骨髓基质干细胞

骨髓基质干细胞（精选7篇）

骨髓基质干细胞 第1篇

1 材料与方法

1.1 主要试剂及设备

1.1.1 主要试剂

胰蛋白酶粉剂、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、EDTA粉剂、胰岛素、转铁蛋白、地塞米松、消炎痛、3-异丁酸-1-甲基黄嘌呤(BMX)均购自Sigma公司;流式相关鼠抗人单克隆抗体:CD105-FITC,CD166-PE,CD29-PE,CD34-PE,CD45Cy5-PE,CD14-FITC购自美国Becton Dickinson公司;磷酸盐缓冲液溶液(PBS)、胎牛血清(FBS)购自Gibico公司;NBT/BCIP碱性磷酸酶(Beyotime)、DMEM培养基(Hyclone)、TGF-β1(Peprotech)。

1.1.2 主要仪器

Nikon4500倒置相差显微镜(Nikon公司)、二氧化碳细胞培养孵箱(Harris公司)、流式细胞仪(EFACS Calibur,Becton Dickinson公司)、GL-16低速离心机(珠海Hema公司)、YG-875B超净工作台(苏州医疗设备厂)。

1.2 方法

1.2.1 hBMSCs的分离与培养

骨髓的抽取:健康志愿捐髓者(术前签订知情同意书),在无菌条件下用16号骨穿针于髂前上棘穿刺,缓慢抽取骨髓10m L,并用等体积10%FBS低糖DMEM培养基稀释(内含5 mg肝素钠)。

hBMSCs的原代培养:采用全骨髓培养法。将抽取的骨髓-DMEM混合液1 000 r/min离心10 min,弃上清和脂肪团块,加入10%FBS低糖DMEM培养基20 m L重悬,吹打混匀后接种于培养瓶内,37℃、5%二氧化碳饱和湿度下培养,于第3天进行半量换液,第5天予PBS漂洗并更换培养基,直至细胞长至80%融合。

hBMSCs的传代与扩增:待原代细胞长至80%融合后,弃原培养基,用PBS漂洗2遍,加入适量0.25%胰酶溶液(内含0.02%EDTA)消化细胞,倒置相差显微镜下见胞质回缩脱壁后,立即加入10%FBS低糖DMEM培养基终止消化,并用吸管依序轻轻吹打瓶底,置离心管1 000 r/min离心5 min,去上清加10%FBS低糖DMEM培养基重悬,细胞计数后以6 000细胞/cm2传代,培养方法同前,每2、3天换液,直至细胞长至80%融合后再次传代。

1.2.2 hBMSCs表面标志物的流式细胞术检测

取生长良好的第3代细胞,胰酶消化后,制成单细胞悬液,移入离心管,1 500 r/min离心5 min,收集细胞,再以PBS漂洗3遍,每次离心。重悬细胞沉淀并调整细胞密度至6 000/μL,分别加入CD105-FITC,CD166-PE,CD29-PE,CD34-PE,CD45Cy5-PE,CD14-FITC抗体标记,暗区室温孵育25 min,小鼠IgG1-FITC,IgG1-PE作为阴性对照,PBS洗涤1次,800 r/min离心5 min,加入0.5 m L 1%多聚甲醛固定,4℃过夜,次日上机检测,计数105个细胞。

1.2.3 hBMSCs的体外定向诱导

hBMSCs向成骨细胞诱导分化与鉴定:将第3代hBMSCs接种于6孔板爬片培养,加入成骨的诱导体系,包括:地塞米松10-8mol/L、β-甘油磷酸钠10 mmol/L、抗坏血酸磷酸盐50 mg/L、10%FBS高糖DMEM,每3天换液,3周后进行碱性磷酸酶NBT/BCIP染色和钙结节茜素红染色检测。

hBMSCs向软骨细胞诱导分化与鉴定:将第3代hBMSCs接种于6孔板爬片培养,加入0.5 m L软骨培养体系,包括:10-8g/L TGF-β1、6.25×10-3g/L转铁蛋白、6.25×10-3g/L胰岛素和10-8mol/L地塞米松,每3天换液,3周后进行阿利辛蓝染色。

hBMSCs向脂肪细胞诱导分化与鉴定:将第3代hBMSCs接种于6孔板爬片培养,加入成脂诱导体系:0.5×10-4mol/L BMX、1×10-6mol/L胰岛素、1×10-6mol/L地塞米松、2×10-4mol/L消炎痛、10%FBS高糖DMEM,每3天换液,3周后进行油红O染色。

2 结果

2.1 原代hBMSCs的细胞形态

原代细胞培养3 d换液后仍有圆盘状血细胞滞悬于底层培养基中,在培养瓶底可见到数个成簇生长的贴壁细胞集落,6～9 d散在贴壁细胞增多,形成多个细胞集落随着时间延长,集落不断增多、扩大、互相融合,约12～14 d细胞融合成单层,铺满瓶底,见图1A。

2.2 hBMSCs的传代培养

传代细胞很快贴壁,增殖迅速,呈梭形均匀分布,传代hBMSCs生长较原代hBMSCs生长快,约7d长满瓶底,连续传9代,细胞形态无明显变化,无衰老征象,但9代以后细胞增殖较慢,传代周期延长,见图1B。

A:hBMSCs原代培养14 d(×100);B:hBMSCs传代培养9 d(×100)

2.3 流式细胞仪检测细胞表面抗原结果

P3代细胞CD105,CD166和CD29阳性率分别为:90.52%、95.26%和97.42%。CD34、CD45和CD14阳性率分别为:4.39%,4.33%,3.06%,见图2。

2.4 诱导分化结果

2.4.1 成骨诱导分化结果

hBMSCs成骨诱导分化3周后,细胞胞体变宽,呈多边形,钙结节茜素红染色、碱性磷酸酶酶NBT/BCIP染色为阳性,见图3A、3B。

A:成骨诱导钙结节茜素红染色(×100);B:成骨诱导ALP染色(×100);C:成软骨诱导阿利辛蓝染色(×100);D:成脂肪诱导油红O染色(×100)

2.4.2 成软骨分化结果

hBMSCs成软骨分化3周后,阿利辛蓝染色阳性,见图3C。

2.4.3 成脂肪诱导分化结果

hBMSCs成脂肪诱导分化3周后,细胞胞浆内出现脂肪小滴,油红O染色为阳性,见图3D。

3 讨论

3.1 hBMSCs的分离、纯化与培养

BMSCs是骨髓中除造血干细胞之外的细胞部分,主要来源于中胚层,在骨膜、肌肉、外周血以及结缔组织中均有存在,以骨髓和脐血中含量最为丰富[2]。它具有自我更新及多向分化潜能,可向成骨、软骨、脂肪、成纤维、心肌和神经细胞分化[3,4,5,6]。近年来,随着组织工程的兴起及干细胞治疗的开展,对BMSCs的需求增加。如何快速而经济的获得足够的细胞是目前面临的一大难题,目前的分离方法主要有:流式细胞仪分离法、免疫磁珠法、密度梯度离心法和全骨髓贴壁培养法[7]。其中流式细胞仪分离法对细胞活性影响大,所获得细胞很易在培养24 h后死亡;免疫磁珠法虽然可以得到较纯的BMSCs,但所用仪器及试剂昂贵,不宜推广[8];密度梯度离心法,使用Percoll细胞分离液会使BMSCs在瞬间失去造血干细胞的支持,即刻改变了其原本的生存微环境,不利于其生长、增殖。上述方法都有一定的缺陷,至今仍未找到一种公认的标准方法。针对hBMSCs易于贴壁的特点,笔者采用全骨髓贴壁筛选培养方法,抽取骨髓后直接加入培养液制成细胞悬液,以合适的细胞浓度进行接种培养。随着培养时间延长,造血细胞不断坏死破碎,并因其不贴壁而随换液不断清除,而hBMSCs则黏附于培养皿得以纯化;该法保留造血干细胞和其他各种细胞混合培养,可以维持hBMSCs原始的生存环境,采用3 d后半量换液,5 d后全部换液,让BMSCs从体内到体外有一个渐进的适应过程,更利于其生长、增殖和分化;从形态来看,造血干细胞多呈扁圆形,BMSCs呈细小的长梭形,在离体培养的骨髓中,虽然部分造血细胞也会贴壁,但其增殖缓慢,消化时脱壁速度慢,从速度上,通过消化的方法我们可逐渐将其纯化,一般在第3代基本可达到纯化目的。此法虽被认为相对粗糙,但操作简易,分离到的细胞分化潜能较好。

3.2 hBMSCs生物学特性鉴定

可以从三方面对骨髓基质干细胞进行鉴定:细胞形态和培养特性;细胞标记分子;hBMSCs特征性的表面标志物[9]。hBMSCs是一群具有独特表型的细胞,可以表达多种表面标志物,如粘附分子、生长因子、细胞因子及其受体、整合素等,具有非单一性的特点,其特异性表面标志物尚存争议。通常采用其特征性的表面标志物以及能够多向分化为其它细胞系的功能来鉴定。目前比较公认的鉴定hBMSCs标志是:不表达CD34,CD45,CD14,CD31和flk1等,而表达CD44,CD29,CD105,CD166,CD71等[10]。笔者的流式细胞仪结果与文献报道[11]相符,经过不同的诱导后向成骨、成软骨和成脂肪细胞方向分化,符合间充质干细胞的基本功能特征,为用于组织工程的功能细胞提供了实验基础。

摘要：目的体外分离、纯化培养人骨髓基质干细胞(hBMSCs),对其表面标志物、多向分化特性进行鉴定,为骨组织工程提供理想的种子细胞来源。方法抽取健康成人骨髓,采用全骨髓培养法,多次消化以纯化hBMSCs;应用流式细胞仪对细胞表面标志物进行检测;采用成骨、成软骨和成脂培养基进行三向诱导分化。结果培养的第3代细胞表面抗原检测显示:表达CD105、CD166和CD29,不表达造血和内皮标志CD34、CD45和CD14,在体外分别诱导出其向成骨、成软骨和成脂肪细胞分化。结论hMSCs体外经分离传代培养后细胞成分较为单一,具有多向分化潜能,符合间充质干细胞的基本功能特征。

关键词：骨髓基质干细胞,体外培养,表面抗原,多向分化,鉴定

参考文献

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[3]PITTENGER MF,MACKAY AM,JAISDWAL SC,et al.Multi-lineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Sci-ence,1999,284(5411):143147.

[4]ZHAO ZP,ZHOU JN,LI KH,et al.Multilineage potential of pu-rified murine yolk sac mesenchymal stem cells in vitro[J].Chinese Journal of Modern Medicine,2002,12(18):2527.Chinese

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骨髓基质干细胞 第2篇

含RGD肽基因导入系统介导绿色荧光蛋白基因转染骨髓基质干细胞的瞬时表达检测

目的评价以整合素为靶向的新型非病毒载体系统--含RGD肽基因导入系统K16GRGDSPC(记作K16-RGD)作为基因转染载体的`可行性.方法固相合成法合成K16-RGD,以其为载体与不同比例的增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)混合转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),72 h后用荧光显微镜观察转染效率及瞬时表达情况.结果转染效率与K16-RGD和质粒的比例有关,转染体系中K16-RGD(μg):pEGFP(μg)为3:1时EGFP有最高的表达效率.结论含RGD肽K16-RGD能有效介导外源基因在BMSCs内的转染和表达,为下一步利用K16-RGD作为载体构建载基因仿生基质材料进行骨缺损修复研究奠定了基础.

作 者： 潘海涛 郑启新 郭晓东 刘勇 宋玉林   作者单位： 430022,华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科 刊 名： 国际生物医学工程杂志  ISTIC PKU 英文刊名： INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOMEDICAL ENGINEERING 年，卷(期)： 2006 29(3) 分类号： Q78 Q813.1 关键词： 含RGD肽   绿色荧光蛋白基因   基因转染   骨髓基质干细胞

骨髓基质干细胞 第3篇

1 材料与方法

1.1 实验材料

健康志愿者骨髓;叶酸 (Folate, Sigma公司) , 无钙镁的PBS, 消化液 (0.25%胰酶/0.02%EDTA) 、DMEM培养基、胎牛血清 (FBS) 、1 mmol/L二巯基乙醇 (BME) 、 200 μmol/L 3-叔丁基4-羟基茴香醚 (BHA) 、2%二甲基亚砜 (DMSO) 、PDGF、Percoll、MTT (四唑盐比色剂) 。离心机、倒置荧光显微镜、CO2培养箱、超静工作台、流式细胞仪等。抗体:小鼠抗神经原特异性烯醇化酶 (NSE) 、胶质原纤维酸性蛋白 (GFAP) 单抗 (Sigma公司) 、羊抗小鼠二抗 (北京中山生物制品公司) 。

1.2 MSCs的分离与传代培养

常规无菌条件下从髂后上棘行骨穿抽取肝素化骨髓 4 mL。以密度梯度离心加贴壁培养方法分离, 以含20%胎牛血清DMEM培养基进行原代培养, 置于50 mL培养瓶, 于37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中常规培养。3 d～4 d后首次换液, 后每2 d～3 d换液1次, 换液时可轻轻吹打瓶底以尽量去除未贴壁细胞 (首次换液时除外, 以免影响细胞贴壁) 。每天在倒置显微镜观察细胞形态及生长速度, 待细胞至90%以上融合时准备传代。加入经37 ℃温育的消化液1 mL～2 mL, 37 ℃消化1 min～2 min, 镜下观察细胞体开始回缩后移走消化液, 加完全培养基终止消化。用吸管反复吹打瓶底细胞至完全脱落, 吹打均匀, 按1∶3比例分瓶培养。

1.3 MSCs的体外诱导分化

取第5代的MSCs接种于事先放置有消毒盖玻片的6孔板内培养成单层细胞后进行预诱导, 培养液仍为 DMEM, 分4组, 每组都以1 mmol/L BME作为预诱导液预处理24 h。更换培养液, PBS洗涤3次, 每组分别以DMEM+BHA+DMSO为基础培养并作为对照组, 在此基础上分别加以叶酸4 mg/L、40 mg/L、400 mg/L作为另外3组诱导液处理组, 即叶酸低剂量组、中剂量组、高剂量组, 诱导后30 min至3 d, 观察细胞形态并计数。

1.4 免疫细胞化学鉴定及细胞计数

预制备细胞爬片后取出盖玻片, 用4%多聚甲醛固定30 min, 蒸馏水洗涤, 干燥后加入0.5%H2O2封闭内源性过氧化物酶30 min, PBS洗涤, 5%正常羊血清封闭20 min, 甩去封闭液, 分别加入含抗 NSE、GFAP 单克隆抗体作为第一抗体, 置37 ℃1 h或4 ℃过夜, PBS洗涤3次后, 滴加生物素化山羊抗小鼠/兔IgG, 37 ℃反应20 min, PBS 洗涤3次后, 加入SABC试剂, 37 ℃反应20 min, PBS 洗涤4次。最后用新配制的DAB液在室温反应5 min～30 min, 显微镜下监测其颜色变化, 阴性对照不加一抗。细胞分化率计算公式: (NSE+GFAP) 阳性染色细胞数/细胞总数×100%。

1.5 MTT法检测不同时间段对BMSCs增殖的影响

取培养第7天的细胞, 制成单细胞悬液, 用无血清培养基以104个细胞每一接种96孔培养板中, 分为4组, 每一处理做8个复孔, 每孔150 μL。观察变化, 于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h分别测A值。方法:每孔15 μL MTT, 继续培养4 h, 吸出上清液, 加入150 μL DMSO振荡10 min, 用酶标仪测定490 nm波长A值, 同时设立对照。细胞增殖率计算公式: (实验组A值/对照组A值-1) ×100%。

1.6 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行分析。实验数据用均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示。多组间两两比较采用SNK-q检验。

2 结 果

2.1 MSCs的分离与扩增

用倒置显微镜观察, 接种后24 h后少许细胞开始贴壁, 成对出现的较多, 多为椭圆形, 折光性强, 培养2 d～3 d后, 可见多边形和梭形细胞, 胞体向不同的方向伸出突起, 随着培养时间的延长, 胞体逐渐增大, 8 d以后可见集落生长的细胞群, 传代后第2天细胞即可贴壁生长, 5 d左右即可铺满瓶底, 5代的细胞形态比较均一。

2.2 MSCs诱导分化后的细胞形态变化

预诱导后细胞形态即开始收缩, 叶酸诱导后3 h细胞胞体成圆形, 折光性强, 多级细长的突起, 随着时间的延长突起变的更多更长, 并相互连接交织成网。诱导后5 d神经样细胞增多不明显。

2.3 免疫细胞化学鉴定及分化细胞的计数

诱导后8 h细胞免疫化学显示, 对照组约70%细胞呈阳性染色, GFAP阳性为主, 叶酸低剂量组阳性细胞数与对照组相近, 叶酸中、叶酸高剂量组阳性细胞数占90%, 以NSE为主, 对照组、叶酸低剂量组与叶酸中高剂量组比较差异有统计学意义 (P<0.01) 。详见表1。

2.4 MTT法检测结果

叶酸诱导组的细胞生长状态明显优于对照组。诱导后3 d叶酸诱导组仍保持良好的生长状态, 而对照组细胞有明显的凋亡, 其中中高浓度对细胞的影响差异不显著, 但均优于叶酸低剂量组。详见表2。

3 讨 论

骨髓基质干细胞是中胚层来源的干细胞, 目前报道最多的是成人骨髓的MSCs, 在骨髓中含量很少, 占骨髓单个核细胞的1/106～1/105[9]。Zvaifler等[10,11]研究发现, 外周血脐血脂肪组织可能存在MSCs。传统认为成体内神经细胞数目恒定, 不可再生, 因而神经损伤性疾病或退行性疾病均不可治愈。Azizi等[12]将人的BMSCs分离培养, 并用荧光素标记后植入SD大鼠纹状体, 5 d～72 d后发现20%的BMSCs植入细胞成活, 且未发现有炎症反应和排斥反应, 并发现细胞沿注入部位在脑内逐层迁移。1999年Kopen等[13]将BMSCs注入新生小鼠侧脑室, 12 d后, 可在脑内检测到BMSCs来源的神经胶质细胞和神经元中间丝蛋白的表达。此后, 各国的学者们用B-琉基乙醇、二甲基亚砜和4烃基茴香醚等作为诱导剂, 在体外成功地诱导成年大鼠和人的BMSCs分化神经元和胶质细胞, 诱导后的细胞可表达NSE、NF、巢蛋白 (Nestin) 、神经因子受体。国内很多学者也做了大量关于骨髓基质干细胞向神经样细胞分化的研究, 运用依达拉奉[14]、维甲酸、丹参、银杏叶提取物等诱导体系作主要诱导剂, 成功诱导大鼠的BMSCs分化为神经样细胞。

叶酸因绿叶中含量丰富而得名, 是由蝶啶环、对氨基苯甲酸和谷氨酸组成的一种水溶性化合物, 广泛存在于动植物中, 尤以酵母、肝及绿叶蔬菜中含量较多。人体叶酸需要量为50 μg/d～100 μg/d, 较维生素B12为多。在体内叶酸进入小肠黏膜绒毛膜上皮细胞, 被叶酸还原酶还原为四氢叶酸, 四氢叶酸是嘌呤类核苷酸和胸腺嘧啶核苷酸合成所必需的辅酶, 此两种核苷酸是脱氧核糖核酸 (DNA) 和核糖核酸 (RNA) 组成所不可缺少的物质。临床上患者常因摄入量不足、吸收不良、利用障碍、需要量增加等原因而引起内源性叶酸缺乏, 此时DNA合成障碍, 从而使迅速分裂的造血系统和胃黏膜发生病变, 并可使神经系统损伤。近年来人群流行病学及实验室研究均显示叶酸与神经系统疾病的发生有着密切的关系[15,16,17], 而且针对病因叶酸已被广泛的应用于临床。本研究提示不同剂量的叶酸均能促进MSCs向神经细胞增值分化, 但不同剂量诱导效率和分化细胞类型有差异。由于中枢神经系统的主要功能细胞为神经元细胞, 体外诱导细胞应该以神经元为理想。低剂量叶酸诱导效率与对照组相近, 以胶质细胞为主, 而400 mg/L高剂量叶酸诱导效率和细胞类型与40 mg/L中等剂量的相当, 因此认为40 mg/L中等剂量的叶酸诱导MSCs向神经细胞增值分化最为理想。而叶酸促进MSCs向神经细胞增值分化的具体机制值得进一步研究。

摘要：目的探讨叶酸对骨髓基质干细胞诱导分化为神经细胞的最佳浓度。方法MSCs由正常成年人骨髓经密度梯度离心加贴壁离心获得, 取第5代MSCs以1mmol/L二巯基乙醇 (BME) 预诱导24h后, 用羟基茴香醚 (BHA) 、2%二甲基亚砜 (DMSO) 和3种不同浓度的叶酸诱导分化, 采用免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志神经元特异性烯醇化酶 (NSE) 、胶原纤维酸性蛋白GFAP的表达, MTT (四唑盐比色) 法检测不同时间段对BMSCs增殖的影响。结果不同剂量叶酸组分化为NSE阳性神经元样细胞的百分率都较对照组高 (P<0.01) , 但以40mg/L中等浓度的叶酸神经细胞最多, 且神经元比例高于其他组。结论叶酸诱导BMSCs向神经元分化以40mg/L浓度为最佳。

骨髓基质干细胞 第4篇

1 材料与方法

1.1 实验材料

雌性SD大鼠[中国农科院哈尔滨兽医研究所提供,许可证号:SYXK(黑)2006-032]48只,体重(200±5)g;DMEM/F12细胞培养基(Hyclone公司,美国);胎牛血清(FBS,Hyclone公司,美国);青-链双抗(碧云天,中国);胰蛋白酶(碧云天,中国);Ⅳ型胶原酶(碧云天,中国);阿糖胞苷(Ara-C,辉瑞公司,美国);兔抗鼠单克隆抗体S-100(武汉博士德公司);FITC标记的羊抗兔IgG(武汉博士德公司);兔抗鼠碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)单克隆抗体(武汉博士德公司);兔抗鼠表皮细胞生长因子(EGF)单克隆抗体(武汉博士德公司);聚乳酸-聚羟基乙酸神经导管(PLGA,山东代罡生物材料公司);多导电生理记录仪(ASB240U,成都遨生)。

1.2 实验方法

1.2.1 骨髓基质干细胞的分离培养

取SD大鼠10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉后,浸泡于75%酒精中10 min,无菌条件下取出双侧股骨,剪去两端,将骨髓冲到10 mL离心管中。反复吹打至单细胞悬液,1500 r/min离心5 min,弃上清,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬。采用全贴壁培养法,将细胞接种于培养瓶中,置于含5%CO2的37℃细胞培养箱中培养。培养5 d后,对细胞进行换液,弃去瓶中培养液,加入5 mL含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液继续培养。待细胞铺满瓶底80%后传代。

1.2.2 施万细胞的分离培养

取SD大鼠10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉后,无菌条件下取出双侧坐骨神经,在解剖显微镜下剥离神经外膜,磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后剪成0.5 mm小段,加入0.25%胰蛋白酶和0.03%Ⅳ型胶原酶,37℃消化30 min。吸取上清加入培养液终止消化。重复消化1次,将所得单细胞悬液移入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中。1500 r/min,离心5 min,弃上清,向离心管中加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液5 mL,重悬,移入培养瓶,置于含5%CO2的37℃细胞培养箱中培养。

1.2.3 施万细胞的纯化与检测

SCs的纯化采用差速贴壁离心与Ara-C抑制相结合方法[5],每15分钟变换1次培养瓶方向,45 min后取未贴壁细胞移入新瓶。24 h后加入AraC培养2 d,胰酶消化后移入新瓶,待细胞铺满瓶底80%后传代。取第2代细胞进行爬片,4%多聚甲醛固定后,加入兔抗鼠S-100单克隆抗体(1∶200),4℃过夜,加入FITC标记的羊抗兔IgG二抗(1∶400),孵育30 min后荧光检测。在100倍显微镜下随机选取10个不同视野,计数阳性细胞与总细胞数,计算SCs细胞纯度,公式为:SCs细胞纯度=S-100阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.2.4 实验动物的分组与模型制备

48只雌性SD大鼠随机分为A、B、C、D 4组,每组各12只:A组为BMSCs与SCs联合移植组;B组为单纯BMSCs移植组;C组为单纯SCs移植组;D组仅加入PBS作为阴性对照组。10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉后俯卧位固定于操作台,右下肢常规备皮、消毒,取后外侧肌间隙游离暴露坐骨神经,在坐骨神经中段做一长10 mm神经缺损,PLGA导管连接两侧断端,均插入1 mm,各缝合2针。A组向导管内注入1×105/L浓度的BMSCs和SCs各50μL;B组注入1×105/L的BMSCs100μL;C组注入1×105/L的BMSCs 100μL;D组注入PBS100μL。注射完毕后逐层缝合。

1.3 指标的观察与评定

1.3.1 大体观察

观察术后切口情况,右下肢活动能力、步态变化。于4、8周处死动物后观察损伤神经的修复长度及直径。

1.3.2 坐骨神经功能指数(SFI)的测定

每组术后4、8周分别取6只大鼠,记录双下肢足印2～3对,测量损伤侧足印长度(足跟到足尖距离)(EPL)、正常侧足印长度(NPL)、损伤侧足趾宽度(第1趾到第5趾距离)(ETS)、正常侧足趾宽度(NTS)、损伤侧中间足趾距离(第2趾到第4趾距离)(EITS)、正常侧中间足趾距离(NITS)。根据公式SFI=-38.3(EPL-NPL)/NPL+109.5(ETS-NTS)/NTS+13.3(EITS-NITS)NITS-8.8,计算SFI值,0～-12代表正常功能,-13～-99代表功能部分恢复,-100代表无功能。

1.3.3 神经传导速度(NCV)的测定

4、8周时,每组取SFI测定完毕的大鼠,麻醉后俯卧位固定于操作台上,暴露双侧坐骨神经,游离PLGA导管两侧神经干,应用多导电生理记录仪测定双侧坐骨神经的传导速度,并进行统计学分析。

1.3.4 碱性成纤维生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)的免疫组化检测

NCV测定结束后,对各组大鼠处死,取出双侧坐骨神经,去除导管,石蜡包埋后切片脱蜡,3%H2O2浸泡20 min;加入兔抗大鼠bFGF单克隆抗体和兔抗大鼠EGF单克隆抗体(抗体稀释度1∶200),室温过夜;PBS冲洗后,加入生物素二抗(抗体稀释度1∶400),37℃孵育60min;PBS冲洗后加入新配制DAB显色。各例随机选取6张切片,每张切片随机选取5个高倍视野,应用Image-ProPlus专业图像分析系统测定平均光密度值(AOD),并进行统计学分析。

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 18.0对数据进行分析,正态分布计量资料以均数±标准差表示,多组间比较采用方差分析,两两比较采用SNK-q检验。计数资料以率表示,采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨髓基质干细胞的分离培养

采用全贴壁培养法换液2次后,可去除悬浮的血液细胞,贴壁生长细胞以梭形为主兼有圆形、椭圆形。8 d左右原代细胞聚集呈集落样生长,连续传5代后细胞生长良好,未发生异型性改变。

2.2 施万细胞的培养与检测

坐骨神经提取的细胞经差速贴壁法换瓶后,瓶内可见折光性较好的圆形SCs细胞与胞体较大的成纤维细胞。加入Ara-C后,成纤维细胞基本消失,2 d后SCs开始贴壁生长,发出突起,胞体拉长,呈鱼群样排列。传代后细胞形态未发生改变,经S-100抗体荧光染色后,SCs的纯度为(96.2±2.5)%。

2.3 大体观察

术后各组动物全部存活,B组1只,C组2只大鼠切口出现红肿,其余未见异常。术后全部动物出现右下肢跛行,肌力较正常侧减弱。4周时各组处死6只动物,A组可见坐骨神经已恢复连接,修复部位直径略小于正常;B、C组坐骨神经恢复连接,但修复部位直径明显小于正常;D组仅凭借神经外膜相连。8周时各组处死6只动物,A组可见坐骨神经直径与正常相似且略粗;B、C组的修复效果相似,直径略小于正常;D组修复直径较4周时略增大。

2.4 各组坐骨神经功能指数绝对值比较

术后4周A组SFI绝对值优于B、C、D组,差异有统计学意义(P<0.05);B、C组之间差异无统计学意义(P>0.05);D组作为阴性对照,其坐骨神经功能仍有部分恢复。术后8周时A组SFI绝对值优于B、C、D组,差异有统计学意义(P<0.05);A、B、C组SFI绝对值均小于同组4周时,差异有统计学意义(P<0.05);D组SFI绝对值在2个时间点差异无统计学意义(P>0.05)。说明细胞移植在损伤4周后仍有修复,而单纯导管修复功能无恢复。见表1、图1。

注:与A组比较,*P<0.05;与同组4周比较,▲P<0.05

2.5 神经传导速度测定

各组伤侧NCV均小于正常侧,差异有统计学意义(P<0.05);8周时A组损伤侧NCV优于4周时水平,差异有统计学意义(P<0.05),B、C、D组差异无统计学意义(P>0.05),说明细胞联合移植对恢复神经传导速度的作用更为持久。4周时A组损伤侧NCV大于B、C、D组,差异有统计学意义(P<0.05);B、C组损伤侧NCV比较,差异无统计学意义(P>0.05);B、C组损伤侧NCV均大于D组,差异有统计学意义(P<0.05)。8周A组损伤侧NCV大于B、C、D组,差异有统计学意义(P<0.05);B、C组损伤侧NCV比较,差异无统计学意义(P>0.05);B、C组损伤侧NCV均大于D组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.6 免疫组化检测结果

在4、8周时分别对各组标本进行免疫组化检测,测定bFGF和EGF的表达水平。4周时bFGF测量AOD值,A组高于B组,B组高于C组,C组高于D组,差异均有统计学意义(P<0.05);8周时bFGF测量AOD值A、B、C组差异无统计学意义(P>0.05),但均高于D组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。4周时EGF测量AOD值,A组高于B组,B组高于C组、C组高于D组,差异均有统计学意义(P<0.05);8周时EGF测量AOD值,A、B、C组差异无统计学意义(P>0.05),但均高于D组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

注:与同时段B、C、D组损伤侧比较,*P<0.05;与同时段同组损伤侧比较,▲P<0.05;与同组4周损伤侧比较,△P<0.05;与D组同时段损伤侧比较,﹟P<0.05

注:与同时段B组比较,*P<0.05;与同时段C组比较,▲P<0.05;与同时段D组比较,﹟P<0.05;AOD:平均光密度值

注:与同时段B组比较,*P<0.05;与同时段C组比较,▲P<0.05;与同时段D组比较,﹟P<0.05;AOD:平均光密度值

3 讨论

周围神经损伤发生后如何提高修复神经的功能一直是显微外科面临的难点之一,常见的修复方式包括单纯缝合、自体神经移植、神经导管支架以及干细胞修复等等,单一的方法很难达到满意的效果,给患者的生活带来了极大的困扰[6]。BMSCs作为种子细胞在周围神经修复中都起到了关键作用,而SCs则能够提供丰富的营养因子,促进轴突的再生[7]。目前,体外实验表明,BMSCs与SCs共同培养表现出良好的相容性,并且能互相促进增值、分化[8],但对二者在体内相互作用的报道较少,因此本研究利用PLGA多孔导管作为支架材料,观察BMSCs与SCs联合植入体内对损伤神经的修复效果。

BMSCs在特定的条件下具有分化为神经干细胞,进而分化为神经细胞的能力。神经干细胞能够分泌多种神经营养因子,减轻损伤所致的炎症反应,维持轴突的稳定性,防止轴索反应的扩大。损伤发生后,损伤远端SCs细胞会发生变性,产生大量的EGF和bFGF等因子,为干细胞的分化提供适宜的微环境[9],BMSCs植入体内后,会在这种微环境下分化,使营养因子的水平呈现放大反应,加速轴突再生。同时,BMSCs分化的神经元会发出突起,交织成网,介导神经信号的传导。SCs植入体内后,会产生黏层素、Ⅳ型胶原等构成基底膜的主要成分,沿支架内壁形成神经外膜,为轴突再生提供生物支架,弥补体内原有SCs分泌的不足[10]。同时移植的SCs也能够分泌营养因子,加速BMSCs的分化作用[11]。

SFI的结果可以看出,联合移植对大鼠坐骨神经功能的恢复作用更为突出,而单细胞移植则没有差别,说明了BMSCs与SCs的移植修复作用相当,都是为轴突的再生提供了营养的支持[12]。值得注意的是,单纯导管修复大鼠仍有部分功能恢复,说明单纯应用PLGA支架材料对长距离周围神经缺损具有一定的修复作用,其可能机制为PLGA支架限制了自身SCs分泌的营养因子外流,在导管中浓聚,促进了轴突的重连。NCV测定结果与SFI基本一致,但在4周后,联合移植大鼠的NCV仍有提高,而单纯移植则不显著,说明了细胞联合移植的修复作用更为持久,这可能与BMSCs分化产生的神经元传导电活动有关,而单纯BMSCs移植由于缺乏营养因子的支持,分化的神经元比例较少。对所用损伤侧NCV可以看出,无论是那种移植方式,其NCV都不及正常侧的1/2,这也是周围损伤修复效果不理想的体现。对于无BMSCs大鼠,没有分化来源的神经元介导信号传递,仅凭借SCs产生的营养因子不能够满足损伤近端轴突的长距离生长;对于含有BMSCs大鼠,其分化产生的胶质细胞可能会阻碍神经信号的传递,两种原因都可能导致NCV的减慢。

EGF和bFGF是促进轴突生长的重要神经营养因子[13],研究表明,二者联合作用的效果要明显强于单独应用,且二者联合应用具有诱导BMSCs向神经元分化的作用[14]。本实验检测EGF和bFGF的表达,可见短期内(4周)联合移植组营养因子的表达水平更高,BMSCs所分泌的营养因子水平高于SCs,而在长期(8周)则无明显差别,可能是与随着时间的进展,细胞分化且营养不足有关。但由于条件限制,检测尚存在不足,如果对体内的全部营养因子进行蛋白组学的鉴定,则可全面分析细胞移植对神经再生的影响。

骨髓基质干细胞 第5篇

关键词：超顺磁性纳米铁颗粒(SPIO),骨髓间充质干细胞,普鲁士蓝染色

用干细胞移植治疗疾病是当今医学研究的热点之一[1,2],但移植后如何从受体辨别供体细胞,并观察其在活体内的生存迁徙情况,一直是困扰其临床应用的瓶颈之一[3]。超顺磁性纳米铁粒子(superparamagnetic iron nanoparticle,SPIO)可作为磁共振成像分子探针标记骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)[3],从而能够检测活体内细胞的迁徙、代谢和生物学行为。本实验以超顺磁性纳米铁粒子标记大鼠BMSCs,检测其对细胞生物学特性的影响并探讨不同浓度SPIO标记大鼠BMSCs的生物学特性和生命状态,为BMSCs的活体内示踪研究提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以4周龄雌性SD大鼠(体重约120 g,由第四军医大学动物中心提供)为实验动物,主要试剂:DMEM/F12培养基、复合胶原酶NB4、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶、纳米铁(由哈尔滨医科大学附属第四医院医学影像中心惠赠)、亚铁氰化钾、盐酸。主要仪器:倒置相差显微镜、JEN-M1220型透射电镜。

1.2 SD大鼠BMSCs的分离培养与鉴定

取大鼠双侧胫骨及股骨,用无血清DMEM培养基反复冲洗骨髓腔,将冲洗获得的细胞悬液离心,取细胞沉淀,加入适量含10%胎牛血清的低糖型DMEM/F12培养基,置于5%CO2、37°C培养箱中培养。多次换液传代使BMSCs纯化,取第4代细胞进行爬片,4%多聚甲醛固定后行HE染色,光镜下观察。取培养的第5代细胞,吹打为单细胞悬液接种,进行细胞爬片。磷酸缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)洗去培养液,4%多聚甲醛固定15 min,以封闭液(PBS含1%牛血清白蛋白,0.1%Triton)室温下封闭30 min,加入兔抗小鼠CD45,CD105,CD166,CD90抗体4°C过夜后室温30 min,PBS洗涤3次,每遍5 min,然后以CY3联抗兔抗体室温下避光孵育1 h,DAPI室温(1∶500)染核5 min,PBS洗涤3次,每遍5 min,加荧光保护剂,激光共聚焦观察CD45、CD105、CD166、CD90的表达。

1.3 SPIO标记BMSCs的制备与鉴定

1.3.1 SPIO-BMSCs制备

取对数生长期的BMSCs,反复吹打成单细胞悬液。以5×105/mL的密度接种到含有不同浓度SPIO的20%胎牛血清DMEM/F12培养基中孵育。SPIO浓度分别为15、25、50 mg/L,5%CO2、37°C培养48 h。不含SPIO的20%胎牛血清培养基为对照。

1.3.2 SPIO-BMSCs鉴定

1.3.2.1普鲁士蓝染色

用不同浓度SPIO标记的BMSCs制备细胞爬片,4%多聚甲醛固定15 min,PBS洗3次,放入Pearl液(含2%亚铁氰化钾和6%盐酸溶液)中常温孵育30 min,蒸馏水洗涤,显微镜下观察。以未标记细胞作对照。

1.3.2.2透射电镜检查

标记后BMSCs经0.25%胰蛋白酶消化,1500 r/min离心10 min后弃上清液,向细胞沉淀中加入2.5%戊二醛液固定30 min,再用1%锇酸固定30 min,0.5%醋酸铀4°C染色固定过夜,梯度乙醇脱水,EP812包埋。超薄切片,醋酸铀复染,透射电镜观察。

1.4 SPIO-BMSCs的生物学特性检测

1.4.1 SPIO-BMSCs的存活

分别将15、25、50 mg/L浓度SPIO标记培养的第4代BMSCs单细胞悬液与台蓝染色液以9∶1的比例混匀,静置3 min,光镜下计数,死细胞为蓝色,活细胞不着色,计数200个细胞,计算活细胞百分比。设未标记SPIO的细胞对照组。

1.4.2 SPIO-BMSCs增殖活性

用MTT法绘制生长曲线,将各浓度的SPIO标记前后的细胞悬液接种于96孔板,每孔200μL,设5个复孔。分别于第1、3、5、7 d取5孔,加入MTT液,在5%CO2、37°C培养4 h后取出,小心吸弃孔内培养上清,每孔加入150μL DMSO。振荡10 min,用酶标仪在490 nm处侧出吸光度A值。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行处理。计量资料数据以均数±标准差(±s)表示,两组间均数比较采用方差分析,两两比较用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞生长情况

原代细胞48 h半换液,见大量悬浮细胞,在瓶底可见单个细胞贴壁生长,多为短多角形。个别细胞伪足伸长,4 d全量换液,PBS漂洗,去除大量漂浮的细胞,可见分散的BMSCs成簇生长为集落状,细胞逐渐转变为长梭形,纺锤状,胞核为圆形或椭圆形,胞浆内可见较多的颗粒(图1a)。10 d左右细胞大部分融合,达90%以上,细胞形态均匀,长梭形,排列紧密,呈旋涡状,有一定的方向性。传代后,细胞形态类似纤维状,排列更加整齐(图1b)。

2.2 BMSCs的免疫荧光鉴定

BMSCs经免疫荧光染色,绝大多数细胞呈CD105、CD166、CD90(间质干细胞特征性标志物)阳性,CD45呈阴性。见图2。

2.3 SPIO-BMSCs标记鉴定

2.3.1 普鲁士蓝铁染色

普鲁士蓝染色见细胞染色阳性率>99%,表现为细胞内有大量蓝染颗粒,部分聚集成团,颗粒分布以核周和靠近细胞膜处较为明显(图3)。

2.3.2 透射电镜检查

透射电镜观察标记的细胞胞质内见高电子密度颗粒聚集,主要位于各级溶酶体内(图4)。

2.4 SPIO-BMSCs活性

2.4.1 台蓝染色SPIO-BMSCs活细胞计数

实验组1的SPIO浓度为15 mg/L时,活细胞比率与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),但在实验组2和实验组3,当SPIO浓度为25、50 mg/L时活细胞比率有所降低(P<0.05)。见表1。

2.4.2 细胞增殖活性检测

MTT结果显示,SPIO的浓度为15 mg/L时对细胞增殖无明显影响(P>0.05),而当SPIO的浓度为25、50 mg/L时,细胞增殖受到明显抑制(P<0.05)。见图4。

注:与对照组比较,*P<0.05

3 讨论

骨髓间充质干细胞在体外特定的诱导条件下或体内特定环境下可分化为骨、软骨、脂肪、肌肉、骨髓基质、肌腱及韧带等组织[4]。BMSCs具有定向迁移至损伤部位进行增值、分化、并修复损伤组织的能力[5,6,7]。骨髓间充质干细胞取材容易,对机体损伤小,且体外培养简单,细胞扩增速度快,由于自体移植无明显的免疫排斥反应,也不涉及伦理道德问题,具有良好的临床应用前景,目前在组织工程、基因工程等研究中成为理想的种子细胞,在临床疾病的治疗过程中,对白血病、神经损伤、癌症的治疗具有很高的医疗价值。

骨髓基质干细胞 第6篇

1 材料与方法

1. 1实验动物及分组选取6 周龄清洁级Wistar大鼠50 只, 随机分为5 组, 分别为正常对照组、单纯损伤组、移植后2 周组、移植后4 周组、移植后6 周组, 每组10 只。其中, 单纯损伤组和3 个移植组的大鼠均复制为中度TBI模型。

1. 2 方法

1.2.1复制大鼠中度TBI模型单纯损伤组和3个移植组大鼠均采用改进的Feeney自由落体法复制脑损伤模型[2], 在大鼠矢状线左侧做1骨窗, 用重40 g的砝码从20 cm高处撞击位于大鼠硬脑膜上的撞杆, 致大鼠脑组织发生中度脑挫裂伤。取大鼠脑组织, 灌注固定, 行苏木精-伊红haematoxylin/eosin, HE) 染色, 确定损伤程度。

1.2.2 BMSCs的体外培养及鉴定无菌条件下分离Wistar大鼠双侧股骨及胫骨, 获得原代细胞, 进行纯化和扩增, 得到第3代BMSCs, 进行CD44免疫组化染色。

1.2.3大鼠BMSCs慢病毒转染GFP基因后原位移植将第3代BMSCs进行慢病毒转染, 培养24 h后用荧光显微镜观察BMSCs的转染情况。将携带GFP的BMSCs以均分三点的方式注射于脑损伤区。

1. 2. 4 放射形迷宫测试[3]放射形迷宫为木制, 参照文献自制。动物在禁水48 h后开始做放射形迷宫测试。测试8 次/d, 每两次间隔15 min, 连续测试4 d。比较各组平均觅水时间、错误次数和重复次数。

1. 2. 5大鼠脑组织免疫荧光染色分别将移植后2 周组、移植后4 周组、移植后6 周组的大鼠在移植后相应时间点麻醉, 进行灌注、固定、取材、切片, 进行免疫荧光染色, 在荧光显微镜下, 每张切片随机选择5 个视野进行细胞计数并观察细胞分化情况。分别检测神经元的标志性蛋白—神经元特异性烯醇化酶 ( neuron - specific enolase, NSE) 和胶质细胞特异性蛋白—神经胶质纤维酸性蛋白 ( glial fibrillary acidic protein, GFAP) 以及微管相关蛋白2的表达情况。

1. 2. 6 统计学处理应用SPSS 13. 0 软件包完成统计学分析, 计量资料以均数 ± 标准差表示, 多组比较采用方差分析, 以P < 0. 05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 损伤后脑组织病理学改变将损伤后的脑组织切片进行HE染色, 显示为中度损伤。损伤早期, 挫伤灶周围神经元可见细胞肿胀、变性、溶解、坏死, 周围神经元的数量明显减少; 损伤晚期, 神经元核皱缩、裂解, 出现坏死神经元较前增多。见图1。

2. 2 BMSCs的培养、传代及CD44 染色用倒置显微镜观察, 接种后4 h有少量细胞开始贴壁, 呈圆形或三角形, 2 ~ 3 d时贴壁细胞由圆形向长梭形生长, 并可见细胞集落形成。随着培养时间进一步延长, 细胞体积逐渐增大, 细胞核变大。经过第1、第2 次传代后, 细胞形态趋于一致, 贴壁细胞活力增强, 生长较前迅速。传3 代后, 细胞多数呈长梭形, 见图2。BMSCs传代至第三代将细胞进行CD44 免疫组化染色发现CD44 表达阳性, 为胞浆着色, 见图3。

2.3 GFP转染BMSCs及其移植后在脑内的存活情况慢病毒载体介导GFP转染BMSCs 48 h后在荧光显微镜下可以观察到携带GFP基因的慢病毒发出较强的绿色荧光, 提示GFP基因已成功转染到BMSCs内并在细胞内高效稳定表达, 见图4。分别做移植后2周、4周、6周GFP-BMSCs切片, 荧光显微镜下观察, 脑损伤处GFP标记的细胞呈绿色荧光, 移植的细胞散在位于损伤灶内, 细) 胞存活, 见图5。

2. 4 放射形迷宫觅水实验

2. 4. 1 觅水时间比较正常对照组所需时间最短, 单纯损伤组所需时间大于正常对照组和移植后各组 ( P <0.05) , 其中移植后6 周组觅水时间分别与移植后2 周组及移植后4周组比较, 差异均具有统计学意义 ( P <0.05) 。

2. 4. 2错误次数比较单纯损伤组错误次数大于对照组和移植后各组 ( P < 0. 05) , 正常对照组错误次数最少, 其中移植后6 周组错误次数分别与移植后2 周组及移植后4 周组分别比较, 差异均具有统计学意义 ( P <0. 05) 。

2. 4. 3重复次数比较单纯损伤组重复次数大于其它各组 ( P < 0. 05) , 正常对照组重复次数最少, 其中移植后6 周组重复次数分别与移植后2 周组和移植后4 周组比较, 差异均具有统计学意义 ( P < 0. 05) 。见表1。

2. 5植入BMSCs的体内分化结果原位移植GFP -BMSCs在2 周、4 周、6 周后, 取片后在荧光显微镜下观察, 脑损伤处GFP标记的细胞呈绿色荧光, 移植的细胞散在位于损伤灶内, 细胞存活。免疫荧光染色显示BMSCs分别表达NSE, GFAP以及微管相关蛋白2。

3 讨论

BMSCs在特定条件下, 可跨胚层向神经细胞分化[4]。BMSCs在体内外可稳定表达外源性目的基因, 转染目的基因后移植于脑损伤模型, 既可表达目的基因又可分化为神经样细胞。利用BMSCs贴壁的特性, 经过数次换液和传代后, 去掉血细胞使其得到纯化。利用BMSCs的多向分化和自我更新能力、多潜能等特性, 参与组织细胞的替代及修复, 同时也不存在伦理争议和免疫排斥问题。慢病毒载体由人类免疫缺陷病毒改造而来, 转染后大鼠BMSCs的生物学特性和转染前一致[5]。本实验发现, 将GFP标记的细胞植入损伤区脑组织后, 在移植6 周内的切片中均能观察到有表达GFP的细胞存在, 说明移植细胞能够在损伤区域内存活。

本实验免疫荧光染色表明BMSCs分别表达神经元的标志性蛋白NSE和胶质细胞特异性蛋白GFAP以及微管相关蛋白2, 说明BMSCs在脑内分化成为神经元和神经胶质细胞。放射形迷宫觅水实验证明, 移植后2 周、4周及6 周, 远期行为学结果均有所改善, 其中, 以移植后6 周神经功能恢复最好。

综上所述, BMSCs移植能促进TBI所造成的神经功能的恢复, 改善远期行为学表现, 其机制可能与BMSCs能分化为神经元和神经胶质细胞有关。

参考文献

[1]杜杰, 高小青, 涂江义, 等.绿色荧光蛋白作为骨髓间充质干细胞示踪标记物在脑出血脑内的表达[J].重庆医学, 2011, 40 (14) :1364-1366.

[2]Hartyrink KK, Putter H, Klein Kranenbarg E, et al.Value of palliative reason in gastric cancer[J].br J Surg, 2002, 89 (11) :1438.

[3]Balduini W, De Angelis V, Mazzoni E, et al.Simvastatin protects against long-lasting behavioral and morphological consequences of neonatal hypoxi/ischemic brain injury[J].Stroke, 2001, 32 (9) :2185-2191.

[4]林欣, 只达石, 张文治, 等.骨髓基质细胞和神经干细胞体外共培养的实验[J].天津医药, 2011, 39 (3) :247-249.

骨髓基质干细胞 第7篇

淫羊藿次苷II和淫羊藿素(ICT)是ICA的主要体内代谢产物。我们[3]已经证实淫羊藿次苷II的成骨效应。Wang等[4]证实ICT能明显促进成骨细胞的增殖和分化。而ICT对大鼠骨髓基质细胞(r BMSCs)的增殖与成骨性分化的影响尚缺乏研究,我们通过体外实验进行了初步探索。

1 材料与方法

1.1 主要材料

SD大鼠(雄性,体重120~150 g)由上海交大医学院动物实验中心提供;ICT(图1)购自上海同田生物技术股份有限公司;低糖DMEM、胎牛血清、双抗均购自Gibco公司;cck-8试剂盒为美国signalway公司(CP002-500,SAB,USA);ALP试剂盒为美国Bio Assay Systems;成脂、成骨诱导液购自赛业(广州)生物科技有限公司。

1.2 r BMSCs提取、培养与鉴定

1.2.1 r BMSCs的提取、培养

颈椎脱臼法处死SD大鼠,分离股骨和胫骨,冲洗骨髓腔。收集骨髓冲洗液,离心弃上清,重悬,接种。于37℃、5%CO2培养箱中培养。3 d后半量换液,以后每隔3 d换液。原代培养至第10~12天,待细胞达到80%~90%融合时用0.25%Trypsin-EDTA消化2 min后传代。

1.2.2 r BMSCs多向分化鉴定

1.2.2. 1 r BMSCs成骨诱导

取P4代r BMSCs,以3×105/ml的密度接种于预先用明胶包被过的6孔板,细胞融合度达到80%,即分组①阴性对照(negative control,NC)组:加完全培养基(complete medium,CM),即含1%双抗、10%胎牛血清的低糖DMEM;②成骨诱导组:加成骨诱导液。3 d换液1次。21 d后茜素红(AR)染色。

1.2.2. 2 r BMSCs成脂诱导

取P4代r BMSCs,以2×105/ml接种于6孔板,细胞融合度达到80%,即分组①阴性对照(NC)组:CM;②成脂诱导组:加成脂诱导液。待细胞达到100%的融合后,按照上述分组并相应加液,3 d换液1次。19 d后油红染色。

1.3 ICT对r BMSCs增殖的影响

取P4代r BMSCs,以3 000个细胞/孔种植于96孔板。接种后24 h,r BMSCs贴壁后更换为不含胎牛血清的DMEM行同步化处理。继续培养24 h,测零点吸光度(absorbance,A)值。换含10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L的ICT完全培养液培养,每种浓度平行做6个复孔,对照组为完全培养基。培养2、4、6d后测450 nm处的A值。加药后第2、4、6 d所测得的各孔A值÷相对应孔的零点A值所得的r BMSCs增殖倍数作统计学处理。

1.4 不同浓度ICT对r BMSCs成骨性分化的影响

1.4.1 ICT对r BMSCs的成骨分化的ALP活性测定

将P4代r BMSCs以2×105/孔接种至6孔板,细胞贴壁后分别加入含10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/LICT的培养基2 ml,对照组加入等量CM。分别于培养后3、6、9 d收样。按照碱性磷酸酶试剂盒说明收样后测405 nm处的A值并根据公式计算ALP活性(单位:U/L)。所得ALP活性数据作统计学处理。

1.4.2 测定钙化结节的形成

根据CCK-8及ALP检测结果,选取10-9mol/L ICT处理r BMSCs。取P4代r BMSCs,以3×105/ml的密度接种于6孔板,细胞融合度达到80%,即分为①阴性对照(negative control,NC)组;②阳性对照(positive control)组:成骨诱导液(osteogenic medium,OM);③药物处理组:10-9mol/L ICT。按照上述分组加入培养基,3 d换液1次,25 d后AR染色。

1.5 统计学处理

所有实验均至少重复3次,得到类似结果。采用SPSS 19.0统计软件,实验数据用±s表示,各实验组均数比较采用单因素方差分析检验,P<0.05时,差异有显著性意义,P<0.01时,差异有非常显著性意义。

2 结果

2.1 r BMSCs的培养与鉴定

2.1.1 r BMSCs形态学观察

细胞接种后3 d内,红细胞及不规则形状的细胞较多,随着换液逐渐减少。贴壁生长的多角形、梭形细胞增多。随着低浓度胰酶短时间(2 min)消化传代,细胞呈梭形贴壁生长(图2)。

2.1.2 r BMSCs多向分化鉴定

2.1.2. 1 r BMSCs成骨诱导

r BMSCs成骨性诱导处理后细胞开始融合、聚集,出现较多钙化结节,21 d进行AR染色,鉴定为钙化结节形成(图3A,B)。

2.1.2. 2 r BMSCs成脂诱导

与阴性对照组相比,r BMSCs成脂诱导油红染色后见脂滴形成(图3C,D)。

2.2 ICT对r BMSCs增殖的影响

ICT没有促进r BMSCs增殖,10-8~10-5mol/L ICT明显抑制了r BMSCs的增殖(P<0.01)(图4)。

2.3 不同浓度ICT对r BMSCs成骨性分化的影响

2.3.1 ICT对r BMSCs的成骨分化的ALP活性测定

10-9~10-5mol/L ICT组均增加r BMSCs的ALP活性,各浓度组与NC组比较,具有统计学意义(图5)。

2.3.2 测定钙化结节的形成

与NC组比较,药物处理组AR染色有钙结节形成(图6)。

(A:×50,B:×100,C:×200)(A:×50,B:×100,C:×200)

A、B:成骨诱导(AR染色);C、D:成脂诱导(油红O染色);A、C:对照组;B、D:诱导组A and B:Osteogenic induction(AR staining);C and D:Adipogenic induction(Oil red O staining);A and C:Control group;B and D:Induction group

3 讨论

骨髓基质细胞(bone marrow stromal cell,BMSCs)具有多向分化的潜能及自我更新的能力而成为骨组织工程中较为有前景的种子细胞之一,但BMSC仅占骨髓细胞的0.01%[5]。骨髓贴壁细胞中除了BMSCs,还混有如成纤维细胞等其他各种基质细胞,要获得纯化的BMSCs克隆比较困难[6]。在实验中,我们用0.25%的胰酶消化2 min,而巨噬细胞、单核细胞、造血细胞等贴壁能力较强仍贴附于培养皿底,2 min消化下来的细胞进行传代培养,从而使BMSCs得到纯化。

尽管国际细胞治疗协会确定了人BMSCs的鉴定标准[7],但人以外的其他种属BMSCs鉴定标准仍有待探索。目前,确定一群细胞是否是间充质干细胞只能依据细胞形态、表型特征、多向分化特性等多种细胞生物学指标[8]。我们分离培养的r BMSCs呈贴壁生长、梭形,典型的成纤维细胞样形态,经过成骨、成脂等诱导,可见到钙结节、脂滴形成。说明我们分离培养的r BMSCs具有干细胞的特性,能向成骨、成脂肪分化,能用作骨组织工程实验研究的种子细胞。

A:对照组;B:10-9mol/L ICT组A:Control group;B:10-9mol/L ICT group

中药对r BMSCs的作用需要探究一个合适浓度。在本次实验条件下,10-8~10-5mol/L ICT明显抑制了r BMSCs的增殖,可能与其促进了r BMSCs的成骨分化有关。由于在细胞的增殖和分化过程中,增殖和分化往往是此消彼长[9,10]。

ALP为成骨细胞钙盐沉积过程所必需,是参与骨代谢的重要成分,也是最常用的骨形成的生物化学标记[11]。是启动矿化的必备条件[12]。如果ALP活性升高,则说明BMSCs向成骨细胞分化[13]。在我们的实验条件下,各ICT浓度组ALP活性均明显高于对照组。

矿化结节的形成是成骨细胞独特的标志。我们用10-9mol/L ICT处理r BMSCs 21 d后进行AR染色,r BMSCs呈现聚集样生长,钙结节数显著多于对照组。这与成骨分化早期的ALP检测结果相一致。ALP检测及AR染色结果证明,说明ICT以剂量依赖的方式促进了r BMSCs的成骨分化。文献[14]报道,ICT具有比ICA更强的成骨效应,但Yao等[15]认为ICT仅在成骨诱导条件下才具有成骨效应。鉴于ICT是否具有成骨效应尚存在争论,需要我们进一步通过检测成骨/成血管相关蛋白、基因的表达来证实。

摘要：目的:研究淫羊藿素(ICT)对体外培养SD大鼠骨髓基质细胞(rBMSCs)增殖与成骨分化的影响。方法:体外分离培养rBMSCs,传代至第4代作多向分化鉴定。分别以10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L ICT刺激rBMSCs后3、6、9 d,分别用cck-8及碱性磷酸酶ALP试剂盒检测rBMSCs的增殖及ALP活性;10-9mol/L ICT处理r BMSCs后21 d作茜素红(AR)染色以判断钙结节的形成。结果:原代培养的r BMSCs贴壁生长、呈梭形,能多向分化;ICT明显抑制了r BMSCs的增殖;但增高其ALP活性、钙结节形成。结论:ICT以剂量依赖方式抑制rBMSCs的增殖但促进其分化和矿化。