碱性蛋白酶范文

碱性蛋白酶范文（精选7篇）

碱性蛋白酶 第1篇

目前, 提高小麦蛋白乳化性的方法主要有以下4种, 分别包括化学法、物理法、酶解法和基因工程法。目前, 由于酶解法反应条件温和、能耗低, 安全天然, 逐渐成为研究热点, Kong X Z等[2]、张锐昌等[3]、齐军茹等[4]在小麦蛋白改性方面的研究选择了胰酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶等, 经过效果比较, 对小麦蛋白进行改性后, 则其分子结构发生了明显变化, 其酶解产物的一些功能性质发生了明显的变化, 如乳化性、水溶性、起泡性等, 因此可在食品及饲料开发中得到应用。其中, 碱性酶、胰酶等在条件为碱性的条件下对小麦蛋白的水解程度较大, 产生的改性效果也较为明显, 因此成为相关学者研究的重点。

本文选择乳化活力作为试验的指标设计正交试验, 对碱性酶水解小麦蛋白的工艺条件进行了较为系统的研究, 现将试验情况总结如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料包括济宁和美生物工程有限公司生产的碱性蛋白酶、徐州澳凯小麦淀粉有限公司生产的小麦蛋白粉、广东天地食品贸易有限公司生产的纯正花生油等。药剂包括十二烷基硫酸钠 (SDS) 、三氯乙酸 (TCA) 、福林试剂等, 其中甲醛、盐酸、氢氧化钠等为分析纯, 水为蒸馏水。仪器包括上海精密科学仪器有限公司生产的分光光度计 (752N) 、上海大中分析仪器厂生产的酸度计 (p HS-25B) 、国华电器有限公司生产的水浴锅 (HH-4) 、上海沪西分析仪器厂生产的恒温磁力搅拌器 (90-1型) 。

1.2 试验方法

1.2.1 蛋白酶活性测定。

采用福林-酚试剂法[5]测定蛋白酶活力。

1.2.2 小麦蛋白粉粗蛋白含量测定。

采用凯氏定氮法 (2010年标准) 测定小麦蛋白粉粗蛋白含量。

1.2.3 小麦蛋白粉乳化性测定。

测定小麦蛋白粉乳化性的方法为取0.1%蛋白溶液45 m L, 加入纯正花生油15 m L中, 在离心速度为10 000 r/min、室温下进行搅拌, 时间控制为1 min即可, 取样的时间分别在搅拌后的0、5、10 min, 取样的部位为底部[6]。以0.1% (w/v) 的SDS稀释100倍, 对500nm处的吸光值A500进行测定, 空白溶液选择SDS。乳化活力指数EAI可用零时刻的吸光值表示, 计算公式如下:

式 (1) 中, EAI表明蛋白质的乳化面积, 单位为m2/g;N表示稀释倍数;Ф表示油相所占的分数, 本试验中油相占1/4;C表示蛋白质的浓度, 单位为g/m L;L表示比色池光径, 单位为1 cm。

以5、10 min时刻的吸光值表示乳化稳定指数 (ESI) :

式 (2) 中, A0表示零时刻的吸光值;At表示t时刻时的吸光值;ΔT表示时间差;ΔA表示ΔT内的吸光值差。

1.2.4 小麦蛋白粉乳化性影响的单因素考查。

(1) 温度对小麦蛋白粉乳化性的影响。取5份小麦蛋白粉5 g溶解在蒸馏水95 m L中, 并将p H值调到8.5, 加入碱性蛋白酶0.05 g, 分别在40、45、50、55、60℃的水浴锅中进行反应, 滴定的试剂选择1 mol/L Na OH, p H值控制为8.5, 反应时间达到2 h后, 将5份反应样均放在温度为95℃下进行灭酶, 时间为10 min, 然后按照1.2.3中的方法, 对乳化活力指数进行测定。

(2) p H值对小麦蛋白粉乳化性的影响。准备5份小麦蛋白粉5g溶解于95 m L的蒸馏水中, 加入适量的碱性蛋白酶 (0.05 g) , 将p H值分别调节为7.5、8.0、8.5、9.0、9.5, 然后将5份样品均放在温度为50℃的水浴锅中反应, 滴定的试剂为1 mol/L Na OH, p H值应保持恒定, 反应的时间达到2 h后, 在温度为95℃下进行灭酶, 时间控制为10 min, 然后按照1.2.3中的方法, 进行乳化活力指数的计算。

(3) E/S (碱性蛋白酶/小麦蛋白粉质量比) 对小麦蛋白粉乳化性的影响。准备5份小麦蛋白粉5 g溶解于95 m L的蒸馏水中, 并将p H值统一调至8.5, 分别加入碱性蛋白酶0.025、0.050、0.075、0.100、0.125 g, 然后放在温度为50℃的水浴锅中进行反应, 滴定的试剂选择1 mol/L Na OH, p H值维持在8.5, 反应时间达到2 h后, 5份样品均放置在温度为95℃的条件下进行灭酶处理, 时间控制在10 min, 然后按照1.2.3中的方法, 对乳化活力指数进行测定。

1.2.5 正交试验设计。

根据单因素试验结果, 以乳化活力指数为指标, 确定了三因素三水平L9 (34) 的正交试验, 各因素水平设计见表1。

2 结果与分析

2.1 样品蛋白酶活力

经过试验, 样品蛋白酶活力测得为133.05 U/g。

2.2 小麦蛋白粉粗蛋白含量

经过试验, 小麦蛋白粉粗蛋白含量测得为75%。

2.3 温度对小麦蛋白粉乳化性的影响

由图1可知, 随着反应温度的增加, 小麦蛋白粉的乳化活性逐渐降低。可知, 反应温度为40℃时的小麦蛋白粉乳化活性最好。温度在45~50℃之间, 乳化活力指数趋于平稳;而在50~60℃乳化活力指数呈下降趋势。由图2可知, 在温度为45℃时, 乳化稳定性 (ESI) 达到最好, 说明此时的小麦蛋白粉乳化稳定性活性比较稳定。

2.4 p H值对小麦蛋白粉乳化性的影响

由图3可知, 随着p H值的升高, 产物的乳化活性呈先上升后下降, 在碱性条件中, 氨基酸为阴离子, 氨基反应性较强, 因此p H值增加会加速Maillard反应[7], 进而促进小麦蛋白酶解。因此, 乳化活性的p H值为7.5~8.0之间较好, 其他p H值范围内较差。由图4可知, 在5 min时刻, p H值为8时, 小麦蛋白粉的乳化稳定性达到最好;在10 min时刻, p H值为9时, 小麦蛋白乳化稳定性达到最好。

2.5 E/S (碱性蛋白酶/小麦蛋白粉质量) 对小麦蛋白粉乳化性的影响

由图5可知, E/S为2.5%时乳化活性最好, EAI为12.16m2/g;E/S为0.5%~2.5%乳化稳定性变化趋势呈波动型。在选定范围内, 乳化活性变化为下降后上升, 下降后再上升的趋势。由图6可知, 在E/S为1.50%时, 小麦蛋白粉的乳化稳定性最好。

2.6 正交试验结果分析

表2、表3是碱性蛋白酶水解小麦蛋白粉的正交试验结果、极差以及方差分析。

由表2可知, 通过正交试验结果和极差分析可以得到最佳改性条件为p H值7.5、E/S为2.5%、温度为60℃。各因素对提高小麦蛋白粉乳化性的重要性按大小次序为p H值>E/S>温度。根据分析, 最佳条件下的EAI为15.48 m2/g。由表2可看出, 3个因素对小麦蛋白粉乳化活力指数均无显著影响[8]。

3 结论

以乳化活力指数为指标, 采用单因素和正交实验研究了碱性蛋白酶对小麦蛋白水解最适条件。结果表明:3个因素对小麦蛋白粉乳化性的影响由强到弱的顺序为p H值>碱性蛋白酶/小麦蛋白粉质量>温度, 最佳酶解条件为p H值7.5、底物浓度2.5%、温度60℃, 此时的乳化性达到最高, EAI为15.48 m2/g。各因素对小麦蛋白粉乳化性的影响都不显著。酶法改性小麦蛋白粉生产乳化剂不仅成本低廉, 而且天然健康, 若能工业化生产天然食品添加剂, 具有巨大的市场潜力。

参考文献

[1]阙斐, 赵粼, 陈锡威.胰酶提升小麦蛋白酶解产物乳化活性工艺及其功能特性研究[J].食品工业科技, 2014 (10) :303-307.

[2]KONG X Z, ZHOU H, QIAN H F.Enzymatic preparation and functional properties of wheat gluten hydrolysates[J].Food Chemistry, 2007, 101:615-620.

[3]张锐昌, 徐志宏.小麦蛋白酶解物功能性质的研究[J].粮食与饲料工业, 2011 (7) :27-30.

[4]齐军茹, 王兰, 李瑜.中性蛋白酶对小麦面筋蛋白的水解改性研究[J].郑州工程学院学报, 2001, 22 (4) :46-49.

[5]李伟格, 李美同, 苏晓鸥, 等.饲料分析及饲料质量检测技术[M].北京:中国农业科技出版社, 1998:5.

[6]王亚平, 王金水, 张伟红, 等.乳糖改性提高谷阮粉乳化性研究[J].食品工业科技, 2005, 26 (4) :77-80.

[7]程辉, 黄河龙, 谢小勇.水溶性小麦蛋白制备工艺研究[J].粮食与油脂, 2008, 11 (8) :23-24.

牦牛蹄碱性蛋白酶脱毛关键技术研究 第2篇

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

牦牛蹄由青海绿草源食品有限公司提供, 菌种Bacillus pumilus UN-31-C-42由四川大学生命科学学院赠, 枯草杆菌Bacillus subtilis由青海大学农牧学院微生物实验室保存。

1.1.2 培养基

LB培养基, 购自西宁中正化玻试剂公司, 产酶培养基自行配制。

1.1.3 试验设备

回旋式汽浴恒温振荡器 (SHZ-82, 金坛市科析仪器有限公司) , 隔水式电热恒温培养箱 (PYX-DHS, 上海市跃进医疗器械一厂) , 离心机 (TGL-16C, 上海安亭科学仪器厂制造) , 721分光光度计 (上海第三分析仪器厂) , 手提式压力蒸汽消毒器 (GMSX-280, 北京市永明医疗仪器厂) 。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化

首先将菌种在LB培养基上活化, 然后将在LB斜面上37℃下培养18 h的Bacillus pumilus UN-31-C-42菌苔, 用无菌生理盐水洗下, 制成菌悬液 (A600 0.7) 。吸取1 m L菌悬液接种到装有50 m L基础发酵培养基的250 m L三角瓶中, 采用L9 (34) 正交设计进行蛋白酶发酵条件试验。

1.2.2 蛋白酶活力测定

利用Fulin法进行蛋白酶活力定量测定。

1.2.3 脱毛试验

采用综合脱毛工艺, 大毛先用炭火烧烤, 去除大部分毛的同时产生烧烤味道, 再用文火烧烤, 烤2～5 min用刀刮1次, 再用100℃水浸烫1 min, 使皮子收缩, 根毛外露, 同时刀刮去毛, 洗净, 除去水分, 准确切取1 cm×2 cm皮块若干, 分别放入100 m L三角瓶中, 加入20 m L发酵液上清液, 将pH值调整为7.5左右, 封口, 置34℃摇床中, 在不同时间内观察其脱毛程度。

1.2.4 牦牛蹄制品工艺流程

精选牦牛蹄→炭烤→刮毛→100℃浸烫1 min→刮毛→蛋白酶去根毛、蹄夹毛→流动水漂洗12 h→滚揉→预煮→加调味料蒸煮七成熟→控汤汁→熏烤→过秤→装袋→杀菌→保温→装箱→入库。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶浓度标准曲线的绘制

用Folin法测定蛋白酶浓度, 绘制出标准曲线, 见表1。

2.2 正交试验

L9 (34) 短小芽孢杆菌UN-31-C-42最佳产酶条件的确定。

2.2.1 正交试验因素水平表

设计L9 (34) 正交试验因素水平表确定菌株最佳产酶温度、因素及时间, 见表2。

2.2.2 正交试验因素结果分析 (见表3)

由表3所示可知:RA, RC较大, RB较小, 以最小RB作误差估计, RA、RC分别是RB2倍以上, 由此可知A、C为影响酶浓度大小的重要条件, B处于次要地位。再结合各因子K值愈大愈好来看, 用A2、B1、C2组合比其他明显地要好, 由此确定产酶最佳条件为;温度34℃, pH值7.0, 发酵时间48 h。

2.3 脱毛试验

2.3.1 脱毛时间

在相同的蛋白酶活力和脱毛条件下, 对短小芽孢杆菌UN-31-C-42和阴性对照菌株枯草杆菌的发酵液进行了不同时间脱毛试验, 结果见表4。

注:1为毛无松动感;1～2为毛开始松动, 表皮未动;2～3为大部分毛不费力能拨掉, 表皮已开始松动;3为尚有小部分毛要稍用力可拨掉, 表皮已松动;4为在整块皮上的毛及表皮用手一抹即掉。

从表4可以看出, 随着脱毛时间的延长, 脱毛效果越来越明显, 24 h效果最好。

2.3.2 pH值

在pH值7.0的条件下, 于短小芽孢杆菌UN-31-C-42发酵液中加入不同浓度的Na Cl, 作用36 h结果见表5。

从表5可以看出, 1%盐浓度脱毛效果最好。

3 讨论

3.1 蛋白酶脱毛

是一种酶促反应的结果, 因此它受到酶浓度、反应温度、pH值、脱毛时间等因素的影响。研究发现, 酶液浓度越高, 脱毛速度愈快。因此笔者试验获得的最佳的脱毛温度为34℃, pH值为7.0, 脱毛时间24 h。同时pH值的确定需要考虑到产品的食用性, 过酸过碱不宜食用, 故pH值确定在7.0左右, 脱毛时间36 h最佳, 脱毛时间不宜过长, 否则容易烂皮。

注:1为毛无松动感;1～2为毛开始松动, 表皮未动;2～3为大部分毛不费力能拨掉, 表皮已开始松动;3为尚有小部分毛要稍用力可拨掉, 表皮已松动;4为在整块皮上的毛及表皮用手一抹即掉。

3.2 振荡脱毛

笔者研究尝试振荡脱毛, 结果发现比静置脱毛效果更好, 且在发酵培养液中加入1%的Na Cl, 增强了脱毛效果。

3.3 菌科结构

在脱毛试验中发现菌种枯草杆菌UN-31-C-42对羊蹄的脱毛效果较牦牛蹄的脱毛效果好, 推测可能与二者蹄部的组织结构有关。

3.4 抑菌

在发酵制取酶液过程中应注意无菌操作, 否则会因杂菌污染而影响酶液的脱毛效果。

3.5 牦牛蹄制品加工工艺的改进

(1) 生产时由于牦牛蹄大部分是筋腱, 调料和盐份难以入味, 煮制时结合中式肉制品的调味料, 煮七成熟时即停火带汤腌制10～12 h, 使调料味、盐味彻底吃透, 第2天捞出, 装袋, 抽真空, 121℃杀菌, 这样做出来的产品不仅香气足, 调味料渗透均匀。

(2) 针对高温杀菌时牛蹄过于熟烂, 无咬头, 用小火100℃炖30 min后, 牛蹄七成熟时就装袋高温杀菌, 保证了成品牛蹄的韧劲和口感。

(3) 针对现在人们喜欢带骨产品的特点, 只将牛蹄的大骨剔除, 小骨予以保留, 保留了产品的民族区域特色。

碱性蛋白酶 第3篇

但未经处理的玉米蛋白粉颜色深黄, 含脂量较高, 并具有强烈的异味, 影响着酶解产品的质量及酶的水解率, 因此, 采用玉米蛋白粉制备活性肽之前应最大限度地除去原料中所含色素、脂类及异味。本文首先采用有机溶剂对原料进行预处理, 然后用碱性蛋白酶进行水解玉米蛋白粉的一系列研究, 为玉米蛋白粉的综合利用打下了一定基础。

1 试验材料与方法

1.1 主要仪器

恒温水浴振荡器、pH计、水浴锅及高压灭菌锅。

1.2 主要试剂及原料

无水乙醇、95%乙醇、丙酮和石油醚;Alcalase碱性蛋白酶, 诺维信酶制剂有限公司;玉米蛋白粉, 山东鲁洲生物科技有限公司。

1.3 试验方法

蛋白质含量的测定, 采用微量凯氏定氮法;水解度 (DH) 的测定, 采用甲醛滴定法和pH-Stat法;脂肪含量的测定, 索氏抽提法;水分的测定, 快速水分测定仪;灰分的测定, 直接烧灰法。

2 结果与分析

2.1 玉米蛋白粉预处理有机溶剂的选择

本试验分别选用了无水乙醇、丙酮、三氯甲烷、正已烷及石油醚为处理溶剂, 以去除的色素含量为指标, 来确定有机溶剂的选用, 试验结果如图1所示。

以色素的吸光度高低表示去除色素的多少, 由图1可知:无水乙醇对色素的的浸出最大, 故选无水乙醇用于原料的预处理。

2.2 无水乙醇对玉米蛋白粉的预处理

称取一定量的玉米蛋白粉, 加入无水乙醇后, 按条件优化试验确定的温度及处理时间进行处理, 玉米蛋白粉处理前后其成分变化见表1。

由表1可知:玉米蛋白粉经处理后, 脂肪含量明显下降, 色素去除率达到95%以上, 更有利于下一步碱性蛋白酶的水解。

2.3 高温预处理对玉米蛋白粉水解度的影响

本试验中采用了高温预处理法, 分别将经有机溶剂处理过的玉米蛋白粉按固液比1∶10配制成悬浮液, 分别在80、100和121℃条件下进行热处理10、20、30、40和50min, 在碱性蛋白酶加酶量4% (E/S) 、温度50℃及pH值9.0的条件下水解2h, 水解结束后, 沸水浴10min灭酶, 离心, 测水解度, 结果如图2所示。

由图2可知:随着温度的升高及时间的延长, 水解率也越来越高, 时间到30min后, 上升趋势缓慢, 因此我们选择121℃, 30min做为处理时间。

2.4 碱性蛋白酶单因素及正交试验条件的筛选

2.4.1 碱性蛋白酶水解pH值对玉米蛋白粉水解的影响

pH值是影响酶解反应的主要因素之一。酶活性部位与蛋白质的作用位点随pH值的不同而不同, 在最适作用pH值下, 酶分子可以更好的结合于底物的作用位点发挥最佳反应。

由图3可知:碱性蛋白酶作用最佳pH值为9.5~10之间。

2.4.2 碱性蛋白酶水解温度对玉米蛋白粉水解的影响

每种酶反应都有其最适反应温度, 在此温度下, 酶的反应速度最快, 由图4可知:随着反应温度的升高, 酶反应速度逐渐加快, 但高于55℃, 酶反应速度迅速下降, 这与温度升高造成酶的活性下降有关。因此碱性蛋白酶作用最适温度为50~55℃之间。

2.4.3 碱性蛋白酶加酶量对玉米蛋白粉水解的影响

在底物浓度一定时, 玉米蛋白粉的水解率取决于酶浓度, 酶浓度越大, 与底物作用位点接触的越多, 水解度就越大, 但考虑到生产成本, 我们将加酶量 (E/S) 定在4%。

2.4.4 碱性蛋白酶水解时间对玉米蛋白粉水解的影响

由图6可知:反应开始时, 因底物浓度较高, 随着水解时间的增加, 水解度逐渐上升, 但随着时间延长, 作用位点越来越少, 因此水解度也逐渐变缓, 因此我们选择2~3h为反应终点。

2.4.5 碱性蛋白酶水解正交试验极差分析结果

在上述单因素试验的条件下, 我们就温度、时间、p H值及酶量进行了L9 (34) 正交试验方案设计, 结果见表2。

通过极差分析, 得出各因素对水解度的影响大小顺序为加酶量>时间>pH值>温度, 最佳配比为C3D3A2B2, 即加酶量为5%、水解时间为2.5h、p H值9.5、温度55℃, 在此最佳试验条件下, 水解度达到17.9%。

3 讨论

(1) 玉米蛋白粉是玉米湿法制取淀粉的副产物, 除含有蛋白质外, 还有脂肪和色素等杂质, 还有一定的异味, 在玉米蛋白粉水解过程中, 如果不把脂肪和色素等杂质去除, 将降低酶的效率, 且给后处理过程造成不必要的困难。本试验中我们将玉米蛋白粉用无水乙醇处理, 使其脂肪和色素含量大幅度降低, 有利于后续酶解的进行。

(2) 玉米蛋白粉结构紧密, 使其酶的作用位点卷曲于蛋白分子内部使成球状, 不易被蛋白酶活性部位接触而降解, 因此必须采用预处理使其立体空间结构破坏, 从而使酶更好地作用于其作用位点进行降解。本试验中我们采用了高温预处理对蛋白粉进行了处理, 经试验, 在121℃处理30min蛋白水解度达到最高。

(3) 玉米蛋白粉经无水乙醇和高温预处理后, 我们做了碱性蛋白酶水解玉米蛋白粉的单因素及在此基础上做了正交试验, 得出最佳水解条件为加酶量5%、水解时间2.5h、p H值9.5~10和温度55℃, 在此最佳试验条件下, 水解度达到17.9%。

(4) 本试验中蛋白粉降解的水解度采用了甲醛滴定法, 为了与报导中的蛋白水解度做比较, 为此, 我们在上述最佳试验条件下, 进行了甲醛滴定法与p H-Start法测定值的比较, 经试验, 甲醛滴定法蛋白水解度为17.9%时, 而用p H-Start法计算水解度为34.9%。因此, 在本试验中甲醛滴定法测定的结果偏低。

参考文献

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[2]藤蔽, 柳琪, 等.玉米黄粉的综合利用研究[J].氨基酸与生物资源, 1995, 17 (1) :33-34.

[3]郑冬梅, 孔保华, 李升福.玉米蛋白及其水解肽的研究动态[J].食品与发酵工业, 2002, 11 (28) :55-59.

[4]刘勇刚, 李世敏, 郭爱光.玉米活性肽研究进展[J].深圳职业技术学院学报, 2004 (1) :28-31.

[5]陈新, 陈庆森, 庞广昌.酶解玉米蛋白生产生物活性多肽的研究现状及开发趋势[J].食品科学, 2004, 25 (7) :202-205.

[6]Yamaguchi M., Takeuchi M., Ebihara K..Inhibitory effect of pep-tide prepared from corn gluten meal on7, 12-Dimethylbenz an-thraceneinduced mammary tumor progression in rats[J].Nutrition Research, 1997, 17 (7) :1121-1130.

[7]天津轻工业学院, 等.工业发酵分析[M].北京:中国轻工业出版社, 1980.

碱性蛋白酶 第4篇

1. 材料与方法:

1.1 化学试剂和培养基

化学试剂均为国产分析纯。

发酵培养基:牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、水1000mL, pH调至7.0, 121℃灭菌20min

溴钾酚绿脱脂牛奶培养基:脱脂奶粉100g、1.6%溴钾酚绿酒精溶液1.4mL、琼脂20g、蒸馏水1000mL, pH调至6.8, 115℃灭菌20min

1.2 主要溶液

磷酸氢二钠—磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾—氢氧化钠缓冲液、巴比妥钠—盐酸缓冲液、Tris—盐酸缓冲液等。

1.3 芽孢杆菌蛋白酶的发酵及性质检测

1.3.1 芽孢杆菌蛋白酶在发酵过程中活力曲线测定

利用发酵培养基在28℃, 120r/min条件下进行摇瓶发酵。

每隔4h取发酵液在溴钾酚绿脱脂奶粉培养基平板上检测酶活, 37.0℃温育12h, 根据透明圈直径 (dH) 和牛津杯直径 (dC) 之比 (dH/dC) 表示发酵过程中相对蛋白酶活力的变化。

1.3.2 不同缓冲体系对酶活性的影响

缓冲液与酶液1∶1体积混合, 50℃水浴50min后测定酶活力 (酶液与无菌水1∶1混合作对照) 。

1.3.3 蛋白酶的酶学性质研究

(1) 蛋白酶最适作用温度:发酵液低温离心 (8000r/min, 20min) 去菌体, 酶液分别于5, 11, 20, 30, 40, 50, 60, 70℃条件下保温40min, 测定蛋白酶活力, 以pH值为横坐标, 相对酶活力为纵坐标作图。

(2) 蛋白酶热稳定性:酶液50℃恒温水浴中分别温育10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80min后测定酶活力。

(3) 蛋白酶的最适作用pH:用1mol/L盐酸溶液或者1mol/L氢氧化钠溶液分别将酶液pH调至3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 6.7, 7.0, 7.2, 7.5, 7.7, 8.0, 8.5, 9.0, 50℃水浴50min后测定酶活力。

1.3.4 沉淀分离纯化实验

(1) 硫酸铵Ks分段盐析法:设定硫酸铵饱和度分别为0%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 4℃盐析过夜 (12h) , 分别离心 (12000r/min, 20min, 4℃) , 用与上清液体积相同的无菌水溶解沉淀, 然后再和上清液分别测定酶活力, 以硫酸铵饱和度为横坐标, 相对酶活力为纵坐标作图。

(2) 硫酸铵β分段盐析:将硫酸铵饱和度达到40%的酶液分成三组, 每组处理5个不同的pH梯度即pH5～9, 间隔为1, 分别在5℃、25℃、37.5℃条件下保温8h, 之后测定剩余酶活力。

(3) 丙酮沉淀:酶液与丙酮按1∶1.2, 1∶1.5, 1∶2.0体积比混合均匀, 4℃过夜处理, 测定酶活力。

(4) 聚乙二醇沉淀实验:取30%、50%的PEG2000和PEG20000溶液, 将其与酶液按1∶1等体积混合均匀, 4℃过夜处理, 测定酶活力。

2. 结果与讨论

2.1 芽孢杆菌蛋白酶的发酵及酶活检测

用溴钾酚绿牛奶蛋白平板对发酵过程中该芽孢杆菌抗氧化碱性蛋白酶进行显影, 测定酶活力变化如图1:

该芽孢杆菌蛋白酶产量在16～20左右达到最高水平。酶活显影的最佳时间在12h左右, 按1.6%的溴钾酚绿酒精溶液配制脱脂牛奶培养基可以加强显影效果。

2.2 酶学性质的研究

2.2.1 酶最适作用温度的研究

通过蛋白显影平板上dH/dC测定, 确定该蛋白酶的最适作用温度, 见表1。

该蛋白酶的最适作用温度在50℃左右, 低于50℃时, 酶活差异不明显, 但超过50℃蛋白酶活性开始迅速下降, 该蛋白酶的活性温度范围更倾向于较低温度。一定程度上也揭示了发酵工业中, 微生物的生长繁殖的适宜温度与大量积累代谢产物适宜温度的不相关性。曾有报道枯草芽孢杆菌 (As1.398) 进行中性蛋白酶发酵时, 其生长繁殖温度要求经过前期升温阶段, 即从 (31±1) ℃开始, 逐步升至40℃然后再冷却至 (31±1) ℃进行发酵大量积累蛋白质, 其蛋白酶活力比前期不升温者可提高66%。一般说来, 发酵温度比种子培养温度高一些, 对产酶有利。

2.2.2 蛋白酶热稳定性的研究

根据酶活显影数据可以显示该蛋白酶热稳定性较好, 50℃条件下处理50min, 酶活性仍残留86%。

2.2.3 蛋白酶最适作用pH

图2显示该蛋白酶的最适pH值是7.7, 但该蛋白酶pH耐受范围有限, 仅在中性偏弱碱性条件下可以保持较好的蛋白酶活性。

2.2.4 酶对不同缓冲体系的适应性

(注:C:Na2HPO4—KH2PO4,

E:巴比妥钠—HCl,

从以上5种不同缓冲液对酶稳定性影响可知, 不同的缓冲液因其离子种类和缓冲范围等对酶活影响不同, 应据蛋白酶的应用方向选取适宜的缓冲作用体系, 就碱性蛋白酶而言, 可以优先考虑巴比妥钠—盐酸缓冲液的使用。

2.3 沉淀分离纯化实验

2.3.1 Ks分段盐析实验

不同饱和度的硫酸铵对蛋白酶活性影响如图4。

实验数据分析可以看出, 用硫酸铵进行Ks分段盐析实验时, 沉淀的酶活力比上清液的酶活力要好, 当硫酸铵饱和度为40%时, 沉淀中蛋白酶活性显影情况最好。40%硫酸铵饱和度时, 不同温度不同pH值条件作用, 通过实验获得β分段盐析实验结果:5℃沉淀效果最明显, 酶活力最高, 且当pH为9.0时, 沉淀的蛋白酶回收率为95%左右。

2.3.2 丙酮沉淀实验

丙酮与酶液按比例混合作用, 离心后所得的上清液酶活显影都不明显, 而沉淀的酶活显影情况较好, 尤其当粗酶液与丙酮1∶1.2体积混合时, 收集酶活力最好, 此时蛋白酶回收率达82%, 1∶2体积时次之, 1∶1.5体积混合时蛋白酶沉淀效果再次之。

2.3.3 聚乙二醇沉淀实验

实验数据表明, 聚乙二醇可以有效沉淀蛋白酶, 且体积分数30%效果优于50%, 其中30%PEG-20000沉淀中的蛋白酶活性最好, 其蛋白酶回收率达到89%。

3. 结论

芽孢杆菌产蛋白酶Ⅳ号菌株的酶产量在16～20h左右达到最高水平, 酶活显影的最佳时间为12h, 该菌株的最适作用温度为50℃, 不同的缓冲液对酶活影响不同, 最适作用pH值为7.7。同时沉淀分离纯化实验的结果表明:采用硫酸铵盐析沉淀法作用于蛋白酶, 蛋白酶分离回收效果明显, 回收率达到95%。

摘要：土壤中筛选获得一株产碱性蛋白酶的芽孢杆菌。该蛋白酶发酵16h达到产酶高峰, 蛋白酶热稳定性较好, 50℃条件下处理50min, 酶活性残留86%, 最适pH值7.7, 丙酮、PEG等可有效沉淀蛋白酶, (NH4) 2SO4在5℃, pH9.0条件下可沉淀分离蛋白酶, 回收率达95%。

关键词：蛋白酶,酶学性质,沉淀分离,芽孢杆菌

参考文献

[1]Zhang M, Zhao C, Du LX, Lu FP, Gao C.Expression, purification, and char-acterization of a thermophilic neutral protease from Bacillus stearothermophilus in Bacillus subtilis.Science in China Series C:Life Sci-ences.2008.51 (1) :52～59

[2]雷晓燕, 王志刚.土壤中产碱性蛋白酶细菌的筛选及产酶条件优化.沈阳化工学院学报.2007 (.2) 3:174～178

[3]唐雪明, 王正祥, 邵蔚蓝, 刘吉泉, 方慧英, 诸葛健.碱性蛋白酶工程菌发酵条件及重组酶的纯化和性质的研究.生物工程学报.2002 (.18) 6:729～734

[4]李建武, 萧能, 余瑞元等.生物化学实验原理和方法.北京:北京大学出版社, 1994.405～408

碱性蛋白酶 第5篇

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集于我科治疗的急性颅脑损伤患者33例, 年龄12岁~83岁, 男21 例, 女12 例。均于伤后24 h内入院, 行头颅CT或腰椎穿刺检查确诊, 其中单纯广泛性脑挫伤12 例, 单纯硬膜外血肿8例, 弥漫性轴索损伤10例, 合并脑内血肿8例。排除脑脊液漏及开放性颅脑损伤病例, 且无严重胸腹部及四肢脊柱外伤, 既往无神经系统病, 无合并严重心肺功能不全, 心肌缺血及急慢性肾衰。入院后行格拉斯哥昏迷评分 (GCS) , 将患者分为轻中型 (9分~13分) 20 例, 重型 (3分~8分) 13例。另选15例同期在本院普外住院拟行腰椎麻醉手术的非创伤患者为对照组。经χ2及t检验年龄、性别与对照组差异无统计学意义 (P>0.05) 。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集 所有急性颅脑损伤患者于创伤后≤12 h、4 d~6 d、10 d~12 d行腰椎穿刺取脑脊液2 mL (若颅内压达300 mmH2O以上时先静脉输注20%甘露醇250 mL 30 min后再取脑脊液) , 低温-70 ℃保存待测。对照组入院后记录一般项目并给予常规检查及治疗, 择期手术腰椎麻醉中收集CSF标本。

1.2.2 CSF中MBP检测 采用ELISA测定CSF中MBP浓度, 试剂盒由USCNLIFE公司提供。检测仪器采用Biorad酶标仪和自动洗板机。

1.2.3 预后判定分析 GOS 1分~3分为预后恶劣组, 4分~5分为预后良好组。患者于伤后2周或死亡前行GOS评价:死亡, 1分;植物生存2分;重度病残, 意识清楚, 生活不能自理3分;中度病残, 生活自理4分;恢复良好, 正常生活但有轻度神经障碍5分。

1.3 统计学处理 应用SPSS 13.0软件包。数据以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示, 采用t检验, MBP与GOS、GCS间采用直线相关分析, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 颅脑损伤患者CSF中MBP含量

颅脑损伤轻中型组、重型组患者于伤后≤12 h、3 d~6 d、10 d~12 d脑脊液MBP水平均高于对照组 (P<0.05) 。对于脑创伤后不同时期, 重度组的脑脊液MBP水平明显高于轻中度组 (P<0.05) 。详见表1。

2.2 MBP与患者意识状态的关系

33例急性颅脑损伤患者中意识障碍22例 (昏迷14例为9.48 μg/L±0.32 μg/L, 嗜睡8例为3.65 μg/L±0.82 μg/L) , 11例意识清醒者MBP值为1.23 μg/L±0.16 μg/L, 意识障碍越重, MBP含量越高 (P<0.05) 。

2.3 急性颅脑损伤患者MBP与GCS, GOS的关系

相关检验发现, MBP与GCS 呈明显负相关 (r=-0.612, P< 0.01) , 与GOS也呈明显负相关 (r=-0.598, P< 0.01) 。

3 讨 论

MBP是中枢白质髓鞘上特有的膜蛋白, 具有显著的组织和细胞特异性, 即只在中枢神经系统少突胶质细胞和周围神经的雪旺氏细胞内合成, 占髓鞘蛋白总量30%, 与髓鞘脂质紧密结合, 起着维持中枢神经系统髓鞘结构和功能稳定的作用[3]。当头部外伤引起神经组织细胞破坏并累及髓鞘时, MBP即可进入CSF中, 并经受损的血脑屏障渗透于血液。

急性颅脑损伤后CSF中MBP在发病24 h内达到高峰, 而发病后3 d~5 d才逐渐释放到血液中, 故在发病早期检测CSF中MBP含量的变化较血更具有临床价值, MBP含量的变化与病情呈正相关。提示颅脑损伤后脑实质损害程度和临床症状、体征的轻重与脑脊液MBP含量呈一致性[4,5]。

本组资料表明, MBP在急性颅脑损伤组患者中高于对照组 (P<0.05) , 且轻中型组与重型组在急性期的CSF中MBP含量升高, 组间也有统计学意义 (P< 0.01) 。MBP水平的增高发生在脑实质性损伤的不同时期, 即CSF中MBP的变化趋势是脑实质性损伤早期就达到峰值, 随后逐渐降低;而血清的变化趋势为脑实质性损伤早期不一定升高, 水平较低, 然后逐渐升高后再下降, 与急性脑实质性损伤具体情况有密切关系[4]。提示脑实质损伤越重, CSF中 MBP含量越高;CSF中 MBP含量与颅脑损伤有关颅内血肿大小, 脑挫裂伤的范围关系密切。血肿越大, 脑挫裂伤范围越大其含量越高, 提示脑实质损害血脑脊液屏障越重。颅脑损伤后脑脊液MBP含量增高, 反映了脑实质损害和神经脱髓鞘的病理变化过程, 对判断颅脑损伤的严重程度及预后有重要价值[6,7,8]。

对脑外伤病例进行CSF的 MBP定量测定, 从生化指标角度来反映脑实质损害与血脑屏障破坏的程度, 结合影像学诊断有助于从不同侧面了解脑实质损伤和神经脱髓鞘及血脑屏障破坏的程度, 可较真实地反映患者病变的实际状况, 并弥补了CT 检查的不足, 是辅助临床诊断弥漫性颅脑损伤的有力手段。同时了解脑外伤患者CSF中MBP含量变化, 不仅能及时对脑损伤的程度和类型作出初步判断, 而且还能间接了解血脑屏障的受损程度, 有助于客观评估脑损伤的演变过程, 且对临床用药的选择具有一定的参考价值[9,10,11]。

摘要：目的探讨急性颅脑损伤患者脑脊液 (CSF) 中髓磷脂碱性蛋白 (MBP) 的含量变化及其临床意义。方法采用酶联免疫吸附法 (ELISA) 测定33例急性颅脑损伤患者CSF中MBP, 另以15例同期在本院普外住院拟行腰椎麻醉手术的非创伤患者为对照组。结果急性颅脑损伤组CSF中MBP含量明显高于对照组 (1.053±0.207) μg/L, 不同病情组间CSF中MBP含量比较有统计学意义 (P<0.01) 。MBP与格拉斯哥昏迷评分 (GCS) 、格拉斯哥预后分级 (GOS) 呈明显负相关。结论急性颅脑损伤患者CSF中MBP含量升高, 脑实质损伤程度越重, 其脑脊液MBP含量升高越明显, 检测CSF中MBP含量变化对判断颅脑损伤病情及其预后有一定实用价值。

碱性蛋白酶 第6篇

1 材料与方法

1.1 实验动物及方法

豚鼠22只,雌雄各半,7～8周龄,体重200 g左右,利用髓鞘碱性蛋白作为抗原,复制MS的动物模型EAE,在每只大鼠的双侧后足跖一次性皮下注射含有豚鼠MBP 25μg的弗氏完全佐剂(FCA)200μL,模型制备成功的表现为急性、严重的单向病程,可自发缓解。将试验动物随机分为两组,对照组予以EAE+生理盐水,共10只,研究组在EAE诱导的第1～7天,每日腹腔内注射剂量为1 mg/kg的FK506,共12只,其中急性发作期8只,缓解期4只。

1.2 统计学方法

数据采用SPSS 13.0进行统计学处理,计量资料采用均数±标准差表示,组间比较采用t检验或进行方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠及对照组血清和脑脊液中MBP水平比较

研究组大鼠血清和脑脊液中的MBP水平均显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。且两组脑脊液中的MBP水平均显著高于血清中MBP水平,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

注:与同组血清MBP比较,#P<0.05

2.2 大鼠急性发作期及缓解期MBP在血清及脑脊液中的变化情况比较

研究组MS大鼠急性发作期及缓解期血清及脑脊液中MBP水平分别明显高于对照组,差异有高度统计学意义(P<0.01),且MS急性发作期MBP水平血清及脑脊液中均分别显著高于MS缓解期,差异有高度统计学意义(P<0.01),且MS大鼠其脑脊液MBP和血清MBP水平呈正相关(r=0.562,P<0.01)。见表2。

2.3 研究组大鼠血清和脑脊液治疗前后不同时间MBP水平的变化情况比较

12只大鼠予以他克莫司注射后,结果显示,治疗后的第3天及治疗后第7天血清和脑脊液MBP水平均较治疗前明显降低(P<0.01),且脑脊液MBP水平较血清MBP水平降低更明显,差异有统计学意义(P<0.01),见表3。

3 讨论

MS是一种中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病,其病因及病理学机制至今仍未完全阐明,但MS自身免疫的发病机制已得到证实和公认[5]。各种原因导致髓鞘破坏后,血清或脑脊液中的MBP浓度增高,因此测定血清和脑脊液MBP的水平,可以用于反映中枢神经系统有无实质性损害及有无髓鞘脱失[6]。由于MS患者的免疫功能异常,使MBP具有抗原性,引起T淋巴细胞致敏活化,而致敏的T淋巴细胞反应对髓鞘有很大的破坏作用[7]。

注:与缓解期比较,*P<0.01;与对照组比较,△P<0.01

本组资料显示,研究组大鼠血清和脑脊液中的MBP水平均显著高于对照组(P<0.05),提示检测MBP含量变化是诊断MS的一项有价值的生化指标,本组表2结果显示,研究组急性发作期及缓解期大鼠血清及脑脊液中MBP水平分别明显高于对照组(P<0.01),说明大鼠活动期血清MBP明显升高,反映了损害的范围和严重程度,尤其对判断MS是否处于活动期具有重要的临床意义[8]。

本组表1、2均显示,研究组12只大鼠,其中急性发作期8只MS其脑脊液中MBP水平最高。Majewska等[9,10]研究证实,MS患者急性期脑脊液MBP与临床评分关系密切,提出监测脑脊液MBP的变化水平,有利于判断MS的病情严重程度和预后。且大鼠脑脊液MBP和血清MBP水平呈正相关(r=0.562,P<0.01),说明作为主要自身抗原之一的MBP对MS的发病敏感性高,检测患者CSF和血清中的MBP水平对于MS的诊断和疗效监测有重要参考价值。

FK506是一种新型免疫抑制剂,是一种广泛应用于器官移植的大环内酯类免疫抑制药物,于1984年从日本筑波山土壤中被分离到。研究组12只大鼠应用他克莫司治疗后,MBP水平在治疗前明显增加,但治疗后的第3天及治疗后的第7天的不同时间显著下降,说明MS对他克莫司等激索类药物的短程疗效较好。国内外已有学者将FK506应用于自身免疫性疾病的研究,其中,Gold等[11]研究证实,FK506通过免疫抑制和神经保护作用显著改善小鼠的髓鞘脱失和轴突损伤。

综上所述,通过检测周围血和脑脊液髓鞘碱性蛋白的水平,并动态观察应用他克莫司治疗前及治疗后MBP的变化情况,一方面对判断MS预后、病情严重程度和临床诊断具有重要的临床意义,另一方面可能为预防多发性硬化的临床复发提供一种有效的新药提供指导依据,但由于样本量过小,仍需日后在扩大样本量的基础上对其进一步深入研究。

摘要：目的 探讨他克莫司(FK506)对多发性硬化(MS)大鼠髓鞘碱性蛋白检测的动态变化及影响。方法 将试验动物随机分为两组,对照组(10只)予以实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)+生理盐水组;研究组(12只)在EAE诱导的第1～7天,每日腹腔内注射剂量为1 mg/kg的FK506,其中急性发作期8只,缓解期4只。检测研究组和对照组周围血和脑脊液髓鞘碱性蛋白(MBP)的水平,并动态观察应用他克莫司治疗前及治疗后不同时间MBP的变化情况。结果 研究组血清和脑脊液中的MBP水平均显著高于对照组(P<0.05)。且两组脑脊液中的MBP水平均显著高于血清中MBP水平(P<0.05)。研究组大鼠急性发作期及缓解期血清及脑脊液中MBP水平分别明显高于对照组(P<0.01),且大鼠急性发作期MBP水平血清及脑脊液中均分别显著高于MS缓解期(P<0.01)。且大鼠脑脊液MBP和血清MBP水平呈正相关(r=0.562,P<0.01)。12只大鼠予以他克莫司腹腔注射后,治疗后的第3天及治疗后第7天血清和脑脊液MBP水平均较治疗前明显降低,且脑脊液MBP水平较血清MBP水平降低更明显(P<0.01)。结论 通过检测周围血和MBP的水平,并动态观察应用他克莫司治疗前及治疗后MBP的变化情况,一方面对判断MS预后、病情严重程度和临床诊断具有重要的临床意义,另一方面可能为预防多发性硬化的临床复发提供一种有效的新药提供指导依据。

碱性蛋白酶 第7篇

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

大鼠IL-12、IFN-γ、MBP(ELISA)试剂盒(美国R&D公司);BIO-RAD 550型酶标仪(美国BIO-RA D公司)。

1.2 实验动物及方法

豚鼠22只,雌雄各半,7~8周龄,体重200~250 g,利用MBP作为抗原,复制MS的动物模型EAE,在每只大鼠的双侧后足跖一次性皮下注射含有豚鼠MBP 25μg的弗氏完全佐剂(FCA)200μL,模型制备成功的表现为急性、严重的单向病程,可自发缓解。将试验动物随机分为研究组(12只)和对照组(10只),对照组予以EAE+生理盐水,研究组在EAE诱导的第1~7天,每日腹腔内注射剂量为1 mg/kg的他克莫司,其中急性发作期8只,缓解期4只。

1.3 检测方法

大鼠心室内取血0.6 m L,静置20 min,3 000 r/min离心20 min,取血清-20℃冻存,备测IL-12、IFN-γ、MBP用。IL-12、IFN-γ、MBP检测采用双抗体夹心法(ELISA)测定,操作方法严格按使用说明书进行。

1.4 统计学方法

数据采用SPSS 13.0进行统计学处理,计量资料采用均数±标准差表示,组间比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清和脑脊液中MBP水平比较

研究组大鼠血清和脑脊液中的MBP水平均显著高于对照组,差异有高度统计学意义(P<0.01)。且两组脑脊液中的MBP水平均显著高于血清中MBP水平,差异有高度统计学意义(P<0.01)。见表1。

注:与血清MBP比较,#P<0.01

2.2 大鼠急性发作期及缓解期血清及脑脊液MBP水平及血清IL-12、IFN-γ水平比较

研究组MS大鼠急性发作期及缓解期血清及脑脊液中MBP、IL-12、IFN-γ水平均明显高于对照组,差异有高度统计学意义(P<0.01),且MS急性发作期血清及脑脊液中MBP、IL-12、IFN-γ水平均分别显著高于MS缓解期,差异有高度统计学意义(P<0.01),且MS大鼠其脑脊液MBP和血清MBP水平呈正相关(r=0.562,P<0.01)。见表2。

注:与对照组比较,*P<0.01;与缓解期比较,#P<0.01

2.3 研究组大鼠治疗前及治疗后的不同时间血清和脑脊液MBP水平及血清IL-12、IFN-γ水平比较的变化情况比较

12只大鼠予以他克莫司注射后,结果显示,治疗后的第3天及治疗后第7天血清和脑脊液MBP、IL-12、IFN-γ水平均较治疗前明显降低,且脑脊液MBP水平较血清MBP水平降低更明显,差异有统计学意义(P<0.01)。见表3。

注:与血清MBP比较,#P<0.05

3讨论

MS是一种中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病,其病因及病理学机制至今仍未完全阐明,但MS自身免疫的发病机制已得到证实和公认[5]。各种原因导致髓鞘破坏后,血清或脑脊液中的MBP及血清IL-12、IFN-γ浓度增高,因此测定血清IL-12、IFN-γ及血清和脑脊液MBP的水平,可以用于反映中枢神经系统有无实质性损害及有无髓鞘脱失[6,7]。

本组研究结果显示,研究组大鼠血清和脑脊液中的MBP水平均显著高于对照组(P<0.01),提示检测MBP含量变化是诊断MS的一项有价值的生化指标。表2结果显示,研究组急性发作期及缓解期大鼠血清及脑脊液中MBP水平、血清IL-12、IFN-γ分别明显高于对照组(P<0.01),说明大鼠活动期血清MBP明显升高,反映了损害的范围和严重程度,尤其对判断MS是否处于活动期具有重要的临床意义[8];说明IL-12、IFN-γ是介导MS始发免疫反应的重要因子,可正向调节细胞免疫使病情加重,这也与有学者发现MS患者体内有高水平的循环IFN-γ的研究结论一致。

表2显示研究组12只大鼠,其中急性发作期8只,其脑脊液中MBP、IL-12、IFN-γ水平最高。Majewska等[9,10]研究证实,MS患者急性期脑脊液MBP与临床评分关系密切,提出监测脑脊液MBP的变化水平,有利于判断MS的病情严重程度和预后。且大鼠脑脊液MBP和血清MBP水平呈正相关(r=0.562,P<0.01),说明作为主要自身抗原之一的MBP对MS的发病敏感性高。有学者研究显示,IL-12在稳定期的原发进展型MS患者中显著升高,而血清IFN-γ含量的增高对MS引起病情加重,这说明检测患者CSF和血清中的MBP、IL-12、IFN-γ水平对于MS的诊断和疗效监测有重要参考价值。

他克莫司是一种新型免疫抑制剂,是一种广泛应用于器官移植的大环内酯类免疫抑制药物,于1984年从日本筑波山土壤中被分离到。他克莫司除了在抑制器官移植排斥反应方面具有显著疗效外,还广泛应用于斑秃、银屑病、鱼鳞病、糖尿病、白塞病、变应性皮炎、类风湿性关节炎以及MS等自身免疫疾病的治疗,在对脊髓损伤的模型中具有保护神经,营养神经和促进神经再生和抑制T细胞增生、活化的作用。研究组12只大鼠应用他克莫司治疗后,MBP水平在治疗前明显增加,但治疗后的第3天及治疗后的第7天的不同时间显著下降,血清IL-12、IFN-γ水平也显著下降。说明MS对他克莫司等激索类药物的短程疗效较好。国内外已有学者将他克莫司应用于自身免疫性疾病的研究,其中,Gold等[11]研究证实,他克莫司通过免疫抑制和神经保护作用显著改善小鼠的髓鞘脱失和轴突损伤。

综上所述,通过检测周围血和脑脊液MBP的水平,并动态观察应用他克莫司治疗前及治疗后MBP、IL-12、IFN-γ的变化情况,一方面对判断MS预后、病情严重程度和临床诊断具有重要的临床意义,另一方面可能为预防多发性硬化的临床复发提供一种有效的新药提供指导依据,但由于样本量过小,仍需日后在扩大样本量的基础上对其进一步深入研究。

摘要：目的 探讨他克莫司对EAE鼠血清白介素12(IL-12)和干扰素-γ(IFN-γ)的影响及其与髓鞘碱性蛋白(MBP)相关性的研究。方法 将试验动物随机分为两组,对照组予以EAE诱导+生理盐水,共10只;研究组在EAE诱导的第1～7天,每日腹腔内注射剂量为1 mg/kg的他克莫司,共12只,其中急性发作期8只,缓解期4只。检测研究组和对照组血清IL-12、IFN-γ及周围血和脑脊液(CSF)MBP的水平,并动态观察应用他克莫司治疗前及治疗后不同时间MBP、IL-12、IFN-γ的变化情况。结果 研究组血清和脑脊液中的MBP水平均显著高于对照组(P<0.01)。且两组脑脊液中的MBP水平均显著高于血清中MBP水平(P<0.05)。研究组大鼠急性发作期及缓解期血清及脑脊液中MBP、IL-12、IFN-γ水平分别明显高于对照组(P<0.01),且大鼠急性发作期MBP、IL-12、IFN-γ水平血清及脑脊液中均分别显著高于多发性硬化(MS)缓解期(P<0.01)。且大鼠脑脊液MBP和血清MBP水平呈正相关(r=0.562,P<0.01)12只大鼠予以他克莫司腹腔注射后,治疗后的第3天及治疗后第7天血清和脑脊液MBP、IL-12、IFN-γ水平均较治疗前明显降低,且脑脊液MBP水平较血清MBP水平降低更明显(P<0.01)。结论 通过检测血清IL-12和IFN-γ及周围血和脑脊液MBP的水平,并动态观察应用他克莫司治疗前及治疗后MBP、IL-12、IFN-γ的变化情况,一方面对判断MS预后、病情严重程度和临床诊断具有重要的临床意义,另一方面可能为预防多发性硬化的临床复发提供一种有效的新药提供指导依据。