抑制作用范文（精选12篇）
抑制作用 第1篇
关键词：惰性介质,粉尘爆炸,抑制效果,抑制机理,协同效应
粉尘燃烧与爆炸是化工、冶金、煤炭等行业中的严重安全隐患,深入研究和认识粉尘燃烧爆炸过程及其惰化机理,对于采取合理技术措施预防及减缓粉尘爆炸风险具有十分重要的理论和实际意义。其中,基于本质安全替代和缓和原则 的粉尘爆 炸惰化是 最为常用 的抑爆手 段。惰化即向可燃粉 尘中添加 惰性介质 以抑制粉 尘爆炸。该方法常见于煤矿开采时在煤井巷道内撒布岩粉, 对沉积煤尘进行惰化抑爆。目前,对于粉尘爆炸惰化的研究多集中于惰性介质添加量对粉尘爆炸特性的影响, 伍毅等比较了碳酸钙、碳酸氢钠和碳酸氢钾三种惰性介质对煤尘最大爆炸压力的影响,发现碳酸钙的抑爆效果最优,碳酸氢钾最差;谭迎新等发现煤尘最大爆炸压力和最大升压速率随石灰石添加量增加而下降,且随煤粉粒径的减小,达到相同的抑爆效果所需的石灰石用量将增加;Chatrathi等在1 000L球形容器中采用碳酸氢钠、磷酸二氢铵和岩粉分别对匹兹堡煤、玉米淀粉、聚乙烯、蒽醌和铝粉进行了惰化,得到了相应的完全惰化需求量;甘媛等发现碳酸钙的爆炸抑制效力与可燃粉尘爆炸机理有关。就现有的研究工作而言,涉及惰性介质抑制机理及其协同效应的研究相对较少。协同效应是指两种或两种以上的组分组合在一起,所产生的作用大于各组分单独应用时的作用,其在助燃剂的开发过程中已被广泛运用。 从工程实际的角度,工业过程中大多数固体惰性介质单独使用的惰化效能均不高,要达到理想的惰化水平通常需要添加较高的惰性介质量。因此,深入研究惰性介质惰化机制以及不同惰化剂之间的协同作用,对推动粉尘爆炸惰化技术的发展和应用有重要意义。
基于上述背景,从高效利用惰性介质、提高惰化效率的角度,通过系统实验测试研究了三种惰性介质及其混合物对煤粉爆炸的抑制行为,对比分析了不同惰性介质的抑制效果及机理以及惰性介质之间的协同作用。
1 实验介质及测试系统
1.1 粉尘试样及惰性介质
实验用烟煤粉、无烟煤粉由市售煤块经破碎、研磨、 筛分后制得。烟煤粉、无烟煤粉的粒径分布分别为43~ 75μm、75~125μm。实验过程 中涉及的 惰性介质 为碳酸钙、磷酸二氢铵、氢氧化铝。其中,碳酸钙廉价易得,是工业实际中使用最多的固体惰性介质,磷酸二氢铵为干粉灭火器主要成分,而氢氧化铝则为常用阻燃剂。
1.2 测试系统
爆炸实验主要利 用Siwek 20-L球型测试 系统完成。整个测试系统主要由装置本体、控制系统和数据采集系统三部分组成,结构如图1所示。其中,装置本体为带冷却水的不锈钢双层夹套球形结构;控制系统用来控制系统进气、触发采样、开阀喷粉、点火过程;数据采集系统则用于记录爆炸过程中压力的变化。
实验时,将系统内压力预先抽空至-60kPa,粉尘在2 MPa压缩空气携带下喷入球罐,形成常压下的粉尘云, 点火延迟时间 根据IEC、EN 14034、ASTM以及GB/T 16425推荐设为60ms,以确保粉尘云分散均匀。化学点火剂由锆粉、过氧化钡及硝酸钡按4∶3∶3的比例混合配制而成。
2 结果与讨论
2.1 碳酸钙的惰化行为及机制
实验在粉尘(烟煤粉、无烟煤粉)质量浓度为500g/ m3条件下,采用5kJ点火能量考查了碳酸钙惰性介质含量对两种粉尘爆炸猛烈度特性参数(pmax和(dp/dt)max)的影响,结果如图2所示。
由图2可以发现,无论烟煤粉或者无烟煤粉,随着惰性介质含量增加,粉尘最大爆炸压力及升压速率均出现一定程度的下降。这主要因为碳酸钙能在粉尘燃烧爆炸过程中充当冷源吸收粉尘燃烧反应释放的热量,使粉尘爆炸猛烈度降低。图中烟煤粉与无烟煤粉爆炸压力相差不大,压力上升速率明显不同,是由于烟煤粉及无烟煤粉中挥发分含量显著不同造成的。值得注意的是,图中两种粉尘混合体系爆炸猛烈度与碳酸钙添加量(质量分数0~50%范围)均近似呈线性关系。该结果在一定程度上表明碳酸钙的惰化机制主要为单一的物理吸热作用,此时碳酸钙吸热量正比于其质量,故爆炸猛烈度参数随碳酸钙添加量的增加而近似线性下降。
实验还给出了空气氛围下无烟煤及无烟煤/碳酸钙混合物(碳酸钙质量分数30%)的热重分析(TGA)结果, 如图3所示。TGA采用15 ℃ 的升温速率,升温范围为室温至800 ℃。从图中可以发现,无烟煤—碳酸钙混合物热重曲线在煤粉燃烧温度范围内(400~600 ℃)的失重速率明显低于纯无烟煤粉,这正是由碳酸钙的吸热作用造成的。当无烟煤氧化反应结束后,对于无烟煤—碳酸钙混合物,其在700 ℃左右又出现了一个失重峰,这一行为是由混合物中碳酸钙的分解造成的。然而,由于碳酸钙分解温度较高(煤粉氧化反应已经结束),且其分解反应诱导时间远长于煤粉脱挥发作用诱导时间,在惰化粉尘爆炸的过程中,碳酸钙的分解能力无法发挥,其对粉尘爆炸的抑制机理仅仅只是一种物理吸热作用。考虑到碳酸钙较低的比热容(约0.9kJ/(kg·K)),其对可燃粉尘爆炸的惰化效能将十分有限。这意味着实际应用中, 当采用碳酸钙作为惰化剂时,要获得理想的惰化水平,可能需要较高的惰性介质添加量。
2.2 磷酸二氢铵及氢氧化铝的惰化行为及机制
以磷酸二氢铵作为惰性介质,考察了粉尘(烟煤粉、 无烟煤粉)质量浓度为500g/m3、点火能量为5kJ时,粉尘爆炸猛烈度(pmax及(dp/dt)max)随磷酸二氢铵添加量的变化规律,结果如图4所示。不难看出,磷酸二氢铵对两种粉尘惰化行为基本一致,在惰性介质质量 分数为0~ 50%的范围内,粉尘爆炸猛烈度随磷酸二氢铵含量增加明显下降。
相比碳酸钙单纯的物理吸热惰化原理,磷酸二氢铵惰化机制更为复杂。这是因为磷酸二氢铵除充当冷源吸收热量之外,也通过自身化学分解进一步消耗反应热量, 其主要化学反应如下:
磷酸二氢铵分解产物能够稀释氧气,并在一定程度上阻碍粉尘燃烧火焰传播,隔离空气和粉尘颗粒。除上述作用外,磷酸二氢铵分解产生的游离氨还能快速夺取粉尘爆炸反应的自由基-OH,终止燃烧反应链,使燃烧火焰无法传播下 去。正是由于 上述物理 化学机制 的存在,磷酸二氢铵表现出较高的惰化效能。进一步比较图4数据发现,磷酸二氢铵质量分数为30%时,继续添加磷酸二氢铵,爆炸压力缓慢减小,惰化效能减弱。这一现象是由于高惰性介质含量下磷酸二氢铵难以完全分解,故惰化效能降低。
图5比较了空气氛围下获得的无烟煤及无烟煤/磷酸二氢铵混合物(磷酸二氢铵质量分数30%)的热重分析结果。可以发现,无烟煤/磷酸二氢铵混合物热重曲线相较于纯无烟煤在 煤粉燃烧 温度范围 内失重速 率明显更 低,且在200 ℃左右存在一个明显的失重峰。结合前文给出的磷酸二氢铵分级反应式,不难判断这是由于混合物中磷酸二氢铵分解造成的。该结果也证实了磷酸二氢铵在惰化粉尘爆炸过程中的确能较好地发挥其化学分解能力,故惰化效能相对较高。
此外,实验以烟煤粉为例,考察了氢氧化铝作为惰性介质添加进入500g/m3烟煤粉后的抑制行为,得到如图6所示的粉尘爆 炸猛烈度 随惰性介 质添加量 的变化规 律。结果发现,氢氧化铝对烟煤粉的惰化行为与磷酸二氢铵相似。这源于二者间类似的惰化原理及机制。即除了物理吸热外,氢氧化铝也能从化学分解方面惰化粉尘爆炸。经计算,在240~500 ℃范围内,氢氧化铝自身分解反应的吸热量高达1 967.2kJ/kg,这将在很大程度上降低粉尘爆炸猛烈度。反应生成的大量水蒸气能够显著降低密闭空间内的氧含量,尤其反应生成的三氧化二铝能在可燃粉尘颗粒表面形成致密保护膜,阻隔氧气的扩散以及颗粒中挥发分的释放,增强了氢氧化铝熄灭可燃粉尘燃烧的能力,表现出较高的粉尘爆炸惰化效能。此外,从图6中还可以看到,氢氧化铝质量分数为40%时惰化最高效,继续添加氢氧化铝惰化效能无显著提升,这同样是由于高含量下惰性介质分解效率降低造成的。
基于以上结果,比较图2、图4和图6可知,磷酸二氢铵及氢氧化铝的惰化效能明显强于碳酸钙,但在高惰性介质添加量下,二者均存在分解效率下降的问题。因此无论哪种惰性介质,要实现可燃粉尘爆炸的完全惰化均需添加较高的惰性介质量(质量分数至少高于50%)。这一结果强调了研究新型惰性介质、设法提高惰化剂利用效率的必要性。
2.3 固体惰性介质间的协同作用
对于以碳酸钙为代表的低效能惰性介质,其单独惰化粉尘爆炸时效能十分有限,而磷酸二氢铵及氢氧化铝在惰化粉尘爆炸过程中又存在不同程度分解效率下降的问题。为此,实验在烟煤粉质量浓度500g/m3、点火能量为5kJ条件下,以碳酸钙 为基础惰 性介质,分别按照10%的质量比例(相对含量)递增添加磷酸二氢铵或氢氧化铝进入碳酸钙中配制成新型复合惰化剂(复合惰化剂总含量保持不变),考察了复合惰化剂对烟煤粉爆炸的惰化行为。
表1、表2给出了磷酸二氢铵、氢氧化铝分别与碳酸钙混合作为惰性介质时,不同复配比例下得到的烟煤粉爆炸压力即升压速率的变化情况。分析表1中数据,随复合惰化剂添加比例变化,粉尘爆炸压力逐渐减小。当复合惰化剂中添加的磷酸二氢铵质量分数增至30%时, 爆炸压力(0.26 MPa)即低于添加纯30%磷酸二氢铵时的爆炸压力(0.27 MPa)。说明磷酸 二氢铵与 碳酸钙混 合确实能在一定程度上提高惰性介质惰化效能。究其原因,一方面是因为高效能惰性介质的优先快速分解吸收了部分粉尘燃烧释放的能量,提高了碳酸钙的吸热效率; 另一方面则是由于磷酸二氢铵化学分解中产生的磷酸能与碳酸钙反应:
H3PO4+CaCO3→CaHPO4+H2O+CO2↑
该反应加速磷酸二氢铵分解,反应产物进一步稀释氧气以及阻碍粉尘火焰传播,抑制了粉尘的燃烧,因而复配惰化剂表现出明显的协同效应。对比表2中数据,相比添加等量氢氧化铝单独作用时,复合惰化剂惰化效能并没有增强,这是由于碳酸钙与氢氧化铝之间未产生抑制粉尘燃烧的附加反应,未表现出协同效应。由此表明, 两种惰化剂是否存在协同效应取决于二者在粉尘燃烧爆炸条件下是否发生抑制粉尘燃烧的附加反应,即一定条件下,惰化剂间确实存在协同效应。
3 结 论
(1)碳酸钙在可燃粉尘爆炸过程中仅通过自身的物理吸热作用抑制粉尘燃烧和爆炸,所以实验测试范围内可燃粉尘爆炸压力及升压速率均随碳酸钙含量的增加近似线性降低。
(2)相较碳酸钙,磷酸二氢铵及氢氧化铝除了物理吸热之外还能通过自身化学分解反应生成水蒸气,捕获爆炸反应自由基,并有在粉尘颗粒表面生成保护膜等作用, 进一步抑制粉尘的燃烧爆炸,故惰化效能明显较高。但随着添加量的增加,磷酸二氢铵及氢氧化铝均存在化学分解不完全现象,导致二者惰化效率逐渐下降。
抑制作用 第2篇
发挥物价部门职能作用 抑制物价过快上涨
南川区物价局
（2008年10月 日）
近两年,随着粮油、石油、矿产资源等原材料价格大幅上涨，世界范围内多数国家都面临通货膨胀的压力。今年以来，党中央、国务院高度重视物价工作，先后把“双防”、“一保一控”作为宏观调控的首要任务。可以说，严峻的形势和紧迫的任务已把物价部门推到了10多年来最为瞩目的历史浪尖，成为参与实施经济调控工作的重要部门。作为基层物价部门，我们深刻认识到：在这场艰巨而复杂的价格调控战斗中，如果物价部门无所建树，则物价部门的地位和形象就会黯然失色，就有可能会在下一轮机构改革中被削弱。为此，我局紧紧围绕全区价格调控目标，自我加压、突出重点、强化监管、狠抓落实，充分发挥物价职能，努力遏制物价过快上涨势头，为全区经济社会发展营造了较为稳定的价格环境。
一、树立“大物价”意识，牵头抓好价格调控的协调工作
市场价格调控工作是一项系统的综合性工作，涉及商品
生产及储备、市场流通及监管等多个环节，需要各级各部门乃至最广泛的基层组织共同参与和落实好各项价格调控政策。作为全区价格调控工作的牵头部门，区物价局主动加强与区纪委、监察、农业、畜牧、粮食、工商、供销等部门的联系，多次召开贯彻落实价格调控政策协调会议，及时传达中央及重庆两级关于落实市场价格调控政策的工作意见，研究出台了《重庆市南川区关于落实市场调控政策的工作意见》，认真收集和反映各级各部门在落实市场价格调控政策工作中存在的问题和困难，从而为我区认真落实市场价格调控政策提供了可靠的组织保障。
二、加强价格监测，准确掌握市场价格动态
价格是经济运行的综合反映，价格监测是物价部门的一项重要基础工作。我局监测的品种绝大部分属市场调节价，少部分属政府定价或政府指导价，都是与老百姓生产生活密切相关的。通过实施监测，可以及时掌握市场价格动态，及早发现经济运行中的苗头性、趋向性问题，有效防控市场价格异常波动。一是对8类商品及服务近300个品种价格实行按旬监测报告制度，并按月撰写月度分析材料报送区领导参阅。二是对粮油肉禽蛋菜水产品等近30个品种的价格实行日监测报告制度，及时向上级反映市场动态。在价格监测具体工作中，监测人员始终坚持实时、实地采价原则，节假日也从未间断过，同时注重询问、了解价格变动原因，多方求
证，从而较好地保证了价格监测质量。今年以来，我局累计报送区委办、区府办市场价格信息近百条，被采用50余篇，有效发挥了价格监测工作服务政府决策的作用。
三、实行临时价格干预，坚决遏制市场价格过快或不合理上涨
今年以来，国家和重庆先后出台了4次大的临时价格干预措施。一是对粮食、食用植物油、猪肉、牛奶、鸡蛋、液化石油气等6种重要商品实行调价备案管理制度；二是对帐篷、矿泉水、方便面等16种抗震救灾生活必需品实行临时限价管理；三是对钢材、砖瓦、水泥等11种救灾物资价格实行临时限价管理；四是对供发电用煤价格实行临时限价管理。对每起临时价格干预措施，我局都坚持事前成立专门工作小组、召开由管理对象参加的专题情况通报会、通过新闻媒体广泛宣传有关政策、深入市场摸清掌握第一手价格资料，事中认真受理调价备案、加强价格巡查，事后通过新闻媒体及时告知取消干预措施等，从而确保各项临时价格干预措施顺利开展，有效遏制了相关商品价格过快或不合理上涨的势头，为稳定物价起到了非常重要的作用。我局还以实行临时价格干预措施为契机，对西街农贸市场70余个肉摊点全面实行明码标价制度，受到群众好评。
四、贯彻落实资源性产品价格改革，坚决防范价格连琐反应
今年6月份，国家出台了两项大的价格改革措施，对成品油价格和电网电价作了较大幅度上调，重庆还上调了旅客运输燃油附加标准。这两项价格改革力度大、涉及面广、政策性强，我局坚持在摸清实际情况的基础上，及时转发文件，加大宣传力度，严格政策界限，妥善疏导和处理各种价格矛盾，严格控制油电价格连琐反应。一是严格贯彻落实成品油和电力价格调整方案。对此轮调价中明令不许调价的相关商品及服务价格，要求相关部门、单位及企业务必执行。二是认真贯彻落实对发电用煤的临时价格干预措施。三是配合财政部门落实对种粮农民、城乡低保户、交通运输行业的专项补贴资金。四是加强价格监测和市场价格巡查，密切关注相关下游产品的价格变动。五是组织人员深入相关企业，详细掌握了解此次油电调价后对我区经济运行的影响，并据此提出对策建议，供区委、区政府决策参考。
五、严格控制出台政府定价项目，防止增加社会群众负担
按照年初国务院召开的物价工作电视电话会议和年中重庆市物价局召开的全市物价局长会议精神，我局严格控制本级管理的价格项目，坚决落实会议作出的近期一律不得提高供水、供气、供电、城市公交等公用事业价格和旅游参观点门票价格的规定。今年以来，除公路客运票价根据重庆市局有关文件精神在特定时期实施上浮、南涪线路客运票价因
设臵收费站并实施收费致使经营成本增加而调价外，本级政府管理的其他任何项目价格均未作调整，从而为社会稳定营造了良好的价格环境。与此同时，我局还主动敦促有关部门认真落实对特殊行业及群体制定的收费优惠政策。此外，积极着手对供水、供气等垄断行业开展成本监审，为做好今后政府调价工作奠定基础。
六、强化价格监督检查，努力维护消费者合法权益 对于基层物价部门而言，价格监督检查可以说是价格工作的重中之重。一方面，上级制定出台的价格政策不仅需要我们去贯彻，更需要我们去监督和落实；另一方面，通过开展价格监督检查，可以及时发现价格政策在执行过程中存在的问题和困难，从而为上级制定价格政策提出合理建议和意见。从这个意义上讲，价格监督检查工作就是物价部门的“千里眼”和“顺风耳”。今年以来，我局围绕大局、突出重点、加大力度，全力抓好各项价格监督检查工作。一是组织开展重大节假日和特殊时期的市场巡查。在今年元旦、春节期间对城区超市、农贸市场以及金佛山沿线旅游景点等价格执行情况开展检查，在今年公路客运票价上浮期间及上浮期限结束后组织开展客运价格检查，及时纠正处理了少数商家不执行明码标价、部分客运业主擅自提高票价的行为。二是组织开展液化气价格、惠农收费、农资价格、电信邮政资费等专项检查，查出化肥生产企业超出政府规定限价销售金额3万
余元、利用优惠电价生产化肥以外产品从而套取差价近100万元。三是组织春期开学教育收费检查，督促学校落实义务教育阶段免收教科书费等规定。四是认真受理查处价格举报案件。截至目前，2008年我局共受理价格举报29件，涉及教育、药品、物业、客运、农网改造等领域，通过查处价格举报案件退还消费者近4000元。
抑制作用 第3篇
【关键词】信息披露 博弈模型 监管制度 委托代理
Supervision system to the listed companies false information disclosure inhibition
Based on the game model， the design and analysis
BaoKeQi southwest university of finance and economics institute of accounting
【 abstract 】 because of information asymmetry and the existence of the principal-agent relationship， the listed company management based on their own interests， it is possible to false accounting information disclosure， to dampen the behavior occurs， it is necessary to establish an effective supervision system， and in the end of investors and listed company managers contradictions， safeguard the legitimate rights and interests of the investors. This paper construct two between listed companies and investors the game model， the first model for no supervision system game model， the second model for existing supervision system of the game model， through the contrast of the two game model， it can be found that the supervision system to control the listed companies false information disclosure has vital role.
【 key words 】 information disclosure supervision system principal-agent game model
一、引言
在上市公司信息披露中，所受影响最大的是上市公司和投资者两个主体。由于对每个理性的经济个体来说，其行为动机和目的，都是使自身的预期效用最大化。无论是中国的银广夏，还是美国的安然（Enron）、世通公司（WorldCom）等，产生虚假会计信息的根本原因，在于这种行为能满足该上市公司的需要，能为其带来预期的经济利益，这部分经济利益即为虚假信息的“租”。
上市公司会从提供虚假信息中受益，而投资者也是这一经济活动的一个主体，在上市公司披露本公司盈利的信息时，投资者会选择相信并继续持有该公司股票，或者选择不相信而抛出该公司股票。这样两个主体之间会产生某种程度的利益冲突和对抗，从而产生博弈。
但是投资者的判断，即是否认为公司披露的盈利信息为虚假信息这一决策，由于信息的不对称，并不能得到实质性的证实，若存在监管机构对上市公司所披露的盈利进行审查并向外报告时，其博弈行为又会发生改变。如果仅仅依赖市场的力量，信息披露是无法达到决策有用性的目标的。为了更清楚地说明这一点，本文将通过两个博弈模型来证明对于信息披露而言，有效的监管制度不仅重要、而且十分必要。
二、博弈模型的设计与分析
1.1 前提假设
1）假设上市公司与投资者均为理性的经济人，且均为非风险偏好型。
2）上市公司作为一个整体，即上市公司管理层与公司股东利益完全一致。
3）上市公司披露的盈利信息对投资者是决策相关的， 将影响证券的价格。
4）只有当上市公司存在着披露虚假盈利财务报告时，监管机构才有可能发现其造假行为，当上市公司诚实地对外提供会计信息时，监管机构不会调查出上市公司有造假行为。
5）监管部门对上市公司披露虚假信息所处的罚款数额对市场股价的影响忽略不计。
1.2 模型建立与分析
（一）无监管制度的博弈
在没有监管机构的情况下，上市公司在 时刻进行信息披露，可以选择进行诚实披露，如实披露它的盈利状况 元/股，这时股价会在下一期 时刻上升 元， 为与 正相关的递增函数，或者进行虚假披露 元/股，其中 为虚假披露的额外盈利值，这时股价会在下一期 时刻上升 元；同时投资者可以通过自己的判断、猜测选择相信并继续持有该股票到下一期到 时刻，或者不相信而在披露当期卖出所持股票，由于投资者卖出股票，股价又会下降 元。
由于股价变动，公司的价值会变动 元，则此时的博弈矩阵为：
即无论投资者选择相信或者不相信上市公司所披露的盈利信息，上市公司选择虚假披露的效用均高于诚实披露的效用，也就是说，在没有监管机构的情况下，上市公司会始终选择虚假披露，以达到他的较大经济收益，而投资者是弱势群体，只能被动选择接受。
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（二）存在监管制度的博弈
在有监管机构的对上市公司的盈利信息披露进行审核的情况下，假设监管机构对于虚假信息披露的可辨认概率为 ，不可辨认的概率为 ，当发现上市公司有虚假信息披露后，会对上市公司处以 元的罚款，同时对外报告上市公司的虚假盈利信息披露，当市场得到这一消息后，其股价会在 时刻报复性下跌 元，则此时的博弈矩阵为：
由博弈矩阵可知，在有监管机构的对上市公司的盈利信息披露进行审核的情况下，上市公司的进行诚实披露或者虚假披露的效用孰大孰小就不得而知了。为了迫使上市公司能够城市披露其盈利信息，必须要使虚假披露的效用无论在投资者相信或者不相信的情况下，都要低于诚实披露的效用，即要使的下列方程成立：
（2）
将方程化简后得：
（3）
从化简后的方程（3）中，可以发现：
（1）上市公司由于进行虚假信息披露而获得的额外收益，需要由市场的报复性下跌 ，及对企业所处的罚款 形成的两大部分所抵消掉，才可使上市公司选择诚实披露其盈利信息。
（2）由于对上市公司进行的罚款 ，同时相当于是对没有过错的投资者的变相处罚，故在各国的法律中，对于罚款 的确定值通常较低，对股价变动的影响可以忽略，故在抵消由于进行虚假信息披露而获得的额外收益部分中，市场的报复性下跌 占到绝对的主要部分。
（3）市场的报复性下跌 ，虽然通常来说 ，但它是由市场所反映的，这一值的变化是监管部门所无法控制的，至少在现阶段非有效市场的情况下较难实现，这一方程中只有 值是监管部门能够直接影响到的，并由方程可知， 值越大，越能够保证方程的实现，使得上市公司的信息披露选择诚实披露可获得的效用更大，也就是说，监管部门的审核技术手段越有效，对于虚假披露的辨认能力越强，就越可以驱使上市公司对其盈利信息进行诚实披露。
三、小结
从以上两个博弈模型的对比可以发现，监管制度对抑制上市公司进行虚假信息披露有至关重要的作用。如果没有监管机构，上市公司为了自身利益的最大化，会毫不犹豫的选择进行虚假的信息披露，直接损害金融市场的健康发展秩序。监管机构的存在是十分必要的，它使得上市公司趋向于披露真实的盈利信息，使得处于弱势地位的外部投资者能够获得真实的被投资公司信息。同时监管部门还要加强自身的建设，提高对虚假披露的辨认能力，以近一部加强对上市公司的监管，诱导其诚实地进行信息披露。
参考文献
【1】公允价值信息披露的管制安排，孙丽影，杜兴强，会计研究，2008.11
【2】风险投资中资本与技术的博弈，许长新，宋敏，财经研究，2003.11
氧化石墨烯对浮萍生长的抑制作用 第4篇
石墨烯是近几年新兴的一种碳纳米材料,其中氧化石墨烯(graphene oxide)属于石墨烯的一种。由于拥有羟基、羧基、环氧官能团和羰基等大量的含氧基团,是一种亲水性物质,在性质上与石墨烯具有较大差异[2]。因其特殊的单原子层结构,氧化石墨烯具有非常优良的电子传递、能量转移等物理化学性质,从而被开发为纳米传感器、纳米医药载体等,具有巨大的开发前景和市场价值。这种生产和应用的快速增长,以及人们对其应用的极大兴趣,提示人们需要对氧化石墨烯的环境影响加以关注。
氧化石墨烯具有显著的抗菌作用。Akhavan等发现氧化石墨烯对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均存在抑制作用[3];85μg/m L的氧化石墨烯可以在2 h内抑制大肠杆菌80%以上的代谢活性[4];Liu等研究发现40μg/m L的氧化石墨烯对大肠杆菌产生显著毒性,且在石墨烯家族材料中毒性最强[5]。随之在哺乳动物细胞水平的研究同样证实了氧化石墨烯的毒性作用。Wang等的研究显示,50μg/m L的氧化石墨烯可以对人纤维组织母细胞产生明显的毒性,氧化石墨烯还可以进入细胞质和细胞核[6];Chang等研究了氧化石墨烯对人肺癌A549细胞的形态、活力、死亡率和细胞膜完整性的影响,结果表明,氧化石墨烯未进入A549细胞,并没有明显的细胞毒性作用,但可以引起细胞氧化应激,在高浓度下亦可轻微损伤细胞活性[7]。
氧化石墨烯的生态毒性效应研究相对较为缺乏。Begum等研究了氧化石墨烯对甘蓝、西红柿等植物幼苗的影响,发现2 000 mg/L的氧化石墨烯显著抑制了幼苗的生长[8];Ahme等报道了氧化石墨烯对微生物群落的毒性作用与剂量密切相关,尤其在50~300 mg/L之间,活性污泥中氧化石墨烯的出现显著影响了细菌的代谢活性和存活率[9];而Zanni等的研究结果显示氧化石墨烯对秀丽隐杆线虫没有急性和慢性毒性效应[10];笔者课题组研究了氧化石墨烯对纤细裸藻(Euglena gracilis)的毒性效应,得出其EC50为3.76±0.74 mg/L[11]。
本研究以浮萍(Lemna minor L.)为研究对象,通过氧化石墨烯对其生长情况的影响及其抗氧化酶的响应,反映这种碳纳米材料对浮萍的胁迫效应。
1 实验部分
1.1 试验材料与仪器
氧化石墨烯购自南京先丰纳米材料科技有限公司;浮萍采于临沂大学校内池塘,采集后用自来水冲洗干净,置于过滤后的河水中适应性培养1周。
超声细胞破碎仪(HN92-IID,上海);透射电镜(JEM-1400,日本);普通光学显微镜(Eclipse Ni,日本);离心机(TGL-16 M,湖南);抗氧化酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
Swedish Standard(SIS)培养液,其主要成分(mg/L):Na NO3,85;KH2PO4,13.4;Mg SO4·7H2O,75;Ca Cl2·2H2O,36;Na2CO3,20;H3BO3,1.00;Mn Cl2·4H2O,0.20;Na2Mo O4·2H2O,0.010;Zn SO4·7H2O,0.050;Cu SO4·5H2O,0.0050;Co(NO3)2·6H2O,0.010;Fe Cl3·6H2O,0.84;Na2-EDTA 2H2O,1.4。培养液p H值以0.1 mol/L的HCl或Na OH调至6.5±0.2。
氧化石墨烯母液的制备:称取50 mg氧化石墨烯薄片,加到盛有250 m L双蒸水的烧杯中,将超声细胞破碎仪的探头置入烧杯,超声处理30min(功率200 W,工作时间∶间歇时间为10s∶5s),得200 mg/L的氧化石墨烯母液(即氧化石墨烯碎片悬液)。利用透射电镜观察超声处理后悬液中氧化石墨烯碎片的形貌。
1.2 实验方法
1.2.1 浮萍生长抑制试验
试验按照OECD标准方法进行[12]。实验容器采用直径6.5 cm、高5.5 cm的塑料杯,内盛100m L培养液。将氧化石墨烯母液稀释得到以下4组质量浓度:0(对照)、1、5、10 mg/L。每个杯10株浮萍(40个叶片),每个浓度组5个重复。塑料杯以带孔的塑料膜封口,试验在恒温室(25℃)中进行,光照强度为120μmol/m2·s。暴露时间为96 h。试验结束后计数叶片数,然后取出浮萍,以滤纸吸干水分,称取湿重。利用普通光学显微镜观察浮萍根部氧化石墨烯的附着情况。叶绿素的测定按照Jeffrey等的方法进行[13]。
1.2.2 抗氧化酶的测定
处理96 h后,取浮萍约30 mg,用蒸馏水清洗,加缓冲液,在冰浴中进行研磨。转移到10 m L离心管中,加缓冲液至5 m L,于4℃下5198×g离心5 min,取上清液,利用试剂盒分别测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的活性。测定结果以U/mg(蛋白质)表示,蛋白质的含量以考马斯亮蓝法测定。
1.2.3 数据分析
所有数据均采用平均值±标准差,其中叶片数和湿重的测定中n=5,抗氧化酶测定中n=3。以Origin 8.0软件分析各数据与对照之间的差距,*和**分别表示与对照相比差异显著(P<0.05)和非常显著(P<0.01)。
2 结果与讨论
氧化石墨烯母液呈棕色,制备后稳定性较强,能够存放3天以上,这与碎片上大量的亲水基团有关。氧化石墨烯的透射电镜图见图1。由图1见,氧化石墨烯单层厚度在1 nm以下,碎片不规则,且大小不一,其纵向长度介于2~10μm之间,碎片以单层或多层形式存在。
在氧化石墨烯质量浓度分别为1、5、10 mg/L的培养液中暴露96 h,浮萍叶片数与湿重变化情况见表1。由表1知,1 mg/L的氧化石墨烯并未引起生长的抑制,也未造成浮萍湿重下降,相反,这两项指标略有增加;5 mg/L的氧化石墨烯导致叶片数和湿重均下降,但与对照相比,均无明显变化;10mg/L的氧化石墨烯对叶片数和湿重的抑制率分别约为35.3%和26.1%,显著(P<0.05)抑制了浮萍的生长。叶绿素的变化趋势见图2。图2显示,叶绿素的变化趋势与叶片数、湿重情况基本一致,仅在10 mg/L氧化石墨烯处理时,出现叶绿素含量的明显下降(P<0.01)。氧化石墨烯质量浓度在培养液中达到5 mg/L时,培养液呈淡黄色,10 mg/L时颜色加深;在自然界水体中,5 mg/L以上浓度的氧化石墨烯很少存在,因此,上述各方面的数据说明,氧化石墨烯对浮萍负面效应较小。
暴露96 h后,浮萍植株内SOD的变化如图3所示。
图3显示,1 mg/L和5 mg/L的氧化石墨烯对浮萍无明显影响,当其浓度为10 mg/L时,浮萍内SOD水平明显(P<0.05)高于对照。CAT的响应与SOD基本一致,但比SOD更为明显(图4)。
图4表明,5 mg/L的氧化石墨烯处理时,即可导致CAT活性显著上升;10 mg/L时,CAT活性的增加非常显著(P<0.01)。POD的活性则出现低浓度下促进、高浓度下抑制的趋势,10 mg/L的氧化石墨烯导致其显著低于对照(图5)。
当生物面对环境胁迫时,体内会产生活性氧(ROS),ROS的增加可能会导致细胞受损或生物死亡,而抗氧化酶的诱导生成是一种重要的自我保护机制。植物中的几种抗氧化酶在清除ROS和过氧化物过程中起重要的作用,如SOD能够将O2-转化为H2O2,后者随之被CAT和POD所清除[14]。生物体内ROS增加时,抗氧化酶水平随之增加。因此,可以通过抗氧化酶的变化来反映生物体是否受到胁迫及其程度。本研究中,SOD和CAT在高浓度氧化石墨烯处理下活性增加,说明受到来自该纳米材料的氧化胁迫。POD活性的下降,可能是由于H2O2浓度较高,抑制了其活性。
尽管上述结果说明氧化石墨烯在高浓度下能够对其产生胁迫,但导致该过程产生的机理尚不清楚。图6为浮萍暴露在10 mg/L的氧化石墨烯中96 h后根部的显微照片,图6显示,培养液中的氧化石墨烯能够聚集在浮萍的根部,形成一层明显的覆盖物,这可能会阻碍浮萍对营养物质的吸收利用,但这一机制尚需深入研究。
3 结论
抑制作用 第5篇
烷基糖苷对赤潮生物的抑制与灭杀作用的实验
以赤潮生物具齿原甲藻0201-01(Prorocentrum dentatum 0201-01)和赤潮异湾藻(Heterosigma akashiwo)为材料,研究了烷基糖苷对不同起始密度藻细胞的抑制和灭杀作用.结果表明:烷基糖苷在一定浓度范围内对这两种赤潮生物的生长有明显抑制作用,进一步增大烷基糖苷的用量,可以使藻细胞丧失运动性,细胞破裂乃至溶解消失.可见,烷基糖苷作为除藻剂在赤潮治理中具有一定应用前景.
作 者：龚良玉 王修林 李雁宾 梁生康 韩秀荣 祝陈坚 GONG Liang-yu WANG Xiu-lin LI Yan-bin LIANG Sheng-kang HAN Xiu-rong ZHU Chen-jian 作者单位：龚良玉,王修林,梁生康,韩秀荣,祝陈坚,GONG Liang-yu,WANG Xiu-lin,LIANG Sheng-kang,HAN Xiu-rong,ZHU Chen-jian(中国海洋大学,化学化工学院,山东,青岛,266003)李雁宾,LI Yan-bin(中国海洋大学,生命学院,山东,青岛,266003)
刊 名：海洋环境科学 ISTIC PKU英文刊名：MARINE ENVIRONMENTAL SCIENCE 年，卷(期)： 24(1) 分类号：X55 O621.25 X505 关键词：具齿原甲藻 赤潮异湾藻 烷基糖苷 抑制 灭杀抑制作用 第6篇
关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；波形蛋白；病毒抑制；受体阻断
中图分类号：Q939.91 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2012）10-0001-07
猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）能引起猪繁殖与呼吸综合征（ PRRS），俗称猪蓝耳病。临床表现为母猪晚期流产、早产、死胎和木乃伊胎等繁殖障碍和各年龄猪群的呼吸道症状。该病于1996年在我国首次报道[1]，给我国的养猪业带来了巨大的经济损失。
波形蛋白广泛存在于间充质细胞及中胚层来源的细胞中，主要与维持细胞及细胞器形态、参与有丝分裂和细胞分化、促进细胞粘附和移行、创伤愈合、信号传导、移植免疫和细胞凋亡等有关[2～4]。波形蛋白除了稳定细胞结构之外，还与其他的细胞骨架纤维一起参与许多病毒的侵入或感染过程，例如Ⅰ型疱疹病毒[5]、蓝舌病毒[6]、非洲猪高热病毒[7]、人的呼吸道合胞病毒[8]、痘病毒[9]、泰勒氏小鼠脑脊髓炎病毒[10]和日本脑炎病毒[11，12]等。
PRRSV通过细胞表面受体介导的内吞作用感染易感细胞，从而在细胞内完成其复制和包装等过程，该过程涉及多种蛋白，波形蛋白为其中一种。2006年Kim等用North-Western blot方法从Marc-145细胞中检测到与PRRSV 3′非翻译区RNA结合的分子量为57 ku的蛋白[13]，并验证该蛋白为波形蛋白。尽管波形蛋白在进化过程中是保守的，但在不同细胞内其执行的功能不同，在多种病毒感染过程中都有着重要作用。王伟伟等[14]研究证明PRRSV易感细胞系Marc-145来源的猴波形蛋白及其抗体能阻断PRRSV感染Marc-145细胞。目前已知猪是PRRSV唯一自然宿主，而猪肾细胞系PK-15细胞却是PRRSV的非易感细胞。为了进一步研究猪波形蛋白和猴波形蛋白的功能关系及其与PRRSV的关系，本研究从猪肾细胞系PK-15中扩增出波形蛋白基因，表达纯化后制备抗体，检测猪波形蛋白及其抗体对PRRSV感染Marc-145细胞的影响，为PRRSV致病机制及其受体阻断抑制剂的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 病毒、细胞与菌株
PRRSV分离株TA-12（GenBank登陆号：HQ416720）、PK-15细胞、pET-28a （+）表达载体、受体菌E.coli Top10、表达菌BL21（DE3）均由本实验室保存，载体pMD18-T购自TaKaRa公司。
1.2 主要试剂
TRIZOL购自Invitrogen公司，HiFi ploymerase、dNTP、Ni-NTA Resin、DNA纯化试剂盒、质粒提取试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司，T4连接酶、限制性内切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ购自TaKaRa公司，异丙基-β-D-硫化半乳糖苷 （IPTG） 购自Promega公司，HRP标记的羊抗鼠IgG购自Jackson公司，His 单克隆抗体购自南京金斯瑞公司，抗PRRSV N蛋白单克隆抗体6D10由本实验室制备保存。
1.3 目的基因的扩增和序列的测定
根据GenBank上公布的牛波形蛋白序列（序列号NM_173969.3），设计并合成一对引物，上游引物5′-CAGCCATGTCCACCAGG-3′，下游引物5′-GCTGGTAGTATTTTGCTGC-3′。提取PK-15细胞总RNA，反转录合成cDNA，以其为模板进行PCR扩增。PCR反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 45 s，72℃ 90 s，30个循环；72℃ 10 min。PCR 产物经胶回收纯化后连接于pMD18-T载体，转化至感受态细胞Top10中，提取质粒，酶切、PCR鉴定后送上海生工测序。
1.4 重组质粒PK-28a-VIM的构建与鉴定
根据测序结果设计合成一对引物，上游引物5′-ATAGGATCCATGTCCACCAGGACCGT -3′（带有BamHⅠ识别位点），下游引物5′-CGCAAGCTTTTATTCCAGATCATCGTG -3′（带有Hind Ⅲ识别位点）。以pMD18-T-VIM为模板进行扩增。PCR反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 45 s，72℃ 90 s，30个循环； 72℃ 10 min。PCR 产物经胶回收纯化。将PCR产物和表达载体pET-28a相同酶切后回收，连接，转化至感受态细胞Top10 中，提取质粒，用酶切和测序鉴定重组质粒。1.5 重组表达质粒的诱导表达
将PK-28a-VIM质粒转化至BL21（Rosetta）感受态细胞，挑取单菌落于浓度为100 μg/ml卡那霉素的LB 培养基中，37℃培养12 h。将菌液和培养基以1∶ 100 接种于浓度为100 μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃ 振荡培养至OD600值达到0.4～0.6时，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，分别于诱导前和诱导后2、4、6 h收集菌液，12%分离胶进行SDS-PAGE检测。
1.6 重组蛋白的纯化
大量表达后收集细菌，PBS洗涤菌体3次后超声菌体，5 000×g 离心10 min，用8 mol/L尿素溶解。12 000×g 离心30 min，收集上清，按Ni柱说明书纯化蛋白。
1.7 Western blot 鉴定
将纯化的蛋白进行SDS-PAGE 后，转到PVDF（聚偏氟乙烯）膜上，2.5%脱脂乳4℃封闭过夜，加入1∶ 4 000稀释的抗His标签鼠单克隆抗体室温孵育1 h， PBST洗涤3次，每次5 min，加入1∶ 4 000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，室温孵育1 h， PBST洗涤3次，DAB（增敏二氨基联苯胺）显色。
1.8 抗波形蛋白抗体的制备
选取3只成年健康的雌性新西兰大白兔，1 mg/只对兔子背部皮下及足底注射免疫，首次免疫后第14天和第28天分别进行第2、3次免疫。首次免疫用弗氏完全佐剂，其余用弗氏不完全佐剂。每次免疫前对兔子进行耳缘静脉取血备用。
1.9 抗波形蛋白抗体检测
将4 μg/ml的波形蛋白100 μl包被于ELISA孔板中，将三免收集的兔血清倍比稀释，用ELISA方法检测抗体滴度。同时进行IFA（免疫荧光）检测，将抗重组波形蛋白血清按1∶ 40、1∶ 80、1∶ 160、1∶ 320稀释加入到单层PK-15细胞上，每孔加入100 μl，37℃孵育1 h。加入TRITC（四钾基异硫氰酸罗丹明）标记的羊抗兔二抗，37℃避光孵育1 h后镜检，用未免疫的兔血清作为阴性对照。
1.10 波形蛋白的病毒阻断检测
纯化后的猪波形蛋白用尿素浓度梯度为8～2 mol/L、pH梯度为6.0～8.5的复性溶液于16℃条件下进行双梯度透析复性，每个梯度透析12 h。将透析后含有2 mol/L尿素的5、10、50 μg波形蛋白分别与100 TCID50的PRRSV TA-12于37℃孵育1 h后，接种长成单层的Marc-145细胞，37℃感作1 h后弃上清，PBS洗涤3次；加入含有3%新生牛血清的DMEM，于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h；用-20℃预冷的75%乙醇4℃固定30 min；加入抗PRRSV N蛋白的单抗6D10，37℃孵育1 h后加入FITC标记的羊抗鼠二抗，37℃孵育1 h后荧光显微镜下观察。禽戊肝病毒ORF-3蛋白作为阴性对照。重复3次。
1.11 抗波形蛋白抗体的病毒阻断检测
将抗猪波形蛋白抗体按1∶ 10、1∶ 20、1∶ 40和1∶ 80稀释后分别加到长成单层的Marc-145细胞上，37℃孵育1 h；弃上清，PBS洗涤3次，加入100 TCID50的PRRSV TA-12，感作1 h后加入含有3%新生牛血清的DMEM，于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h；拿出一块细胞培养板用-20℃预冷的75%乙醇4℃固定30 min；加入抗PRRSV N蛋白的单抗6D10，37℃孵育1 h 后用PBS洗涤3次，每次5 min；再加入FITC（异硫氰酸荧光素）标记的羊抗鼠二抗，37℃孵育1 h，荧光显微镜下观察。以未免疫的兔血清作为阴性对照。另一块培养7天，观察CPE（细胞病变效应）。重复3次。
2 结果与分析
2.1 目的基因的扩增
PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳可见大小约为1 401 bp的特异性扩增片段，与预期大小相符。序列测定结果表明其与GenBank公布的非全长的野猪波形蛋白核苷酸序列同源性为99.1%，与牛波形蛋白核苷酸序列同源性为94.7%。
2.2 重组质粒的鉴定
重组载体PK-28a-VIM用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切鉴定，结果切出与目的片段大小一致的片段，序列测定结果完全正确。
2.3 重组质粒的表达及纯化结果
对使用IPTG诱导前后的样品进行SDS-PAGE 分析，结果表明，重组菌在诱导后出现大小约为57 ku的蛋白条带，大小与预期的蛋白分子质量基本一致，诱导后6 h蛋白的表达量最高。将重组菌超声破碎后进行SDS-PAGE分析，发现重组蛋白存在于菌体沉淀中，以包涵体形式存在。用8 mol/L尿素洗涤、溶解细胞沉淀，用Ni柱纯化，得到了纯度较高的目的蛋白（見图3） 。
2.4 Western blot 鉴定结果
用鼠抗His标签单抗对纯化的表达产物进行Western blot分析。结果显示重组波形蛋白在大小约57 ku处出现特异性反应条带2.5 抗波形蛋白抗体水平检测结果
用ELISA方法检测制备的抗波形蛋白抗体，血清按照1∶ 105 稀释时，其OD值仍达到0.518，P/N值>2.1。使用制备2.6 波形蛋白的病毒阻断IFA检测
将不同量的波形蛋白与100 TCID50的PRRSV TA-12孵育后接种长成单层的Marc-145细胞，IFA检测结果显示，Marc-145细胞的细胞病变与对照组相比明显降低，波形蛋白的量越大阻断效果越明显，但是不能完全阻断。
2.7 抗波形蛋白抗体的病毒阻断IFA及CPE检测
用抗波形蛋白抗体对100个TCID50的PRRSV TA-12株进行病毒阻断实验，IFA检测发现抗重组波形蛋白的阳性血清按照1∶ 10稀释时未检测到阳性细胞，而血清稀释度在1∶ 20时阳性细胞较阴性血清显著减少，血清稀释度在1∶ 40
桥粒相连，将细胞核和细胞器维持在特定的空间。它可以被多种蛋白激酶磷酸化，不同细胞表达的波形蛋白存在较大差异，可能与翻译后的加工修饰有关。Kim等[13]对介导感染Marc-145细胞的受体进行了研究，证明了波形蛋白能够与PRRSV结合，外源表达的重组波形蛋白转导到PRRSV非易感细胞系BHK-21和CRFK中，使PRRSV非易感细胞获得了易感性，从而表明波形蛋白是PRRSV 受体复合物的一部分。
本实验从PK-15细胞中扩增出猪波形蛋白，经序列测定分析发现猪波形蛋白核苷酸序列与牛的同源性为94.7%，与人波形蛋白核苷酸序列的同源性为92.6%，与猴波形蛋白核苷酸序列的同源性为92.4%，与小家鼠波形蛋白核苷酸序列的同源性为90.4%。另外，本实验采用的原核表达载体为pET-28a（+），带有His Tag 的蛋白标签，可与目的基因融合表达。经诱导高效表达出大小约为57 ku的蛋白条带。通过Western blot鉴定，所表达的融合蛋白可与His单抗发生特异性结合，由此说明在大肠杆菌中成功表达了重组波形蛋白。透析后的重组波形蛋白与PRRSV孵育后感染Marc-145细胞，感染量明显降低。利用纯化的波形蛋白免疫兔子得到抗波形蛋白的多抗可阻断PRRSV感染。有意思的是，PK-15是PRRSV的非易感细胞系，而抗PK-15细胞的波形蛋白的血清可以阻断PRRSV感染，说明不同的细胞表达了相似的波形蛋白，PRRSV易感与非易感细胞之间波形蛋白主要差异可能与翻译后的加工修饰有关，其磷酸化可能与PRRSV对细胞的严格噬性有关。作为PRRSV非易感的PK-15细胞却表达了能与PRRSV结合的波形蛋白，这对研究波形蛋白的结构、功能以及在PRRSV入侵细胞过程中发挥的作用很有意义。同时，抗血清对PRRSV侵染细胞的阻断作用为PRRS防控提供了一个新的切入途径。
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抑制作用 第7篇
人们已经在多种生物体内发现了由外排泵介导的多重耐药性 (MDR) , 如细菌、真菌、原生动物和哺乳动物的肿瘤细胞。外排泵也被认为是导致传染病和肿瘤方面疾病治疗失败的原因之一。对于细菌感染, MDR是一个主要问题, 因为它限制了药物的选择, 增加了治疗成本, 延长了住院时间, 并且使发病率和死亡率提高。细菌具有大量的药物外排蛋白, 会降低细胞内的药物浓度, 从而阻碍了常用药物在活性部位的作用, 最后导致细菌对药物的敏感性降低。因此, 我们推断在真核细胞中起到抑制药物外排作用的外排泵抑制剂 (EPIs) 也许能用于对抗细菌的耐药性。通过开发EPIs并与现有的抗生素联合使用, 能够延长许多抗生素的有效寿命, 提高治疗效果。
然而以前临床上使用的外排泵抑制剂如利血平、维拉帕米、二甲苯氧庚酸和环孢素A, 由于在达到完全抑制外排泵作用的浓度下具有潜在的副作用, 从而限制了它们的使用。化合物tariquidar是在第三代MDR调节物中最具前景的代表性物质。它是在筛选哺乳动物ABC族外排泵抑制剂时被发现的, 特别是对P-糖蛋白 (P-gp, AB-CB1) 和哺乳动物的癌细胞耐药蛋白 (BCRP, ABCG2) 有很好的抑制作用, 能恢复肿瘤细胞对化疗制剂的敏感性, 对tariquidar的研究已经进入到II/III期临床阶段。
研究人员开始着手调查tariquidar抑制细菌耐药性的效果。I.Leitner等通过测定MICs、时间-杀菌曲线和细菌细胞内环丙沙星累积量的方法研究了Tariquidar对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽寡养单胞菌耐环丙沙星的抑制作用。
2 材料与方法
2.1菌株
金黄色葡萄球菌ATCC 29213 (SA29213) 、铜绿假单胞菌ATCC 27853, 嗜麦芽寡养单胞菌ATCC BAA-85从美国标准菌种库获得。SA1199B为NorA外排泵过表达菌株, 由伦敦大学的生药和植物研究中心提供。ATC-CBAA-85含多药耐药外排泵SmeDEF, 对包括喹诺酮类药物在内的多种抗菌药物耐药。
2.2抗生素、化学试剂和培养基
MH肉汤 (MHB, 德国默克公司) 根据CLSI的标准调整阳离子浓度, 使钙离子浓度为25 mg/L、镁离子浓度为12.5 mg/L。环丙沙星由德国拜耳公司提供。14C标记的环丙沙星 (活度为370 MBq/mmoL) 由美国Moravek公司提供。Tariquidar盐酸盐和elacridar盐酸盐由维也纳大学药物化学部合成。所有储备溶液都保存于-80℃。
2.3体外敏感性试验
依据CLSI的推荐方法, 在两种外排泵抑制剂分别存在和缺乏的情况下, 检测4个待测菌株对环丙沙星的敏感性。菌株先在哥伦比亚琼脂平板过夜预培养, 然后以5×105cfu/mL浓度接种于MHB。MHB含指定浓度的环丙沙星和两种EPIs。37℃培养20 h后, 能够抑制细菌生长的环丙沙星-EPI混合物的最低浓度即为MIC。
2.4时间-杀菌曲线
测定对SA1199B的杀菌曲线是在不含tariquidar的MHB和含有2～5 mg/Ltariquidar的MHB中进行的。环丙沙星的浓度分别为其对SA1198B的MIC值 (8 mg/L) 、1/2MIC、1/4MIC、2MIC、4MIC, 菌液浓度为5×105cfu/mL。将培养管置于37℃水浴后混匀, 取100μl样品用生理盐水连续稀释, 然后取20μL置于哥伦比亚琼脂平板上37℃培养24 h, 并分别于0、2、4、68 h数菌落数, 并计算原液体的含菌数 (cfu/mL) 。所有操作过程重复三次。
2.514C标记的环丙沙星累积
通过对环丙沙星14C进行标记, 来确定在tariquidar和elacridar不同浓度时, 环丙沙星在细胞内累积的变化。菌株在哥伦比亚琼脂平板上过夜培养后接种1 000 mL的MHB培养基中, 37℃过夜培养。室温条件下2 500 g离心10 min, 用生理盐水重新悬浮, 使菌液的含菌量为109cfu/mL;37℃下孵育15 min后, 以预先确定的浓度加入外排泵抑制剂。再经过15 min的孵育后, 分别加入14C标记的环丙沙星和未标记的环丙沙星, 最终获得以1.9 kBq/mL为单位的放射性浓度值和以2 mg/L为单位的质量浓度。再孵育60 min后, 将此混合物在4℃条件下离心, 然后弃掉上清液, 将沉淀用冷的生理盐水溶液重新悬浮。重复该过程, 然后加入闪烁液 (PerkinElmer, 美国) , 然后利用液体闪烁计数器测定放射性 (WALLAC 1410, 芬兰) 。所有操作过程重复三次。
3 结果
3.1药敏试验
环丙沙星对SA29213和SA1199B的MIC值分别为0.5、8 mg/L, 对铜绿假单胞菌和嗜麦芽寡养单胞菌的MIC值分别为0.25、8 mg/L。tariquidar和elacridar的实验浓度未测到抗菌活性 (MIC值大于64 mg/L) 。
添加tariquidar和elacridar后, 两个金葡菌菌株对环丙沙星的敏感性增加, 并呈剂量依赖性, 而在铜绿假单孢菌株却没有效果。在两种抑制剂作用下, 药物对SA1199B菌株的MIC基线降低速度要比SA29213株快。对于嗜麦芽寡养单胞菌株, 只有elacridar能够以剂量依赖的方式提高菌株对环丙沙星的敏感性, 而Tariquidar无作用。
3.2时间-杀菌曲线
tariquidar与环丙沙星联合应用的杀菌数量明显比单独使用环丙沙星的要多。四组待测菌株中, 在tariquidar和elacridar浓度不断增高情况下, 14C标记的环丙沙星不断累积。药敏试验结果可以观察到对菌株SA1199B影响最大, 而对铜绿假单孢菌几乎没有影响。在菌株SA1199B中, 通过tariquidar和elacridar作用, 在摄取14C标记环丙沙星和改变细菌敏感性二者之间具有明显的相关性 (r=0.89, P≤0.0001) 。
4 讨论
迄今为止, 没有一种外排泵抑制剂被授权在细菌感染治疗方面使用。研究表明, tariquidar作为一种有效的P-gp抑制剂, 也许可以用于抑制葡萄球菌对环丙沙星的耐药性。尽管P-gp多药耐药蛋白和NorA均能使药物泵出细胞外, 但是前者是由ATP提供能量, 后者是由质子浓度梯度提供能量。因此, 已知的对P-gp有抑制作用的物质作用模式不能在未经过证实的情况下直接转用到细菌中去。通过在我们试验中产生的MIC值减少与细胞内含放射性物质的增多高度相关, 及一定浓度下tariquidar固有活性的缺乏这两个结论, 我们能够证明, tariquidar通过增加环丙沙星在细胞内的浓度, 从而提高了细菌的敏感性。环丙沙星的MICs值的降低与tariquidar间存在剂量依赖性, 在SA1199B中达到最大效果。这种效果与8 mg/L到<1 mg/L MICs基线的降低是相一致的, 这说明一个高水平的耐药株转化成了对环丙沙星敏感的菌株。
目前可获得的有效的外排泵抑制剂 (如CCCP) 毒性太强, 对病人是不安全的。早一代的化学药物 (如环孢霉素A、戊脉安、异搏定) 不能在抑制多重耐药性方面被充分使用。与此相比, 第三代MDR抑制剂对P-gp具有更高的选择性和较低的细胞毒性。tariquidar对不同菌株作用的差别, 进一步强调了其作为抑制剂的选择性, 因此不太可能造成不良的药代动力学相互作用。先前临床上使用的tariquidar剂量 (150 mg) 可以使药物的最高血浆浓度达到3 mg/L, 最低浓度为0.3～0.5 mg/L;甚至更高剂量的tariquidar也已经在探索性研究中被用于人类。可以推测, 临床应用的具有良好耐受浓度的tariquidar, 可提高某些菌株的敏感性。
由于许多外排泵具有明显的结构相似性, 所以我们希望能有一种化合物对不同细菌的一系列外排泵均起作用。然而, tariquidar和elacridar的作用是特异的, 是P-gp和BCRP的非竞争抑制剂, 它能抑制ATP酶的活性。这些说明了它们的调节作用是通过与底物结合或抑制ATP的水解实现的, 或者两项机制都有。有趣的是, 嗜麦芽寡养单胞菌株BAA-85对elacridar具有剂量依赖性, 而tariquidar无此现象。这一发现可能与先前发现的与tariquidar相比elacridar在抑制哺乳动物ABC族外排泵方面具有更广泛的活性这一结论相吻合。在抑制P-gp和BCRP方面, 二者的效果可以相媲美。然而与BCRP相比, tariquidar对P-gp表现出了更高的选择性。这种作用在铜绿假单胞菌野生株中没有被检测到。
如前所述, 环丙沙星的杀菌作用具有剂量依赖性。出人意料的是, 添加tariquidar后似乎消除了这一药效学特性。由于tariquidar在试验浓度下不具有内在抗菌活性, 所以可以推测环丙沙星的剂量依赖性杀菌作用至少部分是由细菌外排泵功能所介导的。
除了恢复药物敏感性外, 外排泵抑制剂可能进入由P-gp保护的组织, 从而改善抗菌药物的药代动力学过程。事实上, elacridar显著增加脑内伊曲康唑的浓度, 降低伊曲康唑治疗新型隐球菌性脑膜炎时引起的体重减轻。同样, tariquidar已用于增加药物在人类和动物中枢神经系统中的吸收。这些结果表明, 研制能够抑制细菌耐药性和穿过机体渗透屏障的抗生素与外排泵抑制剂复合型化合物具有一定的前景。本研究表明, tariquidar在体外试验中对细菌外排泵具有有效的抑制作用。虽然它对细菌外排泵所具有的高度选择性会限制其临床应用, 但是其在临床应用浓度下所具有的高活性, 很可能会使该类药物在感染性疾病治疗方面具有广阔的应用前景。
[译自]The third-generation P-glycoprotein inhibitor tariquidar may overcome bacterial multidrug resistance by increasing intracellular drug concentration.J Antimicrob Chemother.2011, 66:834-839.
摘要：本研究的目的是评价第三代P-糖蛋白抑制剂tariquidar对细菌多重耐药性的抑制作用。试验将金黄色葡萄球菌29213 (SA29213) 和1199B (SA1199B, NorA过表达) 、铜绿假单胞菌27853、嗜麦芽寡养单胞菌BAA-85分别置于环丙沙星+tariquidar及无抑制剂条件下, 并以elacridar为对照, 通过测定MICs、时间—杀菌曲线和细菌细胞内环丙沙星量来评估两种P-糖蛋白抑制剂的作用。对金黄色葡萄球菌耐药性的抑制作用, tariquidar的活性与elacridar相当, 并且呈剂量依赖性。该效果在SA1199B中最明显, 通过加入tariquidar使环丙沙星的MIC值降低了10倍, 而对铜绿假单胞菌无效。elacrida提高了嗜麦芽寡养单胞菌株对环丙沙星的敏感性, 但tariquidar无此作用。细菌摄取14C标记环丙沙星的量与其敏感性改变之间具有明显的相关性。上述结果表明, tariquidar在体外可明显抑制细菌的外排泵;其在临床应用浓度下所具有的高活性, 使该药在传染病治疗方面具广阔的前景。
抑制作用 第8篇
1材料和方法
1.1药物和试剂
Wee1抑制剂PD0166285(由日本高知大学第三内科提供),Doxorubicin(Sigma公司)均溶于100%二甲基亚砜(DMSO)配制成10-2M于-80℃下保存。临用前用RPMI1640调至所需浓度。小牛血清(FBS):Sigma公司产品,56℃水浴30min灭活后分装,4℃保存。RPMI1640:Sigma公司产品,4℃保存。MTT粉剂:Sigma公司产品。
1.2细胞株及其培养
HL60细胞株(AML)、NB4细胞株(APL)、EOL-1细胞株(eosinophilic leukemia cell line)(均由日本高知大学第三内科提供)。HL60、NB4、EOL-1细胞株按常规悬浮细胞培养法接种于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中,在37℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度条件下培养,2~3d换液一次。取对数生长期细胞用于实验。
1.3细胞活力测定(MTT法)
本实验分单一用药实验和联合用药实验两部分。单一药物作用实验设PD0166285实验组、阿霉素实验组和空白对照组,PD0166285的浓度范围为0.005~1μM/m L、阿霉素的浓度范围为0.03~10μM/m L。根据单一用药对HL-60、NB4、EOL-1作用的实验结果,选择抑制率在10%~30%左右的PD0166285、阿霉素浓度作为联合用药的浓度,作用48h后用MTT法测定PD0166285、阿霉素单独和联合应用对HL-60、NB4、EOL-1细胞的增殖抑制作用,计算抑制率并求得半数抑制浓度(IC50)。
将HL60细胞(2×105/m L)接种于96孔板,每孔体积为100μL,每孔分别加入不同倍比稀释浓度的药物,PD0166285的浓度范围为0.25~1μM,阿霉素的浓度范围为0.1~1μM;将NB4细胞(2×105/m L)接种于96孔板,每孔体积为100μL,每孔分别加入不同倍比稀释浓度的药物,PD0166285的浓度范围为0.125~0.5μM,阿霉素的浓度范围为1~10μM;将EOL-1细胞(2×105/m L)接种于96孔板,每孔体积为100μL,每孔分别加入不同倍比稀释浓度的药物,PD0166285的浓度范围为3~30n M,阿霉素的浓度范围为30~300n M。以上实验组每个浓度设2个平行孔,同时用RPMI1640替代药物作为空白对照,将铺好的96孔板置于含5%CO2的37℃细胞培养箱中孵育48h,然后每孔加入5mg/m LMTT液10μL再孵育1h,加入20%SDS溶解紫瓒晶体后置于微量光谱测量仪器570nm处测吸光度(A)。实验至少重复三次取其中三次的平均值。
1.4统计学方法
采用SPSS17.0软件分析结果,实验数据以均数±标准差(±s)表示。各实验组间比较采用单因素方差分析。若P<0.05表示有统计学意义。
2结果
单独用药实验结果显示:PD0166285、阿霉素对HL60、NB4、EOL-1细胞均有不同程度的抑制作用,并呈明显的浓度—效应关系。PD0166285作用于HL60、EOL-1细胞48h的IC50分别为1μM、0.08μM,作用NB4相对较弱,48h未达到IC50(图1);阿霉素作用于HL60、NB4、EOL-1细胞48h的IC50分别为0.65μM、8μM、0.25μM(图2)。
联合用药实验结果显示:PD0166285联用阿霉素增强了对细胞株的生长抑制作用。例如,单独应用PD0166285(0.25μM,48h)或者阿霉素(1μM,48h),对HL60细胞株的抑制率分别为(33±1)%、(63±0.002)%;当二者联合时,抑制率可达(77±0.2)%(P<0.05)(图3)。同样的,单独应用PD0166285(30 n M,48h)或者阿霉素(100n M,48h),对EOL-1细胞株的抑制率分别为(53±4)%、(57±4)%;当二者联合时,抑制率可达(74±4)%(P<0.05)(图4)。PD0166285联合阿霉素也同样增强了对NB4细胞株的生长抑制作用,但无显著差异(P>0.05)(图5)。
3讨论
参与细胞周期调控的分子靶向治疗已经成为目前肿瘤治疗研究的焦点。Wee1蛋白激酶作为一种细胞周期的调节因子,属于蛋白激酶中丝氨酸/苏氨酸家族的一员。Wee家族包括Wee1-A,Wee1-B和MYT1三种蛋白激酶,Wee1-A主要存在于体细胞中,Wee1-B主要存在于胚胎细胞中,而MYT1在体细胞和胚胎细胞中均存在。Wee1激酶最初的研究源于酵母,是一种细胞分裂周期的突变体,在酵母中呈低表达。人类Wee1激酶是调控细胞周期从G2期到M期的关键靶点。在细胞周期进入有丝分裂之前,Wee1激酶促使其完成DNA损伤修复和DNA复制。Wee1在细胞周期的S期和G2期十分活跃,可通过使Cdc2的Tyr-15位点磷酸化继而降低Cdc2激酶的生物活性,最后可特异地调控细胞周期和有丝分裂。Wee1基因缺失或表达受抑后,致使相关的细胞周期激酶被激活,使细胞DNA损伤无法得到修复而直接进入下一细胞周期,可进一步导致DNA损伤细胞出现有丝分裂灾难,甚至出现细胞凋亡或死亡等[6]。伴有p53失活的肿瘤经常出现细胞周期G1检查点缺失,使细胞DNA复制及损伤修复过程中更加依赖于细胞周期G2/M期检查点的修复功能,因而作为细胞周期G2/M期检查点的关键因子,Wee1蛋白激酶成为了潜在的具有抗肿瘤作用的靶点。国内外报道显示wee1抑制剂已经在肺癌、结肠癌、骨肉瘤等多种肿瘤试验中被证明可以加强放化疗的作用。WANG等[7]通过实验发现Wee1被siRNA沉默后的He La细胞更容易被阿霉素杀死,但正常的宫颈上皮细胞却无明显损伤。Hashimoto等[8]通过研究发现WEE1抑制剂PD0166285可使B16黑色素瘤细胞从G2期阻滞变为G1期阻滞并抑制细胞增殖,促使细胞死亡。SCHELLENS等[9]通过研究证明Wee1小分子抑制剂MK-1775既可以作为单独药物应用,也可以与卡铂、顺铂、吉西他滨等化疗药物联用,均对多种实体肿瘤有明显抑制作用。WANG等[4,10]进行了一系列的实验发现Wee1抑制剂PD0166285可以协同化疗或放疗增强对肺癌、结肠癌和黑色素瘤患者肿瘤细胞的杀伤,从而使肿瘤细胞产生有丝分裂灾难,甚至诱导肿瘤细胞凋亡。阿霉素作为蒽环类抗肿瘤药物的一种代表,是多种肿瘤尤其急性白血病的化疗方案的重要组成药物,使用广泛,能够嵌合于DNA碱基对之间并紧密地结合到DNA上,这种嵌合可破坏DNA三级结构,从而抑制DNA以及DNA依赖性RNA的合成。阿霉素作为一种细胞周期非特异性抗肿瘤药物,对各期细胞均有细胞毒作用,但以S期细胞对其最敏感。然而,DNA损伤后会通过激活相关细胞周期检查点而使细胞周期停滞,为细胞进行DNA修复提供时间并促使细胞经过修复而存活。因此,细胞周期检查点的激活可能是导致阿霉素等蒽环类药物治疗急性白血病失败的原因之一。
为此,本实验应用Wee1抑制剂PD0166285联合阿霉素,观察作用环节及作用机理各不相同的药物联合应用对急性白血病细胞的增值抑制作用。实验结果显示,PD0166285和阿霉素联用后对HL60、EOL-1细胞株的抑制率显著增加,明显高于单一用药,且有显著差异(P<0.05)。综上所述,PD0166285联用阿霉素不仅能提高抗白血病作用,而且可望降低阿霉素的用量而减少相关副作用,联合运用PD0166285与阿霉素可望成为治疗白血病新的有效方案。PD0166285和阿霉素联用对HL60、EOL-1细胞株的抑制有协同作用。PD0166285联用阿霉素不仅能提高抗白血病作用,而且可望降低阿霉素的用量而减少相关副作用,联合运用PD0166285与阿霉素可望成为治疗白血病新的有效方案。
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浅论经济增长对通货膨胀的抑制作用 第9篇
通货膨胀与经济增长是现代经济运行的两大主题，就通货膨胀对经济增长的影响方面的研究主要有以下三种观点：一是促进论，认为政府在有效需求不足的情况下选择通货膨胀，实行赤字财政，扩大货币发行，增加政府投资，以扩大内需和经济增长;二是促退论，主要认为通胀通过再分配效应影响经济发展;三是中性论，即二者没有必然联系。就通胀与增长影响关系的研究来看，目前尚无定论。
对于不同经济发展水平的国家来说，西尔斯、贝尔和·泰勒等结构主义者提出通货膨胀与增长正相关的观点。他们认为发展中国家政府在用于社会投资项目的资源不足的情况下，可通过通货膨胀税的筹资途径获得额外资源，用于发展投资，促进经济增长。但是通胀对经济增长的正效应是有条件的，当这些条件不能满足时，上述正效应就不存在，甚至可能变为负效应。国际货币基金组织的约翰逊博士在题为《发展中国家的增长和通货膨胀》论文中阐述了这些前提条件———投资与国内生产总值GDP的比例必须随通货膨胀而提高，经济增长又必须随投资———GDP比例的增长而加速。
还有学者认为，通胀对经济增长的影响要依不同时期而定。短期内通胀能够促进经济的增长，使得通胀有利于经济的发展。但是从长期来看，通胀的负作用将逐渐明显，并且通货膨胀的短期效益也会被后续的经济滑坡所抵消。
关于经济增长对通货膨胀的影响方面研究很少，更多地讨论集中在通胀时期，政府如何平衡二者的关系，是将宏观调控的主要目标锁定在抑制通货膨胀上还是继续大力促进经济增长上。
二、中国宏观经济目标从治理通胀向经济增长转变
2008年以来，中国经济在世界经济金融危机的冲击下受到较大影响，而且波及范围和深度日渐扩大和加深，就此次中国发生通胀的原因，国内的学者也做了大量的研究，从流动过剩、成本推动、需求拉动、二元结构等角度进行了分析和总结，具体表现在人民币的超额发行，扩张性的财政政策以及利率和汇率水平偏低上。
通货膨胀一般通过CPI、Core CPI、PPI等指标来衡量，其中最常用的是消费价格指数。2008年5月份，我国CPI同比增幅达到7.7%，一直居高不下，面对经济滑坡、通胀日益严重的状况，央行首先采用了一些治理通胀的传统方法，最为直接的就是提高居民存贷款利息率和商业银行等金融机构的法定准备金率的宏观经济政策来缩小社会投资，控制流通中的货币流量，以缓解通货膨胀的继续恶化。2008年1月到10月以来，央行先后八次调整了人民币存贷款利率和商业银行的法定准备金率。
2008年6月份以前，央行一直本着上调利率和准备金率的政策，9月份以后，随着世界金融危机形势的更加严峻，为抵御国际环境对中国的不利影响，面对着这次通胀危机，中国政府重新调整经济政策，认为有必要采取积极的财政政策和适度宽松的货币政策，将宏观调控的主要目标从治理通胀转向经济增长。从这个月开始，先是央行下调了两项利率水平，此次调整，是央行六年和九年来首次采取下调人民币存贷利率和存款准备金率的政策。此外，为进一步扩大内需，促进经济增长，中国政府下大力气，制定并出台了相关措施，由温家宝总理主持的国务院常务会议专门研究了进一步扩大内需促进经济平稳较快增长的十项措施，根据这一会议精神，到2010年，中国完成相关措施的建设需要各项投资4万亿元人民币。
在通胀时期，既要降低通货膨胀率，又要保证经济增长，如何平衡二者的关系，中国一些经济学家和学者经过分析研究认为，2008年中国通货膨胀率与经济增长率调控目标的合理组合是：居民消费价格指数(CPI)的上涨率为4.8%左右(即4.5%-5.5%)，且现实一点的界限可能是高限;而GDP增长率为9.7%左右(9.0%-10.4%)，且现实一点的界限是只要不低于9.0%，就以控制通货膨胀率目标为主。2008年中国经济增长率降至9%水平下，按照这一标准，中国也应将宏观调控的主要目标从抑制通胀转到促进经济增长上来，通过经济的增长缓解通胀问题。
三、产品和货币市场一般均衡下增长对通胀的抑制效应
在当前国际经济政治形势下，一国的经济政策不能仅把控制通胀作为主要目标，关键问题是如何保证经济的持续增长，要在确保经济增长的过程中治理通货膨胀。下面运用产品市场和货币市场的一般均衡理论探析经济增长对通货膨胀的效应问题，得出在通胀时期，仅提高利率不但不能有效治理通胀问题，而且还会使经济增长受损;相反，降低利率，增加政府投资既可以促进经济增长，还能使通货膨胀程度自动减弱。
（一）提高利率条件的通胀与增长
在通胀时期，若仅采取上调居民存贷款利率政策。设初始状态利率水平为i0，相应的消费收入和投资分别为C0, I0，不考虑其他因素，设市场上只有居民和厂商两个部门，在产品市场上，经济总量为y0=C0+I0。现采取上调利率的政策，将利率调至i1 (i1>i0)，相应的经济总量为y1=C1+I1，利率上升，I1
因i1>i0, y1
（二）降低利率、增加政府投资条件下的通胀与增长
现采取刺激内需增长的政策。首先下调利率至i2 (i2
根据以上分析，在央行实施宽松货币政策的基础上，政府增加投资，刺激内需，可以在经济获得增长的同时缓解通货膨胀。2008年中国GDP增长率低于9%，治理通货膨胀是以大幅度牺牲经济增长为代价的，因此要将治理的重点放在经济增长上，在经济增长的同时抑制通货膨胀。
四、结论
运用产品市场和货币市场的一般均衡理论，研究得出在通货膨胀时期，仅依靠提高利率的方法抑制投资和消费不仅不能有效控制通货膨胀，还会有损经济增长;相反，若降低利率，扩大政府投资既可以实现经济增长又可以有效缓解通胀问题。
中国是一个发展中大国，在经济萧条时期扭转被动局面，政府的宏观调控显得尤为重要。物价稳定、充分就业是一国宏观调控的基本目标，但就中国的现实情况来看，这两个基本目标的实现仍要依赖于整个社会的经济增长，要在经济增长中带动劳动就业机会和实际就业量的增加、抑制通货膨胀，力保物价稳定。
在当前世界经济整体水平下滑时期，缓解通胀、促进经济增长不是短期内能够见效和完成的，要切实转变这种不利局面就要从长远利益、长远发展着手，强化基础设施建设。我国尚属经济正在转型的发展中国家，还没有完全实现工业的现代化，居民生活水平参差不齐，总体相差较大，由于基础设施不完善，现代化触角难以遍布城乡，致使一些潜在需求不能得到激发和满足。就我国的现实情况看，大中城市的居民消费基本上已达到饱和，因居民消费具有刚性，即使在通胀时期，这些地区的消费短期内也不会有太大幅度的变化。因此，对于我国这样一个人口众多的国家可以凭借治理通货膨胀的时机，增加基础设施的建设和农业方面的投入，在扩大内需的基础上实现经济增长，抑制通货膨胀。
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壳聚糖对植物病原微生物抑制作用 第10篇
壳聚糖 (Chitosan) , 又名聚氨基葡萄糖, 可溶性甲壳素或脱乙酰甲壳素, 是甲壳素 (Chitin) 乙酰基转化而成的产物[1,2,3]。甲壳素又称几丁质或甲壳质[4], 甲壳质是一种天然多糖类高分子化合物, 在自然界中分布甚广, 主要存在于虾、蟹等甲壳动物的外壳, 蟑螂、蚕 (蛹) 等昆虫的表皮, 以及蘑菇等菌类的细胞壁中。
有关壳聚糖及其衍生物抑菌特性的报道最早见于1979, Allan等[5]发现壳聚糖有广谱抑菌性。近年来, 壳聚糖及其降解产物己被应用于各个领域中, 尤其是在抗菌、抑菌方面, 其中有关壳聚糖及其衍生物抗菌性能的报道较多[6,7,8], 认为壳聚糖不仅具有天然抗菌性能, 而且抗菌谱广。壳聚糖能够有效地抑制细菌和真菌的生长和繁殖, 与一般抑制剂相比, 它具有高活性、广谱性、高效性等优点, 在抑制植物病原菌的方面效果显著。我国海岸线长, 甲壳资源丰富, 加强对其衍生物的研究开发, 变废为宝, 可以带来巨大的经济效益、社会效益和生态效益。
1 壳聚糖对植物病原微生物的抑制作用
由于壳聚糖能阻止植物病原菌细胞的发育生长, 诱导宿主植物对病原菌产生防护机制, 因而能够减少病原菌对植物的危害。
1.1 对病原真菌的抑制作用
喻大昭、扬小军等[9], 研究了低壳聚糖对小麦白粉病菌 (Erysiphe graminis) 、水稻纹枯病菌 (Rhizoctonia solani) 的影响, 室内测定结果表明:低壳聚糖对小麦和水稻纹枯病的抑制率分别达到91.5%和100%;对小麦白粉病有一定的诱导抗病作用。田间实验表明, 在病害发生早期喷施一定浓度低聚糖水溶液可以有效控制水稻纹枯病的发生。
Nicole等[10]用1 mg·mL-1的壳聚糖浸泡番茄根可防治由镰刀菌 (Fusarium oxys-porum f.sp.radicislycopersici) 所引起的番茄茎腐病, 抑制率为70%。廖春燕, 马国瑞等[11]研究了壳聚糖对番茄枯萎病菌 (F.oxysporumf.sp.Lycopersici) 菌丝生长和孢子萌发的抑制作用。结果表明, 浓度大于1 mg·mL-1的壳聚糖能明显抑制菌丝生长, 各设定浓度均可在一定程度上抑制孢子萌发, 而且抑制效果随着处理浓度的增大而增强;浓度大于0.1 mg·mL-1的壳聚糖处理可诱导初生菌丝发生肿胀、分枝增多且菌体分隔增加及体细胞变短等形态学变化。
董秋洪、张样喜[12]用平板抑菌法测定了壳聚糖对辣椒疫霉病菌和水稻恶苗病菌的抑制作用。结果表明, 壳聚糖稀释250～500倍对辣椒疫霉病菌菌丝的抑制效果达59.1%～91.7%, 而对水稻恶苗病菌菌丝的抑制效果达14.6%～68.4%。其中, 壳聚糖稀释250倍液对辣椒疫霉病菌菌丝的抑制效果最为明显, 达到91.7%, 优于25%施宝克稀释液对比药剂的抑制效果。
覃彩芹、龙晶等[13]采用平板法研究了壳聚糖系列样品对大叶黄杨炭疽病、沿阶草炭疽病、广玉兰炭疽病 (Colletotrichum gloeosporioide) 和对节白蜡腐烂病 (Valsa sp.) 等庭院植物病原真菌的体外抗菌性能。结果表明:水不溶性壳聚糖酸溶液均表现出抑菌活性, 且随着浓度的增大而抑菌活性增强;中等分子量 (7.8×104) 壳聚糖比大分子量 (3.8×105) 壳聚糖和低分子量 (1.7×104, 2.3×103) 壳聚糖抗菌作用强。
钟秋平、夏文水等[14]以芒果炭疽病菌 (Colletotrichum gloeosporioides) 、芒果褐色蒂腐病菌 (Phomopsis mangiferae) 、芒果球二胞霉蒂腐病菌 (Botryodiplodia theobromae Pat.) 、芒果小穴壳蒂腐病菌 (Dothiorella Dominicana) 为实验菌株, 研究了不同pH、酸溶剂的种类对壳聚糖抗菌活性及其抗菌稳定性的影响。结果表明:壳聚糖的抑菌率随着壳聚糖浓度的提高而提高;在pH4.8和pH6.0的环境中, 壳聚糖的抗菌能力较强;壳聚糖的乳酸溶液对芒果蒂腐病菌有很强的抑制力;壳聚糖连续刺激诱导40代后, 芒果炭疽病菌、蒂腐病菌的EC50值均有所提高, 其中以芒果球二孢霉蒂腐病菌和芒果褐色蒂腐病菌变化最显著, 说明壳聚糖对其抗菌稳定性最差。
李美芹、肖慧等[15]以番茄叶霉病菌为实验菌种, 用含毒介质法系统研究了壳聚糖的脱乙酰度、分子量、浓度、环境pH及溶剂等因素对壳聚糖抑菌活性的影响。结果表明, 壳聚糖对番茄叶霉病菌具有明显抑制作用;在研究范围内, 随浓度的增加和环境pH降低, 抑菌活性增强;较理想的溶剂是乳酸和醋酸;脱乙酰度为86%、分子量为213×103的壳聚糖抑菌效果较好;0.2%的壳聚糖与三唑酮等农药抑菌效果相同。
1.2 壳聚糖对病原细菌的抑制作用
Struszczyk和Pospieszny等[16]用最小抑制浓度 (MIC) 的方法, 研究甲壳素和壳聚糖对密执安棍状杆菌密执安亚种 (Clavibacter michigmense subsp.Michiganense) 、密执安棍状杆菌诡谲亚种 (Clayibacter michiganese subsp.Indiossum) 、野油蕖黄单胞菌天竺致病变种 (Xang-mmonas campestris pv.Pelargonii) 、丁香假单胞菌、番茄致病变种 (Pseudomonas syringae pv.tomato) 、根癌农杆菌 (Agrob-acterium tumefaciens) 及大肠杆菌 (Escherichia coli) 等多种细菌作用的结果表明:壳聚糖在0.01%～0.3%浓度范围, 可抑制除大肠杆菌外的其他几种细菌的生长。Jeon[17]等作了不同分子量的壳低聚糖对细菌的抑制作用研究, 发现壳低聚糖的抑菌作用与其分子量的大小关系十分密切, 只有分子量接近或大于10 kD的壳低聚糖对细菌生长才可有效的抑制。
马鹏鹏和何立千等[18], 通过测定最小抑菌浓度和相对抑制率, 研究了分子量和脱乙酰度对壳聚糖抑制胡萝卜软腐欧文菌 (Erwinia cartovara Var.carotovora) 、油菜黄单孢菌绒毛草致病菌 (Xanthamonas campestris Pv.holcicola) 等作用的影响。结果表明:在一定范围内, 随分子量和脱乙酰度的增大, 壳聚糖的抑菌效果相应降低, 各种病原菌细菌对不同壳聚糖的敏感性也有很大的差异。
吴小勇、曾庆孝等[19], 比较了相同脱乙酰度不同分子量, 以及分子量相近、脱乙酰度不同的壳聚糖对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌和假单胞菌的抑菌作用。结果表明, 实验中用到的壳聚糖都对金黄色葡萄球菌有很强的抑菌作用 (抑菌率接近100%, 最低抑菌浓度为0.03%) ;对于其他3种细菌, 脱乙酰度相同 (75.3%或93.7%) , 粘均分子量不同 (在40万～80万) 的壳聚糖, 抑菌作用随分子量的升高而增强;而分子量相近脱乙酰度不同的壳聚糖对上述4种细菌的抑菌作用差别不大;在pH5.5～6.0壳聚糖能够发挥最强的抑菌作用;总体看来, 壳聚糖对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强, 其次是对假单胞菌和枯草杆菌, 壳聚糖对大肠杆菌的抑菌作用相对弱一些;实验条件下的壳聚糖对上述4种细菌的抑菌作用普遍比苯甲酸钠强。
杨声、冯小强等[20], 研究了水溶性壳聚糖对大肠杆菌 (Escherichia coli) 、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus) 、变形杆菌 (Proteusspecies) 、白色念珠菌 (Candida albicans) 、绿脓杆菌 (P.aeruginosa) 的抑菌作用。结果表明, 水溶性壳聚糖在1%HAc中的抑菌性强于在水中的抑菌性, 在5种被试菌中, 其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用最强。
1.3 壳聚糖抑制植物病毒、类病毒
Paspieszny[21]发现, 在多种植物 (大豆、烟草等) 叶片上喷洒或叶片注射壳聚糖可保护植株不受病毒的侵染, 并且还认为壳聚糖抗病毒感染的效果与病毒-宿主系统、壳聚糖施用方式和使用剂量有关。Struszczy证实了他的观点, 壳聚糖的抗病毒作用是通过宿主细胞实现的, 且壳聚糖的聚合程度越高, 其抗病毒作用也越强, 但与其脱乙酰度关系不大, 而脱氨基壳聚糖对TMV (烟草花叶病毒) 的抑制作用比未经修饰的壳聚糖聚合物强。
此外, Struszczyk将PSTV (马铃薯纺锤体形块茎病类病毒) 与不同浓度壳聚糖混合后接种番茄植株。结果壳聚糖甚至在0.01 mg·mL-1时即可有效抑制PSTV侵染, 以0.1%的壳聚糖溶液喷洒植株叶片也同样有效, 而且预先对番茄植株施用壳聚糖, 然后再用病毒处理植株, 可使番茄病毒感染率下降50%～75%。他们认为壳聚糖的抗病毒和抗类病毒作用是其引发植株本身的自然抗性所致。
2 壳聚糖抑制植物病原微生物的机理
壳聚糖对许多植物病原菌的生长都有很强的直接抑制作用。但是, 在壳聚糖的抑菌机理和抑菌特性方面, 不同的研究者得出的结论却不尽相同。大多数研究者[23,24,25,26,27,28,29]普遍认为, 壳聚糖对植物病原菌的直接抑制作用主要通过下面两种机制实现: (1) 壳聚糖是甲壳素的多聚阳离子衍生物, 它可以与病原菌细胞表面的生物大分子带负电的侧链相互作用, 形成聚合物, 以至影响病原菌的细胞膜通透性 (有时甚至可使细胞内物质渗出) , 进而抑制病原菌的生长。 (2) 壳聚糖还可直接进入病原菌的细胞核, 与DNA结合通过影响病原菌的mRNA和蛋白质的合成来抑制其生长。
3 研究现状与应用前景
壳聚糖作为一种多聚物, 由甲壳素衍生而来。由于其具有比甲壳素优越的特性, 所以实际中常用的一般为壳聚糖。甲壳素作为壳聚糖的生产原料, 在自然界分布极广, 据估计, 自然界的生物每年能生产1.0×1012t的甲壳素, 其中可被现代化工业利用的就达2.0×106t[30]。这笔丰富的自然资源促使世界各国很早便开始对甲壳素和壳聚糖进行了大量的研究。
总的来讲, 美国和日本在甲壳素与壳聚糖应用研究上发展较快, 尤其在壳聚糖抑制植病方面, 美国已作了较为系统的研究。应该讲, 我国在此方面的研究起步并不晚, 目前存在的主要问题是:重复性研究, 开发力度较分散, 多数研究者未及时将研究成果推广应用, 或虽有应用, 产品档位较低且规模不大, 产业化程度不高, 这些致使目前我国在农业生产中甲壳素类产品所占的份额微乎其微。不过相信壳聚糖等甲壳素衍生物会以它们无毒、无污染和生物相容性等诸多优良特性在农业生产中发挥越来越重要的作用。
抑制作用 第11篇
关键词：辛夷；顺序提取物；灰葡萄孢菌；抑制作用
中图分类号：X 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2014）09-0009-04
植物是生物活性化合物的天然宝库，研究和开发植物源农药是一条研发新农药的有效途径。植物源农药具有易降解、低毒性、对环境污染小等特点，符合当今社会的发展趋势，已成为研究的热点。辛夷是我国一种传统中药，是望春玉兰花蕾的统称[1]。辛夷提取物具有抑菌活性，起抑菌作用的主要活性成分存在于其挥发油中[2-4]。以不同溶剂的辛夷提取物为材料，研究其对黄瓜灰霉病致病菌灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers.）的菌丝生长和孢子萌发的抑制作用，为辛夷作为植物源农药提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 辛夷提取物的制备
采用索氏提取法[5-6]，选取极性不同的溶剂（石油醚<氯仿<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<水），按照溶剂极性由小到大的顺序，对辛夷依次进行提取。然后，将提取液旋转蒸发浓缩，得到黏稠膏状粗提物，称定质量并计算其提取率。此后，置于4 ℃冰箱保存。提取率计算公式为：
提取率（%）=×100% （1）
无菌条件下，用微量二甲基亚砜（不超过总体积2%）分别将6种不同溶剂的提取物充分溶解，再用无菌水配制成40 000 mg/L的母液。此后，采用二倍稀释法将母液配成40 000、20 000、10 000、5 000、2 500 mg/L等5个浓度梯度。
1.2 供试菌株
灰葡萄孢菌从感染灰霉病的黄瓜上分离、纯化获得，保存于聊城大学农学院植物病理学实验室。
1.3 离体生物测定
1.3.1 生长速率法 采用生长速率法[7]测定辛夷的6种溶剂提取物对菌丝生长的抑制效果。培养基为含药PDA（葡萄糖-马铃薯-琼脂培养基），空白对照不加药；提取物终浓度分别为4 000、2 000、1 000、500、250 mg/L；菌饼直径为0.5 cm；十字交叉法测量菌落直径，3次重复。根据菌落直径计算菌丝生长抑制率，公式如下：
校正直径=平均直径-菌饼直径 （2）
抑制率（%）=×100% （3）
1.3.2 孢子萌发法 以孢子萌发法[8]（悬滴法）测定辛夷的6种溶剂提取物对病原菌孢子萌发的抑制作用。提取物终浓度分别为4 000，2 000，1 000，500，250 mg/L，3次重复，根据下列公式计算抑制率：
萌发率（%）=孢子萌发数/检查孢子总数×100% （4）
抑制率（%）=×100%（5）
1.4 数据分析方法
应用Microsoft Excel软件处理数据；采用SPSS 10.0软件建立毒力回归曲线，将抑菌的百分率转换成几率值，浓度转换成对数，进行几率值分析，分别求出辛夷的6种溶剂提取物对灰葡萄孢菌的抑制浓度（EC50）[9]；利用DPS v3.01专业版软件，采用Duncar新复极差法进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 辛夷提取率
采用6种溶剂对辛夷进行顺序提取，计算各样品的提取率，结果如表1所示。
提取率的高低反映植物材料在溶剂中溶解量的多少。由表1可以看出：各种溶剂之间的提取率差别较大，其中去离子水对辛夷的提取率最高，为12.06%；石油醚的提取率次之，为9.63%；丙酮的提取率最低，为1.99%。
2.2 辛夷6种顺序提取物对黄瓜灰葡萄孢菌菌丝生长的抑制作用
辛夷提取物对灰葡萄孢菌菌丝生长的抑制作用分别如表2和表3所示。
由表2可以看出：辛夷的6种顺序提取物对灰葡萄孢菌的菌丝生长起抑制作用，但各溶剂提取物之间的差距较大；石油醚提取物的抑菌效果最好，其次为丙酮提取物，在4 000 mg/L浓度时，抑菌率分别为99.19%和97.40%；乙醇的提取物抑菌效果最差，在
4 000 mg/L时，抑菌率仅为76.96%。
由表3可以看出：各提取物的相关系数均大于0.900 0，相关性较高；EC50最小的是氯仿提取物，为229.84 mg/L；其次为丙酮提取物，为316.48 mg/L；去离子水的EC50较高，为845.44 mg/L；菌丝EC50最高的为乙醇提取物，为1 019.82 mg/L。相对来说，溶剂极性越小，其提取物对菌丝的抑制效果越明显。
2.3 辛夷6种顺序提取物对灰葡萄孢菌孢子萌发的抑制作用
辛夷提取物对灰葡萄孢菌孢子萌发的抑制浓度（EC50）如表4和表5所示。
由表4可以看出：辛夷的6种顺序提取物对灰葡萄孢菌孢子萌发均有抑制作用；在浓度为4 000 mg/L时，石油醚提取物抑制效果最好，孢子萌发抑制率为79.50%；丙酮提取物与水提取物的抑菌效果都较差，孢子萌发抑制率分别为47.26%和46.17%，均不到50.00%。
nlc202309041407
由表5可以看出：石油醚提取物对孢子萌发的EC50最小，为1 318.92 mg/L；其次为氯仿提取物，EC50为1 965.50 mg/L；EC50最大的是水提取物，为
4 321.80 mg/L。由此可以看出，溶剂的极性越小，其提取物对孢子萌发的抑制作用越明显。
3 结论与讨论
采用顺序提取法，用6种溶剂（石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、水）对辛夷进行提取。结果表明：去离子水的提取率最大，为12.06%；石油醚次之，为9.63%。
采用生长速率法测定各样品对菌丝生长的抑制作用，孢子萌发法测定各样品对孢子萌发的抑制作用。结果表明：辛夷6种溶剂的顺序提取物对灰葡萄孢菌的菌丝生长和孢子萌发均有抑制作用；其中，石油醚、氯仿提取物对菌丝生长的EC50分别为372.15 mg/L和229.84 mg/L，对孢子萌发的EC50分别为
1 318.92 mg/L和1 965.50 mg/L，抑菌效果较好；水提取物对菌丝生长和孢子萌发的EC50分别为845.44 mg/L和4 321.80 mg/L，抑菌效果相对较差。
综上说明，辛夷中的一些物质虽易被去离子水提取，但这些物质没有抑菌活性。辛夷的主要抑菌活性物质为脂溶性物质，易被有机溶剂提取，且溶剂极性越小，提取液对孢子萌发的抑制效果越明显；用单一溶剂提取辛夷的有效成分时，可以选择石油醚或氯仿，以及与两者极性相当或极性处于两者之间的溶剂。6种测试溶剂提取物对菌丝生长的抑制效果优于对孢子萌发的抑制效果。
目前，国内利用植物粗提物抑制病原菌的研究还有很多。如王桂清[10]通过采用生长速率法和孢子萌发法测定了辽细辛根的不同溶剂（石油醚、氯仿、乙酸乙酯、乙醇）粗提取物对灰葡萄孢菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用，发现细辛的不同溶剂提取物对灰葡萄孢菌的菌丝生长和孢子萌发均有一定的抑制作用，并且对孢子萌发的抑制效果要好于对菌丝生长的抑制效果；其中石油醚提取物的抑菌效果较好，其对菌丝生长的EC50分别为177.44 mg/L与159.98 mg/L，对孢子萌发的EC50分别为173.23 mg/L与125.29 mg/L。王树桐等[11]研究了丁香的甲醇提取物对番茄灰霉病菌的抑制效果，发现当提取物浓度为20 000 mg/L和
10 000 mg/L时，对菌丝的抑制率达到80%以上，当提取物浓度为10 000 mg/L时，完全抑制孢子的产生，浓度为5 000 mg/L时，对产孢的抑制率为85.40%，浓度进一步稀释的话则不再表现显著抑制作用。国内对辛夷的抑菌作用也有所研究。李红梅等[3]测试了123种中草药提取物对板蓝根根腐病菌（Fusarium solani）菌丝生长及孢子萌发的抑制作用，发现辛夷提取物0.01 g/mL浓度时对菌丝生长的抑制率为11.58%，对孢子萌发的抑制率为6.00%。王树桐等[4]研究测试了123种常见中草药提取物对香蕉镰刀菌枯萎病病原菌（F. oxysporum）的抑菌作用，发现辛夷提取物1%的浓度对菌株B1和B2的菌丝生长抑制率分别为76.56%和24.73%，对孢子萌发的抑制率分别为40.06%和61.62%。
众多的研究结果表明，利用一些植物提取物来作为植物源杀菌剂是可行的，且发展前景较为广阔。为了能够更好地利用植物源杀菌剂，研究清楚其有效成分势在必行。辛夷含有的抑菌活性物质可能不止一种，各物质之间的抑菌活性可能是相辅相成的，可进行层析分离和质谱分析，进一步测定各分离物质对灰葡萄孢菌的抑菌活性。
参考文献
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[3] 李红梅，曹静，张凤巧.中草药提取物对板蓝根根腐病菌抑制作用研究[J].河南农业科学，2009（6）：100-104.
[4] 王树桐，黄惠琴，方哲.中草药提取物对香蕉镰刀菌枯萎病病原菌的抑制作用[J].热带作物学报，2008，29（1）：78-82.
[5] 唐裕芳，张妙玲，陶能国，等.苍术挥发油的提取及其抑菌活性研究[J].西北植物学报，2008，28（3）：588-594.
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[7] 王桂清.离体条件下细辛精油对3种棉花病害致病菌的抑菌活性[J].农业科技与装备，2008，178（4）：41-44.
[8] 王桂清，张军华，张敏，等.辽细辛提取物对拟盘多毛孢菌的离体抑制作用[J].河南农业科学，2008（2）：60-63.
[9] 华南农业大学.植物化学保护[M].北京：农业出版社，1998.
[10] 王桂清.辽细辛提取物对灰葡萄孢菌的抑制效果[J].植物保护，2008，34（2）：53-57.
[11] 王树桐，曹克强，张凤巧，等.中药丁香提取物对番茄灰霉病菌抑制作用及生防效果研究[J].植物病理学报，2005，35（6）：91-94.
抑制作用 第12篇
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验材料酵母多糖,购于浙江某生物技术公司,有效物质含量94%,为淡黄色至黄棕色粉末,β-葡聚糖≥20.0%,甘露聚糖≥20.0%,粗蛋白≤35.0%。
1.1.2试验动物BALB/C纯系清洁级10~12周龄雄性小鼠,体重为20±2 g,购于辽宁医学院实验动物中心。
1.1.3主要试剂四甲基偶氮唑(MTT)、刀豆蛋白A(Con A)(美国Sigma公司)、RPMI 1640培养基(日本Nissui公司)、环磷酰胺(CY)(江苏恒瑞医药股份有限公司)、YAC-1细胞(上海研生生化试剂有限公司)、EZ-Se PTMMOUSE IX淋巴细胞分离液、小鼠IL-4和IFN-γELISA试剂盒(深圳达科为生物技术有限公司)。
1.2方法
1.2.1试验分组将180只雄性小鼠随机分成5组,每组3个重复,每个重复12只。分别为免疫抑制模型组、空白对照组、试验Ⅰ组(0.2 mg/m L)、试验Ⅱ组(0.5 mg/m L)、试验Ⅲ组(1 mg/m L)剂量组。免疫抑制模型组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组、试验Ⅲ组,分别腹腔注射环磷酰胺(CY)40mg/kg,1次/d,连续3 d。第4天起试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组给予YPS,空白对照组和CY模型组给予生理盐水,每只小鼠灌服均为0.1 m L/10 g体重,小鼠隔日称重,以调整灌胃量,1次/d,连续给药30 d。
1.2.2免疫指标测定
1.2.2.1免疫器官指数的测定给药30 d后,每组每个重复取2只小鼠称重,解剖摘取免疫器官脾脏和胸腺,去除筋膜和脂肪组织后称重,根据公式计算脾指数和胸腺指数。
免疫器官指数=免疫器官重(mg)/体重(g)
1.2.2.2IL-4、IFN-γ含量按照ELISA试剂盒说明书方法检测血清中IL-4和IFN-γ的浓度。
1.2.2.3细胞免疫指标的测定
1.2.2.3.1T淋巴细胞转化试验给药30 d后,每组每个重复取2只小鼠,颈椎脱臼处死。无菌取脾,制备脾细胞悬液。应用Con A刺激脾淋巴细胞分化增殖,采用MTT比色法[4]测定脾淋巴细胞增殖能力。
1.2.2.3.2迟发型变态反应试验结束前4 d,每组每个重复取2只小鼠,用2%(v/v)SRBC(约1×108个SRBC)腹腔注射0.2 m L进行致敏。4 d后,测量左后足跖厚度,然后在测量部位皮下注射20μL20%(v/v)SRBC,注射后24 h测量左后足跖厚度,同一部位测量3次,取平均值。计算注射前后厚度的差值[5]。
1.2.2.4体液免疫指标的测定
1.2.2.4.1血清溶血素检测小鼠灌服26 d后,每组每个重复取2只小鼠,每鼠腹腔注射0.5%绵羊红细胞悬液0.2 m L进行免疫。免疫4 d后摘除眼球取血制备血清。采用文献[6]方法测定小鼠血清溶血素抗体含量,以样本半数溶血值(HC50)表示,按照以下计算公式计算:
HC50=(样品管OD值/CRBC半数溶血OD值)×稀释倍数
1.2.2.4.2抗体生成 细胞检测依 文献[7]方法(Jeme改良玻片法)测定全脾细胞溶血空斑数。用空斑数/108脾细胞来表示。
1.2.2.5非特异性免疫指标的测定
1.2.2.5.1小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验给药30 d后,每组每个重复取2只小鼠,每鼠腹腔注射20%鸡红细胞悬液1 m L,30 min后,脱颈处死。计数100个巨噬细胞中吞噬有鸡红细胞的巨噬细胞数及所吞噬的鸡红细胞数,按下式计算吞噬百分率和吞噬指数[8]。
吞噬百分率(%)=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/100×100%
吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞数/100
1.2.2.5.2NK细胞活性测定取1.2.2.1脾细胞悬液,采用乳酸脱氢酶法[9]测定NK细胞活性。
NK细胞活性=试验组OD值-自然释放组OD值/最大释放组OD值-自然释放组OD值×100%
1.3统计学方法
用SPASS 18.0软件单因素方差分析(one way ANOVA)进行组间差异的比较。数据用(±S)表示。
2结果与分析
2.1 YPS对小鼠免疫器官指数的影响与对照组比较,免疫抑制模型组小鼠脾脏及胸腺指数显著低于正常对照组(P<0.05),表明造模成功。与CY模型组相比,空白对照组、试验试验Ⅱ组和试验Ⅲ组的脾、胸腺指数明显提高,差异显著(P<0.05),空白对照组、试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组间差异不显著,试验Ⅰ组与CY模型组间差异亦不显著(P>0.05),说明YPS能促进免疫抑制小鼠免疫器官的生长发育,提高免疫抑制小鼠的免疫功能。详见表1。
注:同一列数据肩标字母相同表示差异不显著(P>0.05),字母不同表示差异显著(P<0.05),大写字母不同表示差异极显著(P<0.01),下同。
2.2 YPS对小鼠血清IL-4和IFN-γ的影响与CY模型组相比,空白组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组小鼠血清中IL-4和IFN-γ的含量均有显著增高,其中试验Ⅰ组和试验Ⅱ组差异显著(P<0.05), 空白组和 试验Ⅲ组 差异极显 著(P<0.01), 试验Ⅰ组 和试验Ⅲ 组间差异 显著(P<0.05),与试验Ⅱ组间差异不显著(P>0.05)。详见表2。
2.3 YPS对小鼠T细胞的增殖能力和迟发型变态反应的影响与CY模型组相比,试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组均明显提高,试验Ⅰ组差异显著(P<0.05),试验Ⅱ组和试验Ⅲ组差异极显著(P<0.01), 试验Ⅰ、 Ⅱ、Ⅲ组 间差异均 显著(P<0.05),试验Ⅲ组与空白对照组组间差异不显著(P>0.05)。详见表3。
2.4 YPS对小鼠血清溶血素抗体积数和溶血空斑数的影响与CY模型组相比,空白对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组小鼠血清溶血素抗体积数和溶 血空斑数 明显提高 , 差异显著(P<0.05),且空白对照组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组组间差异不显著(P>0.05);与试验Ⅰ组相比,试验Ⅱ组和试验Ⅲ组差异均显著(P<0.05)。详见表4。
2.5 YPS对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力和NK细胞活性的影响与CY模型组相比,空白对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组小鼠吞噬细胞百分率、吞噬指数、NK细胞活性均有明显提高 , 其中试验 Ⅰ组各检 测指标差 异显著(P<0.05);空白对照组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组各检测指标差异极显著(P<0.01),空白对照组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组组间差异不显著(P>0.05);与试验Ⅰ组相比,空白对照组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组的各项检测指标差异均显著(P<0.05)。详见表5。
3讨论
3.1 YPS对小鼠免疫器官指数的影响胸腺和脾脏分别属于中枢和外周免疫器官,其增重往往意味着机体淋巴细胞的增殖,直接体现了免疫应答的强弱[10]。当机体的整体免疫功能增强时,其重量有所增加,机体免疫功能低下时,常表现出脏器萎缩,体积变小等现象。本研究表明,与空白对照组比较,免疫抑制模型组小鼠脾脏及胸腺指数显著低于正常对照组(P<0.05),说明腹腔注射环磷酰胺可致小鼠免疫抑制,造模成功。与模型组相比,试验Ⅱ组和试验Ⅲ组脾指数和胸腺指数有显著提高,而与空白对照组相比,试验Ⅱ组和试验Ⅲ组 脾指数和 胸腺指数 差异不显 著(P>0.05),说明酵母多糖能对抗由环磷酰胺所致小鼠胸腺、脾脏的萎缩,使其脏器指数明显增加,并且接近正常值。主要原因可能是酵母多糖中含有β-葡聚糖和甘露聚糖均促使有益菌群在肠道内大量繁殖,不断合成维生素、氨基酸等,可为免疫器官生长提高营养物,促进免疫器官的增长,同时也可促进免疫器官中免疫细胞的分化、增殖。
3.2 YPS对特异性免疫的影响酵母多糖的主要成分为β-葡聚糖和甘露聚糖,许多研究表明这两种物质均能提高动物机体的特异性免疫功能。郭波等[11]报道,β-葡聚糖免疫组Ig G1(P<0.01)、Ig G2a(P<0.05)抗体的产生显著高于单纯卵清蛋白(OVA)对照组。王忠等[12]报道在断奶仔猪日粮中添加β-1,3/1,6-葡聚糖14 d后,试验组外周血T、B淋巴细胞 转化率极 显著高于 对照组(P<0.01)。马志红等[13]报道,甘露聚糖能极显著提高免疫抑制小鼠抗体积数和迟发型变态反应(P<0.01)。朱延军等[14]报道酵母多糖能显著提高细胞亚群中T、B细胞数量。T、B淋巴细胞是参与机体特异性免疫应答的主要细胞,也是反映机体特异性免疫的重要标志[15]。本研究表明,与CY模型组相比,试验Ⅰ组小鼠淋巴细胞的增殖能力、迟发型变态反应和IFN-γ水平均显著提高(P<0.05),试验Ⅱ组 和试验Ⅲ 组差异极 显著(P<0.01)。IFN-γ主要通 过参与诱 导Th细胞向Thl细胞分化,诱导参与和增强机体的细胞免疫,具有重要的免疫调节作用。说明YPS可以逆转免疫抑制小鼠的细胞免疫功能,重建免疫功能低下机体正常的细胞免疫功能。与CY模型组相比,试验Ⅱ组和试验Ⅲ组小鼠的能血清溶血素抗体积数和溶血空斑数明显提高(P<0.05),血清中IL-4水平试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组均显著提高,其中试验Ⅰ、Ⅱ组差异显著,试验Ⅲ组差异极显著。IL-4可促进Th2型细胞发育,促进B细胞增殖与活化,参与特异性Ig G和Ig E的分泌与Ig类别转换,调节Thl和Th2细胞平衡,保持机体的免疫平衡。说明YPS促进B淋巴细胞增殖和抗体合成,能提高免疫抑制小鼠的体液免疫功能。
3.3 YPS对非特异性免疫的影响非特异性免疫是机体免疫系统的重要组成部分,与特异性免疫间有着极为密切的联系。单核-巨噬细胞系统对保持机体内环境稳定具有重要作用。NK细胞是机体重要的免疫细胞,与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关。单核-巨噬细胞系统对保持机体内环境稳定具有重要作用。NK细胞活力和单核细胞的吞噬能力是衡量机体非特异性免疫功能的重要标准。研究表面β-葡聚糖和甘露寡糖均能提高动物机体的非特异性免疫功能,安尚泽[16]报道给小鼠灌服β-葡聚糖,能显著提高小鼠血清中溶菌酶的活性、碳粒廓清指数和吞噬指数。马志红等[13]报道甘露寡糖能极显著提高免疫抑制小鼠的巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数。本研究表明,与CY模型组相比,试验Ⅰ组小鼠的吞噬细胞百分率、吞噬指数、NK细胞活性显著提高,试验Ⅱ组和试验Ⅲ组以上各检测指标差异极显著(P<0.01);试验Ⅰ组与空白对照组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组相比,各项检测指标差异均显著(P<0.05),空白对照组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组组间差异不显著(P>0.05)。表明YPS能明显提高免疫抑制小鼠的非特异性免疫免疫功能。这与文献[14,15,16]的报道基本一致。
4结论
4.1 YPS能提高免疫抑制小鼠的免疫器官指数、血清中IL-4及IFN- γ含量、淋巴细胞的增殖能力、迟发型变态、血清溶血素抗体体积和溶血空斑数,促进淋巴细胞的转化和抗体的生产,进而提高小鼠的特异性免疫功能。