哮喘模型范文（精选4篇）
哮喘模型 第1篇
以往有研究表明, 血管内皮细胞生长因子 (VEGF) 在血管生成过程中起核心作用[3]。近年研究发现, VEGF调节血管生成是通过缺氧诱导因子-1α (HIF-1α) 实现的[4], HIF-1α可以调节基因表达响应氧气浓度的变化。在本研究中建立哮喘小鼠模型, 通过检测气道炎症、血管百分比以及血管生成与VEGF和HIF-1α的关系, 主要评价中药川贝治疗哮喘的分子机制。
1 材料与方法
1.1 试药
中药川贝粉的制备:选取整齐、粉性足者。由于川贝忌水洗, 为去除药材表面的灰尘, 可采用洁净的纱布擦拭药材表面。净选后的川贝通过灭菌消毒窗消毒15min后直接转至粉碎车间, 用Fz-400型粉碎机组加工成100目细粉, 收得细粉装入洁净的容器中, 封口。全部加工完后的细粉用洁净的塑料袋分装成1kg/袋备用。
1.2 实验动物
雌性BALB/C小鼠30只, 6~8周龄, 由哈尔滨医科大学动物实验中心提供, 实验动物合格证号为P00102008。
1.3 模型建立
健康清洁级BALB/C小鼠腹腔内注射10%卵蛋白+10%氢氧化铝混合液1ml作为首次致敏, 第15天将小鼠依次置于超声雾化器中, 用1%卵蛋白生理盐水喷雾激发小鼠哮喘发作, 隔日一次, 一次20min, 共激发28d。以小鼠出现口唇发绀、腹肌痉挛、呼吸加快、点头呼吸或站立不稳等现象表示成功激发。将成功制备的哮喘模型小鼠 (20只) 随机分为两组 (每组10只) 。分别为模型组和中药川贝组, 另设PBS组 (10只以生理盐水代替卵蛋白进行腹腔注射及雾化吸入给药) 。分组后每天灌胃给药, 模型组和PBS组给予等量生理盐水, 中药川贝组给予川贝粉9.0g/kg, 每天1次, 连续28d。最后1次给药2h后, 三组小鼠应用1%巴比妥钠麻醉, 取出肺组织保存, 待用于组织学检测。
1.4 组织学分析
肺组织采用4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片、苏木精和伊红染色、数字显微镜扫描。根据组织学评分系统对支气管周围炎症进行评分: (1) 支气管周围无炎细胞; (2) 可见少量炎细胞; (3) 大量炎细胞, 但未完全浸润支气管; (4) 1层炎细胞完全浸润支气管; (5) 2层炎细胞完全浸润支气管; (6) 3层或更多炎细胞完全浸润支气管。使用所有肺组织的支气管除以有炎症的支气管计算平均支气管炎症指数。
1.5 免疫组化法检测VEGF和HIF-1α表达及计算血管百分比
肺组织石蜡切片、脱蜡、脱水、浸泡于3%H2O2中15min灭活内源性过氧化物酶。置于煮沸柠檬酸钠中修复抗原, 暴露抗原表位并且用3%小牛血清蛋白阻断。切片与血管性血友病因子 (v WF) 初级抗体孵育。VEGF和HIF-1α分别于4℃过夜, 随后与二氨基联苯胺孵育。用均匀结合在内皮细胞表面的v WF抗体标记血管, 所有的后续步骤均在ZSGB-BIO Autostainer进行。随机选定一个HPF (200×) 视野, 像场的总面积除以v WF阳性面积即得血管百分比, 免疫组化染色支气管上皮细胞用于计算VEGF和HIF-1α表达。
1.6 Western blotting检测VEGF和HIF-1α表达
在蛋白酶抑制剂的存在下肺组织匀浆, 以获得肺蛋白提取物, 用于Western blotting分析, 使用bca-100蛋白定量分析试剂盒确定浓度。每组蛋白质等量 (30µg) 固定SDS聚丙烯酰胺凝胶, 然后转移至硝酸纤维素膜, 膜在三异丙基乙磺酰缓冲盐水吐温20 (25m M Tris p H 7.5, 150m M Na Cl和0.1%Tween 20) 中用5%的脱脂奶粉封闭1h, 与原发性抗VEGF抗体或抗-HIF-1抗体4℃过夜孵育, 然后与二抗杂交 (Dako, 1:2000) , 增强化学发光显示特异性结合, 以β-Actin为内参, X射线扫描, 计算机辅助双向光密度计分析光密度, 计算VEGF和HIF-1α表达的相对比例。
1.7 统计分析
计量资料采用均数±标准差 (±s) 表示, 组间比较采用单因素方差分析和Mann Whitney检验相关数据的分布。VEGF和HIF-1α表达与血管百分比的相关性采用Spearman检验评价。P<0.05为具有统计学意义。
2 结果
2.1 中药川贝改善过敏性气道炎症
组织学分析显示, 模型组呈典型哮喘病理特征 (图1A) 。许多炎细胞浸润支气管周围, 支气管上皮增厚, 与PBS组比较炎症指标明显增强, 差异具有统计学意义 (P<0.01) 。给予中药川贝干预后, 气道炎症明显改善, 炎细胞减少, 支气管上皮增厚范围缩小 (图1B) , 与模型组比较, 差异具有统计学意义 (P<0.01) , 见表1。
注:A为模型组, B为中药川贝组, C为PBS组
注:模型组与PBS组比较**P<0.01;中药川贝组与模型组比较※※P<0.01, ※P<0.05
2.2 中药川贝降低血管生成
OVA致敏后, 血管生成 (图2) 。模型组血管百分比明显升高, 与PBS组比较, 差异具有统计学意义 (P<0.01) 。给予中药川贝干预后, 血管百分比明显降低, 与模型组比较, 差异具有统计学意义 (P<0.01) , 见表1。
注:A为模型组, B为中药川贝组, C为PBS组
2.3 中药川贝降低VEGF表达
模型组支气管上皮细胞, 肺泡上皮细胞和内皮细胞VEGF表达明显升高, 中药川贝干预后, VEGF表达接近PBS组 (图3, 表1) 。Western blotting结果显示, 在模型组VEGF表达明显升高, 与PBS组比较, 差异具有统计学意义 (P<0.01) ;中药川贝干预后, VEGF表达降低, 与PBS组比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 见图4和表1。
注:A为模型组, B为中药川贝组, C为PBS组
2.4 中药川贝降低HIF-1α表达
为进一步阐明中药川贝抗血管生成机制, 本实验还检测了肺组织HIF-1α表达水平。PBS组仅可见少量HIF-1α阳性细胞, 而在模型组肺泡上皮细胞核HIF-1α高表达 (图4~5) 。Western blotting检测HIF-1α相对比, 结果显示模型组HIF-1α表达上调, 与PBS组比较, 差异具有统计学意义 (P<0.01) ;中药川贝组HIF-1α表达下调, 与模型组比较, 差异具有统计学意义 (P<0.05, 表1) 。
注:A为模型组, B为中药川贝组, C为PBS组
2.5 血管百分比与VEGF和HIF-1α表达相关性
Western blotting结果显示 (图4) , 血管百分比与VEGF (r=0.693, P<0.01) 和HIF-1α (r=0.785, P<0.01) 表达程正相关, 因此VEGF和HIF-1α表达呈正相关 (r=0.641, P<0.05) 。
3 讨论
为阐明中药川贝抗血管形成机制, 本研究检测了平均炎细胞指数和血管百分比。哮喘模型小鼠肺组织可见大量炎细胞浸润支气管周围, 同时支气管上皮细胞损伤, 炎症是哮喘加重的一个重要因素[5]。炎症效应细胞 (肥大细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞等) 是血管形成的主要诱因, 这与哮喘患者血管生成增多相一致[6,7,8], 哮喘模型小鼠血管百分比明显增加。本研究发现, 中药川贝不仅可以改善气道炎症, 而且还可以减少血管生成, 结果证实中药川贝具有抗血管生成作用。
本研究证实了VEGF和HIF-1α表达的关系。近年研究表明, VEGF的激活受HIF-1α调控, 哮喘发作时HIF-1α表达增加, 从而使VEGF表达上调, 最终引起血管生成增加, 这与文献结果相一致。
在哮喘模型小鼠还发现支气管上皮细胞, 肺泡内皮细胞和血管内皮细胞VEGF表达增加, 此结果明确了VEGF表达和血管百分比之间的关系。众所周知, 在血管生成过程中, VEGF起核心作用[9]。中药川贝降低降低VEGF表达, 抑制内皮细胞增殖和血管生成, 最终降低血管百分比, VEGF表达降低可能是中药川贝抗血管生成的机制之一。
终上所述, 中药川贝可以减轻气道炎症, 降低VEGF和HIF-1α表达, 从而抑制哮喘模型小鼠肺组织血管生成, 本研究支持中药川贝支持治疗人类哮喘的良好作用。
摘要：目的 确定中药川贝对哮喘模型小鼠血管生成的作用及机制。方法 建立哮喘模型小鼠并且将小鼠随机分为三组, 即模型组 (OVA致敏的小鼠) 、中药川贝组 (中药川贝治疗的小鼠) 和PBS组 (正常对照组的小鼠) , 中药川贝组小鼠分别给予中药川贝 (9.0g/kg) 。对模型小鼠的气道炎症、血管生成、血管内皮生长因子 (VEGF) 和缺氧诱导因子-1α (HIF-1α) 进行研究。结果 与哮喘模型组小鼠相比, 中药川贝组可以改善过敏性气道炎症, 并显著减少血管百分比, 也降低VEGF和HIF-1α的表达。血管百分比与VEGF和HIF-1α表达呈正相关, 同时VEGF和HIF-1α表达呈正相关。结论 结果表明, 中药川贝具有重要的抑制哮喘模型小鼠血管生成作用。中药川贝通过抑制VEGF和HIF-1α表达实现抗血管生成活性。
关键词：血管生成,哮喘,中药川贝,血管内皮生长因子,缺氧诱导因子-1α
参考文献
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哮喘模型 第2篇
关键词：罗格列酮,哮喘,气道重塑,平滑肌肌动蛋白-α
平滑肌肌动蛋白-α(SMA-α)是平滑肌的主要标志物,可反映平滑肌细胞的数量及其收缩能力的改变[1],而气道平滑肌(the airway smooth muscle,ASM)收缩导致支气管狭窄是哮喘时气流受限的主要因素。ASM增生肥大是气道重塑的特征性改变。过氧化物酶体增殖活化受体在哮喘气道炎症及重塑中发挥重要作用,但其对气道SMA-α表达有何影响目前尚无相关报道。为此我院应用卵白蛋白(OVA)致敏小鼠复制慢性哮喘模型,观察过氧化物酶体增殖活化受体激动剂罗格列酮雾化吸入对气道炎症及重塑的影响,为开辟哮喘治疗新途径提供理论依据。
1材料与方法
1.1 材料
健康雌性清洁级6～8周龄BALB/C小鼠(徐州医学院实验动物中心提供)32只、鸡卵白蛋白(OVA,Grade V,美国Sigma公司)、罗格列酮(葛兰素史克公司)、地塞米松注射液(江苏涟水制药厂)、SMA-α抗体(武汉博士德公司)、超声雾化器(江苏鱼跃医疗器械厂)。
1.2 方法
将32只小鼠按随机数字表法分为4组,每组8只。正常对照组(A组)、哮喘模型组(B组)、哮喘地塞米松干预组(C组)、哮喘罗格列酮干预组(D组)。B、C、D 3组参照文献[2]方法建立哮喘模型:第0、7、14天腹腔注射10%OVA致敏液0.2ml,第22天开始每天雾化吸入1%OVA溶液30min,持续4周。C组每次激发前1h雾化吸入地塞米松(1mg/kg)30min。D组每次激发前1h雾化吸入罗格列酮(5×10-5mol/L)30min。A组以等量生理盐水代替腹腔注射并雾化吸入。所有小鼠于末次雾化吸入24h后处死。左肺切除后置于10%中性甲醛中固定。然后行HE染色观察气道壁病理变化,免疫组化SABC法测定肺组织SMA-α的表达。以图像分析软件测定支气管基底膜周径(Pbm)、总管壁面积(WAt)、内壁面积(WAi)、平滑肌面积(WAm)。
1.3 统计学方法
计量资料以
2结果
2.1 临床表现
B组激发后,出现烦躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、二便失禁等症状。A组无明显异常反应。C 、D组也出现与B组相似症状,但程度明显较轻。
2.2 HE染色
A组小鼠气道上皮无增厚,管壁及周围无炎症细胞浸润,肺泡壁结构完整。B组支气管上皮水肿、增厚、脱落,气道壁及周围有大量炎性细胞浸润,黏膜下层和ASM增厚,上皮下及ASM周围有大量的胶原沉积,气道壁厚度明显增高。C、D组相似,气道炎症减轻,管壁旁仅有少量炎症细胞浸润,上皮细胞排列整齐,管壁无明显增厚。
2.3 气道形态学参数测定
与A组比较,B组小鼠ASM厚度和上皮厚度均显著增加(P<0.05),气道直径显著减小(P<0.05);C、D组ASM厚度和上皮厚度均增加(P<0.05)。气道直径亦减小(P<0.05)。与B组比较,C、D组ASM厚度和上皮厚度均显著下降(P<0.05),气道直径显著增大(P<0.05)。C、D组上述指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
注:与A组比较,*P<0.05;与B组比较,#P<0.05
2.4 气道SMA-α的表达
免疫组化显示ASM阳性反应呈棕色。A组SMA-α染色阳性率为(10±2)%,B组SMA-α染色阳性率为(840±4)%,C组SMA-α染色阳性率为(21±2)%,D组SMA-α染色阳性率为(25±3)%。与A组比较,B、C、D组小鼠气道SMA-α表达水平显著升高(P<0.05);与B组比较,C、D组小鼠气道SMA-α表达水平显著下降(P<0.05);C、D组SMA-α表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。
3讨论
气道重塑是难治性哮喘的病理基础之一。研究显示,主要与ASM增生肥大、基底膜增厚及管壁玻璃样变等有关,由此引起管腔狭窄而导致不可逆的气流受阻及持续的气道高反应性。但目前关于哮喘病理过程的诸多方面还不十分清楚。本实验显示,与A组比较,B组ASM肌层显著增厚(P<0.05),提示哮喘可导致ASM的增生和肥大。而C、D组与B组比较,ASM肌层厚度显著下降(P<0.05),提示两者皆可延缓不可逆性气道重塑的进程。SMA-α是平滑肌特有的肌动蛋白,是肌丝的主要成分和功能基础,在细胞收缩、舒张及维持细胞结构和功能上起着重要作用。目前发现支气管平滑肌中有α、β、γ 3种肌动蛋白亚型,其中以α亚型所占比例最高。肌动蛋白含量对平滑肌收缩能力具有较大影响[3]。Ma等[4]发现,ASM分为收缩型和分泌型,前者SMA-α水平明显高于后者。而Brameley等[5]研究显示,中度哮喘患者ASM收缩变短能力及缩短时产生的张力均较非哮喘者增加,提示哮喘时ASM以收缩型主。ASM数量增加可导致SMA-α表达上调。哮喘时SMA-α表达上调,可能不仅限于在ASM的高表达,研究证实成纤维细胞亦表达SMA-α。哮喘气道上皮下纤维化时成纤维细胞增生及成纤维细胞迁徙并转化为有收缩能力的肌成纤维细胞,亦可能增加SMA-α的表达[6]。
哮喘模型 第3篇
关键词：健脾补肺化痰方,哮喘,气道重塑,大鼠,全血五元素
对于哮喘缓解期的治疗,近10余年来治疗重点是长期吸入性糖皮质激素(Inhaled corticosteroids,ICS)进行局部抗炎,中医学认为,支气管哮喘(bronchial asthma,BA)在缓解期的特点是肺、脾、肾脏气虚,且哮有夙根,若触遇诱因则易引起BA反复发作,致使正气不支,疾病迁延难愈[1,2,3,4]。为突出中医治疗优势,从中医角度深刻认识支气管哮喘的本质,从而更好地提高临床疗效,我们根据中医药治疗哮喘的临床经验,遵循缓解期以“健脾气补肺气以化痰”的立方法则,确立了以健脾补肺化痰方为主方的治疗方法[5,6,7]。在既往研究的基础上,制订了严谨的科研设计,以哮喘气道重塑模型幼龄大鼠为对象,观察健脾补肺化痰方对幼龄大鼠全血五元素摄入的影响,来论证中医药治疗哮喘所具备的优势,现将研究结果报道如下:
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物与药物
清洁级SD幼龄大鼠,雌雄各半,体重(90±5)g,由安徽省长临河动物实验基地提供。共180只,随机分为6组:正常组、模型组、西药组(地塞米松0.75 mg/片,浙江仙居制药厂生产),每组30只;健脾补肺化痰方(健脾补肺化痰方:炙黄芪10 g、太子参8 g、炒白术8 g、茯苓6 g、陈皮6 g、炙甘草6 g、葶苈子6 g、薏苡仁10 g、砂仁5 g、桔梗8 g、山药10 g、白扁豆10 g,每剂用60～80 mL水混匀,所含生药量为0.866～1.155 g,组方为冲剂剂型。)组分为4周组、8周组、12周组,每组30只。适应性喂养7 d后开始实验。
1.1.2 试剂和仪器
原子吸收光谱仪元素专用检测试剂(北京博晖创新光电技术股份有限公司);原子吸收光谱仪BH5500S(北京博晖创新光电技术股份有限公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 造模及给药方法
1.2.1. 1 造模方法
常规饲养7 d后复制BA大鼠模型,除正常组外,各组参照文献[3],分别于第1天及第8天大鼠腹腔内注射新鲜配制的卵蛋白溶液1 mL(内含卵蛋白100mg,氢氧化铝100 mg)致敏,第15天开始将大鼠逐个放入体积约为4 L密闭容器中,雾化吸入1%卵蛋白激发哮喘,隔日1次,雾化流量5 mL/min,每次20 min,共6周。以大鼠出现呼吸急促深快,肋间隙凹陷,腹肌出现明显收缩,呛水,喘鸣等呼吸道梗阻症状为激发成功。
1.2.1. 2 给药方法
引喘结束后第8天,西药组地塞米松0.75 mg/(kg·d),用蒸馏水融化为3 mL灌胃,连续给药4周。健脾补肺化痰方组予以健脾补肺化痰方7.38 g/(kg·d)灌胃,4周组用药4周,8周组用药8周,12周组用药12周,正常组、模型组予以等剂量生理盐水灌胃,每日1次,连续4周。各组大鼠均于最后给药后常规喂养1周,再予指标测定[7,8,9]。
1.2.2 取血
将大鼠各组大鼠用2%戊巴比妥0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉,于测定肺功能后迅速从体瞄箱取出,打开腹腔,腹主动脉取血2 mL。
1.3 指标测定
腹主动脉全血,加原子吸收光谱仪元素专用检测试剂,1∶31稀释后,按原子吸收光谱仪操作规程检测Cu、Zn、Ca、Fe、Mg浓度。分别统计正常组与哮喘模型组、西药组与哮喘模型组和健脾补肺化痰方各组与哮喘模型组大鼠全血五元素含量。
1.4 统计学方法
应用SPSS 17.0统计分析软件将各组资料建成数据库文件,计量资料采用均数±标准差表示,组间比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 西药组与哮喘模型组大鼠全血五元素比较
西药组与模型组相比,Zn浓度明显高于模型组(P<0.01);Fe浓度低于模型组(P<0.05);Cu、Ca、Mg浓度与模型组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
2.2 健脾补肺化痰方各组与哮喘模型组大鼠全血五元素比较
模型组与正常组比较,Zn浓度低于正常组(P<0.01);Ca浓度低于正常组(P<0.05);Fe浓度高于正常组(P<0.05);Cu、Mg浓度与正常组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。
健脾补肺化痰方4周组Zn浓度明显高于模型组(P<0.01);Cu、Ca、Mg、Fe浓度与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。健脾补肺化痰方8周组Zn浓度明显高于模型组(P<0.01);Cu、Fe浓度低于模型组(P<0.05);Ca、Mg浓度与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。健脾补肺化痰方12周组Zn浓度明显高于模型组(P<0.01);Cu、Fe浓度明显低于模型组(P<0.01);Ca、Mg浓度与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。健脾补肺化痰方各组间比较:健脾补肺化痰方4周组全血Cu浓度高于8周组、12周组,差异有高度统计学意义(P<0.01);其余各组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。
注:与正常组比较,*P<0.01,﹡P<0.05;与模型组比较,△P<0.05,▲P<0.01
3 讨论
大量的临床实验表明,微量元素与哮喘有着密切的关系。周宁等[10]发现哮喘患儿血中必需微量元素Zn、Se、Cr、Sr及宏量元素B、Mg比健康对照组显著降低,而Fe、Cu、Ca、V、Al、Co及有害元素Cd则显著升高。结果表明,小儿哮喘与人体免疫缺陷、部分微量元素降低及有害微量元素升高密切相关。冯学斌等[11]对21例支气管哮喘患儿血清12种微量元素钙、镁含量,以及外周血T细胞亚群进行检测。结果哮喘组血清锌、铁、铜、锂、钙均值明显低于对照组,锂作为重要生物学活性的微量元素,不仅具有抗病毒作用,而且可促进T细胞发育、成熟。且铁与T细胞增殖功能呈显著正相关,而与CD4+细胞百分率呈负相关,铝与T细胞增殖功能呈正相关;钛与CD4+/CD8+比值呈正相关。表明血清微量元素与T细胞亚群间有密切关联。哮喘时微量元素降低或缺乏,可能通过相应酶活性改变,使T细胞功能受损,临床上表现反复呼吸道感染,而促使哮喘发作。
本课题所采用的健脾补肺化痰方由炙黄芪、太子参、炒白术、茯苓、陈皮、炙甘草、葶苈子、薏苡仁、砂仁、桔梗、山药、白扁豆组成。方中太子参、炙甘草性平味甘,健脾益气以扶正;炙黄芪补肺脾之气;茯苓、炒白术健脾补气;葶苈子化痰;陈皮为脾、肺二经之气分药,既能理气,又能燥湿。实验结果表明模型组大鼠全血五元素含量与正常组存在显著差异,Zn、Ca浓度低于正常组,Fe浓度高于正常组,说明哮喘的发生于低Zn、低Ca、高Fe密切相关;健脾补肺化痰方各组与模型组比较,Zn浓度明显高于模型组,Cu、Fe浓度明显低于模型组,说明健脾补肺化痰方能改善哮喘气道重塑模型幼龄大鼠的低Zn、低Ca、高Fe状态,从而减轻哮喘症状。
哮喘模型 第4篇
关键词：咳嗽变异性哮喘,白细胞介素-4,γ干扰素,支气管肺泡灌洗液,黄龙止咳口服液
咳嗽变异性哮喘 (cough variant asthma,CVA)是哮喘的一种潜在形式或特殊类型。现代中医文献根据发病特点及临床表现将其命名为“哮咳”、“风咳”等。目前多数学者认为CVA与典型哮喘的发病机制相同,研究表明[1,2]:CVA与多种炎症细胞、炎症介质、细胞因子共同参与相互作用所致的慢性非特异性炎症的病理基础相吻合,其间接表现为气道高反应性。新近研究发现[3,4],辅助性T淋巴细胞亚群 (Th细胞 )功能紊乱, 可能是支气管哮喘发病中的一个重要环节。而Th细胞根据所分泌的细胞因子的不同,可进一步分为Th1和Th2两个亚型,γ干扰素 (IFN-γ)、白介素4(IL-4)分别是Th1和Th2的细胞因子。因此, 研制具有调节IFN-γ/IL-4免疫功能的中药有重要意义。本实验通过观察黄龙止咳口服液对CVA模型动物血 清和支气管肺泡灌洗液 (BALF)中IL-4、IFN-γ水平的影响 , 探讨CVA发病机制和黄龙止咳口服液的治疗作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1动物SPF级Wistar大鼠 (160~200 g)80只,北京维通利华实验动物技术有限公司提供, 许可证号:SCXK(京)2012-0001。
1.1.2药物黄龙止咳口服液 ,由炙麻黄、地龙、杏仁、紫苏子、桑白皮、前胡、旋覆花、蝉蜕组成,购自南京市中医院药剂科, 用蒸馏水煎至生药1.5 kg/L,4℃冰箱保存。先声咳喘宁:江苏先声制药有限公司,国药准字Z32020967,规格10 m L/支。吸入用布地奈德混悬液(普米克令舒 ): 澳大利亚阿斯利康有限公司 , 批号3144771,规格1 mg/2 m L。
1.1.3试剂氢氧化铝干粉 : 南京市中医院药剂科提供。卵蛋白(OA):美国Sigma公司(批号1001581887);辣椒素 (纯度>95%): 南京都莱生物技术有限公司(批号19404-86-4),取辣椒素30.5 mg,用吐温-80溶液及无水乙醇各1 m L溶解, 加入生理盐水并稀释成1×10-4mol/L溶液;IL-4酶联免疫试剂盒:联科生物科技有限公司(批号:230430312);IFN-γ酶联免疫试剂盒:联科生物科技有限公司(批号238030312)。
1.1.4器材402AI超声雾化器 (江苏鱼跃医疗设备股份有限公司);自动洗板机(Bio-Tek ELX50);酶标分析仪(Bio-Tek Epoch)。
1.2 方法
1.2.1 CVA动物模型的建立采用卵蛋白和氢氧化铝共同激发致敏的方法造模。将除正常组10只大鼠外, 其余以配制的含卵蛋白1 mg和氢氧化铝10 mg的生理盐水1 m L作皮下注射。分别在两后足跖、腹股沟、腰、背、颈部共取10点,每点皮下注射0.05 m L,同时腹腔注射0.5 m L,共计1 m L,第8天重复1次以加强致敏。从第15天起,将大鼠置于密闭有机玻璃罩内, 给予含1%OA溶液的生理盐水超声雾化激发20 min,以激发哮喘 ,以大鼠腹肌明显收缩为阳性 ,直到出现呼吸加深、加快等呼吸道痉挛症状,提示造模成功[5]。
1.2.2分组与给药将造模成功的大鼠随机分为7组(正常组、模型组、布地奈德组、先声咳喘宁组、黄龙高剂量组、黄龙中剂量组、黄龙低剂量组),每组10只。黄龙止咳口服液低、中、高剂量组给药浓度为0.75、1.5、3.0 kg/L;先声咳喘宁口服液组4.2 m L/kg灌胃给药;布地奈德组(0.12 m L/kg)配以等量的生理盐水雾化吸入给药;正常组及模型组同步用1 m L/100 g蒸馏水灌胃。大鼠给药剂量按60 kg成人体表面积换算而来。连续给药14 d,第15天处死动物。
1.2.3指标检测1咳嗽次数测定方法:将每组大鼠放置在密闭箱内,记录2 min内雾化吸入浓度为1×10-4mol/L辣椒素溶液后的咳嗽次数,将给药2、4、6 d内数据进行统计测定。2血清中IL-4、IFN-γ的含量:腹主动脉取血4 m L,标本由无菌干燥管收集,静置1 h后,4℃2000 r/min离心10 min, 分离血清 ,-20℃以下保存 ,测定方法严格按照酶联免疫试验试剂盒说明书操作。3BALF中IL-4、IFN-γ的含量: 左肺行支气管肺泡灌洗术,分3次进行,分别灌入生理盐水4、3、3 m L,共计10 m L。将3次收集的BALF混合均匀, 再以1500 r/min离心5 min,取上清液,-20°C保存,测定方法严格按照酶联免疫试验试剂盒说明书操作。
1.3 统计学方法
用SPSS 16.0软件, 计量资料采用均数±标准差(±s)表示,组间比较采用t检验;除正常对照外,其余各组间比较采用方差分析, 两两比较采用LSD-t检验,以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠咳嗽次数的测定结果比较
用药后第2、4、6天,与正常组比较,模型组咳嗽次数明显增多(P < 0.01),提示造模成功。用药后第2、4、6天,各治疗组咳嗽次数与模型组比较均明显减少(P < 0.01),提示各治疗组药物都具有止咳的功效。用药后第6天,黄龙各剂量组与先声咳喘宁组、布地奈德组比较,差异无统计学意义(P > 0.05),提示治疗组药物之间止咳作用程度相似。黄龙高剂量组与低、中剂量组比较差异有高度统计学意义 (P < 0.01),提示黄龙止咳口服液在改善咳嗽症状方面呈现一定的剂量依赖性。见表1。
注:与正常组比较,★P < 0.01;与 模型组比较 ,▲P < 0.01;与 黄龙高剂量组比较,*P < 0.05
2.2 各 组 大 鼠 血 清 中 IL -4 和 IFN -γ 的 检 测 结 果比较
与正常组比较, 模型组血清IL-4值明显升高,而IFN-γ值明显降低(P < 0.01),提示IL-4、IFN-γ与CVA的发病密切相关;与模型组比较,各治疗组的血清IL-4值明显降低,IFN-γ值明显升高 (P <0.05或P < 0.01), 提示各治疗组均对CVA有一定的治疗作用; 与黄龙高剂量组比较, 先声咳喘宁组IFN-γ值相对降低 (P < 0.01);布地奈德组IFN-γ值相对降低(P < 0.05),提示在调节血清IFN-γ含量水平,黄龙高剂量组优于先声咳喘宁和布地奈德组;黄龙高剂量组IL-4和IFN-γ含量与其低、中剂量组比较差异有统计学意义(P < 0.05),提示在调节血清中显示一定的量-效关系。见表2。
(ng/L,±s)
注:与正常组比较,★P < 0.05,★★P < 0.01;与模型组比较,▲P < 0.05,▲▲P <0.01;与黄龙高剂量组比较,*P < 0.05,**P < 0.01;IL-4:白细胞介素 4;IFN-γ:γ 干扰素
2.3 各组大鼠支气管肺泡灌洗液中 IL-4 和 IFN-γ 含量的检测结果比较
与正常组比较, 模型组BALF中IL-4值明显升高,而IFN-γ值明显降低(P < 0.01),提示CVA发病可影响BALF中IL-4和IFN-γ的含量; 与模型组比较,各治疗组BALF中IL-4明显降低,IFN-γ明显升高(P < 0.05或P < 0.01),提示各治疗组均能起到一定的治疗作用;与黄龙高剂量组比较,先声咳喘宁组、布地奈德组BALF中IL-4值相对升高,IFN-γ值相对降低(P < 0.01),提示黄龙治疗组在调节BALF中IL-4和IFN-γ含量优于其他治疗组;黄龙高剂量组与低、中剂量组比较差异有统计学意义(P < 0.05或P <0.01),显示一定的量-效关系。见表3。
注:与正常组比较,★P < 0.05,★★P < 0.01;与 模型组比较 ,▲P < 0.05,▲▲P < 0.01;与 黄龙高剂量组比较 ,*P < 0.05,**P < 0.01;IL-4:白 细胞介素 4;IFN-γ:γ 干扰素
3 讨论
本方在中医整体观念、辨证论治原则的指导下,针对CVA患儿的病机多为风痰痹阻、肺热气逆的特点,确定了祛风解痉、宣肺化痰、清气降逆的基本治法,方中炙麻黄有宣肺平喘、祛风降气之功;地龙有清肺平肝、平喘通络之功,为清热解痉、止咳平喘之要药,两药相合宣降并举、解痉平喘,使肺气宣达通畅,则咳自止喘自平,共为君药。杏仁有宣肺降气、止咳化痰之功。紫苏子有利肺平喘、下气止咳之功。桑白皮有清肺泄热、止咳平喘之功。前胡有宣肺降气、降气化痰之功,四者均为臣药。旋覆花、蝉蜕为佐使之药,其中旋覆花有降气消痰、和中止逆之功,为治疗呛咳之要药。蝉蜕有清热宣肺、祛风解痉之功,为治疗刺激性干咳与痉咳之要药。诸药合用,宣降同施,温润并用,相辅相成,共奏清热宣肺、祛风解痉、顺气化痰、降逆止咳之功,使风去热清、气顺痰消而咳嗽自愈。本课题前期研究结果表明[6], 黄龙方治疗小儿CVA ( 风热夹痰证)在改善患儿总体疗效、主症、次症及证候等诸方面均优于对照组,显示了中医药治疗本病的优势。
现代医学研究认为[7,8],CVA其发病与免疫因素有关。细胞免疫方面发现哮喘的免疫功能实质是Th1/Th2亚群功能失调,表现为Th1功能不足,Th2功能亢进。研究表明[9],纠正Th1/Th2功能失衡 ,可以减轻气管哮喘的症状。IFN-γ在支气管哮喘中起保护作用,在Th1细胞因子中具有促进炎性反应, 较强的抗病毒、抗细菌感染和抗寄生虫感染,加强宿主的防御和参与免疫调节的作用,其分泌减少与哮喘的发生关系密切[10,11]。而Th2主要分泌IL-4等细胞因子与Ig E合成、嗜酸细胞的浸润和激活密切相关,参与CVA变应性炎症的发生和发展, 被认为是Th2转化的必需因子,并抑制Th1细胞的效应功能[12]。
CVA患儿以咳嗽为主要临床表现。实验结果显示模型组大鼠的咳嗽次数多于正常组(P < 0.01),证实造模成功。用药后第2天,各治疗组咳嗽次数与模型组比较均减少 (P < 0.01), 说明各治疗组均有效缓解CVA大鼠的咳嗽症状。用药后第6天,黄龙各剂量组与先声咳喘宁组、布地奈德组比较,差异无统计学意义(P > 0.05),说明治疗组药物之间止咳作用程度相似。黄龙剂量组间比较,高剂量组与低、中剂量组比较有显著性差异(P < 0.01),说明随着黄龙剂量的增加,止咳效果更加明显。
对血清中IL-4、IFN-γ含量的影响实验结果显示:连续给药治疗14 d后,与模型组比较,各治疗组血清IL-4指标含量明显降低、IFN-γ含量升高 (P <0.01),说明IL-4、IFN-γ与CVA的发病密切相关。治疗方面,黄龙高剂量组与低、中剂量组比较,IL-4含量明显降低,IFN-γ含量明显升高(P < 0.05),说明随着黄龙止咳口服液剂量加大, 治疗CVA的效果更显著,黄龙止咳口服液对CVA治疗作用具有量效关系。与先声咳喘宁组和布地奈德组比较,黄龙高剂量组血清中IFN-γ含量较高, 差异有高度统计学意义 (P <0.01), 而血清中IL -4含量低 , 无统计学差异 , 说明在调节血清IFN-γ含量水平,黄龙高剂量组优于先声咳喘宁和布地奈德组,其调节血清中IL-4含量水平与先声咳喘宁和布地奈德相似。疗效方面,与正常组比较, 先声咳喘宁组和布地奈德组在调节血清IL-4、IFN-γ的含量有显著性差异 (P < 0.05), 说明其一定程度上缓解CVA病情,使其接近正常水平。而黄龙高剂量组与正常组比较无显著性差异(P > 0.05),说明其疗效优于其他对照组,从而达到治疗CVA的目的。
对支气管BALF中IL-4、IFN-γ的影响实验结果显示:BALF中IL-4指标含量明显降低、IFN-γ含量升高, 说明BALF中IL-4、IFN-γ的含量水平与CVA的发病密切相关。治疗方面,黄龙高剂量组与低、中剂量组比较,IL-4含量明显降低,IFN-γ含量明显升高,具有显著性差异(P < 0.05或P < 0.01),说明黄龙止咳口服液对CVA治疗作用具有量效关系。与布地奈德组比较,黄龙高剂量组BALF中IL-4含量低,有显著性差异 (P < 0.01),IFN-γ含量高, 但无统计学差异,说明在调节BALF中IL-4水平优于布地奈德组,在调节IFN-γ水平与其相似。与先声咳喘宁组比较,黄龙高剂量组BALF中IL-4含量低,IFN-γ含量高,无统计学差异, 说明两者通过调节BALF中IL-4、IFN-γ含量达到治疗CVA的目的水平相似。疗效方面,与正常组比较,先声咳喘宁组和布地奈德组调节BALF中IL-4、IFN-γ含量有显著性差异 (P < 0.05),说明其一定程度上缓解CVA病情, 使其接近正常水平。而黄龙高剂量组与正常组比较无显著性差异(P> 0.05),说明其疗效优于其他对照组 ,从而达到治疗CVA的目的。