细胞毒性试验范文（精选9篇）
细胞毒性试验 第1篇
1. 试验材料与试剂
小鼠成纤维细胞L-929(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库),胎牛血清(Hyclone公司),胰蛋白酶(美国Thermo公司),MTT溶液(Sigma公司),RPMI1640培养基(Gibco公司),琼脂(Sigma公司),中性红(美国Amresco公司),麻醉面罩(来自生产企业送样),阴性对照为高密度聚乙烯,阳性对照为5%二甲基亚砜(DMSO)。
2. 样品制备
在无菌条件下,按照3cm2/ml的浸提比例加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,放置于37˚C的CO2细胞培养箱中孵育24h。阳性对照用5%二甲基亚砜(DMSO),阴性对照材料用高密度聚乙烯,称取高密度聚乙烯4g,按0.2g/m L的浸提比例加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基20m L,置于37˚C培养箱孵育24 h,分别取阴性对照、阳性对照及供试品浸提液用于MTT比色试验[2];将麻醉面罩剪成直径为5mm的圆片,用于琼脂扩散试验。
3. 试验方法
3.1 四唑盐(MTT)比色法
取生长旺盛的小鼠成纤维细胞L929,用胰蛋白酶消化成细胞悬液后,调节细胞密度至1×104个细胞/m L,将配置好的细胞悬液接种于96孔培养板,分别设阴性对照组、阳性对照组和供试品组,每组各设6孔,每孔接种100µL细胞悬液,然后将96孔板放置于CO2培养箱(含体积分数5%二氧化碳气体)37˚C培养24h后,弃去原培养液。阴性对照组加入高密度聚乙烯(HDPE)浸提液,阳性对照组加入5%DMSO溶液。供试品组加入试验样品浸提液,每孔100μL,置于37˚C5%CO2培养箱中继续培养72h,更换培养液后的72h后,将96孔板放置于倒置显微镜下观察细胞形态,然后每孔加入质量浓度为5g/L的MTT溶液20µL,继续培养4h后,弃去孔内液体,每孔加入150µLDMSO,置振荡器上振荡10min,在酶标仪570nm和630nm波长下测定吸光度OD值,计算相对增殖率(relative growth rate,RGR,RGR=实验组OD值/阴性对照组OD值×100%)[3]。
3.2琼脂扩散法
将生长旺盛的细胞用胰蛋白酶消化分散细胞,用细胞培养液调节细胞浓度至2.5×105细胞/m L的细胞悬液。吸取10m L细胞悬液于培养皿中,在37˚C含5%CO2的细胞培养箱中孵育24h,吸出每一培养皿中的生长培养液,用Hankʼs缓冲液淋洗单层细胞后,加10m L新制备的琼脂培养基,待琼脂培养基在室温下凝固(约30min)后,加入10m L中性红活体染色液并在暗处避光保存15~20min,弃去多余的中性红溶液,每只实验材料做两只培养皿,每一个培养皿放置三个试样,每个样品尽量彼此远离,并远离培养皿壁。用倒置显微镜观察试验材料和对照的周围褪色区域,并按下列指标计算每一件样品的平均褪色指数和溶解指数[4~5],并按下式表示细胞反应:
3.3统计学处理
实验组数据以x±s表示,各试验组与阴性对照组组间比较采用t检验。
4.试验结果
4.1四唑盐(MTT)比色法
MTT比色法结果表明,麻醉面罩A和B的细胞毒性均为2级,麻醉面罩A的相对增值率(RGR)为59%,与阴性对照组有显著性差异(P<0.05);麻醉面罩B的相对增值率(RGR)为68%,与阴性对照组有显著性差异(P<0.05)。见表1。
4.2 琼脂扩散法
琼脂扩散法结果显示,阴性对照组细胞毒性为0级,阳性对照组细胞毒性为2级,两种麻醉面罩的细胞毒性均为1级,具有轻度细胞毒性反应(表2)。
*阴性对照组对比P<0.05
5. 讨论
麻醉面罩是医院手术室最常见的耗材之一,在临床使用过程中与人体皮肤直接接触。为了观察麻醉面罩对人体组织、细胞的影响,我们选取了体外细胞毒性试验,细胞毒性试验主要是通过倒置显微镜直接观察高分子材料对细胞的形态、增殖和抑制的影响,来定性或定量地评价实验材料对体外细胞的毒性作用。体外细胞毒性试验常用的主要有以下两种试验方法:浸提液试验和间接接触试验。
四唑盐(MTT)比色法是浸提液法的一种,依据GB/T16886.12-2005规定的浸提比例,对供试品材料进行浸提,然后将浸提液直接加入到细胞中,定量地观察供试品材料溶出物对细胞状态的影响。由于MTT比色法具有操作简便、敏感性高、重复性好等优点,在生物医用材料的生物学评价中应用十分广泛。其工作原理是当黄色水溶性的MTT加入细胞后,活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原成为不溶于水的蓝紫色结晶物甲瓒(Formazan),二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒(Formazan),用酶标仪可以测定溶液的吸光度,可间接反映活细胞数量及活力,在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比[6]。因此,通过MTT比色法,可以计算出供试品的细胞增殖率,定量的评估细胞毒性大小。
本实验中采用的琼脂扩散法是间接接触法的一种,该方法是将供试品直接放在琼脂层上面,通过琼脂层的扩散,观察对细胞形态的影响,该方法受溶出物在琼脂层上扩散程度的影响,当溶出物分子量小,易溶于水,其敏感性高,反之,当溶出物分子量大,难溶于水,其敏感性低。缺点是褪色区域指标及溶解指标都是通过实验人员的镜下观察得出,结果判断时易受实验人员主观因素的影响。
本实验中MTT比色法检测时两种麻醉面罩的细胞毒性均为2级,即轻度细胞毒性,用琼脂扩散法检测时细胞毒性均为1级,即轻度细胞毒性。以上结果说明这两种麻醉面罩均具有轻度的细胞毒性,可能与PVC的生产过程中添加塑化剂有关。而麻醉面罩是医院手术室使用频率很高的医疗耗材,因此建议生产企业改进生产工艺,选用质量稳定、优质的PVC材料,或选用新型环保材料聚丙烯(PP)和热塑性弹性体TPE,在国外医疗领域已经开始取代PVC。
参考文献
[1]ISO 10993-5:2009,Biological evaluation of medical devices-Part 5:Tests for in vitro cytotoxicity[S].
[2]国家药品监督管理局.GB/T16886.12-2005《医疗器械生物学评价第12部分:样品制备与参照样品》[S].北京:中国标准出版社,2005.
[3]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局、中国国家标准化管理委员会.GB/T14233.2-2005医用输液、输血、注射器具检验方法.第2部分:生物学试验方法.2005,8~9.
[4]贾文英,史弘道.细胞毒性试验评价医用装置生物相容性的研究概况.实用美容整形外科杂志,2001,12(5):253~255.
[5]YY/T 0127.9-2009口腔医疗器械生物学评价第2单元试验方法细胞毒性试验:琼脂扩散法及滤膜扩散法[S]
细胞毒性试验 第2篇
细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结-CCK-8 法
实验原理：Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
一、用途：
药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。
二、优点：
1.使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂； 2.CCK-8法能快速检测；
3.CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度； 4.CCK-8法的重复性优于MTT 法，MTT 实验生成的formazan不是水溶性的，需要使用DMSO 等有机溶剂溶解；
5.而本方法产生的formazan是水溶性的，不仅省去了溶解步骤，更因此而减少了该操作步骤带来的误差；
6.CCK-8法对细胞毒性小，可以多次测定选取最佳测定时间，与MTT 方法相比线性范围更宽，灵敏度更高；
7.CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。
三、所需设备及仪器：
1.10ul，100-200ul及多通道移液器 2.酶标仪（带有450nm滤光片）3.96孔培养板
4.二氧化碳培养箱
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四、方法及步骤：
实验一：细胞增殖分析
1、制备细胞悬液：细胞计数。
2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数（约1-2×104），每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做4-6个重复。3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。
4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议将枪头浸入培养液中加入且在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含10%CCK8的培养基（现用现配），以换液的形式加入。
5、培养0.5-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件（建议预实验先摸清楚时间点）。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。
6、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。
实验二：细胞毒性分析
1、制备细胞悬液：细胞计数
2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数（约≥5×104），每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做4-6个重复。3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。
4、加入不同浓度的毒性物质。5、37℃培养箱中培养：加入毒性物质的培养时间，要看毒性物质的性质和细胞的敏感性，一般要根据细胞周期来决定，起码要一代以上的时间（例如：6、12、24、48、60、72小时）。
6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议将枪头浸入培养液中加入且在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
7、培养0.5-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。
8、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。
五、实验注意事项：
·若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。
·如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
·当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔(100 μl 培养基)。检 一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物
测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔(100 μl 培养基)。
·酚红和血清对CCK8法的检测不会造成干扰，可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去。
· CCK8可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染，以免影响结果。
· CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年。
·当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔加培养基或者PBS，不作为测定孔用。
·在培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验时，还应考虑药物的吸收，可在加入药物的培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。
·金属对CCK-8显色有影响：当终浓度为1 mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10 mM的话，将会100%抑制。
·悬浮细胞由于染色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。
·加入CCK-8 时，如果细胞培养时间较长，培养基颜色或pH 值已变化，建议换用新鲜的培养基。
·用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定，且要擦拭干净样品板了。
六、经验总结及分享：
CCK8的说明书大家一定要认真阅读，里面很多细节的问题都有提到。而且说明书里提供的一些关于各种细胞的种板数都很有参考价值，因为那是反复验证过的最佳数值。但无论如何，做这个试验一定要摸条件。你就算再懒，这个懒不得，否则你都只是在做无用功。以下言论全部以细胞毒性试验为前提，如果你做的是促进细胞生长的药物的药效实验那就另当别论了。
摸条件包括
1、种板数；
2、种板后细胞的贴壁生长时间；
3、加药后的孵育时间；
4、cck8试剂加入量；
5、cck8试剂加入后细胞孵育时间。看起来很多，其实这就是一个实验。而且都是种的空白板，也就是不加药物，只加细胞和CCK8。
1、种板数：这个要查文献，看你所用细胞别人有无做过，把范围大致找出。记住还要参考说明书，这个很重要。然后稀释一系列浓度种板。首先你要观察多长时间细胞可贴壁完全，一般贴壁生长24小时。然后还有在你的实验时间内，不同细胞数下孔内生长情况。比如我拟定考察4天的时间，那么在4天内，细胞是刚好铺满还是堆积生长？因为每块板都会设置对照孔，也就是含有细胞的培养基+CCK8，这个数值是板上的最大数值，CCK8试验最佳OD 一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物
值在1.0附近，所以这个最大数值最好能控制在1.0左右。我的实验经验是不要让细胞长满，一旦长满了很难去判断是否堆积生长了，对药物能否顺利进入细胞有影响此为其一，其二生长不均匀易导致孔间OD值数据偏差大，而且OD值也很大。
2、贴壁生长的时间我一般就直接让它贴壁长24h了，这个时间细胞已经贴壁完全，而且这样设置时间对自己安排实验时间也方便。没人愿意大半夜爬起来做实验吧。
3、加药后的孵育时间，我的实验摸了3个时间，24h，48h，72h。然后根据数据的稳定性（RSD）、OD值的范围（1.0左右）这些来选择最好的时间。太长了就没有必要了，细胞呆在孔里几天不换液结果可想而知了。
4、CCK8试剂加入量，说明书中明确写出建议加入量为培养基体积的10%。这里有一个问题：假设我要孔内是200微升的体系，即细胞悬液+药液+CCK8=200微升呢，还是细胞悬液+药液=200微升，cck8不算在体系内呢。关于这一点文献报道不一致。本人最终采用的是后者。
5、cck8试剂加入后孵育时间，随着时间的增加，OD值就会增大。总之原则就是把OD值控制在1.0左右。这里我考察了0.5h、1.0h、2.0h。
再说一下关于种板设置问题。众所周知周围一圈孔因为边缘效应都是不用来做实验的。一般每组样品我会设置6个复孔，得到的OD值去掉最大值与最小值，其余取平均值。我用的是排枪，会省很多力气，但是也会增大组内误差。这个只有通过校正移液枪和选用最适枪头了。
做这个实验我想大家遇到的最大问题应该是数据不稳定，组内数据偏差大。讲了很多怎样摸条件，其实就一个原则，把OD值控制在1.0左右。数据不稳定也只能通过增大样品数，借助数据处理来弥补。还有实验操作一定要仔细小心，尽量平行操作。
补充
突然想起用酶标仪检测的时候还有一些细节问题。比如孔里不能有气泡，如果有气泡，就用吸耳球吹掉，气泡会很影响检测结果。样品板要擦拭干净，当然了，盖子一定要记得拿掉啊Big Smile补充说明：这几天有同学提出了一个问题，这个问题非常好也非常关键：将OD值控制在1.0这个说法是否有依据？
这里我还是想提醒大家一定要认真阅读试剂盒的说明书，试想一个试剂盒的上市并且作为技术手段得到认可需要经过多少试验反复验证。我购买的是同仁化学研究所的CCK8试剂盒，说明书的P7Q23：OD值在什么范围比较合适？答：一般情况下OD值在0.1-2.0都可以，在1.0附近比较好。
再说到自己的实验设计，酶标仪的原理其实和紫外分光光度计是一样的，所以UV上很多减小误差的注意事项在酶标仪上同样受用。这就能够理解为什么不能有气泡，为什么要擦拭干净样品板了。再者熟悉UV原理的同学会了解利用紫外检测有一个最佳检测范围，超过了这个范围，数值就会呈现出不稳定，无规律。（大家可以把自己的数据统计分析看看是不是数值控制在1.0附近更稳定。）而更有甚者就是超出了仪器的检测范围，仪器读数为—。一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物
细胞毒性试验 第3篇
1 材料和方法
1.1 实验材料和试剂
(1)细胞株:L-929细胞(ATCC)
(2)试剂:胎牛血清(天津康源生物技术有限公司)、MEM培养基(CORNING)、2×RPMI 1640(吉诺生物医药技术有限公司)、胰酶/EDTA(Gibco)、琼脂(鼎国)、中性红(Solarbio Life Sciences China)、注射用水(石家庄四药有限公司)。
3 g琼脂溶于100 m L蒸馏水制成3%琼脂溶液,高压蒸汽灭菌后冷却至48oC,将1份琼脂与1份预热至48oC的2×培养液混合,使培养基的最终浓度为1×培养基。
配制1%的中性红水溶液,用磁力搅拌器搅拌1 h后,滤纸过滤,高压消毒,2oC~8oC避光保存,使用前,用0.01 mol/L的PBS稀释100倍成为0.01%中性红染液。
(3)对照材料:阴性对照为氯化钠注射液(华润双鹤药业股份有限公司);阳性对照为苯酚(北京化学试剂公司)溶液,用蒸馏水配制20%苯酚溶液,过滤除菌。
(4)试验样品丝裂霉素C(sigma),加入注射用水后分别配制成2 mg/m L、1 mg/m L与0.5 mg/m L的溶液。
1.2 实验方法
(1)将配制好的2.5×105U/m L细胞悬液接种于直径90 mm培养皿内,每皿加入10mL,水平转动培养皿使细胞均匀分散,置CO2培养箱37℃培养24 h,形成近汇合单层细胞。
(2)弃去培养液,将配制好的琼脂培养基10 m L沿培养皿壁加入皿内,水平转动培养皿使琼脂培养基分布均匀并在室温下凝固。每个培养皿内加入10 m L中性红染液,置培养箱37oC避光保持15 min后弃去多余染液。
(3)分别吸取0.01 m L样品或对照材料溶液,加于直径为5 mm圆形滤纸片中,将滤纸片放置在琼脂表面。将培养皿置CO2培养箱继续培养24 h。
(4)置显微镜下观察试样周围及下方的细胞反应区域是否有溶解及褪色现象。参照表1进行结果判定。
2 实验结果
培养24 h后,于倒置显微镜下可明显看到阳性对照材料20%苯酚溶液试样下面及周边反应区域超出试样1.0 cm以上,细胞溶解率大于80%。阴性对照材料氯化钠注射液试样周围和试样下方未观察到反应区域。2 mg/m L丝裂霉素C组反应区域边缘距试样边缘大于5.0 mm小于10.0 mm,细胞溶解率大于60%小于80%,毒性分级为3级;1 mg/m L丝裂霉素C组反应区域边缘距试样边缘小于5.0 mm,细胞溶解度大于20%小于40%,毒性分级为3级;0.5 mg/m L丝裂霉素C组反应区域局限在试样下方范围,细胞溶解度小于20%,毒性分级为2级。实验结果见表2。
3 讨论
琼脂扩散法是一种半定量的细胞生物学方法,由于它具有快速、简便、价廉、灵敏的特点,便于推广应用,长期以来被广泛应用并被ISO和各国标准化组织定为生物材料细胞毒性评价的标准实验方法。尤其适用于牙科充填材料的细胞毒性评价,含有血清的琼脂覆盖层具有模仿牙本质层的仿生学特征[5]。而阳性材料则是指按既定的方法进行试验时可重现细胞毒性反应的材料,其目的是验证相应试验系统的反应。由于琼脂扩散法系统本身的局限性,阳性对照材料不能选择无法通过琼脂层扩散的可沥滤物或与琼脂反应的物质;琼脂扩散法细胞毒性结果的评定是通过光学显微镜观察细胞形态的变化及褪色范围的大小,受主观影响大,只能得到半定量化的实验结果,因此阳性材料宜选择细胞毒性反应级别大于2级的材料,以得到明确的结果。考虑到实际的试验过程,阳性材料还需具有溶解性好、价格低廉、性质稳定、易于获取等特点。
丝裂霉素C是从头状链霉菌培养液中分离提取的一种广谱抗肿瘤抗生素,对多种癌症有抗癌作用。丝裂霉素C可使细胞的DNA解聚,同时阻碍DNA的复制,从而抑制肿瘤细胞分裂,细胞毒性较强[6],相对分子量为334.327,溶解性好,固体状态性质稳定,较为容易获取,可通过琼脂层扩散且不与琼脂反应,具有作为琼脂扩散法细胞毒性评价的前提条件。
根据实验结果,三种浓度的丝裂霉素C均呈现细胞毒性,且具有一定的量效关系。其中2 mg/mL浓度组褪色区边缘距试样边缘大于5.0 mm小于10.0 mm,褪色区域明显,易于观察到;在直径为90 mm培养皿中,不同褪色区域相互之间不会接触或重叠;该组细胞溶解度大于60%小于80%,光学显微镜下可以观察到明显的阳性反应。1 mg/mL浓度的丝裂霉素C为中度毒性,但其反应区域面积小于2 mg/mL浓度组,考虑到试验操作的可行性,及丝裂霉素C本身的价格相对低廉,可认为1 mg/mL浓度的丝裂霉素C作为阳性对照品的效果不及2 mg/mL组;0.5 mg/m L浓度的丝裂霉素C仅具有轻度细胞毒性,不适于作为阳性材料。
综上所述,2 mg/mL的丝裂霉素C可作为琼脂扩散法细胞毒性评价试验的阳性材料。但需要注意的是,丝裂霉素C在水溶液状态下并不不稳定,试验时需要即用即配。
参考文献
[1]ISO.ISO 10993-5:2009 Biological evaluation of medical devices--Part 5:Tests for in vitro cytotoxicity[S].
[2]国家食品药品监督管理局.YY/T 0127.9-2009口腔医疗器械生物学评价第二单元:试验方法细胞毒性试验:琼脂扩散法及滤膜扩散法[S].
[3]曲秋莲,张英鸽,杨留中,等.纳米活性炭吸附丝裂霉素C腹腔化疗的实验研究[J].中华肿瘤杂志,2006,28(4):257-260.
[4]王坚,林茂,吴平,等.丝裂霉素C与表达Smac/DIABLO的肿瘤靶向腺相关病毒联用对抗恶性黑色素瘤的效果[J].西安交通大学学报(医学版),2012,33(4):460-465.
[5]吕晓迎,薛淼,徐淑卿.医用高分子材料的体外细胞毒性研究[J].口腔材料器械杂志,2000,9(4):205-207.
细胞毒性试验 第4篇
氯酸钾污染对蚕豆根尖细胞的遗传毒性效应
利用蚕豆根尖微核技术研究了氯酸钾细胞遗传毒性和污染效应.结果表明,不同浓度的氯酸钾均会对蚕豆根尖细胞分裂产生遗传毒性,在一定浓度处理范围内,随着氯酸钾处理浓度增大,其强氧化性能诱导蚕豆根尖细胞有丝分裂指数、微核率、染色体畸变率和污染指数的增加;但浓度过高时,反而会抑制蚕豆根尖细胞有丝分裂和微核的数量.氯酸钾具有明显的`环境污染效应,利用蚕豆根尖微核技术对其污染效应进行监测和评价既简便又比较可靠.
作 者：黎华寿 张修玉 LI Hua-shou ZHANG Xiu-yu 作者单位：华南农业大学热带亚热带生态研究所,广东,广州,510640刊 名：农业环境科学学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF AGRO-ENVIRONMENT SCIENCE年，卷(期)：200524(5)分类号：X835关键词：氯酸盐 蚕豆根尖微核技术 遗传毒理 污染生态
四种牙科陶瓷材料细胞毒性研究 第5篇
1 材料与方法
1.1 制备浸提液
选择四种陶瓷材料如表1,制作四种陶瓷材料的长方体试件各3枚(10 mm×5 mm×5 mm),将试件打磨圆钝后,无水乙醇超声清洗20 min,去离子水冲洗数遍,干燥后在121℃、33 MPa压力下灭菌。将四种陶瓷分别置于10 ml RPIM 1640培养液中(表面积与浸提液之比为0.75 cm2/ml),后在37℃5%CO2条件下连续浸提72 h,制成浸提液,放入4℃冰箱保存。
1.2 细胞株
小鼠成纤维细胞株L929(第四军医大学实验中心提供)。
1.3 主要试剂
RPIM 1640培养液(Invitrogen公司),MTT(上海普飞生物技术有限公司)实验前新鲜配制,二甲基亚砜。
1.4 细胞毒性试验
选择对数生长期的L929细胞,用胰酶消化成单细胞悬液,接种于96孔培养板,调整细胞浓度为4×104个/ml。观察细胞贴壁良好后,弃去原培养液,按照实验分组分别将当日要用的四种材料的材料浸提液按10%的浓度加入小牛血清,后加入各实验组(200μl/孔),阴性对照为RPIM 1640培养液(含10%血清)。分别培养24,48,72 h,终止培养后加入0.5%MTT(20μl/孔),继续培养4 h,加入DMSO 150μl置于室温下15~20 min,振荡培养板10 min使染色均匀,采用酶联检测仪在490 nm波长测定各孔光吸收值(A值),计算出各组的均值。以阴性对照的A值作为100%细胞增殖率,则各浓度组的细胞增殖百分率可依式1计算求出,按表2将浸提液各浓度组的P(%)转化为0~4级细胞毒性[7]。
P(%)=各浓度组A均值÷阴性对照组A均值×100%(式1)
1.5 统计学处理
所有计量资料以均数±标准差表示,使用SPSS 11.5软件对结果进行统计学分析。采用方差分析进行统计学分析,P<0.05表示有显著性差异。
2 结果
表3列出在细胞培养24、48和72 h后各实验组和阴性对照组的A均值、细胞增殖率P和细胞毒性级别。可见相同培养时间内各实验组的A值之间的差异不显著,各实验组与对照组的A值差异也不显著,无统计学意义(P>0.05);随培养时间的延长,各组的A值都逐渐增高,各实验组与阴性对照组的A均值之间无显著性差异(A>0.05)。
3 讨论
体外细胞毒性实验是用来评价材料对细胞生长状况影响的方法[8]。为了检测牙科材料的生物相容性,细胞毒性实验常常是材料初选时的必测项目[9]。本实验采用间接接触方法,通过细胞的增殖率来测定细胞的生长增殖情况,从而间接检测材料对细胞的毒性作用。
MTT比色法[10]是生活细胞线粒体上的琥珀酸脱氢酶与外源性的MTT发生氧化还原反应,MTT被还原成不溶于水的蓝紫色结晶物沉积于细胞内,形成数目的多寡与活细胞数目和功能状态呈正相关,而死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的紫色结晶物,然后酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定光吸收值,就可以间接反应活细胞的数量[11]。由于结果容易读取,因此可以快速分析和检测大量样品。
在正常培养基中,L929细胞通过有丝分裂呈指数增长,当有外来因素影响其生长时,则会出现细胞黏附力、细胞生物合成活性及细胞增殖率的下降,严重时可导致细胞死亡[12]。本实验用材料浸提液作为细胞培养基,通过材料浸提液对细胞增殖率的影响大小,来判定材料的细胞毒性程度。从表3可知,随培养时间的延长,各组的A值都逐渐增高,且各实验组的A值之间没有明显的差异,与阴性对照组之间无显著性差异,可见细胞在四种陶瓷材料浸提液中生长状态良好,和在正常培养基中生长的细胞状态无明显的差异,这四种材料对细胞的增殖没有影响,在细胞毒性评价标准中,0级表示无毒性,1级表示极轻微毒性,2级为轻度毒性,四种陶瓷材料中除长石质陶瓷材料的细胞毒性级为1级外,其他均为0级,表明材料无明显的细胞毒性,符合临床应用材料对生物相容性的要求。
4 结论
通过以上实验可以初步得出结论,四种陶瓷材料不抑制细胞的增殖,毒性级别都在安全范围内,具有良好的生物相容性,进一步补充验证了其应用于临床的可行性。
摘要：目的:初步评价牙科陶瓷材料的生物相容性。方法:根据ISO标准采用体外细胞毒性试验(MTT法)测试不同材料和浸提时间的浸提液对L929小鼠结缔组织成纤维细胞的影响,从而对全瓷材料的生物相容性进行初筛。结果:各组A490nm值均与阴性对照无显著性差异(P>0.05),材料毒性级别除培养48h后金属烤瓷粉浸提液组的细胞毒性为1级外,其他各浸提液组均为0级。结论:四种材料体外细胞毒性实验阴性,初步认为材料具有较好的生物相容性。
脱细胞异体真皮基质的遗传毒性研究 第6篇
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品与对照品
脱细胞异体真皮基质由北京桀亚莱福生物技术有限责任公司生产、提供,批号:20100705001,型号:I型,淡黄色,规格:5cm×6cm/片。供试液制备:方法(1),将样品按照6 cm2/ml的浸提比例,在水浴摇床18~20 rpm、37℃±1℃、72h±2 h条件下浸提;方法(2),先将样品复水30min即在生理盐水中浸泡30 min再按方法(1)浸提。浸提介质(即阴性对照品):氯化钠注射液(NS),石家庄四药有限公司生产。阳性对照品:叠氮钠(Na N3),MERCK-Schuchardt生产;9-氨基吖啶(9-AA),ACROS ORGANICS生产;2-氨基蒽(2-AA),Fluka生产;呋喃基糠酰胺(AF-2)、苯并芘(B[a]P),日本和光纯药工业株式会社生产;甲基甲烷磺酸酯(MMS)、环磷酰胺(CP)及突变选择剂三氟胸苷(trifluorothymidine,TFT),均购自SIGMA。
1.1.2 菌株与细胞
Ames试验选用鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型(his-)菌株(S.typhimurium)TA98、TA100、TA1535、TA1537和大肠杆菌色氨酸营养缺陷型(trp-)菌株(E.coli)WP2 uvr A,菌种引自日本(株)生物科学中心(JBS INC.),经本实验室分离筛选、特性鉴定合格后置-80℃超低温冰箱保存;试验前定量接种细菌冻融液,水浴摇床37℃、120 r/min培养10 h;培养结束,测定新鲜菌液光密度(OD),经计算确认活菌数浓度达1×109/ml以上的菌液用于试验。MLA采用小鼠淋巴瘤细胞L5178Y tk+/--3.7.2C,引自日本国立医药品食品卫生研究所;经过纯化及支原体检查,合格细胞置液氮保存,复苏后传代5次以内使用。
1.1.3 培养基与试剂
Ames试验:营养肉汤(CM0067 Nutrient broth No.2),英国OXOID生产;Agar Powder,购自日本;MLA:完全培养基由RPMI 1640培养基(GIBCO)、0.2%W/V Na HCO3(北京化学试剂公司)、1%青链霉素混合液(Key GEN)、丙酮酸钠(Amresco,终浓度200μg/ml)配制而成,根据用途不同分为含10%马血清(传代、处理培养)、20%马血清(96孔板培养)和不含马血清(稀释)的培养液;TFT,终浓度3μg/ml。
1.1.4 代谢活化剂
S9由苯巴比妥钠与β-萘黄酮联合诱导处理大鼠肝而获得,本实验室自制。Ames试验用S9混合液(S9 mix)中的S9含量为10%[7];MLA所用S9在处理液中的终浓度为2%,检测时与180 mg/ml的Glucose-6-Phosphate、25 mg/ml的NADP、0.15mol/L的KCl等辅助因子溶液,按2:1:1:1(ml)的比例配制成S9 mix。
1.2 方法
1.2.1 细菌回复突变试验[7]
采用标准平板掺入法,检测1.1.1方法(1)所得样品浸提液3个剂量组50、100、200μl/皿,同时设立NS溶媒(阴性)对照组及阳性对照组,每组平行3皿,在-S9和+S9条件下同时检测;平板置37℃培养48 h,计数回变菌落数,实验数据以x±s表示。若在-S9和/或+S9条件下,所设剂量范围内,一株以上试验菌的回变菌落数呈现剂量相关性增加,或一个以上浓度诱发的回变菌落数呈现可重复性并有统计学意义时,判为阳性;反之,则为阴性。
1.2.2 小鼠淋巴瘤细胞试验[8,9]
设立样品浸提液终浓度2.5%、5%、10%(V/V)3个浓度组,检测同时设立氯化钠注射液溶媒(阴性)对照组和阳性对照组(+S9:CP;-S9:MMS);每组平行2支处理管,+S9/3 h、-S9/3 h、-S9/24 h三种处理条件下的检测分别进行。+/-S9条件下的3 h处理,各组供试液-细胞处理液于37℃振荡培养箱中作用3 h;-S9条件下的24 h处理,各组供试液-细胞处理液于37℃、5%CO2孵箱中静置作用24 h;处理、清洗后的细胞于37℃、5%CO2孵箱中培养2 d进行表达,制备检测接种效PE0、PE2平板,于37℃、5%CO2孵箱分别培养9~10 d、7~8 d;检测基因突变频率的MF平板于表达结束后制备,37℃、5%CO2孵箱培养12~13 d。培养结束,计数含与不含接种效率细胞克隆的孔数并计算PE0和PE2、细胞相对存活率(RS%)、相对悬浮生长率(RSG)、相对总生长率(RTG);观察并分别计数含有突变细胞大集落(LC)、小集落(SC)及大、小集落(LC/SC)并存的孔数,计算基因突变频率(MF)以及小集落突变百分率(SC%)。采用“Poisson分布两样本均数的比较”方法,将处理组的突变率与溶媒对照组进行比较、分析。如果一个或多个浓度组出现浓度依赖性和/或可重复性的突变率增加,且任意浓度组MF值>溶媒(阴性)对照组MF值+126(总体评价因子,GEF)[10,11],则判定为阳性结果;反之,则为阴性。
2. 结果
2.1 细菌回复突变试验
如表1所示,+/-S9条件下,溶媒(阴性)对照组的回变菌落数平均值均在文献[12]报道的背景数据范围内,阳性对照组诱发的回变菌落数均达到阴性对照组的3倍以上,率的显示出明显的诱变能力;脱细胞异体真皮基质(浸提液)的3个剂量组诱发五株菌的回变菌落数对比氯化钠注射液溶媒(阴性)对照组,均无明显增加。
2.2 小鼠淋巴瘤细胞试验结果
如表2~5所示,阴性对照组的PE、MF均在本实验室的背景数据范围内(PE:60~140%;MF:50×10-6~200×10-6);阳性对照组诱发的MF达到阴性对照组的3倍以上(P<0.01),并以小集落突变体为主。脱细胞异体真皮基质(浸提液)各浓度组,在三种处理条件下得到的RTG大于15%,符合本试验方法中细胞毒性小于90%的要求。未经复水处理的样品浸提液在-S9/3 h条件下,5%、10%(V/V)浓度组诱发的MF分别为165、499,均超过阴性对照组MF80与126之和206,且增加具有明显浓度相关性,+S9/3 h条件下诱发的MF、SC%与阴性对照组比较无明显增加;经复水处理后的样品浸提液,-S9/3 h条件下10%(V/V)浓度组诱发的MF增加较明显,但未超过阴性对照组MF与126之和,-S9/24 h条件下诱发的MF、SC%无明显增加(P>0.05)。
*compared with negative control,P<0.01.
*compared with negative control,P<0.01.
3. 讨论
在脱细胞异体真皮基质《医疗器械注册产品标准》的“生物学试验”中未提供说明浸提方法的情况下,本文按照常规以文中方法(1)所得浸提液作为供试液检测,得到Ames试验结果阴性、MLA试验中+S9/3 h处理条件下阴性而-S9/3 h条件下阳性的结果。厂家进一步提供的产品资料表明,该产品在使用前需以生理盐水复水处理30min,使其外观与正常人体真皮一致;另外,产品中附加有冷冻保护剂0.5%甘露醇,目的是使组织结构不受影响。随后,本文又以文中方法(2)复水处理后所得浸提液进行了-S9/3 h、24 h处理条件下的MLA检测,得到全部阴性的结果。目前尚未见关于甘露醇MLA试验阳性结果的相关文献报道[13]。因此,产品在非代谢活化条件下表现出的阳性结果可能与其附加的冷冻保护剂有关,但其具体作用机理还需进一步阐明。本研究结果提示厂家应在该产品实际应用中,对其冷冻保护剂及使用前处理方法进行详细说明,以保证产品的安全使用。
摘要：目的:检测医疗器械注册产品脱细胞异体真皮基质的遗传毒性。材料与方法:以产品浸提液为供试液,采用细菌回复突变试验(Ames试验)和小鼠淋巴瘤细胞试验(MLA),在非代谢活化(-S9)和代谢活化(+S9)条件下检测。Ames试验采用平板掺入法,检测了50、100、200μl/皿3个剂量组诱发鼠伤寒沙门氏菌TA98、TA100、TA1535、TA1537及大肠杆菌WP2 uvrA的回变菌落数;MLA检测了终浓度2.5%、5%、10%(V/V)3个浓度组,在+S9/3 h、-S9/3 h、-S9/24 h三种处理条件下诱发的L5178Y细胞TK基因突变频率(MF)和小集落突变百分率(SC%)。结果:未经复水处理所得样品浸提液诱发五株菌的回变菌落数,对比氯化钠注射液溶媒(阴性)对照组均无明显增加;-S9/3 h处理条件下诱发的MF明显增加(P<0.01),且具有浓度相关性;复水处理后所得样品浸提液,在-S9/3 h、24 h条件下诱发的MF均无明显增加。结论:脱细胞异体真皮基质对测试菌株his-/trp-无明显诱变作用,未经复水处理时在-S9条件下对测试细胞tk-+/-及染色体具明显损伤作用,经复水处理后无明显损伤作用。产品在非代谢活化条件下表现出的阳性结果可能与其附加的冷冻保护剂有关。
细胞毒性试验 第7篇
一般而言, 对细菌具有强大杀灭或抑制作用的抗菌单体对正常细胞也有不可忽视的毒副作用。即便是临床上常用的无抗菌活性的树脂单体, 如Bis- GMA, HEMA等, 其细胞毒性或致敏性也早已被人们重视[6,7,8,9], 因此, 有必要对自行合成的季铵盐型抗菌单体进行生物安全性评价。本研究采用噻唑蓝比色法 (MTT法) 检测该抗菌单体的体外细胞毒性, 依此初步评价其生物相容性。
1 材料与方法
1.1 实验材料和仪器
1.1.1 季铵盐抗菌单体
甲基丙烯酰氧乙基-正十六烷基-二甲基氯化铵 (DMAE- CB) (图 1) 。
1.1.2 细胞株
小鼠成纤维细胞株L929由第四军医大学组织工程中心提供。实验用细胞为传代48 h生长旺盛的细胞, 用细胞培养液配置为1×104 个/ml的细胞悬液。
1.1.3 实验试剂与仪器
1640培养液、2.5 g/L胰蛋白酶 (Gibco, 美国) ;25 %胰酶消化液 (Difco, 美国) ; MTT:3 - (4, 5 - 二甲基噻唑基- 2) - 2, 5二苯基四氮唑溴盐、DMEM培养基 (Sigma, 美国) ;DMSO:二甲基亚砜 (西安化学试剂厂) ;Model- 550 酶联免疫酶标仪 (Bio- Rad, 美国) ;YJ2875DA 型超净工作台 (苏净集团安泰公司) ;微量加样器 (Nichikyo, 日本) ;ER2182A电子分析天平 (A&D, 日本) ;CO2孵箱 (Heraeus, 德国) ;IX- 70 倒置相差显微镜 (Olympus, 日本) ;96孔细胞培养板 (Coster, 美国) 。
1.2 实验方法
1.2.1 抗菌单体溶液的配制
以DMEM培养基为溶剂, 配制浓度分别为100、60、40、20、10、5、2、1、0.5 μg/ml 的DMAE- CB溶液。
1.2.2 MTT测定
MTT比色法参照国家标准GB/T 1688615-1997“医疗器械生物学评价第五部分:细胞毒性试验体外法”进行。具体方法如下:
将细胞悬液接种于96 孔培养板, 每孔100 μl, 置于37 ℃、 5 ml/L CO2、饱和湿度的空气培养箱内培养24 h以使细胞贴壁, 每个实验组6 孔。24 h后吸弃原培养液, 用PBS洗涤2 次, 各浓度实验组分别加入抗菌单体溶液50 μl、含100 ml/L小牛血清的DMEM培养基50 μl, 空白对照组加含100 ml/L小牛血清的DMEM培养基100 μl, 阳性对照组加入100 μl二甲基亚砜。然后放入上述环境中培养48 h后终止培养。每孔加入50 μl DMEM培养基和浓度为5 mg/ml的MTT 50 μl, 培养4 h后终止反应, PBS清洗2 遍, 每孔加入100 ml/L二甲基亚砜200 μl, 振荡5 min, 用Bio- Rad550 酶标仪在490 nm波长下测定每孔的A值[10]。
1.2.3 细胞毒性评价
细胞相对增殖率 (relative growth rate, RGR) :以空白对照组的A值为100%细胞存活率, 各浓度组RGR=实验组A值/空白对照组A值×100%。根据RGR换算细胞毒性级 (cytotoxical grade, CG) , 共分5 级, 即RGR ≥ 100%, 毒性为0 级;RGR为75%～99%, 毒性为1级;GR为50%～74%, 毒性为2 级;RGR为25%～49%, 毒性为3 级;RGR为1%～24%, 毒性为4级;RGR为0, 毒性为5 级。结果评价:实验结果为0或1 级反应, 为合格;实验结果为2 级反应, 应结合细胞形态分析综合评价;实验结果为3～5 级反应, 为不合格。同时以相对增殖率计算抗菌单体的半数致死浓度LC50 (Median lethal concentration) 。
1.2.4 细胞形态观察
在倒置相差显微镜下观察空白对照组及LC50值附近浓度的细胞增殖情况。
1.2.5 统计分析
应用SPSS 13.0统计软件, 进行单因素方差分析。
2 结 果
2.1 MTT比色结果
各实验组RGR数值及毒性分级结果见表 1及图 2。在所设立的浓度梯度内, 浓度为2 μg/ml时, 毒性反应分级即已为2;超过此浓度时分级在3～4级;浓度为1 μg/ml及0.5 μg/ml时, 分级分别为1和0 级。抗菌单体浓度在100、60、40、20、10、5、2 μg/ml时, 细胞的相对增殖率与空白对照组之间均存在显著性差异 (P<0.05) 。依据相对增殖率计算得到抗菌单体的LC50为3.02 μg/ml, 与空白对照组间存在显著性差异 (图 2) 。
2.2 细胞形态观察
空白对照组细胞形态良好, 细胞折光性强, 大部分细胞为长梭形和多角形, 并可见圆形分裂细胞, 表明细胞生长旺盛。而在抗菌单体溶液浓度为2 μg/ml时, 细胞数目明显减少, 细胞形态不规则;而在抗菌单体溶液浓度为5 μg/ml时, 细胞数目更加稀少, 多数细胞形态严重受损, 视野内可见细胞死亡后残存的碎片。
注:含相同小写字母的组间无显著性差异 (P>0.05)
A: 空白对照组细胞形态良好, 细胞折光性强, 大部分细胞为长梭形和多角形, 并可见圆形分裂细胞, 表明细胞生长旺盛; B: 抗菌单体溶液浓度为2 μg/ml时, 细胞数目明显减少, 细胞形态不规则; C: 在抗菌单体溶液浓度为5 μg/ml时, 细胞数目更加稀少, 多数细胞形态严重受损, 视野内可见细胞死亡后残存的碎片
A: In the control group, the mouse fibroblast L929 had good shape and strong light refraction, presented long fusiform or polygon. The presence of round dividing cells showed their vigorous growth; B: The number of mouse fibroblast L929 decreased significantly, and the cell shape became irregular when the concentration of the monomer was set at 2 μg/ml; C: The number of mouse fibroblast L929 was smaller, and the shapes of majority of the cells were seriously injured, when the concentration of the monomer was set at 5 μg/ml
3 讨 论
细胞毒性试验是医用生物学评价体系中重要的检测指标之一, 几乎是各种医疗器械和医用材料临床应用前的必测项目。目前国内外常用的细胞毒性检测方法很多, 如琼脂覆盖法、细胞相对增殖率法, 噻唑蓝比色法等。由于噻唑蓝比色法 (MTT法) 较灵敏, 结果客观且重复性好, 所以被人们广泛应用于细胞毒性评价[11]。
目前临床上常用的树脂单体, 如Bis- GMA, HEMA等, 作为单体形式存在时均表现出较大的细胞毒性。Ratanasathien等[12]研究了常用于牙本质粘接系统的3 种单体对小鼠成纤维细胞Balb/c 3T3细胞系的细胞毒性, 结果表明, 单体双酚A双甲基丙烯酸缩水甘油酯 (Bis- GMA) 的细胞毒性最大, 对小鼠成纤维细胞的半数致死浓度LC50=4.79 μg/ml, 其次是氨基甲酸酯双甲基丙烯酸酯 (UDMA) 的细胞毒性, LC50=8.68 μg/ml, 双甲基丙烯酸二缩三乙二醇酯 (TEGDMA) 的细胞毒性第三, LC50=35.7 μg/ml。甲基丙烯酸β- 羟乙酯 (HEMA) 的细胞毒性在所研究的4种单体中最小, LC50=468 μg/ml。Hanks等[13]报道了导致小鼠成纤维细胞Balb/c 3T3细胞系DNA合成能力降低50%时的单体浓度:Bis- GMA为6.66 μg/ml, UDMA为 5.98 μg/ml, TEGDMA为18.9 μg/ml。上述实验证明牙科常用单体的细胞毒性的大小顺序是:Bis- GMA﹥UDMA﹥TEGDMA﹥HEMA。但是, 上述结果均是体外实验, 并不能代表树脂基修复材料存在于口腔中的实际情况, 毕竟树脂材料固化后析出的单体量极其有限。最近有研究模拟口腔环境, 利用气相色谱/质谱技术定量测定了2 种复合树脂Tetric EvoCeram 和 Filtek Z250浸泡于唾液24 h后单体的析出量, 结果表明, 2 种材料中, HEMA的析出量均没有统计学意义, 而TEGDMA仅在Filtek Z250材料中有微量的溶出 (1.84 μg/cm-2) [14]。
本实验中, 依据相对增殖率计算得到抗菌单体DMAE- CB的LC50值为3.02 μg/ml, 与Bis- GMA的细胞毒性相似。理论上讲, Bis- GMA作为树脂基材料的基质, 在牙科修复材料的成分构成中, 用量远大于作为功能单体的抗菌单体的添加量。因此, 将这种抗菌单体加入到牙科树脂类材料当中并不会增大树脂材料的细胞毒性。此外, 国际上目前唯一已被应用于临床的抗菌单体MDPB在体外对人牙髓细胞的LC50值介于20～40 μg/ml之间, 与TEGDMA的细胞毒性类似。本课题组的前期研究证实DMAE- CB对7 种口腔细菌的MBC值介于1.2～9.6 μg/ml之间, 小于MDPB (MDPB对数种口腔常见致病菌的MBC值介于31.3～62.5 μg/ml之间[15]) 。
吡唑衍生物的合成与细胞毒性研究 第8篇
关键词：吡唑,合成,细胞毒性
吡唑类化合物作为含氮杂环化合物在医药和农药领域有着广泛的应用[1]。 在医药上具有抗菌[2]、抗癌[3]、抗组胺、抗炎症、抗病毒等活性,在农药上具有杀虫、杀菌、除草、调节植物生长的作用[4]。吡唑是许多非甾体抗炎药物的主要药效团,如抗炎药物塞来昔布[5]。2007年,Graneto等人报道了一系列吡唑化合物,对P38激酶体现出较好的抑制活性[6]。吡唑类化合物可由水合肼与1,3-二羰基化合物通过缩合反应方便地制备。1,3-二羰基化合物可由取代芳香苯乙酮与羧酸酯缩合得到,或以芳香苯乙酸为原料经过Vilsmeyer-Haack反应制得。
本文通过Vilsmeyer-Haack反应及缩合反应制得一系列吡唑衍生物,并用 1H NMR MS等手段对所得化合物进行结构表征,进一步测试其对Bel-7402, KB, HL-60 和BGC-823 四类细胞株的细胞毒性。目标化合物的合成路线如Figure 1 所示。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
X-4 型数字显示熔点测定仪(熔点未校正);Bruker AVIII 600 NMR型核磁共振仪(以DMSO-d6为溶剂, TMS为内标);Agilent 1200/6310 lon-trap液相色谱-质谱联用仪。
所用试剂均为市售分析纯或化学纯。
1.2 吡唑化合物4a~4g的合成[7]
将11.3 mL 干燥DMF加入到50 mL三口烧瓶中,在不断搅拌下将2.8 mL的三氯氧磷慢慢滴加上述体系(控制温度5~10 ℃)。室温搅拌1 h,然后将芳香乙酸1(10 mmol)加入上述反应体系,在90~95 ℃反应4 h,冷却到室温,搅拌过夜。 反应液倾入冰水中,待三氯氧磷分解完全后,将由30 mmol NaClO4·H2O 配成饱和溶液滴加到上述体系,大量黄色固体析出,抽滤,真空烘干。 将烘干的固体加入到50 mL单口瓶中,加入20 mmol氢氧化钠配成的饱和溶液,90 ℃反应15 min,冷却,稀盐酸调节pH值到5,量取1.4 mL 80%的水合肼,室温搅拌过夜,析出大量固体,抽滤,蒸馏水洗涤,真空烘干得化合物4。
4-苯基吡唑(4a):白色固体,45%,200 ℃升华;δ: 12.95(brs, 1H, NH), 8.05(brs, 2H, PzH), 7.60(d, J=7.2 Hz, 2H, Ar-H2,6), 7.35(t, J=7.2 Hz, 2H, Ar-H3,5), 7.18(t, J=7.2 Hz, 1H, Ar-H4); MS: 145.0[M+H]+。
4-(4-氟苯基)吡唑 (4b):白色固体,45%,130 ℃升华;δ: 12.92 (brs, 1H, NH), 8.02 (brs, 2H, PzH), 7.62 (dd, J1=9.0 Hz, J2=5.4Hz, 2H, Ar-H2,6), 7.16(t, J=9.0 Hz, 2H, Ar-H3,5); MS: 163.0[M+H]+。
4-(4-羟基苯基)吡唑(4c):白色固体,52%,mp 222~225 ℃;δ: 12.78(brs, 1H, NH), 9.33(brs, 1H, OH), 7.88(brs, 2H, PzH), 7.39(d, J=8.4 Hz, 2H, Ar-H3,5), 6.75(d, J=8.4 Hz, 2H, Ar-H2,6); MS: 161.0[M+H]+。
4-(4-硝基苯基)吡唑(4d):黄色固体,55%,190 ℃升华;δ: 13.24(brs, 1H, NH), 8.45(brs, 1H, PzH), 8.21(d, J=9.0 Hz, 2H, Ar-H3,5), 8.13 (brs, 1H, PzH), 7.90(d, J=9.0 Hz, 2H, Ar-H2,6); MS: 190.1[M+H]+。
4-吡啶基吡唑(4e):黄色固体,32%,mp 195~197 ℃;δ: 13.19(brs, 1H, NH), 8.49(dd, J1=4.8 Hz, J2=1.2 Hz, 2H, Ar-H), 8.43(brs, 1H), 8.12 (brs, 1H), 7.61(dd, J1=4.8 Hz, J2=1.2 Hz, 2H, Ar-H); MS: 145.1[M+H]+。
1,4-双(4-吡唑基)苯(4f):白色固体,38%,mp>250 ℃;δ: 12.93(brs, 2H, NH), 8.06(brs, 4H, PzH),7.59(s, 4H, Ar-H); MS: 211.1[M+H]+。
1,3-双(4-吡唑基)苯(4g):白色固体,29%,mp 238~239 ℃;δ: 12.95(brs, 1H, NH), 8.25(s, 2H, PzH), 8.00(brs, 2H, PzH), 7.86(s, 1H, Ar-H), 7.42(dd, J1=7.8 Hz, J2=1.8 Hz, 2H, Ar-H), 7.33(t, J=7.8 Hz, 1H, Ar-H); MS: 211.1[M+H]+。
1.3 细胞毒性实验
将化合物溶解在DMSO溶液中,在培养基中稀释到所需浓度。将细胞接种于 96孔板,37 ℃,5% CO2细胞培养箱中孵育。化合物加入到每个孔中最终浓度在10-8~10-5 mol/L,以顺铂为阳性对照。培养基在 37 ℃含有 5% CO2的保温箱中孵育48 h。培养结束后,将MTT染色剂(Sigma)溶液(20 μL, 5 mg/μL)加入到每一个孔中。培养4 h后, 用 DMSO 溶解细胞中的蓝色结晶通过酶标仪在570 nm 波长处测量每个孔的光密度(OD)。
2 结果与讨论
2.1 目标化合物的合成
在二醛化合物3a~3g的合成中,水解反应时间太长或反应温度太高会产成黑色油状固体,从而降低反应的产率,因此须严格控制反应时间和温度,实验结果表明最佳反应时间为15 min,最佳反应温度为90 ℃。二醛进一步与水合肼通过缩合反应可顺利得到目标产物。其中,化合物4e的制备方法比较特殊,由于4-吡啶乙酸在三氯氧磷和DMF中经过Vilsmeyer-Haack反应后,加入高氯酸钠置换阴离子后无法析出固体,因此采用了直接加入氢氧化钠进行水解,水解完毕后加入水合肼进行缩合的方法。进而通过二氯甲烷萃取、干燥、过滤、浓缩得粗产品,并通过柱色谱提纯得到纯净产物。
2.2 体外抗肿瘤活性研究
以顺铂为阳性对照,采用 MTT 法测定了化合物4a~4f 对Bel-7402, KB, HL-60和BGC-723 细胞的体外抗肿瘤活性, 结果如表 1 所示。
测量数据表明单吡唑化合物4a~4e细胞毒性较低,而双吡唑化合物相对较高,其中对位双吡唑化合物4f在系列化合物中表现出最好的活性,其对Bel-7402和BGC-823两类癌细胞株的细胞毒性几乎与顺铂相当。
3 结 论
以芳香乙酸为原料,经过Vilsmeyer-Haack反应及缩合反应合成了七个吡唑类化合物,采用多种表征手段对目标产物进行了结构确证,并且测量了它们对Bel-7402, KB, HL-60和BGC-823四类细胞株的细胞毒性,实验结果表明,化合物4f对Bel-7402和BGC-823两类癌细胞株具有较好的细胞毒活性。
参考文献
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细胞毒性试验 第9篇
1 细胞毒性药物在静脉配制中心配置要求
1.1 配置的环境要求
所有细胞毒性药物配制要求在百级的生物安全柜中进行, 严格遵守无菌技术操作原则[2]。
1.2 配置人员的防护措施
接触细胞毒性药物的人员要定期进行体检和合理排班, 不安排怀孕和哺乳的药师从事配置工作, 同时, 加强教育, 岗前规范化培训, 健全防护管理系统, 对药师的职业防护情况进行有效监测和干预。
2 细胞毒性药物集中配制必须注意的问题
2.1 配制前的防护
(1) 配置环境要求温度18℃~26℃;湿度40%~60%, 压差-5~-10Pa, 操作前先检查是否在范围内。生物安全柜保证运转≥30min[3]。 (2) 要求操作人员配置前戴双层手套, 按六步洗手法洗手后戴一层聚乙烯薄膜手套, 再戴无粉乳胶手套, 通常每60分钟或手套破损、药物污染时需要更换。摘手套后还要洗手。戴好一次性帽子、N95口罩和防护镜, 按要求进入一更、二更2次更衣, 穿好无絮状材料制成的连体防护衣, 尽量减少皮肤的裸露, 进入药物配置区域。 (3) 生物安全柜的准备配置前, 按常规用75%乙醇清洁安全生物柜, 在柜台表面铺上塑料布面的无菌治疗巾, 配置前备好所需物品, 防止操作中双手频繁出入安全柜, 减少人员走动, 保证柜内气流稳定, 减少气溶胶逸出。在生物安全柜旁边放置触手可及的防护物品, 如手套、镊子、一次性治疗巾等, 防止刺破容器。另备化疗药溢出包。操作时生物安全柜玻璃窗的高度应在警戒线18cm处。
2.2 配制中的防护
(1) 再次核对已排好的细胞毒性药物标签内容与篮子内的药品是否相符。安瓿在打开前轻轻敲击其颈部和顶部, 以保证没有药液或粉末留于该处, 用小砂轮轻锯安瓿颈部, 75%乙醇消毒后用无菌纱布绕着朝安全生物柜侧面轻轻掰开, 防止安瓿折断时药物在空气中传播和雾化。从安瓿抽取药液时, 倾斜安瓿, 将针头斜面接近开口, 抽取安瓿药液后立即使针头朝上以防止药液流出, 若此时要排除多余的空气或调整抽取药液的量, 必须将活塞向后回抽后才能进行。药液排于安瓿中, 排气时戴上针帽后用无菌纱布包裹再排气。 (2) 西林瓶应与针头呈45度角, 一旦针头穿过瓶塞后立即使针筒呈垂直状态, 用无菌纱布裹住针头和瓶塞部位, 避免药液外溢或外溅。若针筒内还有空气, 分次注入瓶中, 以防瓶内压力过大。瓶装量>5ml时先注入少量空气, 避免抽吸困难, 需稀释的药物应完全溶解后再抽净, 抽取的药液不能超过针筒长度的3/4, 防止针栓从针筒中意外脱落。使用的针筒和针尖应避免挤压、敲打和滑落。
2.3 配置后的防护
操作完毕后待药物气雾吸除干净, 才能清洁安全柜。配置后, 化疗药品用密封袋密封后, 从传递窗口传送、出舱, 由专人送往科室。在完成全部药物的配置后, 需用75%乙醇擦拭操作柜内部和操作台表面。配置后所产生的废弃物, 由专用袋密封, 并贴有“化疗药物废弃物”的标识, 放入专用垃圾袋中, 密封, 由专人按化疗药物的相关规定进行处理。
3 药物溢出或暴露后的处理
3.1 一般性防护措施
操作过程中如有小量药液溢出则用镊子夹取中纱布处理, 如皮肤和眼接触到化疗药物或被针头刺破, 立即脱去被污染的手套, 挤出伤口的血液, 用清水或大量0.9%氯化钠注射液冲洗, 然后用肥皂清洁被污染处。当工作间发生泄漏或被污染时, 如是小量污染 (体积<5ml, 质量<5mg) , 操作者应迅速穿好防护衣, 戴无粉的乳胶手套, 戴口罩、眼罩或防护镜, 如可能产生气雾则戴上面罩。液体用吸收性的织物布块吸干并擦去, 固体则用湿的吸收性织物布块擦拭。擦拭毒物从边界开始, 逐渐向中心靠拢;如有玻璃碎片, 用小铲子将其拾起并放入防刺的容器中, 擦净后用清洁剂反复清洗3遍, 再用清水清洗;需反复使用的物品 (器械) 用清洁剂清洗2遍, 再用清水清洗。清洗范围应从小到大。
3.2 大量溢出物的处理
如是大量溢出 (体积>5ml, 质量>5mg) 时, 隔离溢出的地点, 并用明确的标识提醒;必须评估溢出环境的每个人, 如是人员被污染, 立即脱去衣物, 用肥皂和清水清洗皮肤。如果溢出物污染了生物安全柜的高效过滤器, 用塑料袋封住整个安全柜, 直至更换。
4 药物配制过程中产生的废弃物的处理
静脉细胞毒性药物配置时的废弃物与其他医疗废弃物区别开。操作过程中多余的药液及时弃于密闭、有标识的容器中;配制过程中所有污染的材料, 如注射器、针头、吸水纱布、吸水垫、手套等放置于聚氯乙烯密封袋中, 收集在带盖防漏的专用容器里, 容器外有警示标识, 操作完毕后有专人统一焚烧处理。
5 体会
我院建立PIVAS及实施系统管理3年来, 建立健全了各项规章制度, 提高了细胞毒性药物配置人员职业暴露安全防范意识, 无1人发生与细胞毒性药物有关的职业伤害, 未发生与此有关的环境污染。总之, 建立静脉配置中心, 制定安全操作规程规范操作, 加强对操作人员的培训和执行严格的制度管理[4], 可以最大程度降低配置人员的职业伤害, 同时保证患者的安全用药, 使医院管理迈上一个新台阶。
关键词：静脉配置中心,细胞毒性药物,安全防护
参考文献
[1] 张洁, 蒋惠留.细胞毒药物集中配置中必须注意的一些问题[J].中国药房, 2007, 18 (10) :794-796.
[2] 范静, 王国权, 翟红岩, 等.静脉药物配置中心化疗药物集中配制的管理[J].护理学杂志, 2009, 24 (3) :19-20.
[3] 李丽婷.静脉配置中心化疗药物配置的防护[J].临床医药实践, 2011, 20 (6) :461-46.