酶联免疫技术范文

酶联免疫技术范文（精选11篇）

酶联免疫技术 第1篇

兽用抗菌素在动物体内残留积累, 人食用后可引发过敏反应 (变态反应) 和中毒现象, 或使机体产生耐药性。过量使用抗菌素会使敏感菌产生耐药性, 使药效下降。药物残留还有致畸作用、致突变作用、致癌作用和激素作用。兽药及其代谢产物通过粪便、尿等进入环境, 经动植物富集, 进入食物链, 也危害人类健康。曾给我国对外贸易造成严重损失的氯霉素过去在世界范围内广泛用于动物养殖业中。人们通过大量的研究发现氯霉素对骨髓造血机能有抑制作用, 可引起血小板减少性紫殿、粒细胞缺乏症、再生障碍性贫血、溶血症等, 此外还对早产儿和新生儿有毒害作用, 引发胃肠道症状、口部症状, 引起视神经炎、视力障碍、多发性神经炎、神经性耳聋以及严重失眠。有时发生中毒性精神病, 主要表现为幻视、幻听、定向力丧失、精神失常等。

2 食品中药物残留检测现状

现今, 在畜禽水产养殖业中, 抗生素使用非常普遍。除上面提到的氯霉素外, 还有硝基呋喃, 二甲基咪唑, 青霉素, 磺胺药, 喹诺酮, 四环素等等。这些药物在动物源食品中残留, 严重威胁人们的健康。中国政府近几年开始高度重视食品安全和药物残留, 先后颁布了许多关于食品安全的法律, 严禁在动物源食品中使用某些兽药, 又详细规定了其他药物的合理使用方法, 并据此规定了兽药的检验要求。除此之外, 食品中的药物问题还对我国畜禽、水产品、农副产品的外贸出口造成严重影响。所有这些都为与食品相关的检验试剂和手段的产业化提供了机会。

我国加入世贸组织后, 动物源食品出口面临严峻挑战。国外技术壁垒高筑, 出口企业竞争日趋激烈。美国、欧盟是我国出口的主要市场, 也是壁垒高筑的市场。欧美和日本利用他们拥有的先进的检测技术, 人为地设置绿色壁垒, 保护本国的民族工业的利益。先进的检测技术成为这些国家在国际贸易中进行不公平竞争的手段。因此, 发展高灵敏度的食品检测手段对国家经济发展具有战略意义。

如前所述, 食品中药物残留涉及的领域很广。包括兽药, 抗生素, 兴奋剂, 激素, 农药, 农产品霉菌, 食品病菌等方面。随着人们日益关注食品安全和健康, 食品相关的各种法律法规正在变得日益严厉。国家药品管理局和农业部制定了包括禁用和停药期规定的各种用于畜禽水产业的药物的规定。这使得食品检测的领域的市场迅速扩大。在中国各地区级以上的机构已经设立了相关的检验检疫机构。不仅进出口食品需要检测, 国内销售的各种食品也已开始做各种检测。这个领域的市场规模在10亿人民币左右。

酶联免疫检测技术, 就是通过合成待检测药物或残留物的抗原, 制备抗体, 进而开发出酶联免疫检测试剂盒, 用于上述有害物质的监督和管理。

3 相关技术

3.1 合成有效的完全抗原

几乎所有的兽药和农药都是小分子有机化合物, 有抗原性但不具有免疫原性, 称之为半抗原。因此, 为了制备抗体, 首先必须合成相应的完全抗原。完全抗原的合成有多种方法可供选择, 取决于半抗原的化学结构和化学性质。最常用的方法有6种:重氮化法, Mannich缩合法, NHS酯法, NHS Ester-Maleimide法, 戊二醛法, 碳二亚胺法。这六种偶联法均可用于完全抗原的制备。高质量的抗体取决于高质量的抗原。而高质量的抗原则取决于诸多因素包括选用的载体蛋白, 偶联试剂的种类和长度, 采用的偶联方法, 偶联反应的条件等等。可以说, 技术含量最高的部分就在于通过大量实验摸索, 寻找出一个制备高质量抗原的路线和方法。

3.2 开发酶联检测试剂盒

有了高质量的抗体, 开发何种酶联检测试剂盒取决于市场调查的结果。

ELISA酶标免疫反应基本的思路是将抗体或抗原固定在酶标板上, 然后同样品中或标准中的相应抗原或抗体进行免疫反应。杂质或不反应的物质通过洗涤除去。为了标识, 加入用酶联结的二抗。再通过洗涤以除去杂质或不反应的物质。通过加入酶催化氧化显色来确定反应的阴阳, 得出结论。

单位:山东大学科技开发部

地址:山东济南山大南路27号

邮编:250100

酶联免疫技术 第2篇

重金属残留的酶联免疫吸附检测技术研究进展

重金属残留是当前重点关注的难降解持久性污染物,建立重金属的现场速测方法是重金属残留含量分析中急需解决的研究内容.酶联免疫吸附法是将免疫学技术应用于重金属残留含量速测的新技术,其对于提升重金属残留含量检测的.技术水平具有重要意义.本文对检测重金属残留的酶联免疫吸附法进行了文献整理,对近期重金属残留酶联免疫吸附检测技术的研究进展进行了一定的阐述,以期为相关研究工作提供一定参考.

作 者：车晓青 郭明 Che Xiao-qing Guo Ming  作者单位：浙江林学院理学院化学系,浙江临安,311300 刊 名：福建分析测试 英文刊名：FUJIAN ANALYSIS & TESTING 年，卷(期)： 18(4) 分类号：Q55 关键词：重金属   酶联免疫吸附法   半抗原   抗体  

酶联免疫技术 第3篇

[关键词] 酶联免疫吸附实验；HIV抗体；影响因素

[中图分类号] R446.61 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2012）02-0076-02

The impact factors of enzyme-linked immunosorbent assay in detection of HIV antibodies

BI Xiuxin

International Travel Health Care Center of Dandong in Liaoning Province, Dandong 118000, China

[Abstract] By analysis of all relevant factors in pre-test, during test and post-test of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in detection of HIV antibodies, to explore the various impact factors on the results, in order to find a solution and strengthen the quality control management, to ensure accuracy and precision of the test results.

[Key words] ELISA; HIV antibody; Impact factors

酶联免疫吸附实验因其操作简单、灵敏度高、特异性好、价格低廉等特点成为HIV抗体初筛实验的常用方法。优质的试剂、良好的仪器、正确的操作和高素质的技术人员是保证检测结果准确可靠的必要条件。由于ELISA法检测结果受很多因素影响，其中任何一项因素都可造成HIV抗体结果假阴性和假阳性结果的发生。因此必须加强HIV抗体初筛实验室的全面质量控制，保证其结果的准确可靠。笔者从事多年的HIV抗体检测工作，现将影响因素分析如下。

1 检测前

1.1 试剂

1.1.1 试剂的选择 优质的HIV抗体试剂是结果质量的基础。试剂要从灵敏度、特异性、精密度、稳定性、简便性、安全性和经济性做出全面的评价并选择好的试剂，根据实验室要求选择灵敏度高（精密度高，CV值＜15%）、特异性好的试剂。试剂的选择很关键，通过厂家了解试剂包被物的组成，如原料来源（基因组成或合成多肽）、片段组成（按比例组成或化合组成）、片段长短等来判断抗原、抗体包被的完整性和特异性。根据试剂批号检定报告了解其质量水平和试剂的优劣，还可以室间质评报告中对试剂的评价结果来客观评价、选择适合实验室的试剂。要选择和订购长效批号的试剂，避免试剂批号改变而重新建立质量控制体系[1]。

1.1.2 试剂的储存 试剂应储存在2～8℃冰箱中，力求温度恒定，并防止阳光照射。试剂盒中有3个主要的试剂，即免疫吸附剂、酶结合物和底物。酶结合物具有生物活性，保存不当，极易失活；底物容易被氧化，产生颜色。因此，必须加强试剂的储存管理，防止试剂失活和氧化。

1.2 标本

血清是最常用的标本。酶联免疫吸附实验中标本的质量也是影响结果的关键因素之一，标本的干扰物质容易引起假阳性或假阴性的结果。干扰分为外源性和内源性。外源性干扰：细菌污染、溶血、凝固不全、反复冻融和标本相互污染等；标本放置4℃冰箱冷藏一般不超过5 d，如果保存过久，其中的蛋白质可能发生聚合，可使本底加深；冻结的标本要融化后充分混匀，为防止蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分轻轻混匀，避免产生气泡；浑浊或有沉淀的样本应先离心澄清后再检测；防止反复冻融，引起效价降低。内源性干扰：一般包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异性免疫球蛋白、异嗜性抗体及某些自身抗体等，避免内源性干扰因素主要通过选择合适的试剂。①标本溶血时释放大量具有过氧化物酶活性的物质，增加了非特异显色，干扰测定结果[2]；②标本被细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应；③血清标本应充分离心，否则可因凝固不全、纤维蛋白原非特异吸附于微孔内而造成假阳性结果。

1.3 仪器

酶联免疫吸附实验中会用到移液器、水浴箱或恒温箱、洗板机、酶标仪等。移液器是一种比较精密的工具，要求比较高，必须定期对加样器进行维护和校准[3]。每次加样需更换吸嘴，以免交叉污染。水浴箱温度要准确恒定；洗板机要定期维护，检测残液量。

2 检测中

2.1 加样

在HIV抗体检测中加样3次，即加标本、加酶结合物、加底物。加样时要将所加物加入板孔底部，避免加在孔壁外部，产生气泡，吸取样品速度要均匀，保证加样量准确；加完样品要在微量振荡器上震荡1min以保证混合均匀。

2.2 温育的时间和温度

要力求保证温育的时间和温度，酶联免疫吸附实验属于固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相的表面发生，样品中的抗体并不是都有均等的机会与固相的抗原结合，而是最贴近孔壁的一层溶液中的直接与抗原接触，是一个逐渐平衡的过程，因此需要经过扩散才能达到反应的终点，要保证足够的温育时间，才能使产物生成达到顶峰，有的实验室为加快速度，提高反应温度，但盲目提高温度会影响酶的活性。

2.3 温育的方式

常采用温箱法、微波辐射法和水浴法。其中水浴法能较好地解决因受热不均衡所致周围孔与中央孔结果的吸光度差异（即边缘效应），可将ELISA板置于水浴箱中。无论温育还是水浴，反应板不可叠放，以保证各板的温度尽快达到平衡，反应板要贴近水面，温育时要防止挥发或水珠溅入影响结果。

2.4 洗涤

洗涤虽然不是一个反应步骤，但也影响实验的成败。洗涤的目的是分离游离和结合的酶标记物，通过洗涤来实现清除残留在板孔中的没能与固相抗原结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质，洗液的配制要按照要求，太浓会解离包被在固相的抗原，过低削弱洗涤效果。可以说洗涤是HIV抗体ELISA法检测的最主要的技术，操作者要严格按照要求洗涤，不能马虎，否则前功尽弃。洗涤包括仪器自动洗涤和手工洗涤。仪器洗涤要注意定期检测残余量，检测吸液针和注液针是否堵塞，及时更换洗液和废液，防止时间过长引起细菌污染和废液倒流；手工洗涤包括有浸泡式和流水冲洗式两种。手工洗板要注意孔间的交叉污染和洗涤间隔时间。

2.5 显色与比色

显色是ELISA法中最后一步温育反应，反应时间和温度仍是影响显色的因素。TMB受光照影响不大，但OPD底物受光照会自行变色，因此，显色反应应避光进行。显色的温度和时间要力求准确充分，并在规定的时间内比色，防止时间过长会褪色。比色时应尽量选用双波长进行比色，这样可以排除干扰，比色前要用吸水纸拭干板底附着的液体，防止孔内产生气泡，对测定结果产生干扰。

3 质量控制

3.1 开展室内质量控制（IQC）

室内质量控制程序，每次或每天之间不可能没有误差，决定允许的误差范围以临床上不造成误诊和漏诊为准，选择一个弱阳性的室内质量控制品，其S/CO值应该为2～4之间。利用L-J质量控制图，认真分析每次的失控的原因，要解决失控，必须分析造成失控是随机的还是系统的很重要，随机误差表现离散度增大，而系统误差逐渐产生，如漂移或者倾向性，如果是系统误差，再对系统误差进行分析。实验室每月、每一季度要对室内质量控制结果进行分析总结，对当月的均值、变异系数等进行比对分析，及时发现问题，及时采取纠正措施来提高检测结果的可靠性。

3.2 外部质量控制

积极参加室间质评能力验证活动，通过室间质评和能力验证，利用实验室间比对来确定实验室检测或校准能力的活动，判断和监控实验室内部质量控制方法，有效消除偏差，对分析结果起到校准和复核作用。有效地实施能力验证，在实验室质量控制中起着非常重要的作用。利用实验室间的比对和能力验证来不断提升实验室的能力。

3.3 加强人员培训

人员是实验室最宝贵的资源，一个实验室水平的高低很大程度上取决于人员的素质，尤其是关键的技术岗位人员，因此，有针对性地加强人员培训，对艾滋病初筛实验室是非常重要的[4]。

[参考文献]

[1] 于振喜，李连洁. 用ELISA法检测HIV抗体时如何避免“花板”[J]. 中国医药导报，2006，3（23）：56.

[2] 陈云钰. ELISA法检测HIV抗体需注意的影响因素[J]. 中国卫生检验杂志，2011，21（6）：1564-1565.

[3] 全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版）[S]. 中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心，2009：1-5.

[4] 张斌. 实验室管理、认可与运作[M]. 北京：中国标准出版社，2005：162-164.

（收稿日期：2011-11-18）

酶联免疫技术 第4篇

长期以来,食品安全问题一直受到公众的重点关注,且对公众的生命健康产生一定的影响,同时也影响着国家的利益及社会形象。当前,食品安全监测人员经过系统、合理、科学的收集与食品污染和食品当中有害物质相关的数据与信息,加以分析后,能够准确掌握国内的食品安全状况,进而找出存在的食品安全问题,及时了解食品污染物的分布情况、种类以及污染程度等,以便为之后进行食品污染物安全分析、风险评估以及制定和修正相关的食品安全标准,提供有效的数据参考。

食品与酶联免疫吸附技术

根据《中华人民共和国食品安全法》的有关规定,国内2010年首次在全国范围内进行大范围的食品化学污染物安全风险监测工作,且食品化学的污染物的安全风险监测所涉及的范围非常广。酶联免疫吸附技术能够有效地检测食品所含物质以及含量,主要包括食品内的重金属含量、各种食品添加剂及在食品生产、加工及包装等环节所带来的各种污染物等。实现全范围的食品安全监测,从食品的种养殖、生产、加工、销售以及到餐桌等各环节,进行全面、细致的监控。

酶联免疫吸附技术在食品检测分析中的运用

食品中残留农药

我国一直都存在滥用农药的现象,且这个现象逐年加剧。在食品检测中,高效液相色谱法虽然能够精准的检测农药的含量,但是检测仪器贵、试剂处理复杂、专业性强以及分析周期长。张国范认为目前在我国的食品检测中,普遍采用酶联免疫吸附技术检测,主要检测农产品、食物、饲料等。在西方国家中,多个国家也运用了此技术检测食品有毒物质。

动物食品中残留的药物

近些年来,动物性食品的残留药物问题日益凸显,目前我国的酶联免疫吸附技术在此领域的研究取得了较大的发展。江鹏、周小虎认为动物食品中残留的药物主要包括有抗生素、抗球虫类、激素药和磺胺药类等。瘦肉精常被用于动物食品中,但是其本身具有危害性,直接影响人类的健康,可致癌。酶联免疫吸附技术用于瘦肉精的检测,其灵敏度高、经济成本低、操作简单既快捷。酶联免疫吸附技术结果呈现阳性,则需要用气相色谱-质谱(GC/MS)确证。

转基因食品的检测

转基因食品的安全性一直受到世界各国的关注,转基因食品的安全性极具争议,在很多国家通过法律来管理转基因食品。李明尧认为酶联免疫吸附技术是通过特定的转基因表达蛋白,分析食品中是否含有转基因成分。

检测食品中的生物毒素

食品中的毒素在一定的条件下产生,食品加工过程中,虽然经过加热、煮沸、烹调等处理,但是食品中毒素的结构难以被破坏。在我国,食品安全问题越来越受到大家的重视,因为食品的安全问题直接影响了国民的生命安全。黄曲霉毒素的致毒性和致癌性极强,各个国家严格控制黄曲霉毒素在食品中的含量。李月娟等认为酶联免疫吸附技术能通过分析B1结合物,了解食物中黄曲霉毒素的含量。

结语

酶联免疫技术 第5篇

1引言 赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)是一种广泛分布于世界近岸海域的.有害针胞藻类(Raphidophyte),也是我国近海常见的赤潮生物,曾经有多次引发赤潮的报道[1,2].在赤潮发生的早期,自然水体中赤潮生物的细胞密度相对较低,且赤潮藻个体微小,传统的鉴定方法,即海水样品采集后利用光学显微镜直接观察,主要用于藻的定性和分离,当样品量较多时,定量计数过程则烦琐、费时、费力,工作量大.

作 者：亓海刚 米铁柱 辛泽毓 李荣秀 于志刚 QI Hai-gang MI Tie-zhu XIN Ze-yu LI Rong-xiu Yu Zhi-gang 作者单位：亓海刚,QI Hai-gang(中国海洋大学,生命科学与技术学部,山东,青岛,266003)

米铁柱,MI Tie-zhu(中国海洋大学,环境科学与工程学院,山东,青岛,266003)

辛泽毓,XIN Ze-yu(中国科学院,上海生命科学研究院,上海,33)

李荣秀,LI Rong-xiu(上海交通大学,生命科学技术学院,上海,30)

于志刚,Yu Zhi-gang(中国海洋大学,化学化工学院,山东,青岛,266003)

酶联免疫技术 第6篇

(辽宁省鞍山市铁西区卫生防疫站辽宁鞍山114012)【摘要】艾滋病是当前严重威胁人类健康和生命的一种传染病,由早期的静脉吸毒者共用注射器传播,发展到当今性传播和母婴垂直传播,即向普通人群的传播, 艾滋病的流行给人类的健康、生命安全以及经济社会发展带来了严重影响。最常用的艾滋病诊断方式是进行抗体检测，要了解和掌握HIV的感染情况，关键就是实验室的检测技术，下文就关于在HIV抗体检测中酶联免疫吸附法和快速法的比较分析及其注意事项的总结。【关键词】酶联免疫吸附法;胶体金快速法;HIV抗体;检测【中图分类号】R446.6【文献标识码】B【文章编号】1004-5511（2012）04-0594-01 一、引言进入20世纪90年代，HIV在我国迅速传播，感染人数成倍增长，艾滋病的防治已经成为全世界面临的重要课题。HIV感染的诊断以HIV抗体的检测为金标准，为了达到早诊断、早治疗、早管理的目的，全国先后建立了大量的HIV抗体初筛实验室，对HIV抗体检测的准确性要求也越来越高。现简述关于我站用酶联免疫吸附法及胶体金快速法检测HIV抗体的思考。二、酶联免疫吸附法对HIV抗体的检测HIV抗体检测是发现HIV感染的有效途径，酶联免疫吸附法（ELISA）是一种敏感性高、特异性强、重复性好的试验诊断方法，由于其试剂具有稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观等因素，以及既适用于 规模筛查试验，又可以使用于少量标本的检测等优点，一直以来，成为艾滋病初筛试验室检测HIV抗体普遍使用的方法之一 1、试剂的选择:试剂盒的质量直接影响到结果的准确性，因此，要选择灵敏度和准确度较高，而且特异性较强的试剂盒。选择试剂盒的原则是，必须是经国家食品药品监督管理局注册批准，批检合格，临床评估质量优良，在有效期内的试剂，并经常了解同行对试剂盒使用的反馈情况一级卫生部临床检验中心对参加室间质评实验室试剂盒的综合评价。本站检测HIV抗体主要采用北京万泰生物药业有限公司试剂盒。另外，也应该注意试剂的保存，试剂从冰箱中取出后，应先平衡到室温后再使用，用多少取多少，防治反复冻融。2、仪器设备的校准与检定: 对实验结果起关键作者用的仪器，水浴箱、洗板机和酶标仪等均需按周期进行计量检定，并在检定周期内进行期间核查，同时，建立仪器设备的维护及操作规程，进行日常维护，保持仪器设备的最佳状态。3、样品样品的采集与保存: 样品采集时候应该尽量避免溶血和细菌污染、霉变，否则会导致假阳性。尽量不用抗凝血，保存时间不宜太长，一般2°C-8°C冰箱中保存一周内完成检验，长期保存最好在零下20oC度低温冰箱存放，并避免反复冻融，浑浊或有沉淀的样品要离心。作HIV抗体检测的血样不宜用塑料试管，应用玻璃试管装。4、检测中关键点的控制：（1）加样：微孔板条从冰箱中取出后应平衡至潮气干尽方可使用，用微量加样器按规定量加入孔底，避免加在孔壁上部，尽量慢慢快放，以免溅出或产生气泡，同时不要使吸头碰到酶标板孔上的包被抗原。（2）温育：调节水溶箱至合适的温度，不能过高也不能过低，放在水溶箱的隔板上或放在温箱的温盒里均可。（3）洗涤： 一定要用洗板机，防治污染。注意洗板机上的每一个放液和吸液纤孔都一致的插入孔底，将孔内液体吸干，严格按照要求设置一定的浸泡时间和洗涤次数，不要将各种试剂盒的洗涤液混用。（4）.显色： 严格按照说明书规定的时间温度恒定反应后终止，不可以随意更改。在加液和混均过程中避免产生气泡，洗涤后反应板用纸吸干后再置酶标液中比色。5、实验室内质量控制： 室内质控一般使用质控品和质控图。联合应用即刻法质控图法进行室内质控也是一种很使用的方法，可以借鉴。并积极参加室间质控活动，了解本实验室的实验误差情况。三、胶体金快速法对HIV抗体的检测与ELISA法相比，胶体金快速法具有快速，安全，操作简单等有点，但是在实际应用中要注意假阳性和假阴性结果。本站主要采用上海科华的胶体金快速检测法检测HIV抗体，其原理是采用HIV特異性抗原gp160和gp36等包被微孔反应板，用gp36、gp41标记辣根过氧化物酶。当待测标本中存在HIV抗体时，该抗体与固相化的抗原结合于反应板上，并进一步与酶结合物相结合，在TMB底物参与反应的情况。对于弱阳性样本的处理要慎重，不能轻易舍去，宜用正常血清稀释后与原液对照一起测定，往往可以收到很好的效果。四、结论ELISA法是实验室检测HIV抗体普遍使用的方法，但影响ELISA法测定结果的因素很多。与ELISA法相比，胶体金快速法具有快速，安全，操作简单等优点，但是在实际应用中要注意假阳性和假阴性结果。将胶体金快速法和ELISA法联合使用，并力求控制各个影响因素，可以大大降低假阳性和假阴性结果，提高检测的准备性，为艾滋病的防治工作提供更有效的依据。参考文献［1］中国疾病预防控制中心.全国艾滋病检测技术规范（2009年版）.北京：中国疾病预防控制中心，2009：6.［2］李秀华，宋爱京，王佑春.HIV抗体快速诊断试剂与酶联免疫诊断试剂灵敏度比较.中国生物制品学杂志，2004；17（3）：175-176.［3］胡静云，陈善昌.胶体金快速检测法与ELISA法检测HIV抗体效果观察.华夏医学，2009；22（3）：488.

酶联免疫技术 第7篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2010年4月至2012年9月在我院就诊的87例乙型肝炎患者, 其中男性43例, 女性44例;年龄22~73岁, 平均年龄46.3岁。另选87例健康志愿者, 其中男性45例, 女性42例;年龄20~74岁, 平均年龄46.7岁。收集所有检测者的血液样本, 对其进行检测。

1.2 试剂与仪器

试剂盒有上海天齐生物科技有限公司提供;仪器采用ALISIE全自动酶联免疫分析仪。质控血清购自卫生部临床检验中心, 浓度为1IU/mL, 批号为0806。

1.3 方法

分别取所有检测者的血液, 取到的血液要经过至少半小时的凝集, 然后取上层血清。将酶复合物用稀释液进行稀释后, 加入血清、阴性和阳性对照以及质控品。放置1h进行孵育, 然后洗板, 加入底物, 避光反应30min后加入终止液即完成反应部分。然后滴加底物溶液, 底物在酶的作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型, 出现颜色反应。通过底物的颜色反应对有无相应的免疫反应的发生进行判定, 颜色反应的深浅与标本中相应的抗体或抗原量呈正比。

重复性试验:收集检测组S/CO检测值 (是样本吸光度与临界质控即阳性对照吸光度值之比, 比值<1为阳性) 接近于1的阳性样本, 进行一系列的稀释, 重复检测稀释后的样本直到出现阴性与阳性的概率分别为50%时, 次浓度即本检测方法的临界值浓度。根据上述试验得到的临界值计算出临界值样品±20%浓度的稀释倍数, 并对其进行20次检测, 记录其检测结果。

1.4 统计学方法

记录采用酶联免疫技术检测乙型肝炎表面抗原所得到的数据, 然后采用SPSS11.0软件来完成对数据的统计与处理。

2 结果

对检测组87例乙型肝炎患者进行接近临界值分析物的重复性检测, 其结果为+20%浓度临界值分析物检测的阳性率不小于95%, -20%浓度临界值分析物检测的阳性率不大于5%。灵敏度:检测组中有85例乙型肝炎阳性, 灵敏度为97.70%, 对照组中, 乙型肝炎阴性为85例, 灵敏度为97.70%。

3 讨论

乙型肝炎感染呈世界性流行, 目前我国乙型肝炎病毒的携带率为7.18%。HBsAg是乙型肝炎病毒的外壳蛋白, 本身不具有传染性, 但它的出现常伴随乙型肝炎病毒的存在, 故它是已感染乙型肝炎病毒的标志[1,2,3]。HBsAg可在患者的血液、汗液、唾液、泪水、乳汁、鼻咽分泌物、阴道分泌物及精液中检测出。当感染乙型肝炎病毒2~6个月后, 以及丙氨酸氨基转移酶升高前的2~8周, 检测其血清结果为阳性。慢性乙型肝炎患者该指标表现为持续阳性, 急性乙型肝炎患者则大部分可在病程早期由阳性转为阴性, 所以乙型肝炎表面抗原阳性是HBV感染的标志。酶联免疫法简称ELISA, 是1971年由瑞典学者提出的一种特殊的试剂分析方法, 是酶免疫测定技术中应用最广的一种技术[4,5]。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体的表面, 使具有酶标记的抗原抗体的反应在固相表面上进行, 然后将液相中的游离成分洗除。本文选择了87例乙型肝炎患者以及87例健康志愿者, 采用酶联免疫技术对其血清进行乙型肝炎表面抗原进行检测, 结果乙型肝炎表面抗原的检测临界浓度+20%时的分析物检测的阳性率不小于95%, -20%浓度临界值分析物检测的阳性率不大于5%, 所以酶标仪检测的临界浓度值为±20%, 当在这范围之外的标本都可以得到可靠的检测结果;检测组与对照组的灵敏度均为97.70%。综上所述, 酶联免疫技术检测乙型肝炎表面抗原的分析性能在分析物浓度为±20%时, 检测结果可靠, 且灵敏度也高, 故值得在临床上推广与应用。

参考文献

[1]陈桂山, 张秀明, 熊继红, 等.酶联免疫技术检测乙肝表面抗原的分析性能评价[J].国际检验医学杂志, 2011, 32 (9) :932.

[2]李秀梅, 刘秋霞, 阎泽君, 等.ELISA法检测乙肝表面抗原出现假阳性结果分析[J].慢性病学杂志, 2010, 12 (9) :1037.

[3]周永刚, 方树和, 张玉静.ELISA法检测乙肝表面抗原室内质控的探讨[J].内蒙古中医药, 2009, 13 (8) :86.

[4]李宁宁, 杨继红, 郑义, 等.乙肝表面抗原酶联免疫实验质控结果分析[J].湖北预防医学杂志, 2009, 11 (2) :7.

酶联免疫技术 第8篇

1 酶联免疫分析法概述

1.1 基本原理

酶联免疫分析法的基本原理是把抗原或抗体预先结合到某种固相载体表面;测定时,将受检样品(含待测抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原或抗体复合物;反应终止后,固相载体上酶标抗原或抗体被结合量(免疫复合物)与标本中待检抗体或抗原的量成一定比例;经洗涤去除反应液中其他物质,加入酶反应底物后,底物即被固相载体上的酶催化变为有色产物,最后通过定性或定量分析有色产物量即可确定样品中待测物质含量。

1.2 与其他检测法相比的优势

目前用于食品安全检测的方法有很多,如薄层色谱(TLC)、微生物法、气相色谱(GC)、质谱(MS)、高效液相色谱(HPLC)和核酸探针技术等。但这些方法有的必须进行较为复杂的样品预处理,有的不能定量且灵敏度低,有的虽灵敏度高,但设备昂贵,检测费用高,难以推广使用。微生物法不易筛选到特别敏感的菌株,也只能定性不能定量,易受其他抗菌药物的影响;核酸探针则在试验过程中易受到污染。而酶联免疫分析法不仅灵敏度高、干扰小、安全性高、污染少、检测通量大,且操作简便快捷。

2 ELISA技术在食品安全性检测中的应用现状

2.1 农药残留检测

近年来滥用农药现象使农药残留量超标相当严重,并逐年加剧。传统的农药残留检测方法如气相色谱法和高效液相色谱法能精确地检测残留的农药量,但需要昂贵的仪器设备、复杂的前处理、专业技术人员及较长的分析周期。20世纪80年代开始,农药的免疫检测技术作为快速筛选检测方法得到了快速发展。目前几乎所有农药类别都建立了酶联免疫分析方法,检测样本以农产品、食品、饲料和环境为主。欧洲、美国、日本、巴西等多个国家应用该技术对农产品中有毒物质残留进行生物技术监测研究,粗筛检测水产品、肉类产品和果蔬产品中农药残留量。最近,英国研制的通用型有机磷杀虫剂免疫检测试剂盒可同时检测8种以上的有机磷农药[1]。我国在近10年来也相继开展了农药残留酶免疫法快速检测方法的研究,取得了一定的研究成果,如山东京蓬生物药业公司在乙酰胆碱酯酶基础上开发研制的快速检测试纸,对有机磷和氨基甲酸酯类农药残留检测快速而准确,敏感度0.01~5.00mg/kg,准确率达90%以上。

2.2 动物性食品中药物残留检测

近年来动物性食品药物残留问题更加突出。目前,国内应用ELISA技术检测药物残留研究取得较大进展。王伊琴等[2]建立了氯霉素残留检测的ELISA方法,灵敏度0.025~2.000ng/m L,检测限0.02μg/kg,回收率达78.2%。王自良等[3]研制的苯巴比妥ELISA试剂盒,线性检测范围达1.0~81.0ng/m L,灵敏度0.75ng/m L,检测限1ng/m L,在饲料样和猪尿样的平均添加回收率分别为85.8%和91.3%。王选年等[4]研制的盐酸克伦特罗ELISA试剂盒线性检测范围为0.5~128.0ng/m L,与肾上腺素、去甲肾上腺素、莱克多巴胺及多种抗生素均无交叉反应性,回收率高达90%以上。

2.3 生物毒素的检测

Anna Yu Kolosova等[5]运用ELISA方法测黄曲霉毒素B1,检测范围0.1~10.0ng/m L,IC500.62ng/m L,大米样品中的回收率为94%~113%。近十几年来国内用于生物毒素检测的ELISA方法得到迅速发展,已有多种ELISA诊断试剂盒用于分析不同的毒素。湖北省农科院研制的黄曲霉毒素ELISA试剂盒,在检测食品、饲料中的黄曲霉毒素时,抗原转化率为89.4%,检测限3.33ng/m L;王玉平等[6]在抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体基础上,研制出ELISA定量检测试剂盒,灵敏度1ng/m L,检测限10ng/g,该方法也被广泛应用于各种藻类和贝类毒素的检测。

2.4 微生物的检测

食品安全问题中,首要问题是微生物污染。检测微生物的方法很多,常规的微生物学检验方法试剂繁杂、检验周期长,远不能适应实际需要,而ELISA法很好地弥补了这一缺陷。用ELISA法可检测食品中沙门氏菌、大肠杆菌等微生物,其中通过制备单克隆抗体分析食品中细菌的ELISA技术研究最多,检测结果准确可靠。Lyer MS等[7]用间接ELISA法来测食品和饲料中的镰刀菌,可检测出102~103cfu/m L的含量;文其乙等[8]建立了直接ELISA法检测沙门氏菌,能检出沙门氏菌属99个菌株,最低检测量可达500cfu/g,时间仅需22h,比常规方法缩短了3~4d,与其他肠道杆菌不发生交叉反应。

2.5 转基因食品安全性的检测

转基因过程的每一个环境都有可能对食品的安全性产生影响,因此转基因食品的安全性是最近有关食品安全性研讨的热点问题之一,许多国家都有严格的法规来管理转基因食品。ELISA主要应用于原料和半成品的快速定性分析[9],因而解决了转基因样品检测中核酸制备困难的问题。Rogan等用ELISA技术检测出传统大豆加工产品中混有2%Roundup Ready大豆中的CP4 EPSPS蛋白质。此方法具有选择性和灵敏性,具有商业可利用性。Holzhauser等[10]运用ELISA技术检测出各种食物中花生蛋白质的最低残余量为2mg/kg。目前,市场上已有检测常见转基因蛋白的ELISA试剂盒。如Stratejic Dignostics公司已开发能简便地定性检测转基因大豆的试剂盒,其原理就是利用ELISA方法制备出的特异性抗体检测Roundup大豆的特异基因产物CP4EPSPS蛋白。

3 ELISA技术在食品安全性检测中的研究展望

酶联免疫技术研究虽然只有短短几十年,但它可以应用到检测的各个领域,也为医学、分子生物学领域的应用展示了广阔的前景。国内外有许多家公司制作了大量的ELISA商业试剂盒。但我国现行的食品安全检验还没有规范化,体现在:检测方法多借鉴或参照国外的一些方法,不完整,没能形成体系;可比性、可操作性较差;检测方法繁琐、报告结果周期长,不适应日常大量的生产流通环节对产品质量的临控;检测灵敏度无法达到国际上现行的、越来越严格的标准。酶联免疫吸附法因其简便、快速、灵敏、微量化等诸多的优点,在建立安全检验方法方面有很大的应用空间。现在,有大量的ELISA商业试剂盒,可供作相应项目的检测,但由于食品原料体系的多样性、复杂性,ELISA法要成为某一食品安全检验的标准方法,并将其推广应用,还有一定距离。在改进样品的纯化步骤,提高回收率、灵敏度方面;在减少基底干扰,提高重现性和稳定性方面;在简化分析程序,降低分析成本方面;在与其他理化分析方法联用,克服自身局限性方面;在试剂、操作规程的标准化等方面有待于进一步摸索,还有大量工作要做。目前许多学者正致力于改进完善这种技术,不断有新的研究成果推出,可以肯定,ELISA在各种产品安全检测领域有着广阔的应用前景。

参考文献

[1]CARSTEN JAHN,WOLFGANG SCHWACK.Determination of cutinound residues of chlorothalonil by immunoassay[J].Agr Food Chem,2001,49(3):12-33.

[2]王伊琴,包勇敢,胡烈山.ELISA在检测动物组织氯霉素残留中的应用[J].中国农学通报,2006,22(4):26-29.

[3]王自良,王建华,杨艳艳,等.苯巴比妥残留快速检测阻断ELISA试剂盒的研制及性能测定[J].中国兽医杂志,2006,42(4):62-64.

[4]王选年,杨艳艳,邢广旭.盐酸克伦特罗单抗快速检测试剂盒的研制[J].中国兽医学报,2004,24(1):75-78.

[5]KOLOSOVA,A Y,SHIM,W B,YANG,Z Y,et,al.Direct competitiveELISA based on a monoclonal antibody for detection of aflatoxin B1.Stabilization of ELISA kit components and application to grain samples[J].Anal Bioanal Chem,2006(1):286-294.

[6]王玉平,计融,江涛.玉米赤霉烯酮ELISA定量检测试剂盒研制[J].卫生研究,2006,35(2):221-224.

[7]IYERM S,COUSIN M A.Immunological Detection of Fusarium Speciesin aModel Food System[C].2002 IFT AnnualMeeting,USA,2002.

[8]文其乙,焦新安,刘秀梵.沙门氏菌快速检测试剂盒的研制及其应用[J].江苏农学院学报,1996,17(2):29-33.

[9]崔林开,叶华智.3种ELISA法检测Bt杀虫蛋白的比较研究[J].安徽农业科学,2005,33(11):2056-2057.

酶联免疫技术 第9篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院2014年3月-2015年3月收治的40例乙型肝炎患者为本次研究对象, 所有患者均符合临床关于乙型病毒肝炎的诊断标准, 收取患者血清标本。男29例, 女11例, 年龄32~62岁, 平均 (43.72±6.34) 岁。

1.2 方法

1.2.1 仪器和试剂

酶联免疫吸附法选用瑞士帝肯公司生产的型号为BI0-RAD i Mark的全自动酶免仪, 北京万泰生物工程公司生产的HBV-M试剂盒;时间分辨荧光免疫法选用由上海新波生物技术公司生产的ANYTEST检测仪以及其配套的试剂和EFFICUTA全自动标本前处理系统。

1.2.2 检测方法

早晨抽取患者空腹静脉血5~10 ml, 并将其置于真空管内, 于37℃的恒温环境内凝血分离血清, 待血清分离1 h后开始检测, 检测严格按照检测仪和试剂盒的使用说明书进行。酶联免疫吸附法为定性检测方法, 检测时, 首先复温试剂至室温, 移取微量血样于板孔底部, 加入适量稀释液, 振荡混合后使用检测仪检验, 依据仪器检测结果判读阴、阳性, 若HBV-M中的任一指标检测为弱阳性则将其标记设置2个平行孔, 以待复查, 若复查结果仍显示阳性则判读为阳性。时间分辨荧光免疫法为定量检测方法, 检测时首先复温试剂盒, 然后将血液样本加入稀释之后的标记物内, 接着将标记物工作液加入其中, 振荡孵育完毕后将反应板洗涤干净, 加入增强液, 使用检测仪检验, 将检测结果与检测的正常范围对比, 若超出正常范围则判定为阳性。

1.3 观察指标

分别记录酶联免疫吸附法和时间分辨荧光免疫法对于乙肝病毒感染血清学标志物的阳性检出例数并计算阳性检出率。酶联免疫吸附法依据HBc Ab、HBe Ab、HBs Ab、HBe Ag、HBs Ag各项指标密的度来判读阴、阳性;时间分辨荧光免疫法检测指标及其正常范围为HBc Ab (0~0.9 PEU/ml) 、HBe Ab (0~0.2 PEU/ml) 、HBs Ab (0~10 m U/ml) 、HBe Ag (0~0.5 PEU/ml) 、HBs Ag (0~0.5 ng/ml) , 指标值超过正常范围则视为阳性[3]。阳性率= (阳性例数/总例数) ×100%。阳性符合率= (酶联免疫吸附试验阳性检出例数/时间分辨荧光免疫试验阳性检出例数) ×100%。

1.4 统计学处理

使用SPSS 20.0软件对收集到的数据进行统计学分析, 计数资料以率 (%) 表示, 比较采用字2检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

患者HBc Ab、HBe Ab、HBs Ab、HBe Ag、HBs Ag各指标阳性符合率依次为84.80% (28/33) 、63.63% (14/22) 、95.00% (19/20) 、94.40% (17/18) 、88.30% (15/17) ;时间分辨荧光免疫法检出的HBc Ab、HBe Ab阳性率均显著高于酶联免疫吸附法, 差异均有统计学意义 (P<0.05) , 其余各指标之间比较差异均无统计学意义 (P>0.05) , 见表1。

3 讨论

乙型肝炎为全球广泛流行的一种肝脏疾病, 全球共有约超过3.5亿的人口感染乙型肝炎病毒, 其中, 中国人口约占7.18%[4]。乙型肝炎病毒所导致的乙型病毒性肝炎是威胁人类健康和生命安全的重要传染性疾病, 因此, 提高乙型病毒型肝炎的诊断率, 把握最佳治疗时机意义重大。

临床主要通过乙型肝炎病毒血清学标志物来对乙型病毒型肝炎进行诊断, 检测指标包括HBc Ab、HBe Ab、HBs Ab、HBe Ag、HBs Ag等, HBc Ab为患者感染后血清中出现最早的指标, 具有检测价值高、时效长等优点, 对于乙型病毒性肝炎的早发现、早治疗意义重大[5];HBe Ab的感染检出率在肝癌患者中最高, 显著高于肝硬化患者和乙型肝炎患者, 对于患者病情的具体判断有着一定的指导意义[6]。临床对于乙型肝炎病毒血清学标志物的检测主要可分为定性检测和定量检测两种, 定性检测包括金标法、酶联免疫吸附法等, 定量检测包括化学发光免疫分析法、时间分辨荧光免疫法等。

传统的酶联免疫吸附法主要通过对患者抗体抗原酶标记、病毒定性分析的方法来达到病毒检测的作用, 具有经济、操作简单、检测速度快等优点, 能够在基层医疗机构得到推广与普及;但由于只能定性检测, 因此无法对病毒血清标志物进行动态监测和定量计算, 检测的特异性、灵敏度较低, 对于低浓度患者的诊断准确性不够, 同时无法准确判定患者的感染情况和病毒的复制水平;此外该检测方法还存在较大的污染风险。

时间分辨荧光免疫法对于抗原抗体的标记主要通过稀土离子来完成, 可起到示踪作用[7];此外, 其还能有效克服传统酶标记物标记不稳定、受环境影响大的缺点, 通过波长分辨和时间延迟, 非特异性信号可以有效降低, 甚至可以忽略, 检测灵敏度远超放射性同位素, 可达10~12 g/m;以细胞和核酸探针为特征, 检测信号通过放大器扩大后, 由标准曲线对其进行详细分析以明确血清病毒标志物的具体含量, 因此, 时间分辨荧光免疫法不仅弥补了传统酶联免疫吸附法无法定量分析的缺点, 同时还具有超高灵敏度, 整个检测过程交由全自动检测仪完成, 有效避免了人为操作技术差异而引起的检测误差, 检测结果准确性和可靠性大大增加, 相较于其他检测方法, 具有检测可重复、检测范围广、检测稳定、检测结果无误差、无衰变等优势。

本次研究中, 时间分辨荧光免疫法对于乙肝病毒感染血清学标志物各指标的阳性检出率均高于酶联免疫吸附法, HBc Ab、HBe Ab指标之间的比较差异均有统计学意义 (P<0.05) , 其余各项指标之间的比较差异不显著, 时间分辨荧光免疫法检出阳性率略高。

综上所述, 酶联免疫吸附法和时间分辨荧光免疫法均可用于乙型病毒性肝炎的判断, 酶联免疫吸附法适用于医疗设施条件较差的广大基层医疗机构, 具有经济、快捷等特点, 时间分辨荧光免疫法具有更高的检测灵敏度和特异性, 对于乙型病毒性肝炎患者的诊断更加准确, 尤其适用于弱阳性标本的检测, 此外, 其能够准确地对血清标本进行定量分析, 为临床对于患者的感染程度、病情发展程度、疫苗注射量的判断提供可靠参考, 进而可实现患者更有效的临床治疗, 因此, 时间分辨荧光免疫法值得临床进一步推广和使用。

摘要：目的:对酶联免疫吸附试验和时间分辨荧光免疫技术在乙型肝炎病毒血清标志物检测中的临床价值进行分析和比较。方法:选取本院2014年3月-2015年3月收治的40例乙型肝炎患者, 分别使用酶联免疫吸附试验和时间分辨荧光免疫技术对患者的血清标本进行检测, 对比两种检测方法结果的有效性。结果:时间分辨荧光免疫技术HBc Ab、HBe Ab的阳性检出率均显著高于对酶联免疫吸附试验, 差异均有统计学意义 (P<0.05) , 两种方法 HBs Ab、HBe Ag、HBs Ag检出阳性率比较差异均无统计学意义 (P>0.05) 。结论:两种检测方法有较高的阳性符合率, 均适用于乙型肝炎病毒的临床检测;时间分辨荧光免疫技术拥有更高的阳性检出率、敏感性及特异性, 临床检测效果更加稳定和显著, 值得推广使用。

关键词：酶联免疫吸附试验,时间分辨荧光免疫技术,乙型肝炎病毒,血清标志物检测

参考文献

[1]赵树波, 方艳秋, 邢国燕, 等.时间分辨荧光免疫法定量检测乙型肝炎病毒血清标志物的应用价值[J].吉林医学, 2012, 33 (32) :6966-6967.

[2]薛芳芳, 赵婷婷.三种方法检验乙型肝炎血清标志物结果评价[J].现代仪器与医疗, 2014, 17 (5) :73-75.

[3]何宗忠.三种检测方法对乙型肝炎病毒血清标志物的比较研究[D].广州:南方医科大学, 2010.

[4]王丽萍.时间分辨荧光免疫法与酶联免疫吸附法检测乙型肝炎病毒感染血清学标志物的对照探究[J].国际检验医学杂志, 2015, 19 (7) :994-995.

[5]董志宁.乙型肝炎病毒表面抗原光激化学发光免疫测定试剂及人类免疫缺陷病毒时间分辨荧光免疫检测试剂的研制[D].广州:南方医科大学, 2012.

[6]罗惟, 张杰.时间分辨荧光免疫法与酶联免疫吸附法检测乙型肝炎病毒血清标志物的比较[J].现代医药卫生, 2015, 25 (12) :1855-1856.

酶联免疫吸附试验操作影响因素分析 第10篇

1 标本处理的影响

1.1 标本凝固不全。

凝固不全的血清中含有部分纤维蛋白原, 可使结果呈假阳性。解决这个问题可使用加有抗凝剂而不含分离胶的红色帽采血管;将采集后的血液放入37℃水浴, 待充分凝固后再离心分离血清。

1.2 标本离心的影响。

标本离心力过大或离心时间过长都会造成标本溶血。溶血的标本中血红蛋白的含铁血红素有类似氧化物酶的活性, 因此, 在含有辣根过氧化物酶 (HRP) 的ELISA测定中, 很容易使含铁血红素吸附于固相, 从而与加入的HRP底物反应显色。因此在试验中建议选择相对离心力 (RCF) 为1000g~1200g, 离心时间为5~10分钟为宜[2]。

1.3 标本保存的影响。

标本在冰箱中保存过久, 容易在离心时造成溶血, 另外血清中Ig G可聚合成多聚体, 导致本底过深, 甚至造成假阳性。因此, ELISA检测尽量采用新鲜标本, 或离心后吸取血清保存。

2 试剂的影响

很多实验室的试剂从冰箱里拿出来即用。这种做法使试剂在微孔内反应温度太低, 反应不充分, 容易对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此, 在ELISA测定中试剂准备最为关键的是将试剂盒先从冰箱中拿出来, 在室温下放置30 min, 使反应微孔内及试剂的温度较快地达到试验所需的温度。

3 加样的影响

3.1 加样时间的影响。

实验样本过多时, 加样时间过长使得标本与阳性对照、阴性对照、质控反应时间不一致, 从而影响临界值与标本检测OD值的一致性, 导致假阳性或假阴性结果出现。解决这个问题可分批次操作, 从而缩短同批次的加样时间, 使标本与阳性对照、阴性对照、质控反应时间尽量相同, 减少误差。

3.2 加样量的影响。

很多试剂采用滴瓶包装, 可以采用滴加方式, 方便操作, 缩短时间。但滴加的角度不同、挤压的力度不同, 甚至滴瓶内进入空气量的多少都可以使滴加的试剂量不准确。而阳性对照、阴性对照与质控常常需要加样器加注, 两者量的差别也容易使临界值与标本检测OD值不一致而导致假阳性或假阴性结果。为消除这一影响, 建议尽量按照试剂盒说明量使用加样器加注, 加样前检查吸头松紧度, 用吸头反复吸打几次, 并经常校正其准确性。

3.3 加样方法的影响。

加注同一种试剂时, 常常多孔使用一个吸头, 在繁忙的操作中很容易接触孔壁污染吸头, 从而污染其他微板孔。这就要求操作者多进行操作, 练习悬空加注, 掌握正确的操作姿势、手法。持握移液器的肘部在操作台支撑一下, 可以增强手部悬空加注的稳定性。另外悬空加注容易产生气泡, 会减少试剂接触面积, 影响试剂反应。这也需要通过反复练习消除其影响。若微板孔中同时需要加入两种以上试剂时, 加入后要混匀, 以利于试剂充分反应。

4 温育

4.1 温育时间、温度的影响。

温育也是ELISA测定容易出现问题的步骤。试剂盒确定的一定温度下的反应时间并不是反应的终点。升高反应温度, 会加快反应, 同样增加时间会延长反应, 这样得到的反应程度会比试剂盒确定的反应程度高, 会引起阴性高值或假阳性。所以要严格根据试剂盒的说明书选择温育时间、温度。将微孔板从室温放入水浴箱或温箱中时, 孔内温度从室温升至37℃需要一定时间, 如果将微孔板一放入温箱即开始计时, 容易造成实际温育时间缩短, 易致弱阳性标本测不出来。如有备选温度、时间段, 尽量使用较低的温度、较长反应时间的条件。

4.2 温育方式的影响。

温箱温育时容易产生“边缘效应”, 即ELISA测定的96孔板中, 外周孔显色较中心孔深的现象。产生的原因可能是为96孔板周围孔与中心孔在温育中的热力学梯度造成的[4], 因此在温育时尽量采用水浴。水浴时注意水的高度要高出试管架少许, 使微孔板底部浸入水中, 并尽量减少微孔板重叠。

4.3 覆膜的影响。

试剂盒通常设定的反应温度为37℃, 这个温度下放置30分钟, 微板孔内蒸发的水分会很多, 对于整个反应体系来讲, 各种反应物的浓度会不断增加, 这样必会导致反应最后的值升高, 因此温育时最好覆盖胶贴。

5 洗板

ELISA测定的洗板步骤是最主要的关键技术, 应引起操作者的高度重视。一般有两种方式, 即手工和洗板机洗板。

5.1 手工洗板。

人为因素较大, 实验人员必须经验丰富, 加入的洗液量以刚满反应孔为限。注液量太少, 孔口内有游离酶未能洗净;注液量太多, 孔与孔之间液体交叉, 容易污染。洗涤结束后扣干亦非常重要, 有残留易造成假阳性。拍板时要垂直, 避免交叉污染, 用力不能过猛, 防止抗原抗体复合物脱离。酶结合物不耐干燥, 特别在较高的温度下更易失活, 所以拍干的反应板应尽量缩短在空气中暴露的时间, 时间越长, 吸光度值越低。

5.2 洗板机洗板。

人为因素少, 速度快, 条件恒定, 洗液量注入较准确。但是使用洗板机洗板的一个特点是, 每次洗板后不能拍干, 故有较多的液体残留, 需增加洗板次数来减少这种误差。但洗板次数并非越多越好, 太多不但浪费人力、物力, 并且也会导致假阴性结果。同时需要严密观察, 洗液量不足导致洗板不彻底, 洗板针堵塞导致抽吸不完全, 同样会出现误差。为了洗涤效果好, 可采用机器与人工洗涤相结合的方法, 在机器洗涤后再进行人工洗板1~2次, 能达到理想的洗涤效果。

6 读板

读板时微板孔中避免存在气泡, 以免假阳性结果出现。读板时微板放置应平稳, 否则影响与酶标仪透光孔的对齐。读板前还要注意微板孔底的清洁, 以免读数不准确。综上所述, 在使用ELISA试剂盒中, 会由于各种情况影响试验结果。但只要按照说明书规范操作, 仔细分析各个步骤的影响因素, 并加以有效地防范和解决, 就能得到准确的实验结果。为疾病的诊断、预防和治疗提供可靠地实验依据。

摘要：酶联免疫吸附试验是临床广泛应用的一种免疫检测方法。在操作中有一定的技术要求和影响因素。对可能影响结果的标本、试剂的处理、加样、温育、洗板、读板等关键环节的操作进行了分析, 并提出规范操作的重要性和相应的解决措施。

关键词：ELISA,影响因素,分析

参考文献

[1]宋炳荣, 杜彩霞, 崔娜等.ELISA一步法检测乙型肝炎病毒标志物影响因素的实验研究[J].实用医学进修杂志, 2004, 9 (11) :65.

[2]李会英.酶联免疫吸附实验影响因素的分析[J].检验医学与临床, 2007, 4 (10) :985-986.

[3]尚文章, 罗云杰, 郭斌等.对影响HBV-DNA PCR-ELISA定量方法测量精密度相关因素的探究[J].医学研究通讯, 2005, 34 (9) :52-53.

[4]李宁.影响酶联免疫吸附实验测定的关键环节[J].检验医学与临床, 2006, 3 (7) :314-315.

酶联免疫技术 第11篇

1资料与方法

1.1 一般资料

2009年8月至2010年8月, 本院住院、门诊患者及体检者血清样本3260份。其中住院、门诊患者368例, 体检2892例。

1.2 方法

应用厦门新创科技有限公司生产, 批号为2010055103 HBsAg诊断试剂盒;本试剂是经卫生部生物制品鉴定所批检合格, 并在有效期内使用。严格按试剂盒说明书操作, 对以上3260例标本进行定性检测, 按说明书结果判断方法判读阴阳性, 对弱阳性的HBV M、“HBsAg、抗-HBs”或“HBeAg、抗-HBe”双阳模式的HBVM均须2孔复查, 仍为阳性者判为阳性。复检:对初检呈阳性反应的标本和初检可疑的标本血浆进行乙肝两对半复核检测。

2结果

3260 份血样初检出HBsAg阳性145例, 初检阳性率为4.45%, 对阳性结果进行乙肝两对半复核检测, 确定HBsAg阳性132例, 报告阳性率为4.04%, 假阳性率为0.39%, 13例假阳性中静脉血样9例, 耳垂血样4例, 追踪这部分假阳性原始血样, 分别存在凝固不全、溶血、脂血、血量过少等状态。

3讨论

ELISA法一方面是建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上, 因而, 具有特异性。而另一方面又由于酶标记抗原或抗体是酶分子与抗原或抗体分子的结合物, 它可以催化底物分子发生反应, 产生放大作用, 正因为此种放大作用而使本法具有很高的敏感性[1]。ELISA法是目前表面抗原检测的首选方法, 该方法应用时间长, 应用地区广泛, 结果可靠, 具有高度的灵敏性和特异性;但是该方法的操作程序相对烦琐, 所需要的反应时间也长, 不能满足急诊患者的需要。在操作上要注意许多的影响因素, GI-CA法相对来说不需要任何仪器, 出结果的时间也短, 有些技术可以直接使用全血操作, 使患者的痛苦减少, 特别适合年龄小的儿童体检, 快捷迅速得出结果。

乙型肝炎病毒用酶联免疫吸附试验 (ELISA) 检测具有特异性强、敏感性高、试剂成本低、操作简便、快速等优点, 目前在国内被广泛使用。尽管ELISA法操作简单, 但可能影响测定结果的因素也较多。如标本因素、试剂的因素、操作因素等[2], 注射乙型肝炎疫苗, 正在使用干扰素类药物或AFP、RF补体自身抗体阳性的标本也都会影响结果的检测[3], 因此, 在检测过程中, 必须严格按照操作步骤, 同时作好室内质控、室间质评, 加强个人工作责任心, 加强质量管理, 尽量避免或减少影响因素的干扰, 力求做到试验结果的准确和可靠。

作好HBsAg检测须注意的要点[4]:①选择卫生部批准合格的试剂盒;②空腹采血, 无溶血, 血清分离完全;③ 严格按照说明书操作, 将样本对应微孔按序编号, 每块板上均做阴性、阳性、空白对照, 加样时使用一次性吸嘴, 避免交叉污染。加酶时应先弃去一滴, 避免滴在孔壁上, 注意不可溅出, 均应加在板孔的底部。加样完成后振荡混匀用封膜封板后置37℃恒温水箱温育30 min;④水浴温度保持37℃;若温度不稳定, 则会影响显色结果, 出现假阴性、假阳性的错误结果, 所以一定要保持温度和温浴时间的稳定;⑤坚持室内质控和阴、阳性对照同时做, HBsAg阳性复查, 并选用不同厂家、不同批号的试剂盒复查, 保证结果的准确、可靠, 降低假阳性率。

摘要：目的 比较酶联免疫法测定乙肝表面抗原的结果。方法 对3260例血清标本通过酶联免疫法测定乙肝表面抗原, 并且对结果进行分析。结果 3260份血样初检出HBsAg阳性145例, 初检阳性率为4.45%, 对阳性结果进行乙肝两对半复核检测, 确定HBsAg阳性132例, 报告阳性率为4.04%, 假阳性率为0.39%, 13例假阳性中静脉血样9例, 耳垂血样4例, 追踪这部分假阳性原始血样, 分别存在凝固不全、溶血、脂血、血量过少等状态。结论 酶联合免疫法是目前表面抗原检测的首选方法, 该方法应用时间长, 结果可靠, 具有高度的灵敏性和特异性, 可广泛应用于临床。

关键词：酶联免疫法,HbsAg,分析

参考文献

[1]关秀茹, 辛晓敏.现代临床检验技术与应用.北京:科学出版社, 2005:213.

[2]周红妹, 黄小虎, ELISA法检测HBsAg影响因素分析.中国热带医学, 2006, 6 (10) :1867-1868.

[3]李会英.酶联免疫吸附试验影响因素分析.检验医学与临床, 2007, 4 (10) :985-986.