓度为105~108cfu/mL供试菌种菌悬液20μL, 加至直径为9cm的培养皿中, 加入10mL经溶解并冷却至40~50℃的营养琼脂培养基或PDA固体培养基, 迅速振荡摇匀, 致使菌悬液均匀分散, 冷凝后用直径2.7mm的打孔器打孔, 每孔加入5μL待测液, 灭菌培养基对照, 静置片刻, 适宜温度下培养 (细菌37℃下培养12h, 霉菌30℃培养48h) , 测量抑菌圈直径[8]。
1.2.3 不同温度处理的抑菌效果检测
采用琼脂扩散法对活性最强部分上清液粗提取的抑菌物质在不同温度条件下的抑菌效果试验。将提取物配制成0.05g/mL的溶液。分别取1mL置于编号的玻璃瓶, 分别置于-19、4、60、80、90、100和120℃中20min。以常温处理为对照, 用琼脂扩散法测试其抑菌效果。
1.2.4 不同p H值处理后的抑菌效果检测
上清液粗提取的抑菌物质在不同pH值条件下的抑菌效果试验。将具有抗菌活性的上清提取物配制成0.05g/mL的溶液。用HCl溶液, NaOH溶液通过p H计调粗提取物溶液p H值为2、4、6、8、10和12, 分别取1mL置于编号的玻璃瓶, 以自然p H值为对照, 用琼脂扩散法测试其抑菌效果。
1.2.5 不同光照处理后的抑菌效果检测
上清液粗提取的抑菌物质在不同光质下的抑菌效果试验。将上清提取物配制成0.05g/mL的溶液。分别取1mL置于编号的玻璃瓶, 分别放在日光下处理1、6、12、24、48、72和84h;紫外下处理5、10、15、20、2和30min, 以未处理样品为对照, 用琼脂扩散法测试其抑菌效果。
1.2.6 最低抑菌浓度 (MIC) 的测定
采用刃天青法[9]:将刃天青配制成100μg/m L, 菌悬液调制成106~108cfu/mL, 将配好的刃天青溶液7.5mL与调好浓度的菌悬液5mL充分混匀。备好无菌96孔板, 第11列置于100μg/mL的刃天青溶液100μL, 从第1列到10列及第12列置于100μL的刃天青与菌悬液的混合液。将样品配成一定浓度, 吸取样品100μL置于第1列, 充分混匀, 再从第1列吸取100μL置于第2列这样依次至第10列, 则样品也依次稀释2倍, 到第10列时混匀后扔掉100μL混合液。最后, 将细菌培养板置于37℃培养5~6h, 真菌培养12~16h。结果判定:细菌有抑菌活性是红色变成蓝色, 真菌有抑菌活性是由蓝色变成红色, 则颜色转折点为最低抑菌浓度 (MIC) 。
2 结果与分析
2.1 茶籽粕初提物各个不同极性的抑菌结果
试验结果表明:茶籽粕提取物对不同的菌株具有不同的抑菌效果, 各个不同极性在相同浓度下对各种菌的抑菌效果也不同, 其中80%乙醇提取物的抑菌活性最强, 对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌及真菌均有较好的抑菌作用。后续试验均以活性最强组分80%乙醇提取液为试验材料, 结果见表1。
注:“/”表示无明显抑菌圈。
2.2 80%乙醇茶籽粕提取物经不同温度处理后的抑菌效果比较
80%乙醇茶籽粕提取物经-19、4、60、80、90、100和120℃等不同温度的热处理20min后, 对试验菌的抑菌活性与常温相比无显著变化, 表明茶籽粕提取物的抑菌活性成分对热较稳定, 在短时间内能耐较高温度, 结果如图1所示。
2.3 80%乙醇茶籽粕提取物经不同p H值处理后的抑菌效果比较
茶籽粕提取物经不同p H处理后, p H值为1.0~7.0时, 提取物的抑菌作用随着p H值的提高而升高;当p H值为8.0~12.0时对细菌的抑菌效果降低甚至完全消失, 但是对真菌的抑菌效果变化不大。茶籽粕提取物中的活性成分在酸性环境下较碱性条件下稳定, 结果如图2所示。
2.4 茶籽粕提取物经不同光照处理后的抑菌效果
茶籽粕提取物经日光和紫外光等光照处理后, 其抑菌效果无明显变化, 说明提取物在光照条件下及紫外条件下都较稳定, 结果如图3和图4所示。
2.5 最低抑菌浓度MIC的测定
通过刃天青方法检测80%乙醇茶籽粕提取物的最低抑菌浓度, 测定结果表明:茶籽粕提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及苏云金杆菌枯草都有抑菌效果。且对大肠杆菌的最低抑菌浓度约为62.5μg/mL, 对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为31.25μg/mL, 对沙门氏菌的最低抑菌浓度约为62.5μg/mL, 对苏云金杆菌的最低抑菌效果为3.906μg/mL, 对黑曲霉及黄曲霉的最低抑菌浓度为500μg/mL, 结果见表2。
3 结论与讨论
本文首次系统地研究了茶籽粕提取物中强抗菌活性部分的抑菌效果以及最低抑菌浓度的试验, 得出革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌及真菌的最低抑菌浓度。茶籽粕提取物在120℃下处理20min、不同光下处理一段时间抑菌效果没有减弱, 在酸性条件下较稳定, 这说明茶籽粕提取物中抗菌活性成分较稳定。
通过最低抑菌浓度的测定表明, 茶籽粕提取物对革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌及部分真菌都有良好的抗菌作用且抗菌谱较宽, 因为茶籽粕来源非常广阔且廉价, 研究表明:茶籽粕对热血动物并无毒性, 而目前天然防腐剂的要么抑菌谱窄, 要么价格昂贵, 而研究抑菌谱宽、价格相对低、来源广的天然防腐剂成为现在研究的热点, 而茶籽粕提取物中抑菌成分具有抑菌效果强, 抑菌谱广的特点, 本论文的研究为日后从茶籽粕中开发天然防腐剂可以起到理论指导作用。
参考文献
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香樟精油的体外抑菌活性 第5篇
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
供试菌种金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus ATCC26112) , 购于中国医学菌种保藏中心。香樟油由西南科技大学天然药物化学实验室提供。
1.2 实验方法
1.2.1 香樟精油稀释液的制备
香樟精油不溶于水, 以丙酮作为稀释剂。精确量取5ml香樟精油, 加入5ml丙酮, 震荡摇匀, 配置成50%的溶液, 装入棕色瓶作为母液, 二倍稀释法配制一系列浓度梯度的精油溶液。
1.2.2 菌悬液的制备
将供试菌种在斜面培养基上活化2代后, 用接种环从斜面上轻刮菌苔一环, 收集到内盛10m L无菌水的三角瓶中, 配成终浓度为106CFU/m L的菌悬液, 备用。
1.2.3 香樟油的抑菌活性测定
待培养皿中培养基凝固后, 在无菌条件下, 取0.2ml菌悬液涂布到培养皿上。将D=6mm的无菌滤纸片在香樟油中浸泡2小时, 沥干, 平铺在培养皿上, 每平板铺2片。以丙酮作为空白对照, 以1.0mg/ml氨苄青霉素作为阳性对照, 于37℃恒温箱内培养24h后观察, 并测定抑菌圈的直径。平行实验3次。抑菌圈试验判定标准:滤纸片直径为6mm时, 抑菌圈直径大于20mm, 极敏;15~20mm, 高敏;10~15mm, 中敏;7~9mm, 低敏;小于7mm, 不敏感[5]。
1.2.4 最小抑菌浓度 (MIC) 的测定[6]
将不同浓度梯度的香樟精油溶液各1m L加入融化的固体培养基中混合均匀, 待培养基凝固后, 即得含各浓度香樟油的供试样品的平板。在平板上画线接种菌液, 37℃培养1d。观察菌体生长情况, 生长菌体为阳性 (+) , 不生长菌体为阴性 (-) , 以不生长菌的试验样品的最低浓度为香樟油最低抑菌浓度 (MIC) , 以丙酮作为阴性对照。重复2次。
2 结果与分析
香樟精油对金黄色葡萄球菌抑菌活性测定结果
“+”表示培养基有菌落生长, “-”表示培养基未出现菌落。
从表1、2看出, 不同浓度香樟精油对金黄色葡萄球菌抑菌活性不同。纯精油对金黄色葡萄球菌的抑菌圈最大, 为13.1mm, 在10~15mm之间, 属中敏。精油抑菌圈的直径随体积分数的增大而增强。最小抑菌浓度MIC值是测定抗菌物质抗菌活性大小的指标。当浓度降到到12.5%时平板中没有检出菌落, 6.25%时平板中检出少量菌落, 当香樟精油的浓度大于12.5%时, 可完全抑制金黄色葡萄球菌的生长, 故其对金黄色葡萄球菌的MIC为12.5%。
3 结束语
该实验表明香樟精油对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为13.1mm, 金黄色葡萄球菌对香樟精油中度敏感。马英姿[7]、李爱民[8]等的实验结果也发现香樟精油对金黄色葡萄球菌有明显的抑菌效果。香樟油主要成分为樟脑、β-芳樟醇 (24.09%) 、桉油醇 (15.72%) 、α-松油醇 (11.20%) 、蛇床-6-烯-4-醇 (5.724%) [9], 其中, 芳樟醇具有抗细菌、抗真菌和抗病毒作用[10], 是樟树叶精油中的主要抗菌成分。香樟是我国亚热带绿阔叶林的主要树种之一, 资源丰富, 加快其抑菌活性及机理的研究有利于开发香樟油的开发和利用。
摘要：采用抑菌圈实验和二倍稀释法研究了香樟精油对金黄色葡萄球菌的抑菌活性、最低抑菌浓度 (MIC) 。结果表明:香樟精油对金黄色葡萄球菌抑菌活性显著, 当香樟精油的浓度大于12.5%时, 可完全抑制金黄色葡萄球菌的生长。
关键词：香樟,精油,抑菌
参考文献
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真菌分离及其抑菌性鉴定 第6篇
1 实验内容
采集油菜地的土壤进行真菌分离纯化, 通过实验结果分析对比它们之间的真菌种类有什么大同小异, 分离出的真菌对油菜的生长有什么样的影响, 有没有使油菜致病。
1.1 实验过程
(1) 样本采集:采用五点采样法分别采集刚收获过后的菜地和表层1～35 cm深度范围内的土壤样品, 充分混匀后取定量土壤样品制备土壤悬浮液。
(2) 土壤悬浮液的制备:称取10g土壤置于盛有90mL无菌水的250 mL灭菌三角瓶内, 充分振荡10min, 制成10-1的稀释液, 然后进行10倍倍比稀释至10-3。
(3) 土壤真菌的分离:
(1) 制备加有氯霉素和孟加拉红的马丁琼脂培养基。
(2) 用稀释平板法, 此种方法在土壤真菌分离中最常用, 用无菌水将土壤稀释后得到的悬浮液, 将一定量稀释悬浮液均匀涂抹于培养基上, 菌落长成后, 将单个菌落挑出。
(3) 培养:将接种土壤浮液的平板倒置于28°的温度区培养3-5天。
(4) 挑菌纯化:从长有单菌落的平板中选取菌落转接斜面。
(4) 真菌鉴定:真菌培养基采用马铃薯葡萄糖培养基。
(1) 制备平板:将15-20毫升溶化后冷却到50度左右的培养基倒入培养皿中。
(2) 接种:在培养基表面划线接种。
(3) 倒置平板:于最适温度下培养1-2天。
(4) 观察菌落的形状、大小、边缘、表面、隆起形状、透明度及培养基的颜色等。
1.2 需重点研究的关键问题及解决思路
设4个处理: (1) 土壤未灭菌与菌核表面消毒; (2) 土壤未灭菌与菌核表面未消毒; (1) 土壤灭菌与菌核表面未消毒; (2) 土壤灭菌与菌核表面消毒。
孟加拉红琼脂培养基对于计数来说最常用, 松膏培养基可兼顾计数、分离和鉴定, 适用于大多数土壤真菌和植物病原真菌的分离, 尤其适宜于木生真菌的分离, 并且孢子与菌落同步形成菌落不扩展可获得较好的测数结果是一种用途广泛的培养基。土壤真菌中, 无性态真菌 (半知菌) 占很大比重。无性态真菌中又以丝孢纲真菌所占份额最大。由于基本上无法通过生殖隔离试验来测定无性态真菌成员之间的亲缘关系, 在培养过程中, 观察真菌的形态特征和性状, 如菌落的颜色、分生孢子的形态和菌丝的颜色等。查看文献从中学习, 思考每次的方案。
1.3 实验主要设备、仪器及药品
(1) 设备、仪器。
天平, 烧杯, 电炉, 试管, 三角瓶, 棉花, 橡皮圈, 标签纸, 量筒, 灭菌吸管, 玻璃棒, 镊子, 漏斗, 分装漏斗架, 显微镜, 玻片等。
(2) 药品。
葡萄糖, 蛋白胨, 1/3000孟加拉红水溶液, 链霉素, 琼脂, KH2PO4, MgSO4.7H2O, 等。
2 结果与分析
从未灭菌土壤与表面消毒菌核、未灭菌土壤与表面未消毒菌核这两个处理中从油菜菌核表面分别分离到4株和3株不同种类的真菌;其它两处理未能诱捕到任何真菌, 表明以上真菌来自土壤而非菌核。7株菌株纯化后回接到表面消毒的菌核上。20d时从土壤中取出菌核, 少数菌核破碎, 大多数菌核变软, 表面长有大量孢子, 显示已经被分解。经鉴定, 这三个菌株分别属于短帚霉、哈茨木霉菌和棘孢曲霉。
3 小结与讨论
本试验研究表明, 短帚霉、哈茨木霉菌、棘孢曲霉 (Aspergillus aculeatus) Asp-1对油菜菌核萌发有较强的抑制作用, 致死率均在78%以上。木霉菌作为生防菌已有很多的报道, 木霉菌生防作用的生化机制主要包括:代谢几丁质酶、β-1, 3-葡聚糖酶、蛋白酶等多种胞外酶, 强烈水解植物病原真菌的细胞壁, 抑制病原菌生长与繁殖。但曲霉作为生防菌尚未见报道。将三述的三种真菌用于制作生防制剂, 有助于肥田, 提高土壤的活性, 对保护农业环境和提高食品安全很有效果生物防治前景广阔
摘要：本实验需重点研究的关键问题是怎样从几块不同的油菜地中取来土壤样品, 然后把制作良好的培养基进行真菌分离纯化, 运用形态学, 理化方法鉴定出抑菌性真菌。
关键词：菌核,真菌,抑菌性,实验
参考文献
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木糖醇抑菌作用研究 第7篇
1 实验方法
1.1 培养基的适用性检查
1.1.1 菌种
铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) [CMCC (B) 10104];大肠埃希菌 (Escherichia coli) [CMCC (B) 44 102];金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) [CMCC (B) 26 003];白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC (F) 98 001];黑曲霉 (Aspergillus niger) [CMCC (F) 98 003]。
1.1.2 菌液制备
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至胰酪胨大豆肉汤培养基中, 30℃～35℃培养18～24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖肉汤培养基中, 20℃～25℃培养24～48h。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液 (取供试液1mL, 接种到9mL灭菌生理盐水中) 制成每1mL含菌数为50～100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基中, 20℃～25℃培养5～7d, 加入3～5mL含0.05% (mL/mL) 聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液, 将孢子洗脱, 用含0.05% (mL/mL) 聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成孢子数50～100cfu的菌悬液。
1.2 适用性检查方法
取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌各50～100cfu, 分别注入无菌平皿中, 再分别立即倾注胰酪胨大豆琼脂培养基, 每株试验菌平行制备2个平皿, 混匀, 凝固, 置30℃～35℃培养48h, 计数;取白色念珠菌、黑曲霉各50～100cfu, 分别注入无菌平皿中, 再分别立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基, 每株试验菌平行制备2个平皿, 混匀, 凝固, 置20℃～25℃培养72h, 计数;同时用相应对照培养基同法操作, 计数。
1.3 结果判定
被检培养基的菌落数与对照培养基菌落数相比为95%, 因此判该培养基的适用性检查符合规定。
2 抑菌效力测定
2.1 测定方法的验证
2.1.1 菌液制备
同培养基适用性检查。
2.1.2 供试液配制
分别精密量取20%和35%的木糖醇水溶液2.0mL, 用灭菌的0.1%蛋白胨缓冲液稀释10倍作为供试液。
2.1.3 验证方法
(1) 菌液组:分别精密量取1.0mL稀释至50～100cfu的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌, 白色念珠菌和黑曲霉菌液, 立即倾注胰酪胨大豆琼脂培养基, 加有白色念珠菌和黑曲霉的平皿, 立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基, 每株试验菌平行制备2个平皿; (2) 阴性对照组:精密量取1.0mL供试液注入无菌平皿中, 立即倾注胰酪胨大豆琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基; (3) 试验组:分别精密量取1.0mL供试液和稀释至50～100cfu的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌, 白色念珠菌, 黑曲霉各1.0mL, 注入无菌平皿中, 立即倾注胰酪胨大豆琼脂培养基, 每株试验菌平行制备2个平皿, 混匀, 凝固, 置30℃～35℃培养48h, 计数;加有白色念珠菌和黑曲霉的平皿, 立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基, 每株试验菌平行制备2个平皿, 混匀, 凝固, 置20℃～25℃培养72h, 计数; (4) 同法做3次独立平行试验:
2.1.4 结果
稀释剂对照组的菌数回收率为: (1) 83.0%、81.6%、86.1%、90.0%、79.4%; (2) 83.2%, 79.7%, 84.3%, 92.0%, 81.6%; (3) 82.6%, 80.8%, 84.0%, 89.2%, 78.5%;20%。木糖醇溶液大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收率分别为: (1) 78.7%, 81.3%, 83.6%, 88.2%, 84.1%; (2) 78.5%, 81.1%, 83.9%, 88.0%, 84.6%; (3) 78.1%, 81.7%, 83.8%, 88.6%, 84.4%, 35%。木糖醇溶液大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收率分别为: (1) 81.3%、79.9%、86.5%、87.4%、83.9%; (2) 81%、80.2%、86.2%、87.0%、84.3%; (3) 81%、79%、86.5%、87.4%、83.6%。因此两浓度木糖醇溶液稀释10倍后对上述5种菌已没有抑菌性。
2.2 抑菌效力测定
2.2.1 菌种
同培养基的适用性检查。
2.2.2 菌液制备
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至胰酪胨大豆肉汤培养基中, 30℃～35℃培养18～24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖肉汤培养基中, 20℃～25℃培养24～48h。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液按10倍递增的稀释方法制成每1mL含菌数为108cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基中, 20℃～25℃培养5～7d, 加入3～5mL含0.05% (mL/mL) 聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液, 将孢子洗脱。用含0.05% (mL/mL) 聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液按10倍递增的方法稀释制成孢子数108cfu的菌悬液。
2.2.3 试验方法[3]
取100mL浓度为20%、35%木糖醇各5份, 分别加入上述已备妥的菌悬液各1mL, 每一容器加入一个试验菌, (1、2、3类供试品中1g或1mL接种菌量为105～106cfu, 4类供试品中1g或1mL接种菌量为103～104cfu, 接种菌液的体积不得超过供试品体积0.5%～1%) , 使相加后的最终含菌浓度为105～106cfu/mL。另取100mL0.1%蛋白胨缓冲液5份同法加入上述5种菌作阴性对照。
分别在7、14、21天按下述方法测定活菌数:将供试液按十倍系列稀释到适宜浓度 (取供试液1mL, 接种到9mL灭菌生理盐水中, ) 用注皿法进行测定。取1mL适宜浓度的供试液加入平皿中, 分别注入无菌平皿中, 再分别立即倾注胰酪胨大豆琼脂培养基, 每株试验菌平行制备2个平皿, 混匀, 凝固, 置30℃～35℃培养48h, 计数;取加有白色念珠菌和黑曲霉的供试品, 分别注入无菌平皿中, 再分别立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基, 混匀, 待培养基凝固后, 置20℃～25℃培养箱中培养72h, 不易计数可延长到5天, 计数平板菌落数, 计算出供试液中每1mL中存活的微生物数, 并按下式计算不同时间细菌变化的百分率:
3 结果与结论
(1) 阴性对照, 细菌:与初始值相比, 14天菌数增加了3.2 lg, 14～28天菌数增加了7.5lg;真菌:与初始值相比, 14天增加了2.8lg, 28天菌数增加了7.1lg。
(2) 20%的木糖醇溶液, 细菌:与初始值相比, 14天菌数没有增加1.5lg, 14～28天菌数增加了4lg;真菌:与初始值相比, 14天增加了1.8lg, 28天菌数增加了3lg。
(3) 35%的木糖醇溶液, 细菌:与初始值相比, 14天菌数下降1.7lg, 14天到28天菌数没有增加;真菌:与初始值相比, 14天下降了1.0lg, 28天菌数下降了2.1lg。
4 结论
依据2010年版《中国药典》二部附录XIX N《抑菌剂效力检查法指导原则》得出35%的木糖醇具有抑菌作用, 故木糖醇用作矫味剂的同时也具有抑菌作用。
摘要：目的:测定木糖醇的抑菌效力。方法:把木糖醇配成20%和35%的水溶液, 按照2010年版《中国药典》二部附录XIX N《抑菌剂效力检查法指导原则》[2]用大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉来进行实验。结果:20%的木糖醇溶液没有抑菌作用, 35%的木糖醇溶液具有抑菌作用。结论:木糖醇可作矫味剂的同时也具有一定抑菌作用。
关键词：木糖醇,抑菌效力,培养基,菌种
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