可培养细菌范文

可培养细菌范文（精选9篇）

可培养细菌 第1篇

关键词：细菌多样性,16SrDNA序列,塔里木河,胡杨林

An enormous amount of effort is being made worldwide by microbial ecologists to isolate and identify microorganisms in environmental soil samples. Analyzing isolates cultivated on plates has traditionally compared bacterial communities[1]. It is estimated that traditional methods of bacterial cultivation recover less than 1% of the bacterial species present, 99% of the bacteria in soil that are uncultured. In soil, 80 to 99% of the microorganisms remain unidentified[2].

Populus euphratica is the only tree that forms forests along all the Tarim River, which forest is originally distributes in the middle of Mediterranean Sea coast and Asian drought and half arid areas, where precipitation are scarce in growing season[3,4]. It grows under unfavorable conditions such as saline and alkaline soils. This forest is the oldest, largest and most complete conservation, the most representative of the original priority Populus euphratica forest[5]. It is comparatively maintained its original ecosystem and microbiological diversity. Bacterial community in such kind of typical hyper-arid, saline and alkaline extremely conditions generally have stronger resistance to a variety challenges conditions and have a unique gene type for special physiological mechanism and special metabolites[6]. We would found to be some special microorganisms in this virgin area. Up to date, there was not any report about the bacterial diversity of the Populus euphratica Forest of Tarim River Vally.

Molecular techniques over the last few decades have revealed an enormous reservoir of unexplored microbes[7,8]. The use of the polymerase chain reaction (PCR) technique to amplify a gene common to all organisms now allows the identification of these previously unknown organisms[9,10,11]. The gene commonly amplified for this purpose codes for the 16S and 23S rRNA sequences of the small subunit (SSU) and the large subunit (LSU) of the ribosome . It has been found that the misidentification of bacteria is far less common with the gene coding for SSU rRNA (SSU rDNA) sequence[12] than with more traditional methods of microbial identification such as morphology, Gram stain, enzyme activities, and the utilization of several substrates as sole carbon and energy sources.

1 Materials and methods

1.1 Materials

1.1.1 Study site and Sampling

The study areas are located in Kharqugha village of the Lopnor County, at the southern side of the lower reaches of the Tarim River. Samples were collected from three different sites in a small area (200m2 85°04′E, 41°00′N, abandoned üg!?n Darya river) of Natrural Populus Forest of Tarim River Valley, Southern Xinjiang[Fig.1], the samples include waste water, soil and secretion liquid of the Populus euphractica stand, respectively.

1.1.2 Main Reagents and Instruments

The universal bacterially based primers B27F and B1492R, Taq DNA polymerase, dNTP and UNIQ-10 Column PCR gel extraction kit (obtained from Shanghai Shenggong and TAKARA Company). Superclean bench, Incubater, PCR thermocycler.

1.2 Methods

1.2.1 Isolation and purification of Bacterial

Cultivable bacterial strains were isolated on Luria-Bertani (LB) plates containing 1% peptone; 1% NaCl; 0.5% yeast extract; pH 7.5-8.0. Appropriate dilutions of the saline suspensions were spread in LB plates, the single colonies were selected and further streaked on the same depicted media.

1.2.2 DNA extraction from bacteria

DNA was prepared from all different isolates by the sodium dodecyl sulfate proteinase K-cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) method[13]. All DNA preparations were treated with RNase A, and DNA concentrations were estimated by visual examination of ethidium bromide-stained agarose gels as well as by spectrophotometrical examination.

1.2.3 16S rRNA gene sequence and analysis

Bacterial small-subunit rRNA genes were PCR amplified using the universal bacterially based primers B27F was (5’-3’) AGAGTTTGATCCTGGCTCAG and B1492R was (5’-3’) ACGGCTACCTTGTTACGACTT, as previously described[14]. The 50μl PCR reaction mixture contained 100ng of purified DNA extract, 10×Tag reaction Buffer, 10 pmol of each primer, 2.5mmol/L dNTP, and 2.5U of Taq DNA polymerase (TIANGEN Biochemical Company, Beijing). After initial denaturation at 94℃ for 5min, each thermal cycling was as follows: denaturation at 94℃ for 30s, annealing at 58℃ for 30 s, and extension at 72℃ for 1min 30s. At the end of 30 cycles, the final extension step was at 72℃ 10min. PCR production analysised by agarose gel electrophoresis.

1.2.4 Blast Search and Phylogenetic Analysis

The amplified 16S rDNA sequences of the isolated strains were compared with those available in the public databases. Identification to the species level was determined as a 16S rDNA sequence similarity of >99% with that of the prototype strain sequence in the Gen Bank. Sequence alignment and comparison was performed using the multiple sequence alignment program CLUSTAL X (v 1.83)[15] with default parameters and the data converted to PHYLIP format. Minor modifications in the alignment were made using the BIOEDIT sequence editor. Rooted and unrooted phylogenetic tree was constructed using neighbor-joining (NJ) method and the TREEVIEW (Win32) program for display of phylogenetic relationship[16]. Bootstrap analysis was performed as described by (Falsenstein, et al. 1985) on 1 000 random samples taken from the multiple alignment analysis was done using the Clustal X programs.

1.2.5 Activity assay of extracellular enzyme

To detect extracellular cellulase, amylase and pectinase from the isolates the agar diffusion method was used. For amylase, cellulase and pectinase screening, the mineral medium was used with some modifications (vitamin solution was replaced with 0.5% yeast extract)[17].The mineral medium used for the screening study contained 5g/l of yeast extract, 7g/l of K2HPO4, 2g/l KH2PO4, 0.1g/l of MgCl2·6 H2O, 1g/l of NH4Cl, 5g/l of NaCl and (pH 7.0-7.5). The medium was supplemented with 1.5% agar and with 5g/l soluble starch, pectin, and carboxymethyl cellulose for amylase, pectinase, and cellulase screening, respectively. All the plates were incubated at 30-37℃ for 1-7days. Based on zone of clearing on starch, pectin, cellulose, containing plates, pure colonies were selected and used for characterization studies. All the isolates were stored as glycerol stock at -70℃ freezer in Lab of microbiologic resources, Xinjiang University.

2 Results

2.1 Isolation of cultivable bacteria

Twenty two pure bacterial strains were isolated from different samples. Bacteria most closely related to Bacillus sp. were found in all three different samples. The waste water samples were containing members of the genus Pseudomonas, Acinetobacter, Planococcus and Bacillus, while the samples from secretion liquid of the Populus euphractica stand were containing the members of the genus Bacillus and Ornithinibacillus. The soil samples containing the members of the genus Bacillus and the only one members of the genus Agrococcus.The bacteria community of the small area in the Natrural Populus euphractica Forest, included Bacillus sp. (14 isolates), Acinetobacter sp. (four isolates), Planococcus sp. (one isolate), Pseudomonas sp. (one isolate), Agrococcus sp. (one isolate), and Ornithinibacillus sp. (one isolate).

The samples from the waste water was composed of 6 isolates which represented 5 species, the samples from secretion liquid of the populus euphractica stand was composed of 5 isolates, which represented 5 different species, and the soil samples was composed of 11 isolates which represented 11 different species (Table 1).

2.2 Phylogenetic Analysis of 16S rRNA Data

A total of 22 strains were used for genomic DNA extraction followed by PCR amplification using 16S rRNA universal primers. All the amplified PCR products were gel-purified and were sequenced to analyze their 16S rRNA genes.DNA sequencing and phylogenetic analysis revealed that all of the 16S rDNA sequences from 22 isolates from Natrural Populus Forest were between from 95.9% to 99.9% identical to the sequences by GenBank BLAST searches.

A maximum-likelihood phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of 22 bacterial isolates from Natrural Populus Forest Area are shown in Fig. 2. The 16S rDNA sequences have brought about certain ideas regarding the microbial populations and diversity in this small area. The branching order of this tree showed four distinct clusters, in which one clade contained species of Bacillus, Ornithinibacillus and Planococcus, second group was formed from species of Pseudomonas, another group was formed from Acinetobacter, final grouping was composed of species of Agrococcus.

2.3 Accession Number

The sequences were submitted to GenBank and accession numbers were assigned: FJ373023(W1-1), FJ373024(W1-2), FJ373025(W1-3), FJ373026(W2-1), FJ373027(W2-2), FJ373028(W2-3), FJ373029(S3-2), FJ373030(S3-3), FJ373031(S3-4), FJ373032(S3-6), FJ373033(S4-1), FJ373034(S4-2), FJ373035(S5-1), FJ373036(S6-1), FJ373037(S7-1), FJ373038(S7-2), FJ373039(S7-3), FJ373040(ZM1), EF672042(M3), EF672043(M4), EF672044 (M5), EF672045(M6).

Bootstrap values generated from 1 000 replicates are shown at the nodes. 16SrDNA sequence of Thermoproteus neutrophilus is used to assign an out-group species.

2.4 Activity assay of extracellular enzyme

Among the isolates from this small area, some of these bacteria were showed cellulase, and amylase activities, but pectinase activities have not detected in all the isolates (Table 1). The cellulase and amylase producing isolates among the bacteria all belong to the genus Bacillus. All the isolates from waste water have not detected any enzyme activities. Among the isolates from soil samples, Bacillus sp. (S3-4, S4-1 and S5-1) had cellulase activity, and Bacillus sp. (S3-3, S3-4, S4-1, S4-2 and S5-1) had amylase activity. Among the isolates from secretion liquid of the Populus euphractica stand, Bacillus sp. (S7-1) had amylase activity and Bacillus sp. (S7-3) had cellulase activity.

3 Discussion

In our laboratory 22 different bacterial strains were isolated from the small area of Tarim Populus euphractica Forest. Based on 16S rDNA similarity, 22 different isolates belonging to six different genera have been identified. Our microbiological observation result with some of the isolates shows a predominance of spore-forming bacterial strains, which have been suggested adaptation and survival enhancement for extreme environment[18]. Among the isolates, 68% were found to be Bacillus, and this has been true for most of the natural soils studied before[14]. There is a high diversity of Bacillus species in this small area.Some of the isolates have strong enzymatic activities (Table 2); utilize different substrates capable of producing metabolic properties. Among the isolates, S3-4, S4-2 and S5-1 have cellulase activity, also have amylase activities. Some isolates capable grows on the high pH (alkaline condition) and high saline concentration conditions. These characteristics of the isolates were may concerned with the special environmental conditions of the small area of natural Populus euphratica forest.

Size of halos formed around bacterial colonies on specific media .Symbols: -, implies no halo zone indicates no enzyme activity; + implies have halo zone indicates have enzyme activity. Symbols:-, +, ++ and +++ indicate no, presence, moderate and strong activity, respectively.

The interesting result is that in this furthest ocean area, we found closely related bacteria of ornithinibacillus and oceanobacillus were that discovered in ocean or seaside area in previous study[19,20]. So far, it is difficult to find novel species belong to Bacillus genus, however, in this paper we found few potential novel species belong to Bacillus genus in this virgin area.

可培养细菌 第2篇

研究了桂林桃花江水体可培养中温细菌的种群及分布.16S rDNA序列分析表明,分离获得的51株细菌主要属于γ-Proteobacteria(45.10%)、β-Proteobacteria(27.45%)和Firmicutes(23.53%)三大类群,其中大部分细菌与假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)和芽孢杆菌属(Bacillus)系统发育关系密切.共分为24个不同的分类单元,Shannon多样性指数为3.14.细菌数量在取样点26、32、33、38、42和43号较多(约105 cfu/mL),在取样点9、14、20、31和35号较少(约103 cfu/mL).各取样点均有假单胞菌属(Pseudomonas)分布.排污口附近分布有芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)和水生螺菌属(Aquaspirillum).深层洁净的.水体中分布有小球菌属(Micrococcus)和色杆菌属(Chromobacterium).

作 者：姚晓丽 梁运祥 YAO Xiao-li LIANG Yun-xiang 作者单位：姚晓丽,YAO Xiao-li(华中农业大学,农业微生物国家重点实验室,武汉,430070;桂林绿地环保高科技投资有限公司,广西,桂林,541004)

梁运祥,LIANG Yun-xiang(华中农业大学,农业微生物国家重点实验室,武汉,430070)

刊 名：桂林工学院学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF GUILIN UNIVERSITY OF TECHNOLOGY年，卷(期)：200626(4)分类号：Q939 X172关键词：可培养中温细菌 种群 分布 桃花江 桂林

★ 光合细菌培养条件的研究

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研究发现一种细菌可分解PET塑料 第3篇

京都工艺纤维大学日前发表的公报说, 该校联合其他科研机构共同发现的这种细菌属于“艾德昂菌属”, 它能产生两种酶逐步分解PET塑料, 最终产生二氧化碳和水。研究人员发现, 这种细菌在自然界中能以PET塑料为营养源生存并繁殖。

PET全称为“聚对苯二甲酸乙二酯”, 是以石油为原料的常见化工材料, 广泛用于生产食品容器和电子产品。京都工艺纤维大学的专家指出, 2013 年全球PET塑料总产量约为5600 万吨, 而PET塑料制品废弃后在自然界中极难降解。

可培养细菌 第4篇

一、实验目的与要求：

（1）掌握从环境（土壤、水体、活性污泥等）中分离培养细菌的方法，从而获得若干种细菌纯培养技能

（2）掌握细菌纯种分离的方法：稀释平板分离法和平板划线法。

（3）掌握几种接种技术：斜面接种技术、穿刺接种、稀释平板涂布法等。

二、实验原理

在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。

为了获得某种微生物的纯培养。一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。

三、实验器材

1、牛肉膏蛋白胨培养基

2、盛9ml无菌水的试管，盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，1ml和5ml无菌 吸管，无菌培养皿；

3、接种环，土样，酒精灯等。

四、操作步骤

1、倒平板 将加热融化的牛肉膏蛋白胨培养基倒平板，并标明培养基的名称。

2、贴标签 接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口径2-3厘米的位置。

3、点燃酒精灯。

4、接种

取接种环 右手拿接种环(如握钢笔一样)、在火焰上将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌。

环冷却 将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触边壁，使其冷却。

取菌种 待环冷却后轻轻沾取经稀释10倍的土壤悬液-环，然后将接种环移出菌种管，注意不要使环的部分碰到管壁，取出后不可使环通过火焰。

接种 在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环在平板上划线。划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。常用的划线方法有下列二种：

⑴用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线(图A)。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培养。

⑵将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线(图B)。划线完毕后，盖上皿盖，倒置温室培养。

环灭菌 将接种环烧红灭菌。

5、挑菌 将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培养基的斜面上，分别置25℃和28℃温室中培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否单纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂，就要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。

四、注意事项

可培养细菌 第5篇

目前, 新的生物太阳能研究重点之一是利用几乎在地球每个陆地和水生生物栖息地都能发现的蓝藻作为可持续能源的资源。去年, 该研究团队通过改变用在电池上的正负极材料, 建造了一个较好的生物太阳能电池, 同时设计了一个基于微流控的小型单腔装置安置细菌, 以替代传统的双腔生物太阳能电池。而这一次, 研究人员以3×3的模式连接了9个相同的生物太阳能电池, 形成一个可扩展和堆叠的生物太阳能电池板, 通过细菌的光合作用和呼吸活动, 连续产生了60 h的电力。

这种细菌发电是在微流控生物太阳能板中进行的, 研究人员通过小型化器件结构和在面板上连接多个微型电池, 可使这种生物太阳能电池板的性能显著提高, 这或将克服生物太阳能电池研究面临的障碍, 使生物太阳能电池可持续、更高效地产生电力。

研究人员认为, 该研究有助加深人们对在控制良好的微环境下, 一个较小微生物群中光合细胞外电子转移过程的理解, 从而为基本的生物太阳能电池研究搭建起一个多功能平台。这一突破可以最大限度地提高发电能力/能源效率/可持续性。现在只能部分理解蓝藻或藻类的代谢途径, 其显著的低功率密度和低能量效率尚不适用于实际。由此, 需要进行额外的基础研究, 搞清楚细菌的新陈代谢和生物太阳能应用的生产潜力。

可培养细菌 第6篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取笔者所在医院2013年3月-2014年3月收治的80例细菌性阴道病患者作为研究对象, 年龄21~65岁, 平均 (31.7±3.6) 岁;入选标准:符合中华医学会妇科学会制定的细菌性阴道病的诊断标准[4];经相关实验室检查、影像学检查、妇科检查结合临床症状确诊为细菌性阴道病患者。所有患者均出现白带分泌物增多、阴道炎、异味、外阴瘙痒等表现。所有患者均排除妊娠期、哺乳期女性, 无严重肝肾功能不全、半个月内未进行抗菌药物治疗及性接触。

1.2 方法

应用无菌棉签采集患者阴道后穹隆处阴道分泌物, 置存于无菌盐水内, 分别进行细菌培养法及PCR检验法。细菌培养法:取出标本, 置于培养基内, 培养于CO2孵箱内48 h, 菌落长成后取出半透明状、露滴状、灰色、光滑的菌群, 严格按照标准予以生化鉴定;后进行PCR检验法:采集含有无菌盐水的阴道分泌物1000μl, 在离心管内离心15 min, 1200 r/min, 离心后除去上清液, 将组织裂解液加入分泌物中, 置于60℃水液锅内, 10~15 min后取出, 离心10 min, 1200 r/min, 采集少许上清液制作DNA模板, 扩增DNA模板时, 需进行阴性对照, 向其中加入模板、双蒸馏水、缓冲对、引物等, 加入PCR仪内进行循环。比较两种方法的检测准确率情况。

1.3 评价标准

参照以下评估标准: (1) 条带宽不超过1 mm, 边缘整齐; (2) 条带在期望的碱基大小之内; (3) 背景上无smears, 也无引物二聚体的出现则是PCR扩增失败, 而非阴性反应; (4) 如果出现期望的碱基大小之外的其他条带, 不管是否有期望大小的条带, 均为人工假象[5]。

1.4 统计学处理

采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析, 计数资料以率 (%) 表示, 比较采用x2检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

PCR检测法的阴性检出率26.2%明显低于细菌培养法的65.0%, 阳性检出率73.8%明显高于细菌培养法的35.0%, 其中肠球菌检出率13.8%、加特纳菌检出率42.5%、棒状杆菌17.5%均明显高于细菌培养法的3.8%、26.2%、5.0%, 两组检验方法比较差异均有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。

例 (%)

3 讨论

阴道内存在多种正常菌群, 彼此可相互拮抗平衡达到阴道内环境的稳定。如果阴道内p H值超过4.2或低于3.8, 阴道内解脲、人形支原体等条件致病菌会过度滋生而引发阴道炎症病变[6]。近年来认为细菌性阴道病的发生是由于阴道菌群失调, 乳酸杆菌减少而导致其他病原如加德纳菌、各种厌氧菌、弯曲弧菌等的大量繁殖, 实际上是以加德纳菌为主的一种混合感染[7]。阴道细菌感染性疾病的病理机制主要为阴道内酸性环境影响阴道内上皮细胞, 病菌侵蚀表面的糖原, 引发阴道内感觉出现酸碱度改变, 降低了阴道杆菌的数量, 增加病原菌数目, 大量糖原等营养物质被消耗, 阴道上皮细胞正常代谢能力降低, 阴道内酸碱平衡失调, 阴道上皮细胞无正常的保护屏障功能, 导致出现阴道炎[8]。典型临床症状为阴道异常分泌物明显增多, 呈稀薄均质状或稀糊状, 为灰白色、灰黄色或乳黄色, 带有特殊的鱼腥臭味, 尚有不同程度的外阴灼热感, 偶见性交痛[9]。极少数患者出现下腹疼痛、性交困难及排尿异常感。目前细菌性阴道病主要应用药物疗法, 目前对于细菌性阴道病检验方法已成为医学学者的重要研究课题[10]。

本研究对细菌性阴道病进行PCR检验法及细菌培养法, 结果显示:PCR检测法阴性21例 (26.2%) , 阳性59例 (73.8%) , 包括肠球菌11例 (13.8%) 、加特纳菌34例 (42.5%) , 棒状杆菌14例 (17.5%) ;细菌培养法检测阴性52例 (65.0%) , 阳性28例 (35.0%) , 包括肠球菌3例 (3.8%) 、加特纳菌21例 (26.2%) 、棒状杆菌4例 (5.0%) , 两种检验方法比较差异有统计学意义 (P<0.05) , 与金萍等[11]的研究结果大体一致。

PCR检验法又称PCR聚合酶链反应法, 是经由体外酶合成DNA特异性片段, PCR检测技术具有DNA特异性杂交及PCR的敏感性等特征, 具有快速简便、特异性强、灵敏度高等优越性;标准的PCR过程分为三步, (1) DNA变性 (90℃~96℃) :双链DNA模板在热作用下, 氢键断裂, 形成单链DNA; (2) 退火 (25℃~65℃) :系统温度降低, 引物与DNA模板结合, 形成局部双链; (3) 延伸 (70℃~75℃) :在Taq酶 (在72℃左右, 活性最佳) 的作用下, 以d NTP为原料, 从引物的5′端→3′端延伸, 合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸, DNA含量即增加一倍。细菌培养是一种用人工方法使细菌生长繁殖的技术, 细菌在自然界中分布极广、数量大、种类多, 阴道细菌可用人工方法培养, 即将其接种于培养基上, 使其生长繁殖, 细菌培养方法曾是临床阴道细菌检验法的金标准, 但因对实验室环境要求较高, 操作方法较为复杂, 近年来逐渐被PCR检验法所替代[12]。

本研究结果显示, 分别对细菌性阴道病患者进行PCR检验法及细菌培养法后, PCR检验法的灵敏性、特异性更高, 准确性更高。综上所述, 细菌性阴道病进行PCR检验法, 操作快捷简便, 准确率高, 效果确切, 值得临床推广。

摘要：目的:探析阴道细菌检验进行细菌培养法与PCR检验法的效果观察。方法:选取笔者所在医院2013年3月-2014年3月收治的80例细菌性阴道病患者作为研究对象, 分别对其进行细菌培养法与PCR检验法, 比较两种方法的检测准确率情况。结果:PCR检测法的阴性检出率26.2%明显低于细菌培养法的65.0%, 阳性检出率73.8%明显高于细菌培养法的35.0%, 其中肠球菌检出率13.8%、加特纳菌检出率42.5%、棒状杆菌17.5%均明显高于细菌培养法的3.8%、26.2%、5.0%, 两种检验方法比较差异均有统计学意义 (P<0.05) 。结论:细菌性阴道病进行PCR检验法, 操作快捷简便, 准确率高, 效果确切, 值得临床推广。

细菌鞭毛染色培养条件的研究 第7篇

普通变形杆菌 (proteus vulgaris) , 广泛分布于自然界, 为周鞭毛菌, 易于观察, 是细菌鞭毛教学和实验的理想菌种之一。 鞭毛染色步骤繁琐且结果不稳定, 不同的培养基和培养条件对细菌鞭毛的染色效果影响很大, 如何选择合适的培养基和培养条件是细菌鞭毛形态学研究的热点问题之一[8,9,10,11]。 同时由于操作过程复杂, 影响因素多, 成功率偏低, 使得鞭毛染色在基础医学教学中往往较难取得预期的效果。 因此, 本研究以普通变形杆菌为菌种, 通过常规染色方法 (镀银染色法) 来比较普通变形杆菌在不同培养基 (基础肉汤培养基、普通琼脂培养基、血琼脂培养) 和不同培育时间 (8、12、18、24 h) 下的鞭毛染色效果, 探讨适宜普通变形杆菌鞭毛培育的最佳条件 (培养基和培育时间) , 以提高鞭毛染色的成功率, 从而更好地服务于基础医学的实验教学。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种为普通变形杆菌, 保存于川北医学院病原生物与免疫学教学实验中心。 实验中所用的试剂:肉浸膏、蛋白胨、琼脂粉购于杭州天和微生物试剂有限公司;NaCl、FeCl3购于成都科龙化工试剂厂; 硝酸银购于天津市博迪化工有限公司;兔血来源于川北医学院动物中心;培养箱购于上海精宏实验设备有限公司 (型号为SHP-250) 。

1.2 培养基[12]

1.2.1 基础肉汤培养基于1000 mL蒸馏水中加入固体物质, 包括3.0 g肉浸膏, 10.0 g蛋白胨, 5.0 g NaCl, 1000 ml蒸馏水, 混合加热溶解;校正pH至7.4~7.6, 煮沸3~5 min, 用滤纸过滤;分装于适当试管内, 121℃高压蒸汽灭菌20 min后, 置阴暗处贮存备用。

1.2.2 基础琼脂培养基于基础肉汤培养基中加入15%的琼脂粉, 121℃高压蒸汽灭菌20 min后倒入平板上冷却待用。

1.2.3 血琼脂培养基将已灭菌的普通琼脂培养基加热融化, 待其冷却至50℃左右, 在无菌条件下加入脱纤维兔血5%~10%, 轻摇匀 (勿使有气泡) 后倒入平板上冷却待用。

1.3 菌种

从菌种库取出普通变形杆菌, 采用点接法将细菌接种于基础培养基平板上, 放入37℃恒温培养箱里连续培养18~24 h, 后再转接于另一新鲜平板培养基中继续培育, 如此重复培育3 代 (次) 后备用。

1.4 染液制作

媒染剂A[13]:3.0 g FeCl3·6H2O, 溶于0.01 mol/L的HCl溶液100 mL中, 室温存放, 长期稳定。

媒染剂B[13]:单宁酸15.0 g溶解于100 mL蒸馏水中, 加入37%甲醛1.0 mL。 室温存放, 长期稳定。

银染液C[14]:AgNO35.0 g溶于100 mL蒸馏水, 取出10.0 mL备用, 向余下的90 mL硝酸银溶液缓慢滴加浓氨水, 边加边摇动, 直至形成沉淀完全溶解重新形成澄清液为止, 再将备用的AgNO3溶液缓慢回滴, 直至形成稳定薄雾状溶液。

1.5 载玻片处理

将新载玻片放入洗衣粉水清洁液中煮沸10 min, 取出冷却后用自来水冲洗干净, 再用清洁液浸泡煮沸10 min, 自来水冲洗干净。 使用前放入95%酒精浸泡24 h, 用时取出用纱布擦干。

1.6 染色方法

1.6.1 细菌培养 ①将传代后的普通变形杆菌分别以液体培养基接种法接种于肉汤管, 点接法接种于基础琼脂平板和点接法接种于血琼脂平板内, 37℃恒温培养18 h, 经染色镜检后, 选取染色效果最好的培养基。②将传代的普通变形杆菌接种于染色效果最好的培养基上 (随机接种3 份) , 分别在37℃恒温培养箱内培养8、12、18、24 h后染色镜检, 确定染色效果最好的培育时间。

1.6.2 制片于处理过的载玻片一端滴加2~3 滴蒸馏水, 用接种环以无菌操作法取菌落边缘细菌一环, 悬于蒸馏水中, 待水滴稍变浑浊后立即移开接种环, 静置5 min让鞭毛舒张开来, 稍倾斜玻片, 使菌液从玻片的一端流向另一端, 放置台上, 自然干燥。

1.6.3 染色取A液1 mL滴入带有塞的试管内, 再加入B液1 mL, 充分混合, 用酒精灯火焰微热20 s, 稍冷却后取适量混合液滴于制片好的菌膜上并完全覆盖菌膜染50 s, 用蒸馏水冲洗干净。 因A、B混合物不稳定, 故要尽快使用, 否则影响染色效果。

滴加银染液C覆盖住菌膜, 加热至蒸气微冒 (约持续20 s) , 用蒸馏水冲洗干净, 并保证染液不被蒸干。

1.7 镜检观察

用吸水纸吸干已染色好的载玻片, 后在显微镜 (油镜) 下镜检、观察、拍照。 为了避免实验误差, 每次实验均在同等条件下重复3 次, 不同批次所得的染色玻片均由同一人进行镜检观察。

2 结果

2.1 培养基对细菌鞭毛染色效果的影响

分别比较接种于3 种不同培育基 (普通肉汤培养基、普通琼脂培养基和普通血琼脂培养基) 上普通变形杆菌鞭毛的镜检效果可知, 在血琼脂培养基中培养的细菌鞭毛伸展性好, 菌体形态完整, 粗细均匀, 总体效果好, 而普通肉汤培养基和普通琼脂培养基培养的鞭毛较稀疏, 结果则相对较差。

2.2 菌种培育时间对细菌鞭毛染色效果的影响

培养时间长短对普通变形杆菌的鞭毛生长也有较大影响。 将普通变形杆菌接种在培育效果较好的血琼脂培养基中培育, 分别培养8、12、18、24 h, 比较不同的培养时间下普通变形杆菌的镜下效果:8 h菌龄的细菌菌体粗大且很长、鞭毛周身如毛绒状, 这可能是变形杆菌菌体还处于分裂繁殖阶段, 而鞭毛也正在发育;12 h菌龄细菌菌体中等大小, 鞭毛清晰完整, 效果好;18 h菌龄的细菌菌体较短小, 鞭毛周身且完整, 易于观察, 24 h菌龄细菌菌体短小, 鞭毛比较稀疏, 有些菌体的鞭毛已脱落。 因此选用12~18 h菌龄的细菌做鞭毛染色效果好, 易于观察。 见图1。

a:8 h;b:12 h;c:18 h;d:24 h

3 讨论

可培养细菌 第8篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年1月~2015年1月我院收治的阴道炎患者200例为研究对象, 患者的年龄、体重、病情程度均为白带增多、外阴瘙痒等症状, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。

1.2 方法和观察

收取本院患者200例的阴道分泌物, 用无菌棉签在其阴道后穹隆处, 沾取患者的阴道分泌物来检测, 同时将其进行标签标记, 分别采用细菌培养法和PCR检测法进行试验。

细菌培养法是将患者的分泌物放入到二氧化碳的恒温箱中, 在持续48 h后, 会有半透明的灰色光滑的菌群体呈现出来。

PCR检测时, 将含有患者阴道分泌物的生理盐水转换为离心, 取出清液, 随后加入组织裂解液后置于水浴锅当中进行不断加热, 将水浴锅的温度控制600 c左右, 水浴的时间将设置成2 min左右, 然后利用同样的转动速度进行相同的做法, 时间也同样设置为每分钟12000 R, 待离心完成后, 选取试管当中的清夜作为模板, 将其放入到PCR内部的检测中心进行循环检测, 分析出阴道分泌物当中出现的菌类。

检测后对两组患者的细菌种类进行分析, 对比两种检测的方法的细菌种类和阴阳性率。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行分析处理, 计数资料以百分数 (%) 表示, 采用x2检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

本院收取出的患者200例中, 细菌培养检测出120例为阴性, 80例为阳性, 检测率为40%, PCR的检测法出20例阴性, 阳性为180例, 检测出率为90%, 其两种检测方法对比, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。

3 讨论

阴道内部的细菌感染是造成女性成为阴道炎的直接发病原因, 一般情况下, 由于女性的阴道内壁分泌物主要呈现碱性体质, 而这种环境下能够生存的菌类不多, 因此, 在阴道内部环境中细菌能够保持平衡。但是由于阴道内部齐声的菌群出现失衡, 阴道的可入侵性提高, 稳定性出现下降, 阴道杆菌等在阴道失去平衡后出现大量死亡, 使细菌开始拥有大量的生活空间, 逐渐的在女性阴道内大量递增繁殖[2]。而此时大量的细菌会在女性所引导的上表皮细胞新城代谢的运动, 从而导致阴道内的酸碱性情况出现混乱。阴道内的细菌杆菌也是造成阴道炎等疾病发生的主要因素[3]。随着女性阴道内部环境的失调, 阴道的细菌可侵袭性增高, 稳定性较差, 女性会出现一些白带居多, 颜色较深、外部瘙痒等症状, 但是由于是初发病期, 情况较为轻, 不容易引起人们的注意, 一旦病情进一步的发展, 就会直接导致女性的盆腔以及腹部出现疾病, 严重时会直接导致女性出现不孕的现象[4]。

由于女性的阴道内部是属于无痛无知觉组织, 在前期出现病情时, 体现不出太大的感觉, 阴道内部也会出现疼痛感, 因为, 女性阴道是无痛体质, 所以只能在病情变严重时才能发现出自己的身体不舒服, 那这时才去医院接受治疗时有些晚, 很多患者在发病的初期显示的临床状况比较轻, 因此, 难以加深重视, 从而丢失了良好的时机医治, 才会导致患者的病情不断增加、恶化, 如果不及时治疗, 很有可能会出现加重, 病情转移到盆腔的位置, 那么患者就会出现小肚子疼痛难忍, 腰酸痛的现象。女性的盆腔是一个疼痛感极具严重的地方, 若是出现小肚子和腰部出现酸疼的现象就是形成了盆腔炎, 然而盆腔炎最为苦恼的地方就是, 会不断地折磨女性, 出现疼痛感, 甚至痛到无法动, 然而一旦有阴道炎转移到盆腔炎当中, 后果不堪设想。女性患有盆腔炎的话很难容易治愈, 其病情总是反复发作, 得不到痊愈。在妇科的临床数据分析当中, 采用传统的方式进行取出阴道的分泌物, 并采取细菌培养法, 这种方法的临床理论很简单, 因此, 在以往的早期治疗当中就已经成为了确诊阴道炎的重要指标。在妇科的临床数据分析当中, 采用传统的方式进行取出阴道的分泌物, 并采取细菌培养法, 这种方法的临床理论很简单, 因此, 在以往的早期治疗当中就已经成为了确诊阴道炎的重要指标。但是由于这种细菌培养法的检测形式耗费的时间比较长, 由于细菌培养法采取的方法比较复杂, 对于实验室内部的环境要求也要高, 在临床中不适合采用, 对患者的治疗时间也会有多耽误, 所以不太建议使用细菌培养法的检测。PCR检测效果即快速有保证了检验的结果, 两者对比, PCR明显高于细菌培养法[5]。

综上所述, 采取CR检验法对患者进行阴道细菌检验结果, 能够有效提高细菌阳性检测率, 同时为患者的治疗质量提升到一个空间。

摘要：目的 对比分析PCR检验法和细菌培养法用于阴道细菌检验效果。方法 选取2013年1月2015年1月我院收治的阴道炎患者200例为研究对象, 采取阴道分泌物进行检测, 分别采取细菌培养法和PCR检查法进行阴道细菌检测。结果 200例患者中, 细菌培养检测出120例为阴性, 80例为阳性, 检测率为40%, PCR的检测法出20例阴性, 阳性为180例, 检测出率为90%, 其两种检测方法对比, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。结论 PCR检测法应用于阴道细菌检测具备极高的准确率, 并且速度快捷。

关键词：PCR检验法,细菌培养法,阴道细菌

参考文献

[1]姚虹, 吕治, 苏建荣, 等.实时荧光定量PCR检测阴道加德纳菌的方法及价值[J].现代中西医结合杂志, 2013, 22 (7) :768-770.

[2]欧志方.三种不同检验方法用于阴道细菌检验的比较分析[J].中外医疗, 2013, 7 (05) :171-172.

[3]史跃杰.99例阴道细菌的检验方法比较分析[J].现代预防医学, 2011, 38 (14) :2815-2817.

[4]潘杰, 李蔼文.叶青.三种检测方法在细菌性阴道病快速诊断中的比较分析[J].国际医药卫生导报, 2013, 19 (22) :3471-3474.

可培养细菌 第9篇

关键词：细菌性阴道炎,细菌培养,耐药性

细菌性阴道炎是是由于细菌过度生长所致阴道微生态非正常改变, 可引起患者阴道分泌物增多, 白带有鱼腥臭味及外阴瘙痒灼热, 下腹不适等症状, 会引起宫颈、宫体、附件、盆腔感染和炎性反应, 且多数不会自动消失, 严重干扰患者的正常生活[1]。该病近些年来发病率有所提高, 主要由不洁性生活和间接接触引发[2]。目前我院对细菌性阴道炎患者引导分泌物致病菌分布和耐药性进行探讨, 现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院2012年7月至2013年7月收治的门诊及住院细菌性阴道炎患者200例作为研究对象, 患者年龄范围18~60岁, 平均年龄 (36.5±2.5) 岁。患者中有176例已婚, 剩余24例患者未婚。

1.2 纳入标准

(1) 患者可有阴道分泌物增多, 呈白色、匀质、稀薄, 感染严重时可有脓性分泌物; (2) 患者可有会阴部坠胀感, 阴道瘙痒、灼热, 甚至会有刺痛感; (3) 镜检白带可发现线索细胞; (4) 阴道p H改变, 分泌物检查p H>4.5; (5) 阴道分泌物胺臭味试验阳性。

1.3 排除标准

(1) 患者处于月经期; (2) 患者在阴道分泌物采集前1 d内有性生活、盆浴、使用药物行阴道灌洗; (3) 阴道分泌物采集前7 d内使用过抗生素或磺胺类药物治疗。

1.4 研究方法

所有标本均由高年资妇科医师采集, 在窥阴器辅助下使用无菌棉签在宫颈内2 cm左右来回捻转, 取得标本后立即送检。用标准划线法将标本分别接种于血琼脂平板和中国蓝板上, 37℃培养24~48 h, 选择纯培养或优势生长株进行分离。

药敏试验采用纸片扩散法 (Kirby-Bauer K-B) 质控菌株为标准菌株大肠埃希菌ATCC25922及ATCC35218, 肺炎克雷伯菌ATCC00603, 金黄色葡萄球菌ATCC25923, 肠球菌ATCC29212和铜绿假单胞菌ATCC27853。采用BV联合测定试剂盒进行检查, 并排除阴道毛滴虫, 白色念珠菌等特异性病原体。使用阿奇霉素, 头孢唑林, 环丙沙星, 克林霉素, 红霉素, 庆大霉素, 左氟沙星, 青霉素, 利福平, 四环素, 复方新诺明和万古霉素对革兰阳性球菌进行耐药性检查;使用阿米卡星, 氨苄西林, 头孢哌酮, 头孢噻肟, 头孢他啶, 头孢曲松, 头孢噻吩, 庆大霉素, 左氟沙星, 美洛培南, 美洛西林和复方新诺明对革兰阴性菌进行耐药性检查。

1.5 统计学分析

统计学处理结果数据采用SPSS 16.0处理, 用检出率和构成比表示相对数。

2 结果

2.1 细菌性阴道炎患者细菌分布情况

200例患者分离出致病细菌164株, 其中革兰阳性球菌共99例, 占60.4%, 其中以金黄色葡萄球菌为主;革兰阴性菌65例, 占39.6%, 以大肠埃希菌为主。革兰阳性球菌和格兰阴性菌分布见表1。

2.2 主要革兰阳性球菌的耐药性分析

格兰阳性球菌中金黄色葡萄球菌的整体耐药率最高。金黄色葡萄球菌对青霉素和阿奇霉素, 红霉素耐药率较高, 对头孢唑林和万古霉素的耐药率低;链球菌对头孢唑林和环丙沙星绝对耐药, 且对四环素克林霉素, 和红霉素, 阿奇霉素耐药率高, 对利福平和万古霉素耐药率低;屎肠球菌对头孢唑林、环丙沙星和克林霉素绝对耐药, 对青霉素和万古霉素耐药率低。研究显示, 万古霉素对主要革兰阳性球菌均绝对敏感。见表2。

2.3 主要革兰阴性菌耐药性分析

主要格兰阴性菌种大肠埃希菌的整体耐药率高于肺炎克雷伯菌。大肠埃希菌对氨苄西林、复方新诺明和庆大霉素的耐药率较高, 对阿米卡星、美洛培南的耐药率低;肺炎克雷伯菌对氨苄西林的耐药率较高, 对头孢哌酮、头孢他啶等头孢类药物耐药率较低, 且对左氟沙星和美罗培南的耐药率也较低。其中大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对美罗洛南均绝对敏感。见表3。

3 讨论

细菌性阴道炎是由病菌感染导致阴道内微生态平衡失调, 各种致病的细菌病原体大量繁殖, 导致局部的细菌性阴道炎发作的一种疾病, 可引发患者鱼腥臭味的灰白色的白带, 阴道灼热感、瘙痒等症状, 严重者可有盆腔炎、子宫内膜炎等并发症[3]。每细菌性阴道炎的发病机制较为复杂, 主要通过性传递和间接接触传递有关;同时也和女性患者阴道p H等内环境适宜细菌生长有关, 而阴道独特的生理结构和泌尿生殖系统血液循环则导致抗生素局部药物分布区别较大, 使患者治疗效果欠佳[4]。本研究对细菌性阴道炎患者细菌分布和耐药性进行分析, 研究结果显示革兰阳性球菌感染率多余于革兰阴性菌, 致病菌主要以金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠埃希菌为主。3种致病菌的耐药率均较高, 金黄色葡萄球菌对青霉素和阿奇霉素, 红霉素耐药率较高, 对头孢唑林和万古霉素的耐药率低;链球菌对头孢唑林和环丙沙星绝对耐药, 且对四环素克林霉素, 和红霉素, 阿奇霉素耐药率高, 对利福平和万古霉素耐药率低;大肠埃希菌对氨苄西林、复方新诺明和庆大霉素的耐药率较高, 对阿米卡星、美洛培南的耐药率低;研究中万古霉素和美洛培南未发现耐药菌株。本研究结果与吕春兰[5]的研究结果相近, 但链球菌的感染率有所区别, 这可能和地域差别, 当地卫生情况不同以及不同地区致病菌流行不同有关。

综上所述, 细菌性阴道炎致病菌的耐药率较高, 临床应根据病原学检查和药敏试验结果合理使用抗生素。

参考文献

[1]龙聪, 熊军, 雷鸿斌.1855例阴道分泌物常规及细菌性阴道病检测结果分析[J].中国妇幼保健, 2013, 28 (24) :3978-3980.

[2]蓝红云, 陈少艳.3580例阴道炎患者阴道分泌物病原学检测及耐药性研究[J].国际检验医学杂志, 2012, 33 (16) :1947-1949.

[3]张贤芝, 杨娜, 何淑霞.妇科门诊患者阴道分泌物病原体分布及耐药性分析[J].检验医学与临床, 2013, 10 (12) :1542-1544.

[4]吴美娟.2612例阴道分泌物检测及临床探讨[J].检验医学, 2009, 24 (5) :390-392.