载体检测范文（精选7篇）
载体检测 第1篇
载体桩是一种新型的施工技术,在施工过程中通过填料夯实,形成桩端载体,其受力时侧阻所占的比例较少,主要由桩端载体承担。由于载体桩的施工工艺、受力原理及荷载传递机理等完全不同于传统的桩基础,因此,其检测的判断与传统桩基础也不一样,本文就结合载体桩的构成、受力和施工,介绍载体桩的检测方法。传统桩基础的检测方法包括静载荷试验、低应变完整性检测和高应变检测等。而载体桩桩端存在载体,采用高应变所需要的锤击能量大,一般不采用该方法进行检测,因此本文主要介绍载体桩的静载荷试验和低应变完整性检测。
1 静载荷试验
静载荷试验是通过堆载或锚桩作为反力装置,采用千斤顶作为加载手段,分级对桩基础或复合地基进行加载,模拟桩或复合地基的受力以检测其是否满足工程设计要求的检测手段。一般包括工程试验桩检测和工程桩验收检测。
1.1 工程桩验收检测
载体桩作为一种基础形式,其下部存在载体,上部与普通桩基础一样,故其检测手段和方法与常规桩基础一样,其检测手段可以参见相关规范。唯一不同是由于载体桩的受力与常规桩基础不同,因此对载体桩试验结果的判断不尽相同。
普通桩基础的载荷曲线,根据其桩侧土体、桩端土体的土性及成桩工艺、桩的形状的和尺寸分为不同的类型,但总体上可以分为两大类:陡降型和缓变型,如图1。第1种类型主要为摩擦桩,当荷载达到一定值后,沉降急剧增加,表明侧阻全部发挥,单桩承载力达到极限。第2种类型主要为端承桩,受荷时,首先是侧阻发挥作用,当侧阻全部发挥时候,端阻才发挥。随着侧阻和端阻的逐渐发挥,变形逐渐增大,是一种缓慢增加的过程。普通桩基础承载力的确定原则为:对于陡降型曲线,取发生明显陡降的起始点所对应的荷载作为极限荷载;对于缓变形曲线的桩取s=40mm对应的荷载作为极限荷载,当桩长大于40m时,宜考虑桩身的压缩量;对于直径大于或等于800mm的桩取s=0.05D对应的荷载作为极限荷载。
载体桩主要通过载体传递荷载、实现压力扩散,故其受力类似扩展基础但不是扩展基础,而扩展基础的承载力确定是根据载荷板试验,通过变形和载荷板尺寸的比值来确定,因此载体桩承载力的确定既不同于普通桩基础,也不同于扩展基础。通过试验和实践发现,载体桩变形达到40mm时,承载力还有很大的富余,此时卸载其回弹变形较大,说明还没有发生较大的塑性变形,因此载体桩设计规程规定:对于陡降曲线,取陡降起始点对应的荷载作为极限荷载,缓变型曲线取变形为60mm对应的荷载作为载体桩极限荷载。
1.2 试验桩的检测
载体桩作为一项新的技术,在某些地区可能是首次使用,根据规程规定:对无相近地质条件下成桩资料的载体桩设计,应事先进行成孔、成桩试验和载荷试验确定设计及施工参数。
普通桩基础试验桩的检测必须要28d才能进行试验,原因包括:①桩身强度的影响。如龄期短,强度不满足要求,试验时会出现桩身被压裂或压断等现象;②桩的施工过程对土的结构会造成一定的破坏,因此桩侧阻在施工后短时间内会较低。土具有触变的特性,经过一段时间后,土的承载力恢复,因此在施工完的初期可能承载力不满足设计要求,而经过一定时间后承载力可以满足设计要求。
载体桩由于桩长短,侧阻所占比例小,主要通过载体发挥承载力,而载体承载力的发挥须通过施工过程中形成不同密实度的材料,上部荷载通过桩身传到载体,在载体内部进行扩散,而压力的扩散不太受施工后时间的影响,因此可不考虑时间对其的影响,因此作为试验桩检测时常常用预制桩身作为传力杆件代替桩身进行试验,只要载体承载力满足设计要求,则载体桩必将满足设计要求。图2为某一实际工程中载体和载体桩承载力的对比。从试验数据可以看出载体桩单桩承载力和单个载体的承载力大致相同。
2 低应变完整性检测
低应变完整性检测通常采用的方法为反射波法,反射波法是利用波在固体中传播规律,通过桩底反射波信号进行分析判断桩身与桩底混凝土质量的一种无损检测方法。它利用重锤在桩顶进行敲击产生震动波,震动波在固体中传播时,当传播介质发生变化,或传播截面发生变化时,一部分波便会反射回桩顶。通过对桩顶传感器采集的信号进行数学积分,筛选、分离和放大,分析出桩身的缺陷。
2.1 反射波法的原理
假设一如图3所示的桩,m-m面以上桩身面积为A1,纵波在其中传播的速度为c1,M-M以下桩身面积为A2,纵波在其中传播的速度为c2,入射波声压为P,反射波声压为P1,透过的声波声压为P2。
式中:P、P1、P2为入射波声压、反射波声压、折射波声压;P、P1、p2为入射波、反射波、折射波声波的起始振幅值;ω为阻尼运动的角频率;a为衰减系数。
由于在任何截面固体介质中存在声压连续和振速连续,故:
根据振速与应力的关系:
其中:ρ为介质密度;c为声波在介质中传播的速度。根据图3力的传播方向,将(6)和(7)代入(4)和(5),则
式中:z1、z2为m—m截面上、下桩身材料的阻抗。
由上式可以求出振速反射系数
若Rv大于0时,通过截面的反射波的初动相位与直达波的初动相位相同;若Rv小于0时,通过截面的反射波的初动相位与直达波的初动相位相反。
2.2 载体桩的低应变检测
载体桩上部为混凝土桩身,故工程中常常用低应变动力测试来检测桩身完整性。由于载体桩桩端为复合载体,桩端施工与普通混凝土桩不一样,要正确分析载体桩的测试信号,判断其桩身质量和缺陷,必须了解该技术的原理和施工工艺。
1)桩身判断
载体桩桩身缺陷的判断与普通混凝土没有太大区别,当混凝土强度不变、桩身截面发生变化时,若桩身有缩径,截面减少,即A1>A2,则Rv>0,表明反射波相位与初相位相同,出现同相反射;若桩身某处扩径,即截面增加,A1<A2,则Rv<0,表明反射波相位与初相位相反,出现反相反射;当桩身截面不变,桩身出现离析或夹泥时,混凝土强度降低时,即c1>c2,ρ1>ρ2,则Rv>0,表明截面反射波相位与初相位相同,出现同相反射。如表1所示。
2)对于桩端信号的分析
普通混凝土桩由于桩体强度比桩端土体强度高(嵌岩桩除外),因此桩底出现同相反射的信号,而载体桩的桩底反射情况比较复杂。载体从外形看是椭球状,面积大于桩身截面积,其材料分析依次为混凝土、填充料、挤密土体,材料密度依次降低,波在里面传播的速度也逐渐减小,因此Rv可正、可负,故桩端反射的信号取决于的大小,当材料的密度影响为主时,大于0,出现同相反射;当载体的面积增大影响为为主时,小于0,桩端出现反相反射。由于一般载体桩施工时,都填干硬性混凝土,体积在0.15～0.5m3,通过填料夯实,一般都会形成扩大的混凝土球体,因此一般面积增大影响为主要影响,载体桩的桩底反射一般呈反相反射;当混凝土填量较少时,受材料的影响较大时候,桩底反射呈现同相反射。
载体桩最可能的缺陷是桩身与载体的结合不良,原因可能为施工工艺上的原因,如施工过程中提护筒;也可能是地层的原因,如桩端为饱和土;邻桩的施工造成桩身与载体的脱离或裂缝等。其缺陷的反应为同相反射,与材料材性影响为主的无缺陷桩桩底反射相同。因此对载体桩桩底的反射应认真分析。
桩身质量检测判断一般分为四类:其中Ⅰ、Ⅱ类是属于没缺陷或有轻微缺陷但不影响承载力的桩,Ⅲ、Ⅳ是属于有严重缺陷的须降低承载力使用或不能使用的桩基础。载体桩桩端反射信号大致呈现几种,如图4。
曲线1为典型的载体桩曲线,由于干硬性混凝土扩径引起的同相反射信号大于载体部分介质密度减少引起的反相信号,因此在桩底曲线呈现明显的反相反射的信号;曲线2由于载体基础深度的影响土体范围较深,干硬性混凝土扩径产生的信号与载体材料产生的信号相互叠加形成;曲线3可以看出在反相反射波之前有一低幅的同相反射;曲线4在桩底有明显的同相反射明显时,且振幅较大,同相反射后的反相信号也不明显。其中曲线1和曲线2都属于桩身完整性、承载力满足要求的桩基础;对于曲线3和曲线4,首先应根据施工参数、施工工艺,并结合现场地质条件综合分析,进行判断,必要时要结合静载荷试验进行分析判断。根据经验,有缺陷的桩一定为桩底同相反射,但桩底为同相反射的桩不一定是有缺陷的或影响承载力的桩。
载体桩施工主要在护筒内进行,桩身质量易保证,在三击贯入度严格控制的情况下,一般缺陷表现为施工过程控制不严造成的混凝土桩身与载体的结合不良。对于这类质量事故的处理,可以先采用低应变检测方法,对桩的缺陷进行分类,找出需要处理的基桩,对其可采用锤击桩顶的方法,使桩身与载体结合良好,即可达到设计承载力的要求。
3 结束语
载体桩作为一种新型的地基处理技术,它既是等效扩展基础,同时也具有与混凝土桩一样的桩身,低应变检测时,应根据载体桩的结构与受力机理对桩身与桩端的缺陷进行正确分析和判断,根据其缺陷对承载力的影响进行分类,既保证载体桩的质量,又要避免不合理的判断。
摘要：由于载体桩与传统桩受力原理、施工方法不同,因此其检测判断也不同。本文分别介绍了载体桩的静载荷试验检测和低应变完整性检测的检测方法,并重点介绍了这两种检测的判断依据,对载体桩低应变检测曲线进行了分类。
关键词：载体桩,静载荷试验,低应变检测,缺陷
参考文献
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[4]桩基础工程手册编写委员会.桩基础工程手册[M].北京:中国建筑工业出版社,1995.
载体检测 第2篇
采用大肠杆菌表达体系来获得C-反应蛋白(CRP)融合蛋白.以pDNR-CRP质粒为模板,用PCR方法扩增获得全长的.CRP基因,将其克隆入表达载体pET28a(+)中,再转化到宿主菌BL21(DE3)中,加入IPTG诱导表达,表达产物做SDS-PAGE电泳分析,最后做免疫原性检测.成功地构建了CRP基因原核表达载体pET28a(+)-CRP,经IPTG诱导SDS-PAGE电泳分析表明C-反应蛋白能在大肠杆菌中获得表达,但免疫原性检测初步结果为阴性.结果证明CRP能以融合蛋白的形式在宿主菌BL21(DE3)中得到大量表达,表达产物缺乏免疫原性,其机理还有待进一步试验探讨.
作 者：余云芳 姚伟 张昌菊 鲁林 何正权 乐超银 梁宏伟 YU Yun-fang YAO Wei ZHANG Chang-ju LU Lin HE Zheng-quan YUE Chao-yin LIANG Hong-wei 作者单位：余云芳,YU Yun-fang(三峡大学生物技术研究中心,宜昌,443002;三峡大学医学院,宜昌,443002)姚伟,YAO Wei(三峡大学生物技术研究中心,宜昌,443002;福建农林大学,农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点开放实验室,福州,350002)
张昌菊,ZHANG Chang-ju(三峡大学医学院,宜昌,443002)
载体检测 第3篇
关键词：FOXL2,BPES,酵母双杂交
先天性睑裂狭小综合征(blepharophmiosis-ptosis-epi-canthus inversus syndrome, BPES)是一种罕见的常染色显性遗传病,偶有散发病例。眼部典型临床上以睑裂狭小、上睑下垂、倒转内眦赘皮、内眦远距为主要征象,部分患者有智力低下,生长迟缓,心房或室间隔缺损等。近年来,研究者们通过连锁分析、定位克隆及定位分析将致病基因定位于3q23(3号染色体2区3带)区域的FOXL2 为主要的突变基因。FOXL2[1]位于细胞核内、是一个2.7kb的单外显子基因,包含一个特有的101个氨基酸的forkhead DNA结构域和一个与此分离但功能尚未阐明的多聚丙氨酸肽段。
蛋白质与蛋白质的相互作用是很多生命现象的基础[2]。酵母双杂交系统是近年来新发展起来的一种分析真核细胞中蛋白-蛋白、蛋白-DNA、蛋白-RNA相互作用的一种有效的基因分析方法。本实验希望通过酵母双杂交系统研究分析在BPES发生发展中与FOXL2相互作用的蛋白及其作用,从而进一步从基因水平阐明BPES的致病机理。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料:典型的小睑裂综合征患者及家属外周血和正常人志愿者外周血。Y187酵母菌株,各种营养缺陷培养基及Minmal SD Base,Matchmaker Library Construction & Screening 试剂盒(美国Clontech公司);大肠杆菌DH5α(上海生工); TaqDNA聚合酶(Promega公司),UNIQ-10柱式小量质粒抽提试剂盒(BBI公司),限制性内切酶EcoRⅠ、NdeⅠ和X-α-Gal (美国Clontech公司),Trizol(上海生工)。
1.2 方法
1.2.1 PCR扩增FOXL2编码区DNA片段:
模板,引物: ①FOXL2上游:5′-TCA CATATGATGATGGCC AGCTACCCCCCGAGC-3′;②FOXL2下游:5′-CGG AAT TCTCAGAGAT CGAGGCGCGAATGC-3′。PCR反应条件为:95℃ 3min,93℃1min,63℃1min,72℃1min,5个循环;93℃ 45s,62℃45s,72℃ 1min,72℃10min,34个循环。PCR产物测序分析,分别获得一种编码区突变型和编码区正常的FOXL2 DNA片段。
1.2.2 感受态宿主菌制备:
常规CaCl2法常规制备E.coil DH5α感受态细胞。Y187酵母菌于YPDA固体培养基平板划线,30℃倒置培养至菌斑直径达2～3mm后,挑取单克隆LiAc法制备酵母菌感受态。
1.2.3 构建及鉴定诱饵质粒:
用EcoRⅠ、NdeⅠ限制性内切酶将PCR产物和载体pGBKT7双酶切。酶切后将PCR产物做胶回收,pGBKT7载体去磷酸化并纯化。将载体片段与插入片段利用T4DNA连接酶连接后转化DH5α感受态宿主菌,涂布于含卡那抗生素(Kana,100μg/ml)的LB培养基平板,37℃培养过夜。从平板中随机选出数个菌落,分别接种于含Kana的LB液体培养基中(Kana,100μg/ml),250r/min振荡培养过夜。菌液行PCR初步验证(空载体转化菌液,重组体载体菌液和无模板三者对照),证实含有目的片段插入后进一步提取质粒。EcoRⅠ、NdeⅠ双酶切鉴定和质粒进行测序分析。
1.2.4 重组诱饵质粒pGBKT7-FOXL2自激活和毒性检测
自激活性检测:用PEG /LiAc分别转化FOXL2编码区正常型、突变型的重组质粒pGBKT7-FOXL2和pGBKT7质粒至Y187感受态细胞,涂布SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Ade/-Trp营养缺陷培养基平板。同时分别将pGBKT7-53和pGBKT7-Lam转化Y187感受态细胞,涂布SD /-Trp /X-α-Gal营养缺陷培养基平板作阳性和阴性对照。将上述平板30℃孵育2～5d,观察菌落生长情况。
毒性检测:在自激活性平板中各转移一直径2～3mm菌斑至50ml的SD /-Trp/Kana(20μg/ml)营养缺陷液体培养基,30℃摇床250～270r/min培养,观察其生长速度,24h测菌液OD600。
根据转化菌株在固体和液体培养基的生长情况推定重组质粒有无单独激活报告基因转录的作用及对酵母的毒性。
2 结果与分析
2.1 FOXL2编码区基因片段的扩增产物
电泳可见与FOXL2编码区(1 131bp)大小一致的条带(图1)。测序结果表明所扩增DNA片段为目的基因片段。
1为DNA marker;2-7为PCR产物图。
Lane 1: DNA marker; Lane 2-7: ORF of FOXL2.
2.2 重组pGBKT7-FOXL2质粒鉴定结果
EcoRⅠ和NdeⅠ双酶切重组质粒pGBKT7-FOXL2(图2),重组质粒PCR鉴定(图3),均得到与目的片段大小一致的条带。
1.DNA marker;2.重组质粒pGBKT7-FOXL2;3.重组质粒双酶切。
Lane 1: DNA marker; Lane 2: The recombinant bait plasmid of pGBKT7-FOXL2; Lane 3: The bait pGBKT7-FOXL2 digested by EcoRⅠ/NdeⅠ.
1.DNA marker;2.无模板阴性对照;3.空载体阴性对照;4-7.PCR产物。
Lane 1: DNA marker; Lane 2-3: negative control; Lane 4-7: PCR product of insert in recombinant plasmid of pGBKT7-FOXL2.
2.3 诱饵质粒测序结果显示,插入片段其碱基序列与FOXL2序列一致。
2.3.1 正常FOXL2编码区重组质粒自身引物测序结果:经NCBI分析比对后显示插入片段为目的片段。
2.3.2 编码区突变型FOXL2 PCR测序和编码区突变型FOXL2诱饵质粒pGBKT7-FOXL2自身引物测序与人编码区正常FOXL2 测序比较分析确定重组前后目的片段基因序列一致,插入正确。
测序图谱比较见图4。
2.3 诱饵质粒自激活性及毒性检测(图5)
自激活检测:将诱饵质粒pGBKT7-FOXL2转化Y187感受态细胞,在SD/-Trp/X-α-Gal单缺固体培养基平板上正常生长,无蓝色菌斑出现,在SD /-Ade/-Trp二缺固体培养基平板无生长,结果说明该诱饵质粒无自激活活性。
毒性检测:将诱饵质粒pGBKT7-FOXL2转化菌Y187单克隆(2～3mm )接种于50ml SD /-Trp/Kana(20μg/ml)液体培养基中,培养24h后测得菌液OD600为1.251(突变型:编码区30bp重复插入突变)和1.064(正常型),符合进一步进行酵母双杂交实验所要求的OD600≥0.8。结果说明重组诱质粒无酵母毒性,可用于下一步的酵母双杂交实验。
3 讨论
3.1 FOXL2及特点
FOXL2定位于3q23区域,是大小为2 745bp的单外显子基因,开放性阅读框架为1 131bp。编码的蛋白有376个氨基酸,属于forkhead 转录因子大家族。FOXL2是目前发现的决定卵巢分化最早的标志性启动基因,其通过转录调控作用调节靶基因转录、蛋白表达,参与颗粒细胞增殖分化,对卵泡发育、女性生殖具有重要意义[3]。Crisponi L等[4,5]定位克隆了该基因,并发现FOXL2在形成小鼠的间叶细胞中和成鼠的卵巢滤泡中表达,在成年人卵巢组织中显著表达。而在2009年底Uhlenhaut N H等在《Cell》上的发表的一篇文章更进一步揭示出这个基因是参与性别发育的重要因子[6]。
a.人正常FOXL2诱饵质粒在SD /-Trp/X–Gal培养基的生长情况;b.突变FOXL2重组诱饵质粒SD /-Trp/X-α-Gal培养基的生长情况;c.人.正常FOXL2重组诱饵质粒在SD /-Ade/ -Trp培养基的生长情况;d. 突变FOXL2重组诱饵质粒SD /-Trp/X-α-Gal培养基的生长情况。
a:The growth status of recombinant bait plasmid of pGBKT7-normal FOXL2 on SD /-Trp/X–Gal plate; b: The growth status of recombinant bait plasmid of pGBKT7- mutational FOXL2 on SD /-Trp/X–Gal plate; c: The growth status of recombinant bait plasmid of pGBKT7-normal FOXL2 on SD /-Ade/ -Trp plate; d:The growth status of recombinant bait plasmid of pGBKT7- mutational FOXL2 on SD /-Ade/ -Trp plate.
FOXL2包含一个100个氨基酸的DNA forkhead 结合域,3个α-螺旋形成的螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix)结构,两侧各一个环状的“翼”,即“forkhead”区或“wing-helix”区,其DNA结合区大约跨越15～17bp,呈非对称结构。此外,FOXL2还包含一个功能尚未阐明的聚丙氨酸肽段[7]。
聚丙氨酸肽段的确切功能尚未被阐明,可能在眼睑和卵巢的发育及维持的功能中起重要的作用。有研究者认为,聚丙氨酸肽段与转录因子的活性调节有关。研究发现,聚丙氨酸肽段的氨基酸残基数目在哺乳动物中高度保守,如果存在聚丙氨酸肽段,其丙氨酸残基数目就一定是14个,这也是FOXL2聚丙氨酸残基数目的最适长度[8]。如果其数目发生改变,将会对蛋白产生影响。
3.2 FOXL2与BPES
小睑裂综合征又称睑裂狭小、倒转型内眦赘皮和上睑下垂综合征(blepharophimosis epicanthus in-versus and ptosis,BPES),Aon Ammon于1841年首先描述此病并指出有遗传性。Komoto于1921年首先详细描述本病。小睑裂综合征主要表现为睑裂狭小、上睑下垂、倒转型内眦赘皮,部分患者伴有眦距增宽、低鼻梁,及智力低下、发育迟缓、小头及耳畸形等。它分为两个亚型,Ⅰ型女性患者伴有卵巢功能早衰(premature ovarian failure,POF)导致不育,男性生育功能正常;Ⅱ型男女均可生育。人群中的发病率约为1/10 000。
Loffler K A等测试了FOXL2基因在鼠、鸡和红耳龟胚胎卵巢中的表达,提出FOXL2是脊椎动物卵巢发育中的一种高度保守的早期调控因子,并认为BPES的卵巢功能异常可能是由于胎儿期卵巢发育的早期调控异常引起的,而不是出生后或者成人卵巢早熟后发生的退化[9]。
近年来,研究者们通过连锁分析、定位克隆及定位分析将致病基因定位于3q23区域[10,11],并认为该区域的FOXL2 为主要的突变基因[12]。研究表明,人和小鼠的FOXL2基因氨基酸一致性>95%。FOXL2基因的表达与胚胎眼睑的发育是一致的,相关小鼠的基因表达研究表明FOXL2特异表达于卵巢组织,在视杯周围的间质表达,在发育的眼睑突出的嵴上表达最高,在晶状体纤维中也有低水平的表达。其局部表达的缺失可导致双眼睑的发育异常,就像BPES患者的临床表现一样。
De Baere E[13]等对33个先证者进行了FOXL2 突变的筛选——其中包括19个来自3个Ⅰ型BPES家系、9个Ⅱ型BPES家系、7个BPES类型难以确定的家系的患者,以及14个散发病例。研究表明,67% BPES病人存在该基因突变;Ⅰ型BPES家系该基因的突变率为100%;Ⅱ型BPES家系该基因的突变率为67%;BPES类型难以确定的家系突变率为71%;散发病例的突变率为57%。我们经查阅国内外的研究资料发现,在典型的BPES家系中,FOXL2 的突变率超过67%,是主要的致病基因。除FOXL2外,BPES尚有多个候选致病基因,但是目前真正发现有突变的确切致病基因只有FOXL2基因。
目前关于FOXL2基因的突变研究已经成为相关的研究热点。D'haene B等通过MLPA和qPCR的方法研究报道了17个FOXL2基因大小在29.8 kb～11.5 Mb之间的缺失[14]。Méduri G等的研究则发现FOXL2基因的突变会导致不同的卵巢表型的出现[15]。而最近发表的一篇相关文献则是关于小睑裂患者中发现的一个新型的缺失突变(c.340A>G, NM_023067)的功能性研究[16]。
3.3 FOXL2与酵母双杂交
目前FOXL2控制睑裂发育的目标基因尚不清楚。据推测,FOXL2很可能是控制某些基因,如TGF-α、EGFr、Inhbb、控制睁眼及睑裂的基因位点,而这些基因与其它与眼前肌发育有关的转录因子共同影响睑裂的发育,如Pax6、Bmp4、Bmp7等[17,18]。FOXL2可能参与了对胚胎早期眼睑及眼周肌肉发育过程中某些调节细胞周期的抗凋亡或促凋亡基因的调节,其具体的作用机制尚不清楚。
经计算机辅助的二级结构预测,提示FOXL2多聚丙氨酸肽段包含一个α-螺旋区,在丙氨酸丰富的区域形成α-螺旋,可能与目的基因的抑制有关[19]。有研究者提出多聚丙氨酸是两个功能域之间的可变空间,或者直接参与蛋白与蛋白的相互作用[20]。Goodman F R等推测,多聚丙氨酸的缺失可阻止正常的蛋白-蛋白相互作用或导致新的相互作用,或影响到转录因子结合到其正常的DNA域,或者对野生型蛋白产生负效应[21]。另外,多聚丙氨酸域和转录抑制域相联系,因此其丢失有可能造成正常的转录抑制域的丧失。相反,多聚丙氨酸的扩增或者可以直接干扰蛋白与蛋白的相互作用,或可能扭曲关键的二级结构。
通过基因芯片分析和定量PCR检测到118个受到FOXL2调节的靶基因,分为趋化因子(Chemokine)、细胞凋亡相关(Apoptosis-related)、蛋白酶(Protease)、信号转导(Signal transduction)、转录因子和非聚簇(Nonclustered)六大类,其中包括对80个基因的上调作用和对38个基因的下调作用[22]。
因此FOXL2可能与其他蛋白通过相互作用,共同在眼睑和卵巢的发育及维持的功能中起重要的作用。基因突变使FOXL2功能异常,或者影响了FOXL2转录因子的活性,或是影响了对目标基因的抑制,或者是干扰了蛋白与蛋白之间的相互作用,从而导致了不同表型的BPES。
酵母双杂交酵母双杂交系统[23,24,25,26]是近年来发展起来的一种研究蛋白质分子之间相互作用的实验技术平台。具有独特的优点:不仅能检测弱的、暂时的蛋白质之间的相互作用,还能识别相互作用蛋白质的基因编码,且可用于确定已知的蛋白-蛋白相互作用的特异性结合域;该技术是在转录水平上的操作,不需要分离纯化蛋白质;且酵母生长快、易操作。借此可以揭示功能上密切相关蛋白质分子之间的结构关系,为深入认识机体的生理病理分子机制提供新线索。我们设计酵母双杂交系统研究分析BPES发生发展中与FOXL2蛋白相互作用的蛋白及其作用,为进一步阐明BPES的发病机理以及为进一步的基因诊断、基因治疗提供理论依据。
载体检测 第4篇
1材料与方法
1. 1主要试剂
Trans5α,Transgen公司产品; p MD18 - T Simple载体、pc DNA3. 1载体、TRIZol试剂,Invitrogen公司产品; Ex Taq、Bam HⅠ、HindⅢ、T4连接酶、反转录试剂盒,Ta KaRa公司产品; 质粒小提 试剂盒 ( Star Prep Plasmid Mimiprep Kit) ,Gen Star公司产品; 胶回收试剂盒和无内毒素质粒小提试剂盒,Omega公司产品; 脂质体转染试剂,TIANGEN公司产品; 免疫荧光检测相关试剂、兔抗Myo D一抗、Cy3标记的羊抗兔二抗、 FITC标记的羊抗兔二抗,Trans公司产品。
1.2小鼠肌肉组织总RNA的提取及反转录
取性成熟ICR小鼠( SCXK: J2007 - 0003) 肌肉组织,采用常规方法提取总RNA后,根据反转录试剂盒使用说明书的反应条件及体系进行反转录。
1.3引物的合成与MyoD基因的扩增
利用NCBI获取Myo D相关序列,并通过Primer Premier 6. 0软件设计上游 ( Myo D - 1 ) 、下游引物 ( Myo D - 2) ,在上游和下游引物分别引入HindⅢ和Bam HⅠ酶切位点; Myo D - 1和Myo D - 2引物序列分别为5' - AAGCTTCACGGCTTGGGTTGAGGC - 3' 和5' - GGATCCTACGGTGGTGCGCCCTCT - 3'。引物由博仕公司合成。
利用获得的Myo D - 1 /Myo D - 2引物对上述小鼠总RNA反转录获得的c DNA进行PCR扩增,以期获得长度为1 030 bp的目的片段。PCR反应体系 ( 25 μL ) : c DNA模板2 μL ( 100 ng ) ,d NTP ( 2. 5 mmol/L) 1. 5 μL,Ex Taq Buffer( 10 × ) 2. 5 μL, 上、下游引物各1 μL,Ex Taq酶0. 25 μL,dd H2O 16. 75 μL。PCR反应条件: 94 ℃ 预变性3 min; 94 ℃ 变性30 s,60 ℃ 退火45 s,72 ℃ 延伸1 min,共34个循环; 72 ℃ 再延伸10 min。将上述PCR产物胶回收后,与p MD18 - T Simple载体连接,转化Trans5α 感受态细胞,挑出单克隆进行摇菌,按照质粒小提试剂盒说明书的步骤提取质粒,重组质粒经双酶切及PCR扩增鉴定后将阳性质粒送交博仕公司测序。将测序鉴定正确的重组质粒命名为Myo D - p MD18 - T Simple。
1.4真核表达载体的构建
对测序鉴定正确的重组质粒Myo D - p MD18 - T Simple进行HindⅢ和Bam HⅠ双酶切,凝胶电泳后回收约1 030 bp的目的片段,并与HindⅢ和Bam HⅠ双酶切后的pc DNA3. 1载体约5 400 bp进行连接,转化,摇菌,提取质粒,酶切及PCR鉴定后送交博仕公司测序,将测序鉴定正确的重组质粒命名为Myo D pc DNA3. 1。
1.5小鼠成纤维细胞的转染
根据无内毒素质粒小提试剂盒说明书的步骤提取Myo D - pc DNA3. 1无内毒素 质粒; 取胎龄为13. 5天的小鼠胚胎成纤维细胞培养并传代,当细胞达到90% 汇合时,采用脂质体法转染Myo D - pc DNA3. 1无内毒素质粒。
1.6MyoD基因的相对表达量的测定
在Myo D - pc DNA3. 1转染小鼠胚胎成纤维细胞后的第48小时,按照TRIZol Reagent说明书提取小鼠胚胎成纤维细胞总RNA,利用反转录试剂盒对总RNA进行反转录,以获得c DNA; 根据Gen Bank中的Myo D基因序列,通过引物设计网站Primer - BLAST设计实时定量PCR引物,上游引物( q - Myo D - 1) 和下游引物( q - Myo D - 2) 序列分别为5' - CCGCTACATCGAAGGTCTGC - 3' 和5' - CTGTAGTAGGCGGTGTCGTA - 3'。根据SYBR Premix Ex Taq试剂盒说明,分别以转染前后的细胞c DNA为模板,以 β - actin作为内参基因,用Q - PCR的方法检测Myo D的相对表达量。PCR反应完成后,进行熔解曲线分析以验证PCR产物的特异性和扩增效率。结合2- ΔΔCt法[7],检测转染前后小鼠胚胎成纤维细胞中的Myo D相对表达量。
1.7转基因细胞的MyoD蛋白表达
将Myo D - pc DNA3. 1转染小鼠胚胎成纤维细胞在盖玻片上培养48 h后,采用常规免疫荧光检测方法[8]进行染色,在荧光倒置显微镜下观察转基因细胞是否发出荧光,以确定其是否表达Myo D蛋白; 此外,将在培养皿( 6 cm) 中培养的转染基因的细胞,经消化回收到离心管中,用PBS清洗2次,然后在室温下用4% 多聚甲醛固定15 min; 离心后弃液,用含有0. 5% 吐温的PBS洗3次,加入含有10% 山羊血清封闭液的兔抗Myo D一抗,36 ℃温箱中孵育120 min; 用含有0. 5% 吐温的PBS洗3次,滴加FITC标记的羊抗兔二抗,36 ℃孵育60 min; PBS洗2次; 最后,根据流式细胞仪检测细胞悬浮液方法[9],用BD Accuri C6个人型流式细胞仪测定转基因细胞表达Myo D蛋白的比率; 将转基因细胞悬液置于盖玻片上,在荧光倒置显微镜下进行观察,以检测Myo D蛋白的表达情况。
2结果与分析
2.1小鼠MyoD基因的扩增及克隆载体的鉴定
将利用Myo D - 1 /Myo D - 2引物对小鼠总RNA反转录获得的c DNA的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,结果表明,在约1 030 bp处观察到特异扩增条带,见图1。
将其回收后与克隆载体p MD18 - T Simple载体连接构建重组质粒并对其进行PCR扩增,结果表明, 在约1 030 bp处出现特异性扩增条带,见图2。
用限制性内切酶HindⅢ和Bam HⅠ对重组质粒进行双酶切,结果表明,在约3 000 bp和1 000 bp处观察到2条带,见图3。
2.2小鼠MyoD基因真核表达载体的鉴定
对重组质粒Myo D - pc DNA3. 1进行PCR鉴定, 结果表明,约在1 030 bp处观察到特异性条带,见图4。
对重组质粒Myo D - pc DNA3. 1进行双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳,结果表明,在约5 400 bp和1 000 bp处观察到2条带,见图5。
2.3小鼠胚胎成纤维细胞传代培养及其转染
采用刘欣等[10]的方法,传代培养小鼠胚胎成纤维细胞,在开始培养后的第48小时转染Myo D - pc DNA3. 1,结果见图6; 进行续培养,在开始培养后的第36小时,利用荧光倒置显微镜进行观察,可见细胞呈现与新鲜小鼠胚胎成纤维细胞相似的形态和生长特性,见图7。
2.4转基因细胞的MyoD相对表达量
以GAPDH基因为内参,采用荧光定量PCR扩增方法,检测转染和未经转染Myo D - pc DNA3. 1的小鼠胚胎成纤维细胞的Myo D基因的相对表达量,结果表明,与未经转染的细胞相比,转染Myo D - pc DNA 3. 1小鼠胚胎成纤维细胞的PCR扩增产物条带的亮度明显增高,而内参基因的表达在转染前后无变化, 见图8。
经数据分析显示,当未转染Myo D - pc DNA3. 1的小鼠胚胎成纤维细胞的Myo D基因表达量为1时, 转染的小鼠 胚胎成纤 维细胞的Myo D基因达到8. 926 ± 0. 01,见图9。
2.5MyoD蛋白表达的检测
当将Myo D - pc DNA3. 1转染小鼠胚胎成纤维细胞后进行续培养,在续培养的第48小时,对转染细胞进行染色并在荧光倒置显微镜下进行观察,可观察到细胞显示表达Myo D蛋白的明显荧光,见247页彩图10。
将转染Myo D - pc DNA3. 1的小鼠胚胎成纤维细胞用BD Accuri - C6个人型流式细胞仪进行检测时,约有93% 的转染细胞表达Myo D蛋白,见图11。
当在荧光倒置显微镜下观察转染基因的细胞时, 可观察到表达Myo D蛋白而呈现绿色荧光,见247页彩图12。
3讨论
Myo D、Myf5、Myogenic和MRF4等转录因子调节成肌细胞 分化,其中具有 碱性螺旋 - 环 - 螺旋 ( b HLH) 结构域的Myo D,作用于其他肌肉特异基因启动子区或 增强子区 而促进相 关基因的 转录活性[11]。研究证实,Myo D基因不仅能促使肌卫星细胞向成肌细胞转化,而且,能够使许多体细胞( 如成纤维细胞等) 转化为成肌细胞并使其分化为成熟的肌纤维的功能[12,13]。
载体检测 第5篇
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器
人胃黏膜上皮细胞GES-1 和人胃癌细胞SGC-7901, 大肠杆菌E.coli DH5 均由湘雅医院中心试验室保存提供。RPMI1640、胎牛血清 (FBS) 、胰蛋白酶为Invitrogen-Gibco公司产品。Trizol试剂、lipofectamine TM 2000 转染试剂为Invitrogen公司产品;明胶和嘌呤霉素为Sigma-Aldrich为公司产品。sh RNA序列、PCR检测引物、质粒小量制备、逆转录试剂盒以及PCR试剂盒均由Ta Ka Ra公司合成提供;p RNA-U6.1/Neo vector为Ambion公司产品;限制性内切酶Bam H Ⅰ、限制性内切酶Hind Ⅲ为Fermentans公司产品、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为TIAGEN公司产品;GAPAH, Fox A1 抗体, 二抗 (HRP标记的羊抗兔Ig G) 购自Abcam公司;Western Blot化学发光试剂为Amersham Pierce公司产品;6孔细胞培养板为Corning公司产品, 其他各种化学试剂均为国产分析纯产品。PCR仪为Eppendorf公司产品;测序仪为ABI公司产品。
1.2 三条sh RNA的设计和制备
1.2.1针对三个靶点
1GAACAGCTACTACGCA-GAC;2 GCACTGCAATACTCGCCTT;3 CACA-CAAACCAAACCGTCA在两端和中间加上酶切位点和Loop环, 设计sh RNA片段序列。
1.2.2 Oligo DNA片段片段合成
将合成的六条Oligo片段先稀释成100μM, 两两配对各吸5μL混在一管中, 混匀后置于PCR仪中95℃, 5 min, 室温静置20 min, 形成双链Oligo片段。然后再将双链Oligo DNA片段稀释成10μM, 插入到p RNAT-U6.1/Neo中。见图1。
1.2.3三个Fox A1 sh RNA载体的构建和鉴定
使用Bam H I和Hind III对p RNAT-U6.1/Neo载体进行酶切消化, 将上述混合的反应物置于37℃, 4 h, 经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离, 胶回收试剂盒回收纯化大片断备用。按Takara公司说明书, 将载体与插入子按照一定的比例匹配, 设置连接反应, 16℃反应过夜。将连接产物转化至感受态的DH5菌种中, 卡那霉素和蓝白斑筛选, 挑取白色阳性克隆, 摇菌、小提质粒, 经测序鉴定以确认得到的克隆序列正确, 分别命名为Fox A1-sh RNA1, Fox A1-sh RNA 2, Fox A1-sh RNA 3。
1.3 细胞培养及转染
将1×105个GES-1 细胞和SGC-7901 细胞接种至已用0.1%明胶包被过的6 孔板中, 铺板48 h后转染。细胞转染按照Lipofectamin TM 2 000 说明书操作, 所有细胞均放在37℃, 5%二氧化碳恒温培养箱中进行培养。
1.4实时荧光定量RT-PCR检测转染后GES-1细胞和SGC-7901细胞中Fox A1 m RNA的表达变化
应用Trizol试剂从GES-1 细胞SGC-7901 细胞中提取总RNA并逆转录成c DNA, 扩增内参基因18S。扩增体系与条件按照Takara公司说明书进行。Fox A1 引物序列:Foxa1 RTfor:5'-GTCAGCAACATG AACTCAGGCC-3', Foxa1RTrev:5'-GCCGGCTACTGC GCCGGGACTC-3'。18S序列:18S RTFor:5'-AAATA GCCTTTGCCATCACTGCC-3', 18S:RTRev:5'-GTTC AAGAACCAGTCTGGGATC-3'。Fox A1 的相对表达量由2-ΔΔct公式得出, 其中 ΔΔCt=ΔCt标本-ΔCt校正组= (Ct目标基因/ 标本-Ct 18S/ 标本) - (Ct目标基因/ 校正组-Ct 18S/ 校正组) 。本研究中, 我们以转染前的GES-1 细胞和SGC-7901 细胞作为校正组。
1.5 Western blotting检测转染后GES-1 细胞和SGC-7901 细胞后Fox A1 蛋白质表达水平
加入适量1×SDS裂解液, 提取转染前与转染后的GES-1 细胞与SGC-7901 细胞总蛋白, 行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳, 用兔抗人Fox A1蛋白多克隆抗体 (1∶1 000) 加在其中室温下杂交2 h, 洗膜后加入羊抗兔二抗Ig G (1∶5 000) 抗体, 室温下摇动1 h。最后显影, 定影, 进行拍照, 记录结果。
1.6 统计学处理
实验数据用SPSS12.0 统计学处理。行配对t检验, P <0.05 认为差异有显著性。
2 结果
2.1 Fox A1 sh RNA真核表达载体的构建及测序鉴定
p RNAT-U6.1/Neo载体进行酶切消化 (见图1) , 回收, 将插入子与载体酶切片段进行连接, 通过测序峰图进行核对分析, 证实插入片段为Fox A1 sh RNA DNA片段, 且无碱基突变 (见图2) , 说明sh RNA载体构建成功, 符合预期设计, 能够表达sh RNA。
M:marker;1:双酶切p RNAT-U6.1/Neo质粒;2:p RNAT-U6.1/Neo质粒
A:FOXA1-sh RNA-1;B:FOXA1-sh RNA-2;C:FOXA1-sh RNA-3
2.2 Fox A1 sh RNA对GES-1 细胞和SGC-7901细胞中Fox A1 m RNA表达的抑制作用
应用实时荧光定量RT-PCR检测转染前后GES-1 细胞和SGC-7901 细胞中Fox A1 m RNA的表达变化, 结果发现:空白对照组、空白质粒组和Fox A1 sh RNA1、Fox A1 sh RNA 2、Fox A1 sh RNA 3组总共5 组的标化Fox A1 m RNA水平在GES-1 细胞与SGC-7901 细胞中的表达水平与抑制率见附表和图3、4。
2.3 Fox A1 sh RNA对GES-1 细胞和SGC-7901细胞中Fox A1 蛋白表达的抑制作用
Western blotting检测转染前与转染后GES-1细胞和SGC-7901细胞Fox A1蛋白表达量的变化, 结果发现:在GES-1细胞和SGC-7901细胞中, 收集空白对照组、Fox A1-neo组和Fox A1 sh RNA 1、Fox A1 sh RNA 2、Fox A1 sh RNA 3组总共5组的标化细胞总蛋白, 结果均显示Fox A1 sh RNA 1、Fox A1sh RNA 2、Fox A1 sh RNA 3组蛋白表达条带比空白对照组和空白质粒组条带明显减弱, 而且, Fox A1sh RNA3比Fox A1 sh RNA 1和Fox A1 sh RNA 2条带更弱, 对蛋白表达的干扰效果更好。此与PCR结果一致, 提示Fox A1 sh RNA 2、Fox A1 sh RNA 3能显著地抑制GES-1细胞和SGC-7901细胞中Fox A1的表达。见图5、6。
1) 与空白组比较, P<0.05;2) 与空白组比较, P<0.01;1:空白对照;2:空白质粒;3:Fox A1 sh RNA-1;4:Fox A1 sh RNA-2;5:Fox A1sh RNA-3
1) 与空白组比较, P<0.05;2) 与空白组比较, P<0.01;1:空白对照;2:空白质粒;3:Fox A1 sh RNA-1;4:Fox A1 sh RNA-2;5:Fox A1sh RNA-3
1:空白对照;2:空白质粒;3:sh RNA1;4:sh RNA2;5:sh RNA3
1:空白对照;2:空白质粒;3:sh RNA1;4:sh RNA2;5:sh RNA3
3 讨论
叉头基因 (Fox head box) 是在果蝇的生物学研究中被发现并命名的一个基因家族。Fox蛋白是DNA转录调节及保护家族成员之一, 它调控着生物演化的多个关键环节。通过组蛋白去乙酰化酶的作用, Fox蛋白可以激活和抑制基因的表达, 协同或阻遏有共同能量的因素。此外, Fox蛋白质还可以通过与其他蛋白的作用与联系, 如与P53 和雌激素受体间的相互作用, 直接或间接的调节靶基因的表达进而参与部分常见的肿瘤和癌症进展因素[6]。
Fox A1 (forkhead box A1) 是Fox A翼状螺旋转录因子家族成员之一。Fox A1 能够与下游基因启动子区的Fox A1 结合元件相结合, 从而调控这些基因的表达。通过对下游基因表达的调控, Fox A1 在正常细胞的增殖和分化、肝、肺、前列腺和卵巢等器官胚胎发育以肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。人Fox A1 是一个472 个氨基酸残基组成的转录辅助因子, 包括两个外显子和一个内含子。最初发现Fox A1是因为其在肝脏发育中的作用[7]。最近, Fox A1 也被称为谱系特异性的致癌基因或肿瘤抑癌基因[8]。例如, 在胰腺癌的中, Fox A1 的丢失, 是上皮间质转化和癌症发生和发展必不可少的原因[9]。同时, 在前列腺癌中, Fox A1 通过染色体 (13q14) 缺失在前列腺癌中被观察到, 成为雄激素促进肿瘤的发生和进展的独立性因素, 并且Fox A1 的高水平表达被认为是与转移性癌密切相关因素[9]。此外, Fox A1 的过度表达和扩增也已经在食管、肺和甲状腺癌中被检测出来, 并表明该基因在这些肿瘤实体存在潜在致癌作用[10], 更多研究证实Fox A1 异常表达与乳腺癌相关, 并和雌激素受体 (ER) 有相互作用。Fox A1, 雌激素受体和雌激素组成的网络, 促进管腔乳腺癌细胞增殖和生存的同时, 防止诱导分化转移进展[11,12]。最近在肺癌的研究中显示, Fox A1 表达能显著降低鳞状细胞癌患者的生存时间。Fox A1 强阳性与肿瘤进展关系密切。因此, Fox A1 能预测鳞状细胞癌患者预后情况[13,14]。但是Fox A1 在胃癌中的研究国内外尚未见报道, Fox A1 在胃癌的发生和发展中的作用并不十分清楚。前期本实验室在关于Fox A1 基因的相关研究发现, 免疫组化实验中Fox A1 基因在正常胃组织与高分化胃腺癌组织中明显高表达, 而在中分化与低分化胃腺癌组织中相对低表达, 差异具有显著性。利用RNAi技术特异沉默GES-1 细胞和SGC-7901细胞中Fox A1 基因的表达, 进一步进行GES-1 细胞和SGC-7901 细胞的相关生物学特性研究, 将有助于了解Fox A1 基因在胃癌的发生和发展中所起的作用。
RNAi现象最先由FIRE和MELLO等人提出[1], 是一种转录后基因调节手段, 其机制是双链RNA (double strand RNA, ds RNA) 被核酸酶切割成小干扰RNA (short interfering RNA, si RNA) , si RNA作为RNAi作用发生的重要中间效应分子介导识别并特异性切割同源的靶m RNA序列。该现象被认为可能是生物界普遍存在的一种非常保守和重要的防御机制, 它最显著的特点是高效性和特异性。有研究表明, 少数的si RNA即可诱发RNAi作用[1]。此外, 即使是与靶m RNA之间一个碱基的不匹配也能引起干扰效率的显著下降[15]。RNAi技术被越来越多的应用到研究工作当中, 如基因功能研究、基因治疗等。应用RNAi技术沉默靶基因的表达, 将有助于笔者进行靶基因功能以及靶基因相关下游基因等研究。本研究旨在构建有效的针对Fox A1 基因的干扰载体, 有助于了解Fox A1 基因在胃癌的发生和发展中所起的作用, 并为今后研究Fox A1 在肿瘤基因治疗中奠定基础。
载体检测 第6篇
细胞内趋化因子策略[5]是通过载体导入细胞趋化因子基因及编码定位于内质网等亚细胞器的定位信号短肽, 其在细胞器内提前与细胞内对应的受体蛋白相结合, 以产生阻断受体分子学生物功能的“表型剔除”效应。此策略在防治HIV病毒感染T淋巴细胞及造血干细胞研究上[5]有一定的意义。
野生型SDF-1的在肿瘤微环境中具有致炎作用[6], 笔者曾构建原核表达载体系统, 通过对SDF-1α进行定向遗传改造以消除其受体激活功能、保留或增强其受体结合功能, 开发CXCR4人源性的、无不良反应的SDF-1α突变体拮抗剂。产生了一种具有高结合活性并命名为SDF-1α/54的蛋白, 但此拮抗剂对体外培养细胞的CXCR4的抑制作用短暂可逆, 并在一定的时间和浓度范围内反而使CXCR4回复性增高, 故蛋白水平的作用效果受限[7]。因此, 使用新的策略持续性抑制CXCR4的表达就十分必要。本实验拟借鉴细胞内趋化因子策略, 采用腺病毒表达载体表达细胞内趋化因子突变体SDF-1α/54/KDEL, 并在体外观察因其转染肿瘤细胞而对CXCR4表达的影响, 为进一步的体内外相关实验提供基础。
1 材料和方法
1.1 材料
DH5α、pc DNA3.1/SDF-1、p Ad Track-CMV、Adeasy-1质粒、低代人胚肾HEK293 (简称293) 细胞、不含插入SDF-1α/54/KDEL基因的空病毒Ad Null由中山大学药学院分子生物学实验室保存;人乳腺癌细胞株MCF-7由中山大学医学院实验动物中心惠赠;MTT、DMSO、胎牛血清、DMEM购自GIBICO公司;质粒提取纯化和胶回收试剂盒购自OMEAGA公司;脂质体Lipofectamine2000、TRIZOL、Oligo (d T) 购自Invitrogen公司;T4 ligase、Bam HI、Xho I及Pme I、PacⅠ购自TAKARA公司;质粒纯化试剂盒和胶回收试剂盒由QIAGEN公司生产;PE标记的抗CXCR4单克隆抗体及同型对照购自BD公司;卡拉霉素为Sigma公司产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
293及MCF-7细胞在DMEM培养液 (含100m L/L胎牛血清, 100U/L青霉素, 100U/L链霉素) 中, 于37℃、5%CO2条件下按常规方法培养。
1.2.2 目的基因的扩增
按照引物设计的一般原则用Primer5.0设计引物, SDF-1α/54/KDEL上游引物:5’-ACACTCGAGATGAAGCCCGTCAGCCTGAGCTACAGAT-3’, 下游引物为5’-CCGGGATCCTAGAGCTCGTCCTTCTTCGGGTCA ATGCACAC-3’, SDF-1α/KDEL上游引物为5’-ACACTCGAGATGAAG CCCGTCAGCCTGAGCTACAGAT-3;下游引物为5’-CCGGGATCC TAGAGCTCGTCCTTCATCTTGAACCTCTTGTT-3’, 引物由赛百盛公司合成。扩增片段长度分别为174和228bp, 上、下游引物分别引入Xho I和Bam HI酶切位点, 并在下游引物引入编码内质网定位片段KDEL的基因序列, 以抽提的质粒pc DNA3.1/SDF-1为模板, 进行PCR反应, 反应条件为:94℃预变性3min, 94℃变性30s, 52℃退火30s, 72℃延伸30s, 共30个循环, 最后72℃5min;1%琼脂糖凝胶电泳分析结果;PCR产物经质粒纯化试剂盒纯化。
1.2.3 穿梭质粒构建
用XhoI和BamHI分别对上述 (实验组SDF-1α/54/KDEL和对照组SDF-1α/KDEL) 纯化产物和质粒pAdTrack-CMV同步双酶切。1.5%琼脂糖凝胶电泳回收目的片段, 经PCR纯化试剂盒纯化后, 用T4DNALigase连接。连接产物转化DH5α感受态细菌胞, 并通过含卡拉霉素 (50μg/mL) 的LB平板筛选出带有重组质粒的细菌。然后以菌液为模板, 用腺病毒载体通用引物进行扩增以筛选出带有目的片段的细菌, 用小量抽提试剂盒抽提质粒得到重组质粒pAdTrack-CMV-SDF-1α/54/KDEL和p AdTrack-CMV-SDF-1α/KDEL, 送上海博亚生物技术有限公司测序。
1.2.4 重组腺病毒构建
将测序正确的重组穿梭载体 (pAdTrack-CMV-SDF-1α/54/KDEL和pAdTrack-CMV-SDF-1α/KDEL) 和空质粒 (pAdTrack-CMV) 分别用PmeI进行线性化, 凝胶回收后, 分别转化E.coliBJ5183感受态细胞 (含病毒质粒AdEasy-1) ;用含卡那霉素 (50μg/mL) 的LB平板筛选带有同源重组质粒的E.coli BJ5183, 抽提质粒, PacI酶切鉴定;同源重组成功的质粒, 用腺病毒通用引物进行PCR扩增, 以确定重组质粒是否带有目的片段;之后用质粒大抽试剂盒分别于含有同源重组质粒 (AdSDF-1α/54/KDEL、AdSDF-1α/KDEL) 的菌液进行质粒大量抽提;而后取同源重组质粒5μg, 用3μL的PacI进行线性化, 然后用PCR纯化试剂盒进行纯化, 将纯化产物质脂体Lipofectamine 2000转染融合度达到50%～70%的293细胞;待细胞大部分飘浮, 用滴管把剩下贴壁的细胞吹起, 收集细胞, 离心, 弃掉上清, 加入1mL PBS, 重悬细胞, 然后移到1.5mLEP管中;在-70℃冰箱与37℃水浴反复冻融细胞4次, 12000g离心10min, 收集上清, 即为原代病毒上清。
1.2.5 RT-PCR检测
选择培养接种重组病毒后的293细胞至100%发生病变时用TRIzol抽提总RNA, 以Oligo (d T) 为引物进行反转录以合成c DNA;以1μLc DNA为模板, 以SDF-1α/54/KDEL和SDF-1α/KDEL各自的特异引物进行PCR检测。PCR扩增的反应体系为:5μL10×Buffer, 4μL10mmol/L dNTP, 上下游引物 (10μmol/L) 各1μL, 1μL Taq DNA聚合酶, 补加水到50μL。反应条件为:94℃预变性4min;94℃10s, 52℃10s, 72℃5s, 共28个循环;72℃延伸5 min。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳。
1.2.6 重组腺病毒的滴度测定
用24孔板接种293细胞, 按10倍稀释倍数稀释病毒液, 每一稀释倍数设3个复孔, 分别取100μL实验组和对照组病毒液加入293细胞培养瓶中, 于37℃、5%CO2细胞培养箱孵育30min后, 弃旧培养液, 加入新鲜的DMEM完全培养基, 继续培养20h, 弃培养液, 于荧光显微镜下计数培养板内发绿色荧光的细胞, 按公式计算病毒滴度 (PFU/mL) =发绿色荧光的细胞数×病毒稀释倍数÷0.1。
1.2.7 重组腺病毒的毒性测定
将贴壁生长融合的MCF-7细胞用0.25%胰酶消化后吹打成单细胞悬液, 其浓度调整为 (0.4-0.8) ×105/mL, 接种加有完全培养基于96孔培养板内, 每孔100μL, 在37℃、5%CO2饱和湿度条件下过夜。AdNull空病毒组和AdSDF-1α/54/KDEL、AdSDF-1α/KDEL分别加入1μL不同浓度的重组腺病毒, 使病毒感染单位 (MOI值) 分别为0～200, 阴性对照组加入1μL PBS, 每组设3个平行孔, 并设DMEM完全培养基调零孔, 置培养板于孵箱孵化育2h。每孔加入10μL MTT (5mg/mL) , 继续培养4h, 倾去培养液, 每孔加入100μL DMSO溶解, 用微量振荡器摇振15min, 以测定波长490nm, 参考波长450nm于酶标仪上测定其吸光度。实验重复3次, 绘制细胞生长曲线, 细胞生长增殖抑制率 (%) = (1-病毒感染组细胞OD值/对照组细胞OD值) ×100%。
1.2.8 重组腺病毒转染MCF-7细胞后的CXCR4表达检测
AdSDF-1α/54/KDEL和AdSDF-1α/KDEL分别感染MCF-7细胞5d后, 用PBS (加0.5%BSA) 冲洗3次, 1000r/min, 离心5min, 然后用PBS稀释至细胞数1×106/mL, 取25μL转移至进行抗体封闭, 再加入PE标记的抗CXCR4单克隆抗体及IgG5各20μL, 低温避光反应30min, 用4mL PBS洗涤2次, 流式细胞仪检测CXCR4分子表达情况。
1.2.9 统计学处理
实验数据资料用均数±标准差 (χ—±s) 表示, 采用单因素方差分析, P<0.05为统计学差异有显著性, P<0.01为差异极显著。
2 结果
2.1 重组腺病毒AdSDF-1α/54/KDEL的构建
以本室已构建并鉴定的重组真核表达质粒pcDNA3.1/SDF-1为模板, 扩增出目的基因片段SDF-1α/54/KDEL及对照SDF-1α/KDEL, 可见PCR产物条带分别为174和228bp, 与预计大小相符 (图1) 。
1:DNA marker (DL2000) ;2:阴性对照;3:SDF-1α/54/KDEL;4:SDF-1α/KDEL
穿梭质粒pAdTrack-CMV-SDF-1α/54/KDEL和pAdTrack-CMV-SDF-1α/KDEL经XhoI和BamHI双酶切后出现各自对应的174和228bp条带, 测序鉴定结果与Gene Bank一致;pAdTrack-CMV-SDF-1α/54/KDEL和腺病毒基因组质粒Adeasy-1进行同源重组后, 用PacI酶切鉴定可见23和3.0kb (图2) 两条带。
1:AdTrack-CMV-SDFα/54/KDEL;2:DNA Marker (DL10kb) ;3:Adeasy-1
2.2 重组腺病毒AdSDF-1α/54/KDEL的包装
线性化的pAdTrack-CMV-SDF-1α/54/KDEL和pAdTrack-CMV-SDF-1α/KDEL分别用脂质体介导转染293细胞, 培养24h后, 可观察到实验组转染孔细胞呈现明亮绿色荧光 (图3B) 。继续培养3～12d后, pAdSDF-1α/54/KDEL和pAdSDF-1α/KDEL分别与转染293细胞, 产生重组腺病毒AdSDF-1α/54/KDEL和AdSDF-1α/KDEL (AdNull作空白对照) , 和病毒致细胞病变效应 (CPE) 。重组病毒已包装完成 (图4) 。
A:转染前的293细胞;B:pAdSDF-1α/54/KDEL转染后的293细胞
A:正常293细胞;B:重组腺病毒AdSDF-1α/54/KDEL感染3d后293细胞的形态变化
2.3 AdSDF-1α/54/KDEL的RT-PCR鉴定
提取重组腺病毒AdSDF-1α/54/KDEL转染293细胞的总RNA进行RT-PCR检测, 用特异性引物可扩增出约174bp大小的片段 (对照组AdSDF-1α/KDEL为228bp, 图5) , 表明SDF-1α/54/KDEL在293细胞中能够正确转录。
1, 2:未转染的293细胞;3:Marker (DL2000) ;4, 5:AdSDF-1α/KDEL转染的293细胞;6, 7:AdSDF-1α/54/KDEL转染的293细胞
2.4 重组腺病毒扩增与滴度测定
对经筛选和鉴定正确的重组腺病毒进行滴度测定, 用终点稀释法计算出重组腺病毒AdSDF-1α/54/KDEL (对照AdSDF-1α/KDEL) 滴度为6.0×109 PFU/L, MOI为100时的感染效率为80%。
2.5 重组腺病毒的毒性检测
与对照组相比AdSDF-1α/54/KDEL对MCF-7细胞的增殖抑制率<3%, 且差异无显著性意义。MOI在200以内, 随MOI值的增加重组腺病毒AdSDF-1α/54/KDEL及AdSDF-1α/KDEL对MCF-7细胞增殖无影响 (图6) 。
2.6 重组腺病毒转染MCF-7细胞后的CXCR4表达检测
分别用MOI为100的重组腺病毒AdSDF-1α/54/KDEL和AdSDF-1α/KDEL感染MCF-7细胞5d后, 用荧光显微镜观察细胞内的绿色荧光素蛋白的表达情况, 选择生长良好的细胞3次重复进行流式细胞仪检测。结果为感染5d后, 平均荧光强度下降了72%, CXCR4阳性细胞率下降了99% (图7) 。结果表明:AdSDF-1α/54/KDEL和AdSDF-1α/KDEL对MCF-7细胞表面的CXCR4具有表型剔除作用, 无组间差异, 且这种抑制作用时间较真核表达载体延长。
A:高表达CXCR4的阳性细胞对照租;B:转染AdSDF-1α/54/KDEL的MCF-7细胞;C:转染AdSDF-1α/KDEL的MCF-7细胞
3 讨论
1988年, Baltimore在Nature上提出细胞内免疫的概念。目前细胞内免疫概念已发展成为应用细胞内免疫策略抑制多种病毒或肿瘤抗原的表达的综合免疫方案, 其中以细胞内抗体 (intrabody) 和intrakine策略的基因治疗研究居多, 二者具有许多相似点。
趋化因子SDF-1是具有趋化效应的蛋白质, 其与靶受体的结合活性与天然配体十分接近。与抗体相比其无Fc段, 不易为具有Fc受体的细胞结合或吞噬;细胞内趋化因子还可以避开胞外产生的免疫应答反应, 因为多数会被内质网内部捕获形成复合物, 最后被内质网内部控制机制分解。由于趋化因子较小并由机体本身细胞分泌或者表达, 不具备抗原异物性的特点, 故不产生免疫排斥。这些优势使之可成为合适的基因治疗候选工具。
通常在趋化因子的N端加亚细胞器定位信号和C端加滞留信号肽即可形成细胞内趋化因子, 它能将趋化因子带入细胞的某一亚细胞器。4肽KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) 是一个内质网滞留/诱捕信号, 已用于大量的研究中。内质网是细胞内趋化因子和胞内抗体最通常使用的亚细胞器。在大多数情形下, 蛋白质分泌途径是单向的, 蛋白质在内质网合成, 转运到高尔基体, 然后进行分泌。实际上还存在一条由高尔基体到内质网的逆向途径, 此途径是高度选择性和紧密调节的, 以防分泌蛋白的回流和维持高尔基体的结构。有证据表明, ERD2 (内质网定位缺陷受体, 是ER捕获信号的重要功能分选受体) 在COS-1细胞过表达, 极大提高了DDEL耦联的蛋白在内质网滞留而且, 用KDEL或者DDEL信号共表达使ERD2在ER的积累而不是使之在高尔基体定位[5]。
因此, 可以利用基因治疗的病毒载体和非病毒载体技术, 将趋化因子的编码基因导入到靶细胞内实现基因治疗。常用的病毒载体有腺病毒及腺相关病毒、单纯疱疹病毒和逆转录病毒载体。其中腺病毒载体具有以下特点:不整合入细胞基因组, 毒性低、致病性小, 宿主范围广;对分裂及非分裂期细胞均有较高的感染效率和滴度, 装载容量大。已广泛用于基因治疗研究[8], 且已被美国FDA批准作为基因治疗载体应用于临床试验。
重组腺病毒载体的产生可以将外源基因整合进入腺病毒基因组是一关键环节。本实验将质粒间同源重组放在生长周期快、操作方便的大肠杆菌细胞内进行, 经酶切鉴定后可直接获得基因组结构, 明显缩短了病毒的操作时间, 提高了效率。具有如下优点:同源重组效率提高, 并且方便酶切鉴定;增加了目的基因导入腺病毒基因组的效率和准确性;因腺病毒基因组中含有绿色荧光蛋白基因, 便于直接观察转染和感染的效率, 使实验可靠和准确;该系统使用的是人的腺病毒属和人的宿主细胞系故其能表达多种蛋白质并能正确进行翻译后的修饰和折叠。因此, 用这样产生的病毒可以不用空斑纯化就能获得含目的基因的腺病毒, 从而大大减少了复制活性病毒的产生。在构建含SDF-1α/54/KDEL基因的腺病毒过程中, 通过标记的荧光蛋白的指示, 能充分观察到含目的基因的腺病毒基因组转染293细胞的情况, 在7d观察到大量293细胞脱落、溶解等形态学变化, 与文献报道的一致。
本实验利用重组腺病毒系统通过细菌内同源重组法成功构建了表达Ad SDF-1/54/KDE基因的重组腺病毒 (不含编码人SDF-1αC末端第55～67位氨基酸残基的碱基 (α-螺旋结构域) , 保留其N端和β片层结构。本次所构建的重组腺病毒能够有效表达SDF-1α/54/KDEL基因。重组细胞内趋化因子突变体无细胞毒性并可以显著降低肿瘤细胞表面CXCR4的功能性表达, 达到表型剔除的目的, 从而阻断因SDF-1趋化产生的肿瘤细胞定向转移, 产生的重组腺病毒滴度为并6×109PFU/m L, 能够满足进一步的体内外研究的需要。研究结果将为探究以CXCR4为靶点的乳腺癌等多种肿瘤的基因治疗提供实验依据和参考。
摘要：目的构建含有人趋化因子突变体SDF-1α/54及内质网定位肽段KDEL基因细胞内趋化因子突变体的重组腺病毒表达载体, 并在体外探讨对CXCR4的作用。方法以质粒pcDNA3.1/SDF-1为模板, 通过PCR扩增获得SDF-1α/54/KDEL基因全长序列。PCR产物回收后经酶切, 定向插入腺病毒穿梭质粒, 获得重组质粒pAdTrack-CMV-SDF-1α/54/KDEL。通过酶切、PCR及插入片段测序鉴定, 将正确重组体pAdTrack-CMV-SDF-1α/54/KDEL转化E.coliBJ5183并进行细菌内同源重组, 然后筛选阳性克隆, 提取质粒, 将此重组腺病毒质粒分别进行酶切、线性化、纯化, 用脂质体Lipofectamine2000介导转染293细胞。制备AdSDF-1α/54/KDEL病毒上清并测定其滴度, 将病毒上清转染293细胞, 应用RT-PCR分析SDF-1α/54/KDEL的表达。重组病毒感染MCF-7后, MTT法检测其细胞毒性;流式细胞仪检测重组腺病毒对肿瘤细胞表面CXCR4表达的影响。结果通过细菌内同源重组法构建了含SDF-1α/54/KDEL目的基因的重组腺病毒载体AdSDF-1α/54/KDEL, RT-PCR鉴定表明经重组腺病毒转染的293细胞可有效转录SDF-1α/54/KDEL, 证实其在293细胞中高效表达并产生6×109PFU/mL的重组腺病毒;AdSDF-1α/54/KDEL处理的乳腺癌细胞, MOI在200以内无细胞毒性对细胞生长生长无影响, 但能显著降低肿瘤细胞表面CXCR4的表达量。结论本次构建的细胞内趋化因子突变体重组腺毒表达载体AdSDF-1α/54/KDEL的构建成功, 并具有对乳腺癌细胞系MCF-7具有表型剔除作用。
关键词：细胞内趋化因子,趋化因子受体4,基质细胞衍生因子1,腺病毒
参考文献
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[4]Müller A, Homey B, Soto H, et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis[J].Nature, 2001, 410 (6824) :50-56.
[5]Wheeler YY, Chen SY.Intrabody and intrakine strategies for molecular therapy[J].Mol Ther, 2003, 8 (3) :355-366.
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[7]Tan Y, Du J, Cai S, et al.Cloning and characterizing mutated human stromal cell-derived-1 (SDF-1) :C-terminal alpha-helix of SDF-1plays a critical role in CXCR4 activation and signaling, but notin CXCR4 bingding affinity[J].Exp Heatol, 2006, 34 (11) :1153-1162.
载体检测 第7篇
关键词：多巴胺受体D2,启动子区,单核苷酸多态性,荧光素酶活性
近年来,地震、台风、泥石流等自然灾害越来越常见,交通意外、各种局部战争和恐怖袭击也不断涌现,经历这些创伤性事件而引起的创伤应激障碍综合征(post-traumatic stress disorder,PTSD)也逐渐成为常见病和多发病[1]。研究发现,PTSD具有遗传易感性,但遗传机制不清。目前,随着分子生物学技术的发展、人类基因组计划的不断深入、各国脑科学计划的提出和实施,为揭示PTSD等多基因疾病的遗传易感性及其分子机制提供了可能。
多巴胺是人体内不可缺少的神经递质,在调节认知、记忆、运动及情绪等多种生物学功能中起着十分关键的作用,目前认为,多巴胺信号通路相关分子的基因改变与多种精神类疾病的遗传易感性相关。多巴胺受体D2(DRD2)是最常见的一种多巴胺受体,广泛分布于大脑的多个部位。研究证实,DRD2基因的多个多态性位点与PTSD、抑郁症、精神分裂症等精神类疾病的遗传易感性相关[2,3,4,5,6],是预测PTSD等精神类疾病遗传易感性的重要候选基因。本课题组前期通过生物信息学分析发现DRD2基因启动子区-350 bp位点的A/G多态性可能改变与转录因子SP1的结合能力,从而可能影响DRD2基因的转录;且通过Pubmed文献检索,目前尚无关于rs1799978多态位点对PTSD遗传易感性及其生物学功能研究的相关报道。基于此,本研究通过定基因工程技术分别构建含-350bp G/A多态位点的启动子区荧光素酶表达载体,并探索该多态性位点对DRD2基因转录活性的影响,为后续研究该多态性位点与PTSD易患性的临床相关性及相应的分子机制提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验试剂
经过改造的pmirGlo-promoter质粒(以pmirGlo为母本载体,去掉5094～5609 bp段Human phosphoglycerate kinase promoter,引入源自pAdTrack-CMV的多克隆酶切位点,改造后的pmirGlo-promoter质粒具有BglⅡ、SalⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ4个单克隆酶切位点可用),由重庆金麦生物有限公司单佑安博士赠予;海肾荧光素酶表达质粒pRL-SV40和双荧光素酶报告基因试剂盒为Promega公司产品;质粒提取试剂盒、全血基因组DNA提取试剂盒为北京天根生物技术有限公司产品;高保真DNA聚合酶、胶回收试剂盒、T4DNA连接酶购于Takara公司(大连);限制性内切酶BglⅡ、XhoⅠ购自NEB公司;脂质体Lipofectine2000TM为Invitrogen公司产品;DMEM、胎牛血清等细胞培养试剂购自Gibco;细胞系HEK293由本实验室保存;感受态细胞E.coli DH5α由本科室自行保存;本试验设计的所有PCR引物均由上海生物工程有限公司合成;PCR产物和质粒测序均由Takara公司(大连)完成。
1.2 方法
1.2.1 荧光素酶报告基因重组表达载体的构建及鉴定
提取人全血基因组DNA,然后经核酸定量仪定量并调整浓度至50ng/μL,分装后置于-70℃冻存备用。根据人DRD2基因组序列NC-000011.9设计并合成4条扩增DRD2启动子区序列及-350 bp位点突变的引物。rs 1799978-1:5′-GAAGATCTGGGCCTGGTTTTCT TTCTGTGTGTG-3′下划线为上游加的BglⅡ酶切位点及保护碱基;rs 1799978-2:5′-CCGCTCGAGCCGG CTGCTTGAGGC ITCC-3′下划线为下游加的XhoⅠ酶切位点及保护碱基;rs 1799978-Ml:5′-CACCCAGA GTAACAAGCTGTGATTGCAG-3′;带下划线的碱基为-350bp处;rs1799978-M2:5′-CTGCAATCACAGCTTGT-TACTCTGGGTG-3′,带下划线的碱基为-350 bp处。首先以提取的基因组DNA为模板,用rs1799978-1与rs1799978-2为上下游引物,经PCR反应扩增,25μL反应体系,扩增程序为:98℃退火5 min,98℃30s,57℃30 s,72℃1 min 30 s,35个循环,最后72℃延伸10 min。DRD2基因启动子区序列(-1000～+168 bp),然后将PCR扩增片段经1.5%的凝胶电泳,如果扩增片段在1100 bp左右则用胶回收试剂盒回收目的片段,然后用T4 DNA连接酶将回收的目的片段连入至PTA2载体中,送Takara生物技术有限公司测序鉴定PCR扩增片段的序列是否正确。如果PCR扩增的目的片段序列与GenBank上DRD2基因序列一致,则用限制性内切酶BglⅡ及XhoⅠ双酶切PTA2-rs1799978,并将酶切回收的目的片段经T4DNA连接酶连入同样经BglⅡ及XhoⅠ双酶切回收pmirGlo-promoter空载体中,再将连接产物转化入感受态DH5α中,挑取阳性克隆震荡培养过夜、提取重组质粒,然后用BglⅡ及XhoⅠ双酶切鉴定重组质粒pmirGlo-promoter-A构建是否成功。含突变位点的目的片段扩增则以PTA2-rs1799978质粒为模板,以rs1799978-l和rs1799978-M1为上下游引物进行PCR反应,扩增663 bp(-1000～-338 bp);以rs1799978-2和rs1799978-M2为上下游引物进行PCR反应,扩增533 bp(-365～+168 bp);然后再以这两次的PCR产物的混合物为模板,以rs1799978-1和rs1799978-2为上下游引物,进行融合PCR反应,扩增出-350 bp位点突变为G的目的片段(-1000 bp到+168、-350 bp位点处为G),然后将融合PCR反应扩增出的目的片段经凝胶电泳及胶回收处理后连入至PTA2载体中,送Takara公司测序鉴定-350 bp处的序列突变是否成功。然后重复pmirGlo-promoter-A载体构建及鉴定的步骤,最终得到定点突变的重组质粒pmirGlo-promoter-G。
1.2.2 重组荧光素酶表达载体的转染
用常规细胞培养试剂复苏、培养HEK293细胞,经过几次细胞传代,待细胞处于对数生长期时将细胞传入48孔板,置于37℃、5%CO2孵育箱中继续培养,当细胞融合度为80%左右时,按照Lipofectine 2000TM脂质体转染试剂盒说明书,将海肾荧光素酶报告基因质粒pRL-SV40与重组质粒pmirGlo-promoter-A和pmirGlo-promoterG分别共转染至HEK293细胞,设3个重复孔,转然后48 h后收集细胞,立即采用双荧光素酶报告基因系统检测荧光强度(相对荧光素酶活性)。
1.2.3 双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性
从细胞培养箱中取出培养48 h的48孔板,弃去培养基,每孔细胞先用PBS洗2次,然后每孔加入200μL细胞裂解液(passive lysis buffer,PLB),室温放置于水平摇床上用120 r/min、摇15 min以使细胞充分裂解。收集细胞裂解液,同时用移液器上下吹打数次以充分混匀细胞裂解液,将细胞裂解液转移至1.5 mLEP管中,冰浴放置10 min。4℃15 000 r/min离心5 min以去除细胞碎片,将上清即细胞裂解液再移至一新的1.5 mL EP管中,置于冰上备用。严格按照双荧光报告系统检测试剂盒说明书在化学发光仪上检测Firefly和Renilla的荧光强度,最后以二者比值(F/R)为校正后的结果,每个样品重复检测3次,取其平均值。
1.3 统计学方法
采用统计软件SPSS 17.0对数据进行分析,正态分布计量资料以均数±标准差表示,用单因素ANOVA分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 DRD2基因-350 bp多态位点的启动子区荧光素酶报告基因表达载体的构建及鉴定
以人全血基因组DNA为模板,rs1799978-1与rs 1799978-2为上下游引物进行PCR反应扩增,取扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后,将凝胶放于凝胶扫描仪中观察,可见泳道1中对应1000 bp的条带上面有一条非常明显的DNA条带,与预期的1168 bp大小相符,说明该条带可能为所需的目的片段(图1A)。将该片段通过T4连接酶连入到PTA2测序载体中,经测序鉴定后证实该片段序列与GeneBank上DRD2基因序列一致(图3)。然后分别以rs1799978-1和rs1799978-Ml、rs1799978-2和rs1799978-M2、rs1799978-1和rs1799978-2为上下游引物进行PCR和融合PCR,分别扩增出663、533、1168 bp的目的条带(图1B、C)。将经胶回收和内切酶BglⅡ和XhoⅠ双酶切后的含rs1799978 A和rs1799978 G的PCR产物与报告基因空载体pmirGlo-promoter用T4连接酶连接,然后经转化、克隆及双酶切鉴定(图2)、测序(图3)等步骤证实重组荧光素酶报告基因载体pmirG-lo-promoter-A和pmirGlo-promoter-G构建成功。
A:以人全血基因组DNA为模板,rs1799978-1和rs1799978-2为上下游引物的PCR产物,M:DL2000,1:PCR产物;B:分别以rs 1799978-1、rs1799978-Ml和rs1799978-M2、rs1799978-2为上游引物扩增的PCR产物,M:DL2000,1:以rs1799978-1、rs1799978-Ml为上下游引物扩增的PCR产物,2:以rs1799978-M2、rs1799978-2为上下游引物扩增的PCR产物;C:以B的两种PCR产物混合物为模板,rs1799978-1和rs1799978-2为上下游引物的融合PCR产物,M:DL2000,1:融合PCR产物
M1:DL2000;1:pmirGlo-prmoter-A重组荧光素酶表达载体双酶切M2:DNAI 5000;2:pmirGlo-promoter-G重组荧光素酶表达载体双酶切
2.2 荧光素酶报告基因转录活性的测定
将重组荧光素酶表达载体pmirGlo-Promoter-A和pmirGlo-promoter-G及pRL-SV40共转染HEK293细胞,48 h后收集细胞,裂解后在化学发光仪进行荧光素酶活性检测,以F/R比值作为结果。结果显示,转染pmirGlo-promoter-G质粒的细胞裂解液的相对荧光素酶活性活性显著高于转染pmirGlo-promoter-A质粒的细胞裂解液[(0.0480±0.0004)比(0.0380土0.0005),P=0.000]。见图4。
3 讨论
PTSD是指个体由于经历各种突发性、威胁性或灾难性事件而出现并长期持续存在的一类精神障碍,其主要表现为患者极度恐惧、害怕、无助感,且持续时间超过1个月,给患者、家庭、甚至整个社会都带来重大的影响。目前,通过家系调查、双生子研究、实验动物模型等多种方法研究证实,PTSD具有遗传易患性,也通过大量的临床关联研究,筛选出了不同种系人群中,可能与PTSD易患性相关的候选基因及其多态性位点,主要是神经递质及其代谢相关的基因,如5-羟色胺转运体、5-羟色胺受体、多巴胺受体等。
DRD2是脑内主要神经递质多巴胺信号通路的重要成员,DRD2基因位于1 1号染色体上,长度65.8 kb,由8个外显子与7个内含子组成,编码含415个氨基酸残基的蛋白质,属于G蛋白偶联受体家族[7]。目前临床上所用的多种抗精神类药物都属于DRD2拮抗剂类,说明DRD2在多种精神疾病的发生发展过程中有非常重要的作用。大量的研究结果证实,PTSD的遗传易感性与DRD2基因多态性有关。研究最多、最早发现的基因多态性是3′端非翻译区中的Taq限制性片段长度多态性(rs1800497)。Comings等[8]研究后发现DRD2 Taq1A1多态性位点与PTSD的发生具有临床相关性。另一个经常报道的多态性位点是位于启动子区-141位点的胞嘧啶的缺失/插入突变(-141C del/ins)基因多态性(rs1799732)。研究发现,该多态性位点可使DRD2蛋白表达水平下降[9];且-141C插入突变频率在日本及北欧人群中的PTSD患者较高,但在英国PTSD患者及对照组中却无显著性差异[10],这种互相矛盾的结果可能是由于人群的种族不同所致,另外PTSD患者选择方法以及对照人群不同等都可能出现有争议的结果。位于DRD2基因编码区第7外显子的两种同义突变His313及Pro319多态性也常见报道。研究发现,编码PrO319基因的单核苷酶多态时可降低mRNA的稳定性而导致其后续的翻译效率下降,并证实该多态性位点影响PTSD的遗传易感性[11].此外,最新研究显示,DRD2基因957C/T的多态性与PTSD相关[12]。目前,虽然证实了DRD2受体的多个多态性位点与包括PTSD在内的精神类疾病的遗传易感性有关,但其具体的分子机制还不是特别清楚,可能与多态性位点改变了DRD2基因的mRNA稳定性、蛋白合成,受体密度及其与多巴胺的结合能力等,从而对疾病的易感性改变。