液相色谱质谱联用法

液相色谱质谱联用法（精选12篇）

液相色谱质谱联用法 第1篇

1 仪器与试药

美国Waters液相色谱联用质谱系统,2690型液相色谱配备自动进样器,系统控制等单元,ZQ单级质谱检测器,配有电喷雾离子化源(ESI)以及Masslnxy3.5质谱工作站,Mettler Toledo AL-204电子分析天平,TGL-16G台式离心机,HY-4多用调速振荡器,GL-88B旋涡混合器。

非索非那定对照品:由广州市医药工业研究所提供,含量为98.5%;苯乙双胍对照品:由中国药品生物制品检定所提供,含量为99.5%;甲醇为色谱纯,醋酸铵及其他试剂均为分析纯,水为重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件和质谱条件

2.1.1 色谱条件

色谱柱:Thermo C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相由乙腈及30 mmol/ml NH4Ac(含0.1%甲酸和0.01%三氟乙酸)组成,分流比为1∶3,柱温为35℃,进样量为10μl。采用梯度洗脱程序,各段时间内流动相比例、变化曲线及其流速的变化,见表1。

2.1.2 质谱条件

离子源为电喷雾离子源(ESI+源),毛细管电压为3.00 kV,鞘气(N2)压力为13.00 V,二级锥孔电压为4.20 V,聚焦电压为0.0 V,离子源温度为100℃,脱溶剂温度为280℃,鞘气流速为60 L/h,去溶剂气流速为400 L/h。

2.2 非索非那定对照品和内标溶液的制备

精密称取盐酸非索非那定14.50 mg,置于50 ml量瓶中,加入甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得290.00μg/ml盐酸非索非那定储备液,换算成非索非那定浓度为176.87μg/ml,然后逐步稀释,得到一系列浓度的标准溶液。精密称取苯乙双胍15.90 mg,置于50 ml量瓶中,加入甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得318.00μg/ml内标储备液。

2.3 血浆样品的处理

精密加入血浆样品0.15 ml于离心管中,加入8.56μg/ml苯乙双胍内标溶液10μl,振荡10 s,加入乙腈0.4 ml,涡旋2 min,超声5 min,离心10 min(9 500 r/min)。转移上清液,进样10μl分析。

2.4 色谱行为

在上述条件下,非索非那定出峰时间在12.0 min左右,内标出峰时间在8.7 min左右,非索非那定和内标峰形均良好,无杂峰干扰,基线平稳。提示本方法具有较高的特异性,内源性杂质对药物和内标的测定无干扰,见图1。

2.5 血浆中非索非那定标准曲线及定量下限的测定

取“2.2”项下配制的非索非那定对照品溶液适量,置于一定量的空白血浆中,充分振荡混匀,配制血浆中含非索非那定分别为2.26、4.50、11.00、45.10、90.20、225.46、676.46 ng/ml的标准系列浓度,然后按“2.3”项下方法操作,记录色谱图,记下非索非那定峰和内标峰面积。以非索非那定峰和内标峰面积比值f(f=As/Ai)对血药浓度(C)作回归曲线,得回归方程:f=0.000 830 291C+0.004 045 27(r=0.999 6)。定量下限浓度为2.26 ng/ml,RSD为0.7%。

2.6 准确度与精密度试验

配制含非索非那定低、中、高三个浓度(4.50、45.10、225.46ng/ml)的质量控制样品,按“2.3”项下操作,每一浓度平行操作5份,代入回归方程计算浓度,以测得值与加入值的比值计算回收率。每一浓度平行操作5份,记录色谱图,记下峰面积,计算其比值并代入相应标准曲线,求得日内精密度。连续3天配制并测定上述浓度样品,考察日间精密度。方法的回收率均在85%~115%之内,日内、日间RSD均小于15%,符合药物动力学研究的方法学要求。见表2。

2.7 提取回收率

取空白血浆及非索非那定对照品溶液,配制含非索非那定低、中、高三个浓度(4.5,45.1,225.5 ng/ml)的质量控制样品,按“2.3”项下操作,每一浓度平行操作5份,另取相同量标准品溶液,以水代替血浆,按“2.5”项下操作,作为对照样品,以每一浓度两种处理方法的峰面积比值来评价提取回收率,结果非索非那定在4.5、45.1、225.5 ng/ml的回收率分别为96.0%、95.2%、101.5%,RSD分别为9.7%、9.7%、2.8%;内标提取回收率为98.6%,RSD为5.1%。

2.8 稳定性试验

取非索非那定对照品溶液适量加入空白血浆中配制相当于含非索非那定低、中、高三个浓度(4.50、45.10、225.46 ng/ml)的质控样品各3份,分别于室温条件下放置0、2、4、8、24 h,4次冷冻(-20℃)-解冻(室温)循环,再于-20℃存放0、10、20、30、40 d,然后按上述方法测定,计算非索非那定的浓度。试验结果显示所有室温放置试验、冰冻和冻融试验的测定值的RSD均小于15%,说明分析测试过程中的样品较为稳定。见表3。

2.9 质量控制试验

受试者血浆样品非索非那定的测定在分析方法证实完成之后进行。在样品测定的同时插入高、中、低浓度的非索非那定质控样品(4.50、45.10、225.46 ng/ml),根据质控样品的测定结果(准确度)评判该批样品的测定数据是否可被接受。共测试了6批样品,结果质控样品的RSD均在15%之内。

3 讨论

本试验经过摸索,确定了直接用乙腈沉淀去蛋白的LC-MS/MS法测定血浆中非索非那定的含量,所用血样量少,蛋白沉淀率近100%,表明该血样处理方法相对文献报道[6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20]具有操作更简便、重复性好、应用性更强的优势。

采用LC-MS/MS法来测定血浆中非索非那定浓度,非索非那定和内标物苯乙双胍在ESI离子化方式下,主要生成[M+H]+准分子离子峰,选择性地对准分子离子峰[M+H]+进行二级质谱分析,将非索非那定和内标物苯乙双胍生成的主要碎片离子作为定量分析时监测的产物离子,预处理简单,血浆中杂质不干扰样品和内标物的测定,样品稳定性良好,所建立的方法精密度及准确度均能符合药物(化学药品)制剂人体药动学研究的方法学要求。

液相色谱质谱联用法 第2篇

研究液相色谱-电喷雾质谱联用(LC-ESI MS)测定蚌类水产品中微囊藻毒素的`分析方法.背角无齿蚌(Anodonta woodiana)样品经正丁醇、甲醇及水混合溶剂提取,反相硅胶固相萃取柱净化后,采用正离子检测模式的LC-ESI MS方法进行分析测定.以乙腈-水-甲酸(体积比38:62:0.1)为流动相,经Symmetry C18色谱柱(2.1×150 mm,3.0 μn)分离.采用选择离子监测m/z 520.3(MC-RR)、1 046.1(MC-YR)、996.9(MC-LR)及1 156.4(胰岛素,内标)分子离子峰进行定量分析.线性定量范围0.02～20μg,蚌干粉检出限为0.01μg/g.此方法准确、灵敏度高、专属性好,可作为食品安全风险评价和监测环境污染的分析方法.

作 者：虞锐鹏 陶冠军 贡小清 秦方 杨健 边学森 YU Rui-peng TAO Guan-jun GONG Xiao-qing QIN Fang YANG Jian BIAN Xue-seng 作者单位：虞锐鹏,陶冠军,贡小清,秦方,YU Rui-peng,TAO Guan-jun,GONG Xiao-qing,QIN Fang(江南大学,食品科学与技术国家重点实验室,江苏,无锡,214122)

杨健,YANG Jian(中国水产科学研究院,淡水渔业研究中心,江苏,无锡,214081)

边学森,BIAN Xue-seng(南京农业大学,无锡渔业学院,江苏,无锡,214081)

液相色谱质谱联用法 第3篇

关键词：液相色谱-质谱联用仪 应用 维护

中图分类号：TH83 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）02-0086-03

色谱-质谱联用技术，结合色谱及质谱的技术，是目前分离和鉴定的最重要的分析方法之一。其中液相色谱-质谱仪应用更为广泛，液相色谱除了能分析一般的化合物，还能分析气相色谱不能分析的强极性、热不稳定性、难挥发的化合物。液相色谱质谱仪有着分离能力强、分析范围广、定性分析结果准确、分析时间快、自动化程度高、检测限低等诸多优势，在药物、食品等多领域得到了广泛的应用[1]。液相色谱质谱仪由色谱仪、接口、质谱仪、电子系统、记录系统和计算机系统六大部分组成.是一种高端的检测仪器，仪器的良好工作状态是检测准确度的一个重要影响因子。为了保证仪器有一个良好的状态，保证检测结果的可靠性，需要正确合理的使用和维护仪器。下面以安捷伦6400系列质谱仪为例，从仪器进样系统、色谱柱系统、质谱系统等各个系统的日常维护保养进行详细阐述，并对使用过程中容易遇到的问题进行分析，提出解决方法。

1 液相部分的维护

1.1 开机注意事项

使用安捷伦6400系列质谱仪时，要求使用220V单相交流电。如发生断电，不管任何原因造成的，首先关闭仪器面板左下角的开关，等待供电恢复10分钟以上再开启电源，否则有可能烧毁电路板。仪器运行时需提供纯度>99%的氮气作为喷雾与干燥气，输出压力为0.6～0.7MPa。实验开始前先检查液氮罐液体存量是否充足。仪器开机时，确认电源已经连接而且气振阀处于关闭，打开仪器总电源，随后将前面板左下方的电源按键按下，真空泵即开始工作。大约2～3分钟后，仪器内置的系统启动完毕，可以开启Masshunter软件与仪器通讯。等待四极杆温度达到100℃，高真空达到4x10-5Torr之后，即可进行调谐或开始实验。在仪器开始抽真空时，请不要打开前级泵上的气振阀，否则可能因为回油污染真空腔体内部[2]。

1.2 流动相的要求

每次开机前，保证超纯水和流动相的新鲜，泵的各个管路不应余留上次残留的溶剂。流动相需符合HPLC与LC/MS要求等级，流动相中尽量加易挥发的盐，尽量不使用表面活性剂之类，否则容易导致离子抑制，表面活性剂产生的加合物和离子簇会干扰质谱数据。如果遇到离子抑制，可以把样品峰往后推或者改变提取方法，或者考虑用APCI源。尽量不使用无挥发性的缓冲剂，例如磷酸缓冲剂等，磷酸盐及其他不挥发缓冲盐在离子源会沉淀并堵塞毛细管等。另外液质不能承受过大流速。溶剂瓶避免阳光直射。

1.3 样品的要求

保证样品的清洁，进样前尽量使用0.22μm的滤膜滤过，避免样品太脏而堵塞色谱柱或离子源的毛细管；样品溶剂必须是色谱纯，最好和流动相比例一致；进样浓度不宜太高，因为太高浓度的样品容易污染灵敏度高的仪器，进而影响检验结果。由于液质的流速较小（ESI一般为0.2ml/min），所以配置样品的溶剂强度不能太大，尽量小于起始比例，否则，会出现保留时间偏移、峰形扭曲等问题。

2 进样系统的维护

对于液相色谱来说，无论是手动进样还是自动进样，都是使用六通阀进样的。进样装置要求：密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小样。六通阀使用和维护注意事项：①样品溶液进样前必须用0.45μm滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损。②转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力；再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏。③为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗。注意：溶剂入口过滤芯为消耗品，尤其不可以使用超声清洗，可以使用稀硝酸浸泡，然后用水冲洗至中性，以重复使用。

3 色谱柱系统的维护

色谱柱系统的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题：①色谱柱的选择会直接影响混合物中组分的分离，所以一定要选用合适的色谱柱，在使用新柱前要在自己的液相色谱仪上进行性能测试，即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效，并且在以后的使用中，应时常对色谱柱进行测试。②柱子在使用过程中，不能碰撞、弯曲或强烈震动；避免压力和温度的急剧变化，机械震动和温度的突然变化都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行。③当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净，样品前处理对于柱子使用寿命影响甚大，进样样品要提纯过滤并且严格控制进样量，可以使用保护柱。④注意色谱柱的PH值使用范围，不能高温下过长时间使用硅胶键和相；每天分析工作结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱子。若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭。

4 质谱部分的维护

质谱部分的维护一般可以按照以下日程进行：每天冲洗样品通路、清洁喷雾式；每周检查粗真空泵油的液面；更换粗真空泵油，检查软管、软线和电缆，清空排污瓶可以每半年进行一次；另外在日常的试验中，根据试验需要清洁机壳，更换喷雾针，清洁或更换整个毛细管、分离器及透镜。重要的是每天冲洗系统和清洁喷雾室。毛细管和第一级锥孔要尽可能洁净。6个月更换机械泵油，需要时更换电子倍增器。

4.1 锥孔的清洁维护

定期清洗一级锥孔，一般两周清洗一次，若进样数量较大，则尽量一周清洗一次，根据样品数量多少及时清洗。清洗时将离子源温度降到室温，注意关闭阻断阀，旋开固定锥孔的两个螺丝，取下锥孔滴甲酸数滴，浸润几分钟，在甲醇：水为50∶50溶剂中超声清洗15分钟，切记：避免手触碰到锥孔尖以免影响灵敏度。长期进行一级锥孔的清洗，可相应减少较为复杂的二级锥孔、六级杆等的清洗，这些清洗相对复杂，在进行相关部件清洗时避免用棉花等擦拭关键部位，避免残留的毛绒纤维干扰仪器的灵敏度。

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4.2 粗真空泵的维护

真空泵包括需油的回转泵及无油的涡旋泵，真空泵需注意观察润滑油是否出现浑浊或缺油的情况，及时更换润滑油。泵的油面宜在2/3处，泵长期运作时每周需要拧开灰色震气阀按钮进行半小时震气，使油内的杂物排出，油雾过滤器中的油放回到泵中，然后再拧紧该旋钮，如果发现油的颜色变深或液面降至1/2以下，需及时更换并保存更换记录，注意专油专用；无油涡旋泵，也需定期维护，一般半年到一年时更换叶端密封，每天需要震气。

4.3 其他附属设备维护

①每天实验完成之后，使用1：1异丙醇-水溶液清洗或擦洗离子源。注意清洗离子源时请勿将溶液喷入毛细管入口。②当电喷雾喷针被堵塞，针尖破损或观察到偏离轴的喷射时，就需要更换或调整。③检查毛细管，铂金涂层变透明时需要更换，注意检查毛细管时需要放真空，毛细管两端的铂金涂层不能用砂纸打磨，6410/6420的毛细管可以用清洁丝清洗法或者清洗粉末超声清洗。注意毛细管单次超声时间不能超过15分钟。④数据系统，需定期备份硬盘数据，进行归类整理。定期重新启动机器，将内存区域导入闪存，保证数据系统的稳定。

5 仪器调谐

仪器距离上次调谐超过一个月，或者重新开机预热后，建议调谐质谱仪以达到最佳使用状态。确认调谐液存量、调谐液有效期，以及管线已连接到喷雾针之后，选择Masshunter的Tune界面，选择适当的极性，点击Autotune，系统会自动完成调谐并给出调谐报告。通过调谐报告，可以检查背景信号。如果有较高的背景信号，可能的原因是氮气、喷雾针、离子源或者毛细管较脏。定期做质量轴的校准工作，一般宜6个月校准一次。注意短时间内温度的急剧变化，其会影响质量轴的偏离。

6 常见色谱故障

6.1 压力过高

压力过高的原因有很多，但总体来讲就是一个原因，管路堵塞。所以当出现压力高时候就要分段来检查哪一段发生堵塞，检查柱子进口过滤芯是否被污染，PURGE阀过滤芯是否被污染或色谱柱被污染，检查管路，尤其是针座毛细管，检查进样器旋转密封阀或者进样针及针座有否堵塞。

6.2 压力过低

压力过低总体来讲一个原因就是漏液问题，可能是管路泄露或者泵头密封垫老化，主动阀、四元出口阀或单向出口阀失灵，另外还要考虑是否色谱柱失效造成固定相流失、溶剂或者流速的改变等因素。注意压力传感器之前的某些部件地方堵塞也会造成压力过低[3]。

6.3 压力波动

液相泵的压力波动可以从ripple值看出，1200/1260一般ripple值小于2%。如果液相泵的压力不稳定，会影响质谱TIC基线的稳定，并呈规律性变化。造成压力波动最常见的原因就是泵内有气泡。

综上所述，液相色谱质谱仪联用仪器的工作人员，在熟练掌握仪器操作的基础上，应了解各个组成部分的性能，在日常使用中累积经验，从小处着手做好日常维护保养工作。如此，才能保证仪器的良好状态，最大程度的降低使用维护成本，确保分析结果的准确可靠性，并能降低仪器耗损率，延长使用寿命。

参考文献

[1]向同寿.色质联用仪真空系统维护经验点滴[J].分析测试技术与仪器，2001，7（4）： 252-253.

[2]盛龙生，苏焕华，郭丹滨.色谱质谱联用技术[M].北京：化工出版社，2006：65.

[3]吴方迪，张庆合.色谱仪器维护与故障排除[M].北京：化学工业出版社，2011：196.

液相色谱质谱联用法 第4篇

关键词：液相色谱,质谱,非法制剂,布洛芬

布洛芬是一种临床常用的非甾体抗炎药物, 具有比较理想的解热、抗炎、镇痛的作用, 价格由于比较便宜, 疗效比较确切, 常用在风湿和类风湿关节炎的治疗上。目前, 由于经济利益的驱使有一些不法分子, 将布洛芬掺入到一些纯中药制剂或者保健品以及所谓的祖传秘方中, 用于经营、销售以获得非法利益。很多消费者在不知情的情况下服用这些药物, 虽然在短期内会取得显著的效果, 但由于布洛芬长期服用也会对身体造成一系列的危害, 所以严重影响了人民的生命安全。为了更好的消除这些不法商贩的侥幸心理, 保证人民的临床用药安全, 本文采用液相色谱-质谱联用法对非法制剂中的布洛芬进行了准确、快速的检测, 现报告如下:

1 仪器和试验药品

使用的液相色谱仪为日本岛津生产的LC-20AT;质谱联用仪为美国AB生产的API-3200;对照品为中国药品生物制品检定所生产布洛芬[1];检验对象为一种河南省生产的标有“纯中药-风湿病的克星”等字样的非法生产药品;色谱纯为乙腈;使用用水为自制的超纯水;其它的试剂全部为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件。

使用的色谱柱为Venusil MP C18柱, 规格为150毫米*4.6毫米;流动相为醋酸铵-乙腈, 醋酸铵浓度为0.01mol每升, 含有百分之一的三乙胺, 使用冰醋酸调节PH值到3.5[2];流速为1.0毫升每分钟;柱温为三十摄氏度;检测的波长为263纳米;进样量为10 L。

2.2 质谱条件。

使用电喷雾化的检测方式;质荷比为50-500;离子源温度为500摄氏度;离子源喷雾电压为5.0千伏;使用的雾化气为10升每分钟的高纯度氮气;气帘气为10升每分钟的压缩空气;加热用辅助气为10升每分钟的高纯度氮气[3];碰撞能量为30伏;去簇电压为65伏;锥孔电压为10伏;进行全扫描一级质谱法, 选择离子进行全质谱的检测方式。

2.3 溶液的制备。

进行精密称取适量的对照品布洛芬, 加入流动相使之充分溶解, 然后稀释到成为3.0克每升的溶液, 此为对照品的储备液;进行精密量取储备液5毫升, 放置到25毫升的量瓶内, 加入适量流动相使之充分溶解, 然后稀释到刻度线, 摇动量瓶使之均匀, 此为对照品的溶液。取检测药品10粒, 现继续精密称定, 然后将胶囊内的内容物倒出后混匀, 再从中精密称取一粒检测药品的量放置到50毫升的量瓶中, 进行超声溶解10分钟, 后放置恢复到室内温度, 再用流动相将其稀释至量瓶刻度线处, 摇动量瓶使之均匀, 用10000r每分钟的高速离心速度进行离心10分钟, 取上清液, 此为供试品的溶液[4]。

2.4 考察方法

2.4.1 标准曲线的绘制。

精密从对照液储备液5份, 分别为1毫升、3毫升、5毫升、7毫升、10毫升, 分别放置在25毫升的量瓶中, 再加入流动相稀释到刻度线, 摇晃均匀, 用色谱条件进行检测, 用质量浓度作为横坐标, 以峰面积为纵坐标, 进行线性回归分析。

2.4.2 精密度试验。

对同一对照品, 反复进样6次, 每次10 L, 布洛芬的面积RSD是0.37%。

2.4.3 加样回收试验。

取检测样品10粒, 倒出内部颗粒, 混合均匀后, 精密称取样品半粒的重量, 放置到50毫升的量瓶中, 精密称取对照品储备液3毫升、5毫升、6毫升, 分别加入这些量瓶中, 测量含量, 计算出回收率, 回收率详见表1。

2.5 样品检测。

将对照品溶液以及供试品溶液分别10 L, 加入液相色谱检测仪中进行测定, 测得要检测供试品的溶液内含有布洛芬的含量为21毫克每粒;再分别精密量取供试品溶液以及对照品溶液各1毫升, 放置到100毫升的量瓶内, 加入流动相至量瓶刻度, 摇晃均匀, 再取照品溶液以及供试品溶液各5 L, 用液相色谱-质谱联用仪进行正离子检测, 对对照品的溶液进行多分应监测和质谱分析, 结果发现, 供试品的溶液产生了和对照品溶液一致的离子碎片。所以可以通过以上信息和结论得出, 检测对象“纯中药-风湿病的克星”等字样的非法生产药品中含有非法添加的布洛芬。

3 讨论

目前市面上出现的这些添加西药成分的非法药物制剂多为复杂的多种成分药物, 所以在进行监督检测时, 存在很大的困难, 所以让非法分子存在侥幸心理, 也对药品检测工作提出了很高的要求。本文采用液相色谱-质谱联用方法对非法制剂中的非法添加物布洛芬进行检测。选用色谱柱Venusil MP C18柱, 以醋酸铵含量为0.1mol每升和乙腈作为流动相, 使用液相色谱-质谱联用法对非法制剂提取液进行分析, 与对照品的色谱和紫外以及质谱的行为相比较, 定量测定、定性鉴别非法制剂中的布洛芬。发现检测对象“纯中药-风湿病的克星”等字样的非法生产药品中含有非法添加的布洛芬。这种检测方法具有比较强的灵敏性和选择性, 可以作为对非法制剂中布洛芬检验的一种分析方法。也同时这类严重危害人民健康的非法行为提供了十分有利的证据, 让这种行为得到应有的法律惩罚。

参考文献

[1]薛洪源, 刘军, 王宇奇, 贺文涛, 贾丽霞.高效液相色谱-质谱法测定人血浆中布洛芬浓度[J].华北国防医药, 2007, 19 (6) :51-53.

[2]郑妍, 杜健, 高琳.液相色谱-质谱联用法检测非法制剂中的布洛芬[J].中国药业, 2011, 20 (5) :32-33.

[3]张西如, 姜建国.液相色谱-质谱联用法检测药品非法添加布洛芬[J].中国实用医药, 2008, 3 (18) :63-64.

液相色谱质谱联用法 第5篇

建立了尿液中克伦特罗和沙丁胺醇同时测定的GC-MS方法. 尿液在碱性条件下以异丁醇提取后, 用Waters Oasis MCX小柱净化, 吹干后用BSTFA进行硅烷化衍生, 采用GC-EI-MS法, 选择离子方式采集数据. 结果表明, 克伦特罗和沙丁胺醇的线性范围为0.002～1.00 mg/L, 相关系数分别为0.9993和0.9985, 方法检出限可达0.5 μg/L (S/N=10). 尿液中克伦特罗和沙丁胺醇的回收率分别为75.9%～89.2%和73.6%～89.5%, 相对标准偏差(RSD)均不大于10%.

作 者：张雪曼 程雪梅 苏青云 ZHANG Xue-man CHENG Xue-mei SU Qing-yun  作者单位：东莞市农业检验监测所,东莞,523007 刊 名：分析试验室  ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF ANALYSIS LABORATORY 年，卷(期)：2007 26(2) 分类号：O657.6 关键词：克伦特罗   沙丁胺醇   GC-MS   动物尿液  

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液相色谱质谱联用法 第6篇

瘦肉精是指能够促进瘦肉生长的一类药物的统称，主要包括：盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等肾上腺素受体激动剂。猪摄入瘦肉精后能加速生长、降低脂肪沉积、提高瘦肉率、提高饲料报酬，但猪食用瘦肉精后会在组织内形成残留，人类食用后直接危害人体健康。2002年农业部、卫生部和国家药品监督管理局联合发文，将盐酸克伦特罗和莱克多巴胺一同列入《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》（中华人民共和国农业部公告 第176号）。

2008年以来，国内就多次发生由于猪肉中高浓度的瘦肉精导致的中毒事件。莱克多巴胺过量摄取会引起神经兴奋，出现肌肉振颤、心慌、头疼、恶心、呕吐、甚至心脏骤停致昏迷死亡等症状，特别对心律失常、高血压、青光眼、糖尿病和甲状腺机能亢进等患者有极大危害。所以对猪肉中的莱克多巴胺含量进行检测很有必要。

1.试验部分

1.1主要仪器与试剂

1.1.1仪器

Agilent 6460高效液相色谱质谱联用仪

J2Scientific Preplinc AS4全自动固相萃取仪

1.1.2试剂

莱克多巴胺，纯度97.0%

乙酸铵（0.2mol/L）：称取7.7g乙酸铵，加水溶解并稀释至500mL，用乙酸调pH至5.2

β-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶

高氯酸（0.1mol/L）：称取14.35g 70%高氯酸，加水稀释至1000mL

氢氧化钠溶液（10mol/L）：称取400g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1000mL

甲酸水溶液：2%

甲醇-0.1%甲酸溶液（10：90）

1.2仪器工作条件

1.2.1色谱条件

色谱柱：Agilent SB-C18 50mm×2.1mm×1.8?m 流速：0.4ml/min

柱温：40℃ 进样体积：2?l 流动相：A0.1%甲酸水 B 0.1%甲酸乙腈

梯度 时间（min） %A %B

0 92 8

1 92 8

5 60 40

8 92 8

1.2.2质谱条件

干燥气温度：350℃ 干燥气流速：5L/min 雾化气压力：45psi

鞘气温度：400℃ 鞘气流速：12L/min

待测物 MRM通道（m/z） Fragmentor（V） Collision Energy（V）

莱克多巴胺 320.2>164.0 90 15

莱克多巴胺 320.2>107.1 90 25

1.3试验方法

1.3.1工作曲线

准确移取莱克多巴胺标准工作液，用流动相稀释成浓度分别为2，4，8，16，40?g/L的莱克多巴胺标准溶液，供高效液相色谱质谱分析。以莱克多巴胺为横坐标，离子峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.2样品的预处理

准确称取2.00g测试样品于50ml离心管中，加入0.2mol/L乙酸铵溶液（pH=5.2）8.0ml，再加入β-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶40?l，涡旋混匀，于37℃下避光水浴振荡16h酶解后放置至室温，10000r/min高速离心10min，倾出上清液于另一50ml离心管内，加入0.1mol/L高氯酸溶液5ml，涡旋混匀，用高氯酸调pH至1.0，10000r/min高速离心10min后，将上清液转移至另一50ml离心管内。用10mol/L氢氧化钠溶液调pH至9.5，加入乙酸乙酯15ml，涡旋混匀，并振荡10min，5000r/min离心5min，取出上层有机相至另一50ml离心管内。再在下层水相中加入叔丁基甲醚10ml，涡旋混匀，并振荡10min，5000r/min离心5min，合并有机相，50℃下氮气吹干，用2%甲酸水溶液5ml溶解，經全自动固相萃取仪萃取、净化，最后用甲醇-0.1%甲酸溶液（10：90）0.2ml溶解，供高效液相色谱质谱联用仪测定。

1.3.3测定

将仪器调至最佳测定条件，设定标准系列各点浓度及试样质量、定容体积、稀释倍数。待仪器稳定后依次测定标准空白溶液、标准系列、样品空白溶液、样品溶液。

2.结论

采用高效液相色谱质谱法建立了猪肉中的莱克多巴胺含量的检测方法。样品中残留药物经酶解后，再高速离心去蛋白，用乙酸乙酯和叔丁基甲醚提取，固相萃取、净化，经Agilent SB-C色谱柱分离，梯度洗脱，外标法定量。经实际样品检测的试验，该方法稳定、准确，适合于肉制品中莱克多巴胺的日常检测。

（作者单位：马鞍山市产品质量监督检验所）

作者简介

液相色谱质谱联用法 第7篇

本文对国家标准《可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定液相色谱-串联质谱法》 (GB/T 20756-2006) 和仪器自带的方法进行比较分析, 以期为提高水产品检验质量, 保障水产品安全性提供参考。结果表明, 两种方法检测结果差异无统计学意义 (P>0.05) , 线性相关密切。仪器自带方法检测具有易操作, 省时省力的优点, 可在对水产品中氯霉素类药物残留检测中加以推广应用, 样品加标回收率为81.5%~105.5%。

实验部分

实验材料和设备

实验材料:选取天津市市售水产品进行加标实验。

实验仪器:超高效液相色谱仪于三重四极杆质谱仪, 具体配置为输液泵, 在线脱气机, 自动进样器, 柱温箱, 系统控制器等。

水产品中氯霉素的液相色谱条件

分析仪器:LC-30A系统;色谱柱:Shimadzu Shim-pack XR-ODSⅢ2.0mm I.D.×50 mm L., 1.6μm;流动相:A为水, B为乙腈;流速:0.4 m L/min;进样体积:10μL;柱温:40℃;洗脱方式:梯度洗脱, B相初始浓度为30%, 时间程序见表1。

样品制备

标准溶液配制:用甲醇配制10 mg/L的氯霉素混合标准中间溶液, 用甲醇-水溶液 (V/V, 50∶50) 稀释成0.2、0.5、1、5、10、50μg/L和100μg/L不同浓度的混合标准工作液。

样品前处理:称取5.00 g试样至50 m L离心管中, 加入25 m L乙酸乙酯, 在均质器中以14 000 r/min均质30 s, 以4 000 r/min离心5 min, 上层乙酸乙酯提取液收集于50 m L平底烧瓶中, 残渣加入20 m L乙酸乙酯, 重复上述操作, 合并提取液;45℃减压旋转浓缩至干, 残留物用1 m L甲醇-水溶液 (V/V, 50∶50) 溶解, 再加3.0 m L正己烷混合, 并转移至10 m L比色管中, 涡动混合30 s;以4 000 r/min离心2 min, 弃去上层正己烷, 移取下层, 经0.22μm微孔滤膜过滤后, 用液质分析。

结果分析

线性关系

将浓度为0.2、0.5、1、5、10、50μg/L和100μg/L氯霉素标准工作液, 按1.2中的分析条件进行测定, 以浓度为横坐标, 峰面积为纵坐标, 外标法制作校准曲线, 如图1所示, 氯霉素线性良好。线性方程、线性范围和相关系数见表2。国家标准法氯霉素线性如图2所示。

基质加标实验

按1.3中样品制备方法, 样品中添加混合标样, 加标含量见表2, 各平行4次。测试结果显示, 水产品加标回收率在81.5%~105.5%, 见表2。

结论

液相色谱质谱联用法 第8篇

1 材料

美国Waters液相色谱联用质谱系统,2690型液相色谱配备自动进样器,系统控制等单元;ZQ单级质谱检测器,配有电喷雾离子化源(ESI)以及Masslnxy3.5质谱工作站。Mettler Toledo AL-204电子分析天平;TGL-16G台式离心机;HY-4多用调速振荡器;GL-88B旋涡混合器。

非索非那定对照品:由广州市医药工业研究所提供,含量为98.5%;伪麻黄碱对照品:由广州市医药工业研究所提供,含量:95.8%;苯乙双胍对照品:由中国药品生物制品检定所提供,含量:99.5%;甲醇:色谱纯,美国TEDIA公司出品;醋酸铵:分析纯,上海化学试剂厂出品;其他试剂均为分析纯;水为重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件和质谱条件

(1)色谱条件:色谱柱:Thermo C1 8柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相由乙腈及30mmol/mL醋酸铵(含0.1%甲酸和0.01%三氟乙酸)组成,采用梯度洗脱程序,各段时间内流动相比例、变化曲线及其流速的变化见表1;分流比:分流1∶3注入质谱;柱温:35℃;进样量:10μL。(2)质谱条件:离子源:电喷雾离子源(ESI+源),毛细管电压:3.00kV,鞘气(N2)压力(V):13.00V,二级锥孔电压:4.20V,聚焦电压:0.0V,离子源温度:100℃,脱溶剂温度:280℃,鞘气流速:60L/h,去溶剂气流速:400L/h。

2.2 非索非那定对照品、伪麻黄碱对照品和内标溶液的制备

精密称取盐酸非索非那定对照品14.50mg,置于50m L量瓶中,加入甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得290.00μg/m L盐酸非索非那定的储备液,换算成非索非那定浓度为176.87μg/m L,然后逐步稀释,得到一系列浓度的标准溶液。精密称取盐酸伪麻黄碱10.50mg,置于50m L量瓶中,加入甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得盐酸210.00μg/m L盐酸伪麻黄碱的储备液,换算成伪麻黄碱浓度为176.87μg/m L。精密称取苯乙双胍对照品15.90mg,置于50m L量瓶中,加入甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得318.00μg/m L内标储备液。

2.3 血浆样品的处理

精密加入血浆样品0.15mL于离心管中,加入8.56µg/mL苯乙双胍内标溶液10µL,振荡10s,加入乙腈0.4mL,涡旋2min,超声5min,于9500r/min离心10min。转移上清液,进样10µL分析。

2.4 色谱行为

在上述条件下,非索非那定出峰时间在12.0min左右,伪麻黄碱出峰时间在7.2min左右,内标出峰时间在8.7min左右,非索非那定、伪麻黄碱和内标峰形均良好,无杂峰干扰测定,基线平稳。本方法具有较高的特异性,内源性杂质对非索非那定、伪麻黄碱和内标的测定无干扰,见图1～2。

2.5 血浆中非索非那定、伪麻黄碱标准曲线制备及定量下限测定

分别取“2.2”项下配制的非索非那定和伪麻黄碱对照品溶液适,置于一定量空白血浆中,充分振荡混匀,配制血浆中含非索非那定浓度分别为2.26ng/m L,4.50ng/m L,11.00ng/m L,45.10ng/m L,90.20ng/m L,225.46ng/mL和676.46ng/mL的标准系列浓度和含伪麻黄碱浓度分别为22.11ng/m L,29.48ng/m L,73.70ng/m L,147.89ng/m L,184.24ng/m L,368.48ng/m L和736.96ng/m L的标准系列浓度,然后按“2.3”项下方法操作,记录色谱图及非索非那定、伪麻黄碱和内标峰面积。以非索非那定和内标峰面积比值、伪麻黄碱和内标峰面积比值f(f=As/Ai)对血药浓度(C)作回归计算,得非索非那定和伪麻黄碱的回归方程分别为:f=0.000830291×C+0.00404527(r=0.9996,n=7)和f=0.000345114×C+0.000113641(r=0.9997,n=7)。非索非那定和伪麻黄碱的定量下限浓度分别为2.26ng/m L和23.16ng/m L,RSD分别为0.7%和2.7%。

2.6 准确度与精密度试验

分别配制含非索非那定低、中、高3个浓度(4.50ng/m L,4 5.1 0 n g/m L,2 2 5.4 6 n g/m L)和含伪麻黄碱低、中、高3个浓度(29.48ng/mL,147.89ng/mL,368.48ng/mL)的质量控制样品,按“2.3”项下操作,每一浓度平行操作5份,代入回归方程计算浓度,以测得值与加入值的比值计算回收率,结果见表2。每一浓度平行操作5份,记录色谱图,记下峰面积,计算其比值并代入相应标准曲线,计算求得日内精密度,结果见表2。连续3d配制并测定上述浓度样品,考察方法日间精密度,结果见表2。方法的回收率均在85%~115%之内,日内、日间RSD均小于15%,符合药物动力学研究的方法学要求。

2.7 提取回收率

取空白血浆、非索非那定及伪麻黄碱对照品溶液,分别配制低、中、高3个浓度非索非那定(4.50ng/mL,45.10ng/mL,225.46ng/mL)和伪麻黄碱(29.48ng/mL、147.89ng/mL、368.48ng/mL)的质量控制样品,按“2.3”项下操作,每一浓度平行操作5份,另取相同量标准品溶液,以水代替血浆,按“2.5”项下操作,作为对照样品,以每一浓度两种处理方法的峰面积比值来评价提取回收率,结果非索非那定在4.5ng/mL、45.1ng/mL、225.46ng/mL的回收率分别为96.0%、95.2%、101.5%,RSD分别为9.7%、9.7%、2.8%;伪麻黄碱在29.48ng/mL、147.89ng/mL、368.48ng/mL的回收率分别为100.5%、98.3%、104.2%,RSD分别为8.2%、7.5%、3.3%。

2.8 稳定性试验

分别取非索非那定、伪麻黄碱对照品溶液适量加入空白血浆中配制相当于含低、中、高3个浓度非索非那定(4.50ng/m L,45.10ng/m L,225.46ng/m L)和伪麻黄碱(29.48ng/m L、147.89ng/m L、368.48ng/m L)的质控样品各3份,分别于室温条件下放置0、2、4、8、24h,4次冷冻(-20℃)-解冻(室温)循环,-20℃存放0、10、20、30、40d,然后按上述方法测定,计算非索非那定和伪麻黄碱的浓度。结果见表3,试验结果显示所有室温放置试验、冰冻和冻融试验的测定值与添加值的相对偏差(RE)均小于15%,说明分析测试过程中的样品较为稳定。

2.9 质量控制

受试者血浆样品非索非那定和伪麻黄碱的测定在分析方法确证完成之后进行。在每批血浆样品测定的同时分别测定插入低、中、高浓度非索非那定(4.50ng/mL、45.10ng/mL、225.46ng/mL)和伪麻黄碱(29.48ng/mL、147.89ng/mL、368.48ng/mL)的质控样品,根据质控样品的测定结果(准确度)评判该批样品的测定数据是否可被接受或拒绝。分别测试了6个分析批样品,结果质控样品的相对偏差均在±15%之内。

3 讨论

本试验经过摸索确定了直接用乙腈沉淀去蛋白的LC-MS/MS法同时测定血浆中非索非那定和伪麻黄碱的含量,所用血样量少,蛋白沉淀率近100%,该血样处理方法具有操作更简便、重复性好、应用性更强的优势。

液相色谱质谱联用法 第9篇

固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)是在固相萃取(solid-phase extraction,SPE)基础上发展起来的一种集采样、萃取、浓缩、进样于一体的萃取分离技术,它摒弃传统样品前处理方法的很多缺点,具有下述优点:操作简单,萃取速度快,样品需要量少,所需有机溶剂少,易于实现自动化,与当今国际上提倡的绿色环境友好型样品前处理要求相符。SPME在发展之初主要是与气相色谱(GC)联用进行样品分析,然而GC难以满足多种物质尤其是不易挥发或高极性物质的分析要求,为拓宽SPME的应用,1995年,Chen和Pawliszyn[1]设计出固相微萃取-高效液相色谱(SPME-HPLC)联用接口装置,并由Supelco公司生产出商品,SPME-HPLC技术这才起步并蓬勃发展至今。随着液相-质谱技术的发展,SPME又越来越多地与液质联用并取得很大进展[2,3]。本文主要对固相微萃取和高效液相色谱、液相色谱-质谱技术联用的研究进展作一综述。

1 与液相色谱联用的固相微萃取类型

1.1 纤维针式固相微萃取

最经典的方法就是利用Pawliszyn研制[4]的纤维针式固相微萃取以及Chen等[1]设计的SPME-HPLC联用接口装置。SPME装置类似一个注射器,由手柄和萃取纤维头组成。萃取纤维头是涂有不同固定相或吸附剂的熔融石英纤维,外套不锈钢细管以保护石英纤维不被折断,纤维头在钢管内可伸缩,将SPME针管刺入样品瓶,推出纤维头浸入样品溶液,萃取一定时间后缩回纤维头退出样品瓶,插入SPME-HPLC专用接口。该接口由一个六通阀和解吸池组成,解吸池与进样管相连,将六通阀置于载样(load)状态时,纤维头插入解吸池,六通阀置于进样(inject)状态,流动相冲洗纤维头洗脱富集的化合物并随流动相进入色谱柱和检测器进行分离和测定,纤维头退回钢针中,拔离进样口,此为动态洗脱[5]。动态洗脱不彻底时可进行静态洗脱,即在六通阀置于load状态时使用注射器吸取适量的洗脱溶剂注入并充满六通阀和接口的洗脱室,静态洗脱一定时间后将六通阀置于inject状态。为避免记忆效应,在下次萃取进行前需将纤维头洗净并晾干。此方法由于其经典性一直沿用至今,如Adalberto M Filho[6]等运用此方法以静态模式检测芒果中5种农药残留,检出限可达0.6~3.3μg/kg。

1.2 管内固相微萃取(In–tube SPME)

为使SPME更好地与液相色谱在线耦合,1997年Eisert[7]等人发明管内固相微萃取装置,它将萃取固定相涂覆于GC毛细管柱内壁代替传统萃取头,一端插入试样溶液中,另一端与六通阀相连。六通阀置于inject位置时经自动进样系统控制注射器对试样溶液多次吸入和排出,使被测物在样品溶液和毛细管萃取涂层间达到平衡,再将样品溶液更换为洗脱溶剂,将六通阀先后置于load和inject位置,流动相将被测物导入色谱柱进行检测。之后几年中,In–tube SPME与自动进样器未作任何改造的Agilent LC 1100系列联用的报道较多[8]。管内固相微萃取与液相色谱联用除实现分析自动化,减少人为误差外,还可以克服现有商品SPME纤维种类不多的局限性;其次,GC毛细管柱可以适当增加长度,提高富集倍数;再次,由于采用自动进样装置进行萃取和解吸,其解吸过程可定量进行,防止超载的发生;进样针和毛细管柱每处理完一个样品后都会自动清洗,减少待测物的残留,克服记忆效应对样品检测的干扰。

2000年,Saito等[9~11]人在In–tube SPME基础上发明管内金属丝固相微萃取(Wire-in–tube SPME)和纤维管内固相微萃取(Fiber-in–tube SPME),它们在体积不变的情况下,增大萃取接触面积,提高萃取效率和解吸效率。为进一步提高其选择性和萃取效率,他们又在细丝表面涂覆聚合物涂层。2003年,Shintani等[12]首次将C18键合硅胶整体柱引入管内SPME与HPLC在线联用检测环境水样中的杀虫剂,2004-2006年,冯钰锜研究小组[13]将有机聚合物整体柱引入管内SPME技术中并对其萃取性能进行系统研究。

1.3 针内固相微萃取(In-needle SPME)

2004年,Abdel-Rehim等[14]在一个100~250μL的玻璃注射器内填充约1mg吸附剂制成针内固相微萃取装置,与LC-MS/MS在线联用检测人血浆中的罗哌卡因及其代谢产物,结果良好。很快,这种填充式注射器微萃取(microextraction in packed syringe,MEPS)技术以其简便、样品和溶剂使用量少、全面自动化等诸多优点引起临床、法医毒理学、环境等领域的广泛关注,例如Saracino等[15]成功运用MEPS技术与带有电导检测器(CD)的液相色谱联用检测血浆和唾液中的利培酮及其代谢产物9-羟基利培酮,Wietecha-Posluszny等[16]将MEPS技术与带有二极管阵列检测器(DAD)的液相色谱联用检测血浆中的6种三环类抗抑郁药。

1.4 管尖固相微萃取(In-tip SPME)

管尖固相微萃取是近年来新发展起来的一项SPME技术,目前主要被应用于生物样品的检测。它通过在移液管尖端插入[17]或吸取[18]一段吸附材料形成一萃取吸头与带有机械臂的96孔萃取装置联用实现自动化。移液管一般为一次性聚丙烯材料,吸附剂为大孔径的硅胶颗粒或其他整体柱材料(如甲基丙烯酸酯)。Xie等将其与LC-MS/MS联用检测人血浆中的药物MK-0533[17]和MK-0974[18],效果良好。总而言之,In-tip SPME是一项新型、高效、发展前景良好的前处理技术,它在实现SPME全面自动化的同时体现真正的样品平行性。

2 与液相色谱联用的固相微萃取涂层

2.1 非特异性涂层

涂层是SPME的核心部分,它决定SPME萃取过程的选择性、灵敏度和萃取容量,通常实验中选择涂层材料的原则都遵循“相似相溶”原理。目前常用的商品化有机涂层[19]主要有聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酸酯、聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯、聚乙二醇/二乙烯基苯、聚乙二醇/聚二甲基硅氧烷、聚乙二醇/模板树脂、聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯/聚乙二醇等。前2种为均相聚合物涂层,往往只能通过增加涂层厚度来增加萃取容量;后5种为多孔颗粒聚合物,可以通过增加涂层的多孔性来增加萃取容量及提高对被分析物的保留能力。虽然这些纤维涂层对SPME的发展作出巨大贡献,但仍存在吸附质成本高、价格昂贵、吸附容量小、耐溶剂性差、使用寿命短等缺点。于是很多研究者为提高SPME的灵敏度和稳定性而开发自制很多涂层,如无机碳材料涂层石墨碳黑[20]和活性炭[21],目前也已实现商品化。其他的如杨富巍[22]将介孔硅基分子筛SBA-15与辛基三甲氧基硅烷化后接枝反应合成新型介孔涂层C8-SBA-15。

碳纳米管(CNTS)是当前研究者们比较感兴趣的一类涂层材料,最早是由Iijima[23]发现的,CNTS是一种由石墨片按一定螺旋度卷曲成无缝纳米级圆筒的大分子,根据石墨片层数的不同,分为单壁碳纳米管和多壁碳纳米管。Ma等人[24]利用单壁碳纳米管检测水样中的内分泌干扰化合物,对自来水和海水的样品加标回收率可达81.8%~97.3%。Ji[25]又将多壁碳纳米管用硫酸(98%)/硝酸(70%)的混合溶液处理后使CNTS侧壁引入部分羧基,形成氧化多壁碳纳米管,用于测定水样中的苯并咪唑类杀虫剂,结果表明氧化多壁碳纳米管具有很好的灵敏度和萃取容量。

其他的SPME涂层也越来越多地被应用于各个领域,如具有导电性的聚吡咯、聚噻吩[5]以及利用体积排阻作用阻止大分子物质(如:蛋白质)进入固定相内部的限进介质SPME涂层(RAM)[26,27]等。

2.2 特异性涂层

分子印迹技术[28](Molecular imprinting technique,MIT)是指以目标分子为模板,与功能单体、交联剂进行聚合反应。印迹分子(模板)除去后,聚合物中留下大量空穴,这些空穴和模板分子在大小和形状方面完全匹配,即该聚合物具有反结合模板分子的特异性能。分子印迹-固相微萃取(MIP-SPME)技术[29]因同时具备SPME的高灵敏度和分子印迹聚合物的高选择性而受到广泛关注。Turiel[30]等报道分子印迹固相微萃取整体棒的制备并成功应用于土壤、马铃薯和大豆中扑灭津的检测。Zhang[31]等运用分子印迹整体柱管内固相微萃取和HPLC联用检测人尿液中的8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-OHd G),加标回收率可达84%±3%,在对健康志愿者、焦化厂工人和癌症病人的尿液检测中,癌症病人的8-OHd G明显高于其他健康人群。

免疫亲和技术是一种以抗原和抗体特异性识别为基础的选择性强、特异性高的样品前处理手段,2006年Load等[32]成功利用硼酸硅盐玻璃棒研制针对苯(并)二氮类化合物的免疫亲和探针并与LC-MS/MS联用对尿样中7-硝基氟硝西泮进行检测。Queiroz等[33]将抗体固定到石英毛细管内壁进行免疫亲和管内固相微萃取并同LC-MS联用测定人血浆中的药物氟西汀。目前商品化抗体种类很多,免疫亲和SPME技术可针对多种目标物,所以这项技术将有非常广阔的发展空间和前景。

3 SPME-HPLC装置优化

SPME-HPLC技术发展至今,除萃取涂层的研制更新,萃取支持物的材料、联用接口、萃取进行位置、仪器设备等方面也不断得到优化和发展。萃取支持物从早期较脆易断的熔融石英纤维发展到后来的不锈钢纤维、碳质基体、石墨碳纤维、玻璃-陶瓷棒、改性的笔状铅纤维、硫化铜选择性纤维等[34],在增加机械强度提高使用寿命的同时,拓展分析范围。SPME-HPLC的传统接口由一个六通阀和脱附室组成,Wu等人[35]采用一根3cm的C8柱、一个十通阀及双泵(解吸泵、分析泵)构造整个解吸及进样系统,有效抑制色谱峰的拓展效应,提高灵敏度,可惜此方法仍沿用手动方式。Bagheri等[36]将金属铜电镀到液相色谱进样环内壁,采用溶胶凝胶技术直接在进样环自制以3-(巯基)三甲氧基硅烷为前驱体的涂层,将该装置应用于水样中多环芳烃的检测,自来水中的加标回收率可达90%~104%。舒馨等[37]将毛细管内固相微萃取和微柱高效液相色谱(In-tube-SPME-μHPLC)在线联用,用一段内壁交联色谱固定相的毛细管取代定量阀的外置定量管直接用于样品的浓缩和进样,无需特制接口和专门洗脱液,通过检测水样中的蒽和芴,发现峰高较直接进样分别提高15倍和20倍。

4 展望

固相微萃取和高效液相色谱、液相-质谱技术联用的十几年发展进程中,鉴于其操作简单、高效、环保等优点,被广泛应用于各个领域。为进一步推动其发展、扩大其应用范围,SPME-HPLC可朝以下几方面发展:(1)继续发展新型涂层,提高纤维涂层的萃取容量和灵敏度,延长涂层寿命,扩大萃取对象;同时要深入研究高选择性、特异性的涂层,如分子印迹和免疫亲和技术等在SPME方面的应用还有很大的发展空间。(2)继续发展在线联用技术,这也是当前检测分析技术的热点。研制易于组装拆卸的接口及接口的商品化和标准化将受到关注,开展联用技术的自动化和数字化研究,仪器设备的微型化和集成化研究,将人为误差降至最低。(3)加强与其他先进的前处理萃取技术(例如超临界流体萃取)的联用研究,以及其他新型SPME技术(例如In-tip SPME)的应用和发展。相信SPME-HPLC必定会有更好的发展前景。

摘要：近年来随着现代分析技术的发展,固相微萃取技术作为一种简单有效的前处理手段被越来越多地应用于环境、食品、临床、生物学等方面的检测分析。本文主要综述固相微萃取和高效液相色谱、液相色谱-质谱技术联用的原理和发展现状,介绍该技术在实际应用中的优化,并对其发展前景作展望。

液相色谱质谱联用法 第10篇

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260 UPLC, Agilent 6120 Quandrupole MS, 配自动进样器及数据处理系统。盐酸二甲双胍对照品购自国家食品药品研究检验所 (含量按无水物计算为100.3%, 批号20050126) 。色谱纯乙腈、甲醇购自广州迪马公司, 实验用水均为HPLC级别水, 其余试剂均为分析纯。

1.2 色谱条件

色谱柱为waters X-Bridge HILIC (2.1 mm×50mm, 3.5μm) ;流动相为乙腈:20 mmol乙酸铵 (含1.8%甲酸) =93∶7;流速为1.35 m L/min;柱温为25℃。

1.3 质谱条件

ESI离子源, 选择离子方式进行正离子扫描, 定量离子选择M/z=130.2-->70.7。毛细管电压:3.5 k V;雾化气流量:45 psi;辅助气化气流量12 L/min;离子源温度:350℃, 碰撞电压70 V。

1.4 血浆样品处理

取血浆100μL, 加入乙腈200μL, 震荡2min, 13 000 r/min离心10 min, 取上清液200μL, 入进样瓶, 进样5μL。

1.5 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学处理, 所有数据以均值±标准差 (±s) 表示;组间比较采用t检验分析, 以P<0.05视为有差异有显著性。

2 结果

2.1 方法专属性考察

分别取6个不同来源的空白血浆各200μL, 按“血浆样品的处理”项操作, 在本试验所采用的色谱条件下, 空白血浆样品质谱色谱图, 如图2A;将二甲双胍对照品加入空白血浆后, 依法操作, 二甲双胍的保留时间为1.02 min左右, 如图2B;取健康受试者给药后的血浆样品, 依法操作, 得健康受试者血浆样品色谱图, 如图2C。结果表明, 二甲双胍峰形良好, 空白血浆中内源性物质及代谢产物不干扰二甲双胍的测定。本方法具有较高的特异性, 能准确测定血浆中二甲双胍的浓度, 灵敏度较高。在本方法选用的色谱条件下, 每一样品的二甲双胍的分析周期为2.0 min, 见图1。

2.2 标准曲线和线性范围

稀释二甲双胍溶液至浓度为31 200、15 600、7 800、3 900、1 950、975、487.5、243.8、121.9、60.9和30.5 ng/m L的对照溶液。取以上系列对照溶液各10μL于1.5 m L Eppendorf管, 分别加入空白血浆90μL, 混匀配制成浓度相当于3 120、1 560、780、390、195、97.5、48.8、24.4、12、2、6.1和3.05 ng/m L的样品, 再按“4”项下方法处理进样, 以对照品面积与浓度进行线性回归, 得二甲双胍在该浓度范围呈良好的线性关系, 直线回归方程为Y=117.4X+210.7, 二甲双胍的线性范围为3.05~3.12 ng/m L, r2=0.999, 最低定量下限为3.05 ng/m L。

2.3 定量下限 (LLOQ) 的考察

按“6”项下方法配制标准曲线最低点3.05ng/m L二甲双胍对照血浆10份, 按“4”项下方法处理后进样, 准确度在真实浓度的80%~120%之间, 相对标准差小于20%。

2.4 提取回收率试验

按“6”项下方法配制高中低浓度分别为3 120、97.5和6.1 ng/m L的二甲双胍对照血浆各5份, 按“4”项下方法处理后进样, 得萃取后二甲双胍的峰面积。将31 200、975和61 ng/m L二甲双胍对照溶液用流动相稀释10倍后直接进样3次, 将萃取后峰面积均值与直接进样的两倍峰面积均值进行比较, 得提取回收率。高、中、低浓度的提取回收率分别为71.03%、61.52%和69.17%, 基本一致, 见表1。

2.5 精密度和准确度考察

按“6”项下方法配制高中低浓度分别为3 120、97.5和6.1 ng/m L的二甲双胍对照血浆各5份, 按“4”项下方法对血浆进行处理后进样, 得日内相对标准差 (RSD) 。高、中、低浓度的日内RSD分别为:8.09%、4.11%和7.47%, 均小于10.00%;平均相对回收率 (准确度) 在80%~120%范围内。每天配制高中低不同浓度对照血浆各5份, 连续测定3 d, 得高、中、低浓度的日间RSD分别为:9.33%、6.16%和8.92%, 均小于10.00%, 见表1。

A:空白血浆;B:空白血浆加对照品 (二甲双胍) ;C:服药后2 h样品

2.6 稳定性考察

2.6.1 融冻实验

按“6”项下方法配制高中低浓度分别为3 120、97.5和6.1 ng/m L的二甲双胍对照血浆各5份, 24 h内在水浴37~-20℃反复融冻3次 (8、12和24 h) , 并分别于0、8、12和24 h按“4”项下方法对血浆进行处理, 比较0、8、12和24 h血浆二甲双胍浓度, 结果表明, 二甲双胍在血浆中24 h内反复融冻1、2和3次后浓度无明显变化 (P>0.05) 。

2.6.2 长期稳定性

按“6”项下方法配制高中低浓度分别为3 120、97.5和6.1 ng/m L的二甲双胍对照血浆各5份, 置于-20℃考察14 d, 分别于0、3、7和14 d按“4”项下方法对血浆进行处理, 比较0、3、7和14 d血浆二甲双胍浓度。结果表明, 血浆中的二甲双胍在-20℃条件下储存14 d后浓度无明显变化 (P>0.05) 。

2.6.3 进样器中24 h稳定性

将长期稳定性0 h的处理后样品放置于自动进样器中, 24 h后重复进样, 比较前后进样血浆中二甲双胍的浓度, 结果表明, 处理后样品在进样器中放置24 h内稳定。

3 应用

收集24位健康成年男性志愿者, 口服850 mg二甲双胍的药动学数据。本实验经中南大学湘雅医学院伦理委员会批准。24个健康成年男性志愿者在经筛选合格并签订知情同意书后入组, 于实验当天口服850 mg二甲双胍片, 服药前即刻 (0 h) 及服药后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、6、8、10、12和24 h, 收集肘静脉血5 m L于肝素抗凝管, 3 000 r/min离心10 min分离血浆, 于-40℃保存备用。

血浆样品按“4”项下方法处理, 以随行的标准曲线分别计算二甲双胍的体内浓度, 计算药动学参数。达峰时间 (tmax) 和峰浓度 (cmax) 为实测值, 消除半衰期 (t1/2) 、曲线下面积 (AUC0~∞、AUC0~24) 用DAS软件采用非房室模型计算。二甲双胍的平均血药浓度-时间曲线见图2, 药动学参数见表2。

4 讨论

人体二甲双胍血药浓度的检测已有高效液相色谱[3,4,5,6]和高效液相色谱-质谱联用[7,8,9,10,11]的方法报道。高效液相色谱法因为二甲双胍急性强, 保留差, 所以一般流动相中加入离子对试剂。但此方法所需平衡时间长, 流动相配置批次间微小变动即可明显保留时间, 影响定量准确性。本研究在近一个月高效液相色谱方法基础上, 为提高方法稳定性、缩短检测时间、提高灵敏度建立此超高效液相色谱-质谱联用法检测体内二甲双胍血浆浓度。也是第一次采用超高效液相色谱进行二甲双胍血浆浓度检测, 因为超高效液相色谱可以承受更大压力, 从而可采用更小颗粒的色谱柱以提高分离度, 可在更短时间内实现分离;因为峰型更尖锐, 而提高灵敏度。与已有的普通液相-质谱联用方法比较, 已报道的最低检测限分别有2和10 ng/m L或更高[7,8,9,10,11,12], 虽然本组的最低检测限为3.05 ng/m L没有明显提高, 但因检测限已足以满足需要。已报道方法为降低最低检出浓度, 或采用液液萃取或乙腈直接沉淀后挥干, 均采用了样本浓缩。而笔者采用乙腈蛋白沉淀后直接进样, 明显简化样本处理过程, 缩短样本处理时间, 并降低了浓缩后血浆杂志的基质效应。

本超高效液相色谱-质谱联用法能够简便、高效、快速和灵敏的检测健康志愿者血浆中的二甲双胍, 应用此方法成功的检测了24名志愿者体内二甲双胍的药物浓度, 证明可用于二甲双胍药物代谢动力学以及生物等效性的研究。

参考文献

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液相色谱质谱联用法 第11篇

关键词：超高效液相色谱串联质谱 麻辣豆制品 工业染料

中图分类号：TS201.6 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）06-0039-02

随着国内人们生活水平的提高，人们的饮食越来越趋近于多样化。麻辣豆制品，也在市场中占据了一席之地。某些不法商家为追求利润，在麻辣豆制品中加入碱性橙、碱性嫩黄O等工业染料，从而使其色泽更加鲜亮，但这些工业染料对人体有一定的毒副作用。人们长期食用添加过工业染料的豆制品，会对身体健康带来很大的安全隐患。国家、企业等相关单位对碱性橙2等工业染料检测有相关的报道及方法标准[1-3]，但能同时对3种碱性橙和碱性嫩黄O进行提取以及使用液相色譜质谱定量检测的方法还未见报道。

本研究建立了采用高效液相色谱串联质谱仪同时测定麻辣豆制品中非法添加的4种工业染料包括碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、碱性嫩黄O的检测分析方法，优化了提取及净化条件，可为市场上麻辣豆制品的检测提供方法参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

标准品购置：碱性橙2（99.9%）；碱性橙21（99.9%）；碱性橙22（99.9%）；碱性嫩黄O（99.8%）；甲醇，乙腈均为色谱纯；甲酸，分析纯；C18柱；中性氧化铝固相萃取柱及0.22μm有机滤膜均购于美瑞泰克科技（天津）有限公司。

液相色谱仪：岛津LC-30系列，日本岛津公司；质谱仪：API 4000配有电喷雾离子源（ESI）及数据处理系统，美国应用生物系统公司；超纯水机：美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

储备液：准确称取碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、碱性嫩黄O标准品各0.1g（精确至 0.001g），用甲醇配制成浓度为1.0mg/mL的标准品储备液，4℃冰箱保存备用。

工作液：储备液用甲醇逐级稀释，配制成系列工作液。

1.2.2 样品制备

提取；称取均质好的豆制品5g置于100mL烧杯中，加人乙腈10mL，超声提取10min，将提取液用滤纸过滤到圆底烧瓶中，再加人乙腈10mL，重复上述操作3次，合并提取液，转移提取液过中性氧化铝固相萃取柱，用少量乙腈冲洗残渣并过柱，定容至50mL，经0.22μm 微孔滤膜过滤后用于UPLC-MS/MS测定。

1.2.3 色谱、质谱条件

（1）液相色谱条件；色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6×150 mm×3.5μm）；柱温为36℃；进样量为3μL；流动相：1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱程序：0～1 min，90%A；1～5.0min，90%～10%A；5.0～8min，90%A；流速为0.5mL/min。

（2）质谱条件；电喷雾离子源（ESI+）；离子源温度（TEM）为500℃；雾化气（GS1）为60psi；碰撞气（CAD）为 8psi；气帘气（CUR）为24psi；辅助加热器（GS2）为60psi；喷雾电压（IS）为5500V。

2 结果与讨论

2.1 提取与净化条件的优化

2.1.1 提取溶剂的选择

由于4种工业染料均溶于醇、水等多种溶剂，分别以甲醇、乙腈和水三种试剂进行提取。结果表明，以乙腈作为提取溶剂时，4种组分的回收率均可达85%以上，并且杂质干扰较少，故最终选定乙腈作为提取试剂。

2.1.2 净化条件的选择

为了减少油脂等杂质对目标物分离的干扰，对提取液进行了固相萃取柱净化。比较了C18柱和中性氧化铝固相萃取柱的净化效果，结果表明中性氧化铝固相萃取柱去除油脂等杂质的效果更好，故选定中性氧化铝固相萃取柱作为净化柱。

2.2 质谱条件的优化

本实验首先采用1μg/mL的混标溶液，以蠕动泵样方式在电喷雾正离子模式下进行母离子全扫描，找出准确的分子离子作为母离子，然后以分子离子为母离子对其子离子进行全扫描，最后选取丰度较强的2个子离子，优化其锥孔电压、碰撞能量等质谱参数，选取丰度较大并且响应稳定的来做定量离子。

2.3 标准图谱

在色谱质谱条件下，碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、碱性嫩黄O的保留时间分别是3.93min、2.47min、3.13min、2.15min，标准样品图谱具体见图1。

2.4 标准曲线、线性范围及检出限

在确定的色谱条件下对质量浓度为0，5，10，20，50，100，200，400μg/L的混合标准品分别进行测定，以各组分的峰面积（Y）对其质量浓度（X，μg/L）进行线性回归。4种标准物质在5～100μg/L范围内呈良好线性关系，相关系数均可达到0.999以上。以信噪比S/N=5计算4种标准物质的检测限，具体数据见表1。

2.5 回收率及精密度分析

在市场上购买的13种品牌麻辣豆制品样品中添加20、50、100μg/L的混合标物，经上述方法提取、净化处理后进行UPLC-MS/MS测定。结果表明：在此色谱条件下能很好的将4种目标物质分离。本研究按测量值和真实值计算回收率，5次重复计算变异系数，检测结果表明：13种样品中碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、碱性嫩黄O的本底值均为0mg/kg，4种标准物质的平均回收率在84.5%～105.6%，相对标准偏差（RSD）为1.4%～6.8%，满足回收率与精密度的要求。

3 结语

通过提取样品，固相萃取柱净化、超高效液相色谱分离和串联四极杆质谱检测，建立了麻辣豆制品中4种工业染料包括对碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、碱性嫩黄O检测的UPLC-MS/MS方法。该方法前处理简单易操作，分析时间短，并且线性范围宽，灵敏度高，检测结果准确，可用于麻辣豆制品中上述4种非法添加工业染料的同时测定及确证。

参考文献

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液相色谱质谱联用法 第12篇

1 高效液相色谱-质谱联用仪的分析原理

高效液相色谱-质谱联用仪主要由高效液相色谱,接口装置(HPLC与MS之间的连接装置,同时也是电离源),质谱仪组成。混合样品通过液相色谱系统进样,由色谱柱分离,从色谱仪流出的被分离组分依次通过接口进入质谱仪的离子源处并被离子化,然后离子被聚焦于质量分析器中,根据质荷比而分离,分离后的离子信号被转变为电信号,传递至计算机数据处理系统,根据质谱峰的强度和位置对样品的成分和结构进行分析。

高效液相色谱-质谱联用是通过一个“接口”来实现的,所用接口合适与否,不仅会影响质谱仪的灵敏度,而且影响质谱仪所能提供的结构信息和应用范围。在接口研制方面,前后发展了有20多种,其中主要有直接导入界面、传送带界面、渗透膜界面、热喷雾界面和离子束界面,但这些技术都有不同方面的限制和缺陷,直到大气压电离技术(API)成熟后,液-质联用才得以飞速发展,成为科研和日常分析的有力工具。大气压电离技术包括电喷雾电离[2,3,4](ESI)和大气压化学电离(APCI)。作为LC-MS联用仪的质量分析器,最常用的是四极杆分析器,离子阱分析器和飞行时间分析器。四极杆分析器由4根棒状电极组成,当样品量很少,而且样品中特征离子已知时,可以采用离子监测,这种扫描方式灵敏度高,通过选择适当的离子使干扰组分不被采集,可以消除组分间的干扰。飞行时间质量分析器的特点是质量范围宽,扫描速度快,既不需电场也不需磁场。但是,长时间以来一直存在分辨率低这一缺点,主要原因在于离子进入漂移管前的时间分散、空间分散和能量分散。目前,通过采取激光脉冲电离方式,离子延迟引出技术和离子反射技术,可以在很大程度上克服上述3个原因造成的分辨率下降,这种分析器已广泛应用于液相色谱-质谱联用仪中。离子阱质量分析器的特点是结构小巧,质量轻,灵敏度高,而且还有多级质谱功能,其与四极杆分析器类似,离子在离子阱内的运动遵守所谓马蒂厄微分方程,也有类似四极杆分析器的稳定图。在稳定区内的离子,轨道振幅保持一定大小,可以长时间留在阱内,不稳定区的离子振幅很快增长,撞击到电极而消失。

2 食品安全的检测

随着经济全球化进程加快,进出口贸易的加大,人们的生活水平日益提高,对食品的营养性、保健性和安全性的关注均趋于理性化、科学化。国家对食品的监管十分重视,制定了《食品安全法》,规范管理食品生产,尤其是对危及人们身体健康的添加剂禁止使用或限量使用。此外,食品在生产、包装和运输过程中可能会被化学物质污染,如发生农药残留、兽药残留等,它们的含量过高对人体健康不利。食品监督部门必须及时有效地检测厂家上市的食品,对群众的投诉,尽快给出答案,这些都需要一种准确的分析手段。在食品检测中应用较广泛的是高效液相色谱法(HPLC),近几年发展起来的高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS),集液相色谱对复杂基体化合物的高分离能力和质谱独特的选择性、灵敏度、相对分子质量及结构信息于一体而广泛应用于食品检测方面,为食品工业中原材料筛选、生产过程中质量控制、成品质量检测等提供了有效的分析检测手段[5]。

2.1 食品中农兽药残留的检测

残留检测作为食品安全的重要课题,需要使用多种样品前处理手段与分析检测手段。HPLC-MS日益广泛地应用于不同类型兽药,农药及毒素类有毒有害物质的检测分析,与其他液相色谱应用不同的是,食品及农产品的残留分析对灵敏度、重现性与选择性的要求非常高,常常需要在复杂的基质中检测ppb级甚至更低浓度水平的痕量残留物质。若想达到上述目标,不仅需要良好的样品前处理手段来净化复杂的食品及农产品本底,浓缩目标成分,而且需要选择高性能、高灵敏度的HPLC或HPLC/MS系统进行检测分析[6]。

李波、邓晓军等建立了用HPLC-MS测定植物、动物肉类、水产等产品中草甘膦(PMG)及其代谢物氨甲基磷酸(AMPA)残留量的方法[7]。采用Supelco Discovery C18柱(150 mm×2.1 mm,5 μm),流动相A:0.1%甲酸/乙腈;B:5 mmoL·L-1醋酸铵/0.1%甲酸。采用多反应监测技术所确定的定性离子对其进行定性,同位素内标法定量。方法的定量检测底限为0.05 mg·kg-1,线性范围为0.20~10 μg·L-1,各种基质下PMG和AMPA的平均加标回收率为80.0%~104%,相对标准偏差为6.7%~18.2%。此方法的回收率和精密度符合残留检测要求。韩红新、吴莉宇等[8]应用HPLC-MS同时分析蔬菜中氟铃脲、伏虫隆、虱满脲、氟虫脲4种农药残留。采用C18柱,大气压化学模式电离,多反应离子监测方式检测,方法对氟铃脲、伏虫隆、虱满脲、氟虫脲的检出限分别为0.02、0.02、0.02、0.02 mg·kg-1,在0.05~0.5 mg·kg-1范围内回收率为75.2%~84.5%,其研究结果达到农药残留分析要求,可以满足我国在食品质量安全检测技术方面的要求。陈小霞、岳振峰等建立了肌肉组织中氯霉素残留的电喷雾电离液质联用(LC/ESI-MS-MS)定性定量检测方法[9],方法的检出限为0.01 μg·kg-1,线性范围为0.05~1.00 μg·L-1,加标回收率为74.3%~84.0%,RSD为7.9%~12.3%,该方法灵敏、准确、简便、快速,能够满足残留检测的要求。E.Bermudo,E.Moyano[10]等用液相色谱耦合串联质谱典型分析了西班牙产品中的丙烯酰胺,用多孔石墨碳柱,使丙烯酰胺提取物得到分离,离子阱或三重四极分析仪分析丙烯酰胺的浓度,用这些来确定遗传毒性化合物的食品,发现马铃薯产品、圣诞糖果和糕饼产品中有很高的含量,范围在70~2000 μg·g-1。此外,祝伟霞、杨翼州等应用HPLC-MS测定了动物性食品中硝基呋喃类代谢物残留[11],胥传来、彭池方等应用HPLC-MS分离鉴定出己烯雌酚合成抗原[12],均获得了较好的分析结果。

2.2 食品中违禁物质和有害添加剂的分析

食品是人类生活中不可缺少的必需品,在食品生产过程中往往需要添加防腐剂、抗氧化剂、人工合成色素、甜味剂、保鲜剂等化学物质,它们的含量过高会对人体产生不同程度的危害,甚至威胁人的生命安全,所以有必要建立一套能够快速鉴定并且准确定量食品中有害添加剂和违禁药物的方法。对它们的测定,通用的方法为分光光度法[13],高效液相色谱法,毛细管电泳法,气相色谱等。但分光光度法检出限高;气相色谱需要衍生化,耗时,麻烦;高效液相色谱法多用于成分单一的测定等缺点,而HPLC-MS只需对样品进行简单预处理,适用于含量少、不宜分离得到或在分离过程中容易发生变化或损失的成分[14]。因此HPLC-MS联用技术在对食品中违禁物质和有害添加剂的分析研究中得到了广泛的应用[15]。

黄芳,黄晓兰等建立了食品中三聚氰胺的高效液相色谱-质谱测定方法[16],用Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相:乙腈-0.1%甲酸(体积比5∶95),采用正离子模式的电喷雾质谱检测,线性范围为0.01~0.5 mg·L-1,检出限0.01 mg·L-1(S/N=3),回收率为80%~99%。胡青等建立了减肥类保健食品中非法添加酚酞的液质联用鉴别法及高效液相色谱含量测定法,对减肥类保健食品中添加的酚酞以液相色谱分离,采用离子阱质谱进行定性鉴别,流动相为0.5%甲酸-乙腈(70∶30),离子化模式为ESI(+),阱内击碎电压为0.86 V;然后采用反相液相色谱对酚酞进行定量,流动相为水-乙腈(70∶30),检测波长为230 nm。结果该质谱条件下,酚酞产生[M+H]+分子离子峰,二级质谱的特征碎片离子明显,液相色谱定量法的线性范围为1.09~218 mg·L-1,平均回收率为99.57%,方法定性准确、可靠。Erika Teixid′o, Encarnaci′on Moyano[17]用液相色谱多级质谱(LC-MSn)分析食品中的5-羟甲基糠醛(HMF),使用苯基氟化栏,对几个色谱柱进行了测试,在正极电离模型中使用大气压化学电离(APCI)确定MS模型,MS/MS用于定量分析的同时MS3用于确证。定量参数如精密度RSD<10%,检测限133 ng·g-1,该方法成功用于分析来自西班牙几个当地市场食品中的HMF。汪国权,温忆敏[18]等建立食品中违禁添加药物-伟哥的检测方法,在碱性条件下提取食品中伟哥,用液相色谱和液相色谱/质谱联用仪进行测定,并对伟哥的体内代谢物进行质谱上的研究。在现有色谱条件下,伟哥的特征保留时间为9 min,相应特征检测波长224 nm、295 nm,确证分子离子蜂为475,同时推导了伟哥的一些代谢物结构。喻凌寒,杨运云[19]等用LC-ESI/MS分析食品中4种苏丹红色素的方法,陈春晓,仲岳桐[20]建立了食品中对位红的高效液相色谱-串联质谱法检测方法,结果都较为满意。

2.3 保健食品中功效成分的分析

保健食品指具有特定保健功能的食品,适宜于特定人群食用,具有调节机体功能,不以治疗疾病为目的。长期以来,保健食品因具有促进健康的功效而受到消费者的青睐。我国的保健食品发展以来,各地食品卫生检验机构、大专院校、科研院所投入了大量人力、物力研究保健食品功效成分的测定方法,目前的主要检测方法有HPLC、TLC、GC、比色法等。液相色谱和气相色谱分析的都是功效成分明确的物质,定性、定量准确;薄层色谱主要用于定性鉴别;比色法测定的指标不能令人满意,一般是测定一大类物质的混和体,测定的结果不能确切代表功效成分,是过渡的测定方法。因此这些检测方法远远不能满足检测工作的需要,相当一部分保健食品的功能成分或不清楚,或清楚但没有检测方法[21]。而HPLC-MS联用技术在对保健食品功效成分进行分析时,可以同时得到化合物的保留时间、在线紫外光谱、分子量及特征结构碎片等丰富的信息,具有高效快速、准确、灵敏度高的特点,适合保健食品中功效成分的分析。

文开齐建立了高效液相色谱-紫外-电喷雾质谱(HPLC-UV-ESI/MS)联用测定槟榔食品中槟榔碱的方法[22]。以甲醇和0.1%三乙胺水溶液作流动相,在反相C18(5 μm,250 mm×4.6 mm)柱上梯度淋洗,以质谱定性,紫外定量进行检测。结果在0.2~20 μg·mL-1内峰面积和浓度呈良好的线性关系。该方法抗干扰能力强,可以快速、准确地测定槟榔食品中的槟榔碱。仲岳桐,何彩等[23]应用高效液相色谱-串联质谱联用法和固相萃取技术测定保健食品中的西地那非,在样品前处理步骤中应用固相萃取净化技术,于液相色谱仪上进行样品分离,用三重四极杆串联质谱检测器作定性和定量检测。固相萃取技术减少了杂质对质谱仪的污染,串联质谱检测器降低了基质对测定的干扰,方法的检测限为0.01 ng,变异系数<5.0%,回收率在90.2%~97.0%之间,方法测定特异性好,灵敏度高,定性定量准确,结果令人满意。张虹、吴雪美等建立了LC-MS分析冬虫夏草及其功能食品中的主要活性成分的研究[24],选取不同溶剂提取冬虫夏草样品,比较它们的提取效果,采用高效液相色谱-电喷雾质谱结合选择离子监测(SIR)法分析冬虫夏草中虫草酸,虫草素等活性成分,回收率为90%~110%,该方法灵敏度高,选择性好,操作简便,适用于冬虫夏草及其功能食品中的活性物质分析及产品质量控制。此外,Svetlana A. Lanina,Patricia Toledo[25]等比较了反相液相色谱-质谱联用电化学喷雾和大气压化学电离分析膳食维生素E,ESI和APCI都能在正电压和负电压区域分离的技术,结合LC-MS同时测定4种维生素同系物(α,β,γ和 δ),用甲醇/水(95∶5,V∶V)作为流动相,检出限维生素α,β,γ和δ分别是9、8、7.5和7.5 ng·mL-1。陈波,罗旭彪等[26]建立了高效液相色谱-紫外-电喷雾质谱(HPLC-UV-ESIPMS)联用测定保健食品中荷叶碱的方法。

3 HPLC-MS进展

HPLC-MS技术是一种普适性的分析技术,近年来获得了迅速的发展,在食品分析检验方面具有十分广阔的应用前景[27]。该技术路线的起点较高,故与目前的各种免疫法和高效液相色谱法相比,具有专一可靠、灵敏度高、操作简便、试剂成本低廉、可应对高通量的样品分析测试等特点,可对众多生物基质内的微量物质进行可靠的定量检测与定性验证,远远满足国内外对食品安全控制与监管的要求,与已成熟的GC-MS联用技术相比,HPLC-MS还处于发展阶段,但HPLC-MS所具备的一系列优点,决定了它的应用前景比GC-MS更为广泛。

HPLC-MS的发展可以说是接口技术的发展,扩大HPLC-MS应用范围以使热不稳定和强极性化合物在不加衍生化的情况下得以直接分析并将质谱分析用于生物大分子是液质接口技术的发展方向[28,29]。HPLC-MS各种“软”离子化接口技术,特别是大气压电离(API)技术的开发正是迎合了这个方向,简化了样品处理过程,被人们称为HPLC-MS技术乃至质谱技术的革命性突破。

HPLC/API/MS作为高灵敏度的简捷方法被广泛应用于食品分析的各个领域,API接口的研制成功,解决了HPLC流速与MS仪在真空条件下工作的匹配问题,扩大了HPLC /MS联用技术的应用范围,极大地促进了食品安全分析学科的发展。

在串联质谱方面,目前以四极杆串联质谱为主,它可进行MS1和MS2操作(空间上)。离子阱质谱和傅利叶变换质谱(FT-ICR-MS)亦可完成多级串联质谱分析(时间上),离子阱质谱通过改变阱里射频场最多可进行10级MS操作,FT-ICR-MS通过离子回旋共振进行多级MS操作。飞行时间质谱(TOF)作为第2个质量分析器,由于其分辨率高、质量范围宽、扫描快和灵敏度高等优点,成为一个重要的发展方向。

HPLC-MS/MS联用技术愈来愈多地受到人们的重视,一些国际著名的分析仪器公司和研究机构建立多个实验室参于研究开发。总之,为应用目的而建立的HPLC-MS/MS联用技术会越来越多,应用研究课题也会越来越多。

摘要：高效液相色谱-质谱联用技术是以高效液相色谱为分离手段,以质谱为鉴定工具的一种分离分析技术。本文介绍了高效液相色谱-质谱联用仪的基本原理和进展,及其在食品安全检测中的应用。