膀胱尿路上皮细胞癌

膀胱尿路上皮细胞癌（精选7篇）

膀胱尿路上皮细胞癌 第1篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

本组膀胱尿路上皮细胞癌62例, 包括男48例, 女14例, 年龄34~78岁, 平均 (57.8±6.1) 岁。按WHO病理分级分期标准, Ⅲ级16例, Ⅱ级24例, Ⅰ级22例。Ta~T1期37例, T2~T4期25例。23例正常膀胱组织取自其他膀胱手术患者, 包括男17例, 女6例;年龄26~72岁, 平均 (55.3±7.5) 岁。

1.2 试剂及方法

即用型兔抗人PTEN多克隆抗体, DAB显色试剂盒及SP试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。所有标本经4%福尔马林液固定, 石蜡包埋, 4μm薄切片, 分别作HE及免疫组化染色。采用免疫组织化学SP法, 操作按试剂盒说明书进行。用已知阳性片作阳性对照;用PBS代替一抗, 作阴性对照。

1.3 结果判断

PTEN阳性细胞为胞浆或细胞核着色, 呈橘黄色或棕黄色, 根据视野中阳性细胞占全部同类细胞总数的比例及染色强度综合判定。按着色强度分:不着色计为0分, 浅黄色计为1分, 棕黄色计为2分, 棕褐色计为3分。再将阳性细胞按比例评定:阳性细胞数<10%计为0分;10%~40%计为1分;41%~70%计为2分;>70%计为3分。将两种评分相加, 3~6分为阳性 (+) ;0~2分为阴性 (-) 。

1.4 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析, 率的比较采用x2检验, 小样本资料采用Fisher精确概率检验法, α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 PTEN蛋白在膀胱癌组织和正常膀胱黏膜组织中的表达

PTEN蛋白表达主要于细胞质中, 阳性为黄色、棕黄色颗粒, 胞核可见少量表达。在62例膀胱癌组织标本中有29例呈PTEN蛋白阳性表达, 阳性表达率为46.7%;在23例正常膀胱组织中PTEN蛋白均为阳性表达, 阳性表达率为100%。PTEN蛋白的阳性表达率在膀胱癌组织中明显低于正常膀胱组织, 比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。

2.2 PTEN蛋白的阳性表达与膀胱癌临床病理特征之间的关系

16例Ⅲ级膀胱移行细胞癌标本中PTEN蛋白阳性表达率为25.00% (4例) , 24例Ⅱ级膀胱移行细胞癌标本中PTEN蛋白阳性表达率为37.50% (9例) , 22例Ⅰ级膀胱移行细胞癌标本中PTEN蛋白阳性表达率为72.73% (16例) , 比较差异具有统计学意义 (P<0.05) 。Ta~T1中PTEN蛋白的阳性表达率为64.86% (24例) , T2~T4中PTEN蛋白的阳性表达率为20.00% (5例) , 比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。

3 讨论

PTEN基因是一个高度保守的抑癌基因, 在人类位于10号染色体q23.3区, 有9个外显子和8个内含子。其编码产物为一个含有403个氨基酸的多肽链。PTEN蛋白具有双特异性磷酸酶 (酪氨酸磷酸酶和脂质磷酸酶) 活性, 通过作用于细胞信号转导途径中多种信号分子[1], 脱去PI3K/PIP2/PIP3/AKT、MAPK (丝裂原活化蛋白激酶) 、FAK (聚集粘连激酶) 等多种关键激酶的磷酸根, 降低其磷酸化水平, 使其活性减弱, 阻断细胞信号转导通路。参与调节细胞的正常生长和发育, 抑制细胞转化, 并作用于细胞周期蛋白参与细胞周期的调控, 促进细胞凋亡, 从而负性调控肿瘤发生、发展, 侵袭和转移[2,3,4]。PTEN基因突变或表达缺失导致其双特异性磷酸酶失去活性, 失去对细胞周期的负性调控作用, 细胞将不依赖细胞周期蛋白的调控而无限增殖, 最终导致肿瘤的发生。

目前研究已证明PTEN具有明确的抑癌作用, 它在多种人类肿瘤组织中表达减少或缺失[5]。PTEN的低表达或表达缺失在膀胱癌的发生发展过程中也普遍存在[6], 不但PTEN基因的丢失或灭活与膀胱癌的发生, 膀胱癌的病理级别明显相关, 而且与膀胱癌的进展和预后不良呈负相关[6]。检测PTEN蛋白的表达可以作为观察膀胱癌发生及预后的客观指标之一[7,8]。本研究显示, PTEN蛋白在膀胱尿路上皮细胞癌和正常膀胱组织的表达率分别为46.7%和100%, 其差异有统计学意义 (P<0.05) 。而且随着肿瘤细胞分化程度的降低和临床分期的增高, PTEN的阳性表达也逐渐降低, 其差异均有统计学意义 (P<0.05) , 本研究结果与文献报道相类似。由此表明, PTEN蛋白表达降低或缺失在膀胱尿路上皮细胞癌的发生、发展过程中起重要的作用。

临床上, 膀胱肿瘤的特点是中心性、易复发性, 对放化疗不敏感, 效果差, 表浅膀胱癌治疗方法主要是膀胱部分切除术, 术后局部膀胱灌注, 术后易复发且恶性程度增加, 浸润性癌的治疗方法主要是全膀胱切除术辅以术后放疗或化疗。对于出现转移者则无有效治疗法方。近年来从分子水平对肿瘤的发病机制已有了进一步认识, 对多种肿瘤已成功开始实施靶向治疗。其特点是靶向药物特异性地选择细胞内与肿瘤发生发展相关部的一个基因片段或蛋白分子, 调节细胞的生长、增值、调亡, 使特异的肿瘤细胞死亡, 而正常组织细胞不被会波及, 具有定向性好、毒副作用小、无需最大耐受剂量即可获得较佳的临床疗效等特点, 所以又被称为“生物导弹”。药物靶向治疗在一些肿瘤的治疗方面已取得了一定的疗效, 然而在膀胱癌的治疗方面却无明显进展, 近年来已成为广大学者研究热点之一。

研究发现, 在膀胱癌中PTEN蛋白的表达缺失普遍存在, 而PTEN蛋白在多条细胞信号转导通路中起重要作用。因此, 它有可能成为治疗膀胱癌的重要靶点, 许多学者已在致力于这方面的探索, 可以相信临床上有可能通过上调PTEN蛋白的表达来治疗膀胱癌, 抑制其发生、发展。有文献报道, 甘草苷、姜黄素、吲哚美辛等均可以上调人细胞PTEN的表达[9,10,11], 相信随着研究的不断深入, PTEN有望成为治疗膀胱癌的靶点, 更多的膀胱肿瘤患者将会从中受益。

摘要：目的:探讨PTEN在膀胱尿路上皮细胞癌中的表达与其发生、发展的关系及其临床意义。方法:应用免疫组化法检测62例膀胱尿路上皮细胞癌和23例正常膀胱黏膜标本中PTEN的表达情况, 分析其表达与膀胱癌的发生, 病理分级及临床分期的关系。结果:PTEN在膀胱尿路上皮细胞癌组织和正常膀胱黏膜组织中的阳性表达率分别是100%和46.77%, 比较差异有统计学意义 (P<0.05) ;且膀胱癌细胞分化越差, 临床分期越高, PTEN阳性表达率越低, 比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。结论:膀胱尿路上皮细胞癌的发生、发展与PTEN的表达缺失有关。检测其表达情况对膀胱癌的预后判断及治疗选择可能具有重要价值。

膀胱尿路上皮细胞癌 第2篇

1 资料与方法

1.1 一般资料:

2009年6月～2015年6月,我院接收膀胱尿路上皮癌患者共计466例,其中男性378例,年龄38～72岁,平均年龄为(58.7±4.15)岁,均由临床结合尿常规检查、肿瘤标志物检查、彩超检查确诊,病程1～12年,平均病程为(6.4±3.37)年,均为初次发病;女性88例,年龄36～70岁,平均年龄为(56.3±5.94)岁,均由临床结合尿常规检查、肿瘤标志物检查、彩超检查确诊,病程1～11年,平均病程为(5.7±1.64)年,均为初次发病。两组患者均无其他重要脏器损伤及相关疾病干扰,不存在手术禁忌证及治疗相关用药过敏史,精神状态良好,且一般资料上差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 方法:

向466例患者及家属详细讲解试验目的及过程,在征得患者及家属同意的前提下开展试验。术前患者接受连续硬膜外麻醉,体位取膀胱截石位,准备电切切除术,电切镜功率设定为120W,电凝功率50W,温度始终控制在37℃,用生理盐水灌洗后将电切镜置人,了解前列腺周围结构尿道等器官状态,对膀胱进行全切除或部分切除,术后经尿道予以患者化疗药物灌注。将标本浸泡于浓度为4%的福尔马林中固定40min左右,用水清洗后放置6h后应用乙醇脱水,在低温下进行透蜡及包埋处理,制成石蜡切片,经脱蜡处理后进行苏木精伊红染色,经过水洗、脱水、复染后应用电子显微镜进行观察。

1.3 病理结果判定[1]:

根据世界卫生组织2004分级法对膀胱尿路上皮癌进行病理学分型及TNM分期,原位癌为PTis、非浸润性肿瘤为PTa、发展至皮下结缔组织的浸润性肿瘤为PT1、发展至肌层的浸润性肿瘤为PT2。

1.4 统计学处理:

采用SPSS13.0统计学软件包进行统计学分析、处理,计量资料用表示,组间计量资料比较采用两样本t检验,计数资料用百分率(%)表示,组间计数资料的比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

从病理学角度分析,男性患者中发展至皮下结缔组织的浸润性肿瘤比例为45.77%,高于女性比例20.45%,且非浸润性肿瘤比例为29.10%,低于女性比例54.55%,差异均有统计学意义(P<0.05),此外,男性患者与女性患者原位癌、发展至肌层的浸润性肿瘤所占比例及组织分级的差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

3 讨论

近年来,膀胱尿路上皮癌的发病率逐年攀升,其发病多由于长期吸烟或长时间处于芳香胺含量较高的环境中,此外,有研究证实,遗传因素同样是导致该病病发的诱因之一[2,3]。患者发病初期通常出现镜下血尿,无明显痛觉,可自行恢复,误导患者认为通过治疗痊愈,从而忽视病情发展,继而肿瘤发展出现肉眼血尿,部分患者可能出现排尿异常[4]。

本研究探讨性别在膀胱尿路上皮癌临床病理分型上的影响,结果提示,男性患者中发展至皮下结缔组织的浸润性肿瘤比例为45.77%,高于女性比例20.45%,且非浸润性肿瘤比例为29.10%,低于女性比例54.55%,差异均有统计学意义(P<0.05),此外,男性患者与女性患者原位癌、发展至肌层的浸润性肿瘤所占比例及组织分级的差异无统计学意义(P>0.05)。长期吸烟或长时间接触芳香胺类物质,促使毒性物质在体内大量堆积,随代谢聚集至尿液中,导致膀胱受到伤害,故男性患者多于女性,本研究中,男性患者人数为女性患者的4.3倍,此外,由于男性泌尿生殖器官外露,同样增加了致病感染的概率;此外,有研究表明,雌性激素能对膀胱起到一定保护作用,其一降低癌变的可能,其二可能阻碍肿瘤的发展,且由于内分泌、代谢、生理结构的差异,女性患者肿瘤类型以非浸润性为主,且肿瘤进展性较男性差[2]。

综上所述,男性患膀胱尿路上皮癌的概率高于女性,且从病理学角度分析,男性患者肿瘤更具进展性,女性患者肿瘤类型以非浸润性为主。

参考文献

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膀胱尿路上皮细胞癌 第3篇

1 材料与方法

1.1 标本来源与保存

收集2009年9月-2011年6月间中国医科大学附属盛京医院泌尿外科膀胱尿路上皮癌组织标本55例,行TURBT或开放手术取得病理标本,其中14例患者术中同时取癌组织标本及距肿瘤边缘2cm以外正常组织(术后病理检查证实无癌细胞浸润)作为对照。组织标本离体30min内入液氮保存,同时手术前随机留取患者晨起新鲜尿液1次,4000 r/min离心10min,尿液沉淀置-70℃保存。本组患者男性36例,女性19例,年龄58～87岁,中位年龄69岁。病理分级:低级别31例,高级别24例,临床分期:表浅膀胱癌(Ta～T1)38例,浸润膀胱癌(T2～T4)17例,术后经高年资病理医师明确诊断,患者术前未行放疗或化疗。为进一步说明患有泌尿系非肿瘤疾病患者的尿液沉淀细胞是否存在P16基因甲基化,本组同时收集了18例在本科住院的泌尿系结石、前列腺增生症等非肿瘤老年患者的尿液。

1.2 仪器与试剂

正常对照标本取自无泌尿系统疾病及任何肿瘤的健康人外周血,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。hydroquinone购自Fluka公司,sodium bisulfite购自Sigma公司,Wizard DNA Clean-Up system购自Promega公司,甲基化酶SssⅠ为New England公司产品。

1.3 方法

常规酚/氯仿抽提法提取DNA,-20℃暂存,取4μg DNA,去离子水稀释至90μL,按文献[3]中的方法进行DNA预处理,之后用Wizard DNA clean-up Systerm纯化,方法按说明书操作。

1.4 统计学处理

采用SPSS 13.0软件,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 P16基因甲基化状态

P16基因在膀胱尿路上皮癌组织甲基化阳性率为27.3% (15/55),在尿沉淀细胞甲基化阳性率为21.8% (12/55)。尿沉淀细胞甲基化阳性者在对应的膀胱尿路上皮癌组织中均存在甲基化。癌组织及尿沉淀细胞P16基因甲基化阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。在膀胱正常粘膜组织中,未见P16基因甲基化(0/14);非肿瘤患者的尿液沉淀细胞,未见P16基因甲基化(0/18)。

2.2 P16基因启动子甲基化与临床指标的关系

浸润性膀胱尿路上皮癌(≥T2)组织P16基因甲基化阳性率为52.9%(9/17),相应的尿沉淀细胞甲基化阳性率为47.1%(8/17);浅表性膀胱尿路上皮癌(≤T1)P16基因甲基化阳性率为15.8%(6/38),相应的尿沉淀细胞甲基化阳性率为10.5%(4/38);两组间差异有统计学意义(P<0.05)。P16基因甲基化在不同病理分级(9/31,6/24)和不同性别(11/36,4/19)间差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

DNA甲基化在基因表达调控、细胞增殖、分化发育等方面起着重要作用,是目前表观遗传学调控机制研究的热点[4]。肿瘤相关基因启动子甲基化状态广泛见于各种肿瘤,不仅存在肿瘤病理学意义,还有望成为临床肿瘤诊断新的分子标记物[5]。

P16基因产物P16蛋白通过Rb和P53基因途径抑制组织细胞从G1期向S期过渡的细胞周期调节因子,对抑制肿瘤的发生发展发挥重要的作用。国内外报道P16基因在在膀胱尿路上皮癌组织中CpG岛甲基化的比例为18%～27.5%[6],亦有研究发现60%的膀胱癌组织中出现了P16基因的甲基化[7],认为P16基因是超甲基化的热点基因之一。本研究中,该比例为27.3%,与国内外大多数研究报道一致,支持P16基因是超甲基化的热点基因之一的观点。提示P16基因CpG岛甲基化在膀胱移行细胞癌甲基化图谱的多项指标中有重要地位。

目前在尿液中缺乏合适的膀胱癌诊断标志物[8]。正常人的50mL尿液约含有20万个细胞,其中50%为尿路脱落细胞,通过甲基化特异性PCR方法可以检测出与正常细胞的甲基化谱式相反的肿瘤细胞[9]。本研究55例肿瘤组织标本中,共有15例P16基因CpG岛存在甲基化状态,其中12例对应的尿液标本检出甲基化,尿液标本检测为甲基化者,其膀胱癌组织100.0%甲基化,特异度为100.0%,并且P16基因在非肿瘤患者尿液中均未见甲基化,提示尿液脱落细胞P16基因甲基化检测对膀胱尿路上皮癌诊断的特异性非常高,但单个指标作为人群筛选假阴性仍很高。

本研究发现P16基因甲基化在不同病理分级和不同性别间其差异无统计学意义(P>0.05),提示P16基因甲基化可能是膀胱癌发生过程中的早期事件。另外,浸润性膀胱尿路上皮癌组织P16基因甲基化阳性率高于浅表性膀胱尿路上皮癌,提示存在P16基因异常甲基化的膀胱尿路上皮癌可能倾向于侵袭性生长,预后较差。

DNA甲基化谱式是一有巨大潜力的肿瘤分子标记物,尿沉淀细胞P16基因启动子异常甲基化状态可作为无创性诊断膀胱尿路上皮癌并且判断其预后的重要分子标志物,但单一P16基因作为指标存在较高的假阴性,本研究将进一步系统的膀胱尿路上皮癌相关基因的甲基化谱研究,联合检测多个基因甲基化状态,将有助于提高诊断敏感性,特异性。

参考文献

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膀胱尿路上皮细胞癌 第4篇

1 材料和方法

1.1 标本来源

选用我院2000年1月—2009年6月活检及手术切除并经病理证实的膀胱尿路上皮肿瘤石蜡组织标本100例,男62例,女38例,年龄16岁～77岁。病理分级:PUNLMP 15例,LGPUC 22例,HGPUC 25例,IUC 38例;另取10例非膀胱肿瘤患者膀胱黏膜(NORMAL)做对照。

1.2 主要试剂

免疫组化试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒及Survivin蛋白和PCNA单克隆抗体均购自福州迈新生物技术公司。

1.3 免疫组织化学染色

染色方法按链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP法)试剂盒说明书步骤进行。结果判定:Survivin蛋白免疫组化阳性染色定位于细胞质和细胞膜。观察Survivin蛋白分布、阳性强度和阳性率。Survivin蛋白阳性和阴性表达根据细胞染色强度和染色细胞占面积百分比两者积分之和来判断,染色强度分为:无着色为0分,浅黄色为1分,黄色为2分,棕黄色为3分;染色面积分为:无细胞染色为0分,细胞染色<25%为1分,细胞染色25%～50%为2分,>50%为3分。两者积分相加:阴性(-)为0分,弱阳性(+)为1～2分,阳性(++)为3～4分,强阳性(+++)为5～6分。两者之和>2分为阳性表达,≤2分为阴性表达[2]。

PCNA阳性定位于细胞核,均呈棕黄色着色。光镜下随机选取5个以上高倍视野,每个视野不少于500个细胞,计数100个细胞中的阳性细胞数,即为PCNA代表的增殖指数(proliferative index,PI)。

1.4 TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡发生率

检测方法按试剂盒说明书步骤进行。结果判定:凋亡细胞核呈棕黄色。光镜下随机选取5个以上高倍视野,每个视野不少于500个细胞,计数100个细胞中的阳性细胞数,即为凋亡指数(apoptosis index,AI)。

1.5 统计学方法

PI和AI值均以表示,应用SPSS10.0软件行χ2检验和t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Survivin蛋白免疫组化染色结果

10例正常膀胱黏膜组织Survivin蛋白表达均为阴性(0/10);100例膀胱尿路上皮肿瘤Survivin蛋白表达阳性率为67%(67/100),为细胞质和细胞膜染色。在PUNLMP、LGPUC、HGPUC、IU C中阳性表达率分别为33.3%(5/15)、50%(11/22)、68%(17/25)、89.5%(34/38)。Survivin蛋白表达阳性率随肿瘤恶性程度增加而升高:IUC>HGPUC>LGPUC>PUNLMP,差异有统计学意义(P<0.05),见表1.

2.2 PCNA免疫组化染色结果

PCNA阳性染色位于细胞核,正常膀胱黏膜组织细胞增殖指数为(12.8±2.3)%.膀胱尿路上皮肿瘤增殖指数显著高于正常对照组,亦随肿瘤恶性程度增加而升高:IUC>HGPUC>LGPUC>PUNLMP,差异有统计学意义(P<0.05),见表2.

2.3 细胞凋亡率检测结果

正常膀胱黏膜组织细胞凋亡指数为(8.5±1.2)%.膀胱尿路上皮肿瘤凋亡指数显著高于正常对照组,亦随肿瘤恶性程度增加而升高:IUC>HGPUC>LGPUC>PUNLMP,差异有统计学意义(P<0.05),见表3.

2.4 AI/PI的比值

通过计算各组病例细胞凋亡指数和增殖指数平均值的比值,发现AI/PI的比值随肿瘤恶性程度增加而逐渐降低:IUC

3 讨论

Survivin是一种抗凋亡蛋白,编码基因位于染色体17q25,长约75～135 kb,是迄今发现的最强的凋亡抑制因子。Survivin蛋白的基因特征为没有C端RING指状结构,仅有N端一段单一的BIR.Surivivin蛋白具有抑制细胞凋亡和调节细胞有丝分裂的双重作用,其根本机制为可通过多种调控机制,直接或间接抑制Caspase家族因子活性而发挥抗凋亡作用[3,4]。有研究表明,Survivin蛋白表达具有细胞周期性,只在G2/M期表达;在成人正常组织中无显著表达,而在正常增殖活力较强的组织和肿瘤组织则有广泛表达[5]。Survivin蛋白目前被确认为凋亡抑制蛋白家族的新成员,其仅在正常成人胸腺及胎盘中有少量表达,在人类的许多肿瘤组织,如前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌等则有较强表达[6,7]。近年来的研究发现抗凋亡因子Survivin蛋白可能参与了膀胱尿路上皮肿瘤的发生与进展。

本研究采用免疫组化方法检测了100例膀胱尿路上皮肿瘤组织及10例正常膀胱黏膜组织,结果发现,正常膀胱组织无Survivin蛋白表达,肿瘤组织Survivin蛋白表达阳性率随肿瘤恶性程度的增高而增高,提示Survivin蛋白的表达与膀胱尿路上皮肿瘤恶性程度有关。Survivin蛋白表达变化与肿瘤细胞增殖指数变化一致,从另一个侧面说明Survivin蛋白与肿瘤细胞增殖呈正相关关系。

本研究还采用TUNEL法检测膀胱尿路上皮肿瘤细胞凋亡情况,发现肿瘤细胞凋亡指数随着膀胱尿路上皮肿瘤恶性程度的增高而增高,这和K ing等[8]研究结果相似。细胞凋亡在肿瘤发生发展中起重要作用,肿瘤的发生发展受凋亡促进因子和抑制因子的共同调节,肿瘤的普遍性增生现象提示凋亡抑制因子在肿瘤发生中起主导作用[9]。而本研究结果发现:随着肿瘤恶性程度的增加,增殖指数和凋亡指数都不断增加,而且与Survivin蛋白的表达呈正相关,这完全不同于胃癌[10]中随着Survivin蛋白的表达增加凋亡指数降低的现象,但进一步分析AI/PI比值发现,随着肿瘤恶性程度的增加而比值不断降低。因此我们认为:尽管凋亡指数增加,但是细胞增殖的增加远远大于细胞凋亡的增加。与增殖相比较,凋亡呈现出相对减弱的趋势,故膀胱尿路上皮肿瘤也存在凋亡的减弱,这种凋亡减弱虽然在形式上有别于细胞凋亡值的绝对减少(如胃癌等),但它的实质仍是降低凋亡水平。这也可以说明Survivin蛋白参与了肿瘤的发展,其过度表达可能是凋亡水平下降的原因。

综上所述,细胞增殖的增加和凋亡的相对减弱共同导致了肿瘤细胞数目的迅速增加和恶性程度的加重,Survivin基因是参与膀胱尿路上皮肿瘤的发生、发展的重要基因。虽然目前尚不清楚是什么因素导致Survivin基因在肿瘤中的再活化,但是如果能够证实单独封闭Survivin可充分介导细胞凋亡,那么Survivin基因就可能成为肿瘤治疗中的一个生存基因,这有待于本课题的后续研究。

参考文献

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[8]King ED,M atteson J,Jacobs SC,et al.Incidence of apoplosis cellproloferalion and bcl-2 exepression intransitionalcellcarciond ofthebladder:association with tum or progression[J].Urol,2003,155(13):316-320.

[9]Ebihara N,Takai S,M iyazaki M,et al.M ast cell chym ase inducesconjunctival epithelial cell apoptosis by a m echanism involvingdegradation offibronectin[J].CurrEyeRes,2005,30(6):429.

膀胱尿路上皮细胞癌 第5篇

近年来的研究[1]表明,mi RNA参与了肿瘤细胞的生物调控过程,有些mi RNA间接地起着原癌基因或抑癌基因的作用,在肿瘤的发生和发展中起着至关重要的作用。有些甚至可以作为生物标记物,应用于肿瘤[2,3]诊断、预后评估和靶向治疗。

mi RNA与膀胱癌的关系研究,目前国内外报道均少见。文献报道[4]检测了9例膀胱癌组织mi RNA的表达,结果发现mi R-96在膀胱癌组织呈高表达态势,且与膀胱癌的病理分期,临床分级有一定的关系。但其对膀胱尿路上皮癌生物学行为的影响机制不明确。本研究通过验证mi R-96在膀胱尿路上皮细胞癌组织中的表达,采用MTT法及流式细胞术(flow cytometry,FCM)来观察mi R-96对膀胱尿路上皮细胞癌株T24的生物学行为的影响,为进一步探讨mi R-96在膀胱癌发展中的信号通路及膀胱癌的基因诊断和基因治疗,提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人膀胱癌尿路上皮细胞癌株T24细胞购自长沙赛尔生物公司,mi R-96 inhibitor (2.0吸光度)购自上海吉玛制药技术有限公司,mi RNA inhibitor N.C购自上海吉玛制药技术有限公司,LipofectamineTM2000试剂(使用前贮存在 +4℃) 购自Invitrogen公司,Opti-MEM ®Ⅰ低血清培养基(使用前37℃预热)购自Invitrogen公司,基底膜基质凝胶Matrigel购自美国BD公司,胎牛血清(FBS) 购自Gibco公司,LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司,Transwell小室购自Corning公司,MTT法试剂盒组份购自Sigma公司,Annexin V-FITC & PI凋亡检测试剂盒购自美国ADL。

1.2 方法

1.2.1 T24细胞培养人膀胱癌细胞株T24细胞在含10%小牛血清的完全培养液DMEM(含2 mmol的谷氨酰胺,100 u/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中贴壁生长,37℃、5%二氧化碳CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养,换液用1×D-hank’s洗1次;传代用0.25%胰酶消化。

1.2.2 T24基因转染细胞样品3份,分为A、B、C 3组。A组:正常培养细胞组(T24细胞),B组:mi RNA阴性对照组 (T24细胞 +mi RNA阴性对照片段),C组:mi RNA-96抑制组 (T24细胞 +mi RNA-96抑制片段)。mi R-96抑制片段(5'-AGCAAAAAUGUGCUAGUGCCAAA-3'),mi RNA inhibitor N.C片段(5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3');使用LipofectamineTM2000转染mi R-96 inhibitor。6 h后进行荧光检测转染率。37℃、CO2培养箱孵育48 h,进行后续检测。通过荧光镜下视野与光镜下视野对比,细胞的转染效率达到80%以上便可进行后续的实验。

1.2.3 MTT方法检测细胞存活率MTT法以代谢还原噻唑 蓝3- (4和5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT)为基础。活细胞的线粒体中存在与NADP相关的脱氢酶,可将黄色的MTT还原为不溶性的蓝紫色的甲瓒(Formazan),死细胞中此酶消失,MTT不被还原。用DMSO溶解甲瓒后可用酶标仪在570 nm(450 nm)波长处检测光密度。

将处于对数生长期的各组细胞以2×105个 /ml的密度铺种于96孔板,待融合后弃原培养液,每孔加入含PBS配制的5 mg/ml MTT 10μl的培养基继续培养4~6 h后,弃培养液加入100μl/ 孔的DMSO原液,振摇10 min,待结晶完全溶解后,置酶联免疫仪于570 nm波长处测定吸光度;并根据吸光度,计算细胞存活率(细胞存活率 = 实验组吸光度 / 对照组吸光度×100%)。每组设8个平行孔。

1.2.4 AV/PI双标法FCM检测细胞凋亡率收集生长状态良好的各组细胞,以300×g离心5~10 min;用预冷1×PBS (4℃)50μl重悬细胞1次,300×g4℃离心5~10 min,洗涤细胞;用灭菌去离子水稀释10×Binding Buffer至1×Binding Buffer,按每个标本400μl的1×Binding Buffer的量配制,置于冰箱保存备用;用标记液轻重悬细胞,1×105~1×106个细胞/100μl孵育液,室温下避光孵育15 min;再在每份标本中加入10μl PI;每100μl孵育液中加入冷的400μl×Binding Buffer稀释,15 min内进行流式检测。

1.2.5 Transwell实验Transwell小室制备:用50mg/LMatrigel 1∶8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面,4℃风干;在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel(3.9μg/μl)60~80μl(注意体积不可太大,以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好),置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶;消化各组细胞,终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗1~2遍,用含BSA的无血清培养基重悬,调整细胞密度至5×104个 /ml;6孔板下室一般加入1 ml含FBS的培养基,取细胞悬2 ml加入Transwell小室,常规培养24 h,用棉签擦去基质胶和上室内的细胞,用95%酒精固定15~20 min,苏木素染色10 min,取视野于倒置显微镜观察(放大倍数10×25)行细胞计数并照相。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(±s)表示,各组数据比较用单因素方差分析,LSD-t检验,以P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染效率检测

荧光显微镜下观察人膀胱癌尿路上皮细胞癌株T24细胞中mi R-96 inhibitor及Mi RNA inhibitor N.C的转染情况,发现细胞的转染效率达到80%以上,可以进行后续的实验,见图1。

2.2 MTT 方法检测细胞存活率

通过MTT方法,发现3组细胞的存活率在12、24及48 h差异有统计学意义(P <0.01),见表1及图2。

2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡

流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示,A组的凋亡率为(3.09±0.17)%,B组的凋亡率为(3.88±0.30)%,C组的凋亡率为(10.68±1.14)%。单因素方差分析发现,各组间均数差异有统计学意义(P <0.01);LSD检验发现A组和B组的差异无统计学意义(P >0.05);A组和C组比较差异有统计学意义(P <0.01);B和C组比较差异有统计学意义(P <0.01)。见图3。

2.4 细胞侵袭实验

从各组细胞计数的结果可以看出,C组细胞发生迁移的数目明显减少,肿瘤细胞的细胞侵袭能力明显下降,与B组及A组比较差异有统计学意义(P <0.01),见图4及表2。

注:†与其他两组比较,P <0.01

3 讨论

肿瘤的发生、发展是一个多基因、多阶段的生物学过程,是由于参与调控细胞分化、增殖及凋亡的基因发生突变后引起细胞增殖调控失衡的结果。近年来,mi RNA与肿瘤的关系备受关注,研究发现mi RNA可调节肿瘤细胞增殖和凋亡的过程,也能够参与细胞自我更新和分化过程,有些mi RNA分子还可作为原癌基因或抑癌基因调控肿瘤。国内外许多科研工作者已开展了大量的实验研究工作,来探讨mi RNA与肿瘤的关系,为肿瘤的基因诊断及基因治疗提供了科学依据。本研究通过MTT法、FCM技术及Transwell等方法来观察mi R-96对T24细胞的生长、增殖及细胞侵袭能力的影响。

3.1 mi R-96 对 T24 细胞生长、增殖、凋亡的影响

细胞生长曲线是能够反映培养细胞生长与死亡的动态改变。本研究发现,转染mi R-96抑制剂后,T24细胞生长速度减慢。

Bcl-2基因家族包括抗凋亡蛋白和促进细胞凋亡蛋白,在细胞凋亡中发挥重要的调节作用,是目前最受重视的调控细胞凋亡的基因家族。抗凋亡蛋白Bcl-2可以抑制细胞凋亡,维持细胞增殖和死亡之间的平衡,从而维持机体内环境的相对稳定。有研究发现[5,6],抗凋亡蛋白Bcl-2作为mi R-15和mi R-16的靶基因而受到它们的靶向抑制,从而调控肿瘤干细胞存活。

AV/PI可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来,再利用FCM即可检测凋亡细胞。本研究通过AV/PI及FCM法发现,转染mi R-96抑制剂的T24细胞的凋亡率上升。依据上述实验结果,可推测mi R-96能促进T24细胞的分化与增殖,抑制T24细胞的凋亡。但其抑制凋亡是否与抗凋亡蛋白Bcl-2有关,仍需做进一步的研究。

3.2 mi R-96 对 T24 细胞侵袭能力的检测

引起恶性肿瘤患者死亡最常见的原因是肿瘤的侵袭和转移[7],而mi RNA在肿瘤侵袭和转移中的作用,已成为目前的研究热点[8]。mi RNA通过与靶基因m RNA互补位点的结合,在转录后水平调控靶基因的表达,在肿瘤增殖、分化、凋亡、侵袭和转移中起着重要的作用[9,10]。在mi RNAs与胃癌关系的研究中发现,mi R-34、mi R-27a、mi R-21在胃癌中均为高表达,mi R-34可以抑制p53突变的人胃癌细胞生长,mi R-21参与胃癌细胞的增殖和侵袭过程,抑制mi R-27a的表达水平,可降低胃癌细胞的增殖水平[11,12,13],本研究均提示mi RNAs与胃癌的发生、发展密切相关。研究[14]发现,在胰腺癌细胞株MIA Pa Ca-2细胞和PANC-1细胞中,mi R-96通过调控其靶基因KRAS,能够显著地减弱细胞株的侵袭和迁移能力而发挥抑癌基因作用。

膀胱尿路上皮细胞癌 第6篇

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

真核表达载体pCI-pcDNA3.1(+)由深圳市人民医院中心实验室提供;高纯度质粒抽提试剂盒、G418及脂质体LipofectaminTM2000购自美国GIB-CO/BRL公司。RPMI1640培养基及小牛血清(FCS)购自中国SABC公司;人重组IFN-γ购自深圳晶美公司;24、96孔细胞培养板购自美国CLONTECH公司;Model 550自动酶联检测仪BIO-RAD(美国);FACS Calibur流式细胞仪(美国)。

1.2 细胞株与细胞培养

膀胱尿路上皮癌细胞株T24购自中科院上海生物细胞研究所。水浴复苏后接种于30 m L培养瓶及铺有无菌盖玻片的6孔培养板，以含10%小牛血清的RPMI1640培养液常规培养至80%汇片后进行转染。

1.3 siRNA序列设计及体外合成

针对hTERT基因序列，采用Whitehead研究所研发的si RNA设计软件，在网站http：//wwv.jura.w i.mit.edu/bioc/si RNA/home.phl)上在线设计、i RNA序列，将符合条件的si RNA序列在人类基因组EST库中进行BLAST搜索，进行同源性分析以保证序列作用的特异性，最后确定了4个作用区段，分别为：siRNAa(作用位点335-357),5'-AAGAACGTG CTGGCCTTCGGCTT-3';siRNAb(作用位点1802-1824),5'-AAGTTGCAAAGCATTGGAATCAG-3';siRNAc(作用位点2324-2346),5'-AAGGCCTTCAAGAGCCAC GTCTC-3';siRNAd(作用位点2450-2472),5'-AATG AGGCCAGCAGTGGCCTCTT-3';阴性对照片断si R-NAe:5'-AAGGCTCTAACAGCGCCAGCCTT-3'(与si RNAc序列组成相同，但序列顺序打乱，经BLAST证实与目的靶细胞中其他基因没有同源性)。选定作用位点后，根据选定序列分别设计带T7启动子的互补序列的正义链及反义链DNA模板，分别将DNA模板与T7启动子退火形成双链，在T7RNA聚合酶的作用下37℃孵育2 h后产生单链RNA片断，去除DNA模板，再将对应的正义和反义RNA片断配对后退火形成双链si R-NA_荧兴标记后各用。

1.4 转染细胞及荧光显微镜观察

本实验分为7组，第1组si RNA1组为空白对照，不用脂质体及si RNA，直接用PBS溶液处理细胞，第2组si RNA2组利用不含si RNA的脂质体转染细胞，第3组为阴性对照片断si RNAe,siRNA4-7组分别使用si RNAa至si RNAd与脂质体处理细胞。转染前24 h将细胞按1×105接种于24孔板，待细胞生长至约80%融合度时去除培养基待转染。

1.5 半定量RT-PCR

转染后48 h收集各实验组细胞，用PBS洗涤2次，按Trizol法提取细胞总RNA，用紫外分光光度计定量，调整RNA浓度至1 g/L。在20μL体系中加入1μg处理后的RNA,1 mmol/L的4种(dNTP混合物，AMV逆转录酶5 U,0.125 pmol/μL Oligo(dT)引物，RNAase抑制剂1 U/μL,42℃孵育15 min,99℃10 min以灭活逆转录酶，4℃保存。然后以β-actin为内对照，在40μL体系中加入hT ERT上下游引物各50 pmmol,TagDNA聚合酶1.25 U，加入上一步逆转录反应管中，94℃预变性2 min后按94℃30s,58℃30 s,72℃2 min，扩增30个循环，最后在72℃延伸10 min。hTERT上游引物为5'-GGAAGAG TGTCTGGAGCAA-3'，下游引物为5'-GCTGGAGGT CTGTCAAGGTA-3'，产物大小为243 bp。β-actin上游引物5'-CATCAAGAAGGTGGTGAAGC-3'，下游引物5'-ACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3'，产物大小为465 bp。所用引物均由深圳晶美生物公司合成。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外灯下拍照，根据各条带的吸光度，采用GEL-Pro Analyzer软件分析hTERT m RNA的表达水平。

1.6 WesternBlot法检测蛋白表达

取对数生期的T24细胞，按上述方法分组转染。培养48 h后收集细胞，WesternBlot印迹常规方法取上清进行蛋白电泳、抗体(美国Santa Cruz公司)封闭、显色，然后用Bio Rad2000图像分软件将阳性信号条带进行灰度扫描以判断相对强弱.

1.7 细胞生长曲线的绘制

将T24/Wt、T24/neo和T24/siRNAd细胞分别培养在24孔细胞培养板中，连续细胞计数7 d，以每天的平均细胞数绘制细胞生长曲线。

1.8 MTT法检测细胞生长抑制率

取对数生长期各组T24细胞，常规MTT法，在酶联免疫检测仪上测定波长490 nm处吸光度值。计算方法：细胞生长抑制率=(对照组A490值-实验组A490值)/对照组A490值×100%。

1.9 流式细胞仪检测（FCM)

将各组T24细胞培养48 h后收集细胞，70%乙醇4℃固定，RNA酶37℃孵育1 h，溴化乙啶4℃染色，美国FACS Calibur流式细胞仪进行细胞凋亡检测，结果以multicycle软件进行分析。

1.1 0 体内抑瘤率的测定

3周BALB/C雌性裸鼠32只，体质量18～20 g，购自中南大学实验动物中心。取T24细胞组对数生长期细胞，以5×105个/只接种于裸鼠，14 d后分组给予T24/Wt、T24/neo、T24/siRNAd各细胞组10×105个/只进行瘤内注射，2周后断髓处死动物，分别称量体重和瘤重，计算抑瘤率：抑瘤率(%)=(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。

1.1 1 统计学处理

运用SPSS 15.0进行统计学方差分析。

2 结果

2.1 RT-PCR半定量检测T24细胞的h TERT表达水平

未转染组为对照，β-actin为内参照。各si RNA转染组hTERT的m RNA表达水平各有不同程度的下调(图3)，吸光度扫描分析表明，T24细胞经si R-NA处理后hTERT m RNA表达下调，5～7组分别下调30%，38%，52%，73%，其中以第7组下调最明显，对照组内m RNA的表达水平无明显改弯(图1)。

2.2 WesternBlot检测蛋白表达

Western Blot检测转染48 h后T24细胞hTERT蛋白量的变化(图2)。与对照相比，转染si RNAc及si RNAd后，细胞所表达的hTERT蛋白量明显减少，表明对hTERT基因的抑制有效，而si RNAa及si RNAb转染后hTERT蛋白量减少并不明显，表明这两个片断对hTERT基因的干扰效果欠佳。

2.3 绘制细胞生长曲线

用方差分析比较每组细胞每天的细胞计数均值，结果表明：转染si RNAd后抑制hTERT基因表达，T24细胞的生长速度较T24/Wt组和T24/neo组明显降低(P<0.05)(见图3)。

2.4 MTT比色

实验显示，向T24细胞中转染si RNA抑制hTERT基因后，肿瘤细胞的生长受到了抑制。转染si RNAd的细胞的肿瘤抑制率为53.78%，转染空质粒的细胞的肿瘤抑制率为10.26%，两者相比差异显著(P<0.05)。

2.5 FCM结果

显示T24/siRNAd细胞组能明显改变T24细胞的生长周期，使肿瘤细胞更多地停留在G0-G1期，同时其细胞的凋亡率也明显高于T24/neo和T24/Wt细胞对照组。在对照组中S期细胞较多,反映了肿瘤细胞旺盛生长的特性(表1)。上述结果表明,hTERT基因可能参与了细胞的周期调控，通过抑制细胞分裂、诱导凋亡而延缓T24细胞增殖。

2.6 体内抑瘤率的测定

T24/siRNAd组抑瘤率为34.4%，显著高于T24/Wt与T24/neo对照组(F=18.45,P=0.004)，两组间差异具有显著性(F=6.98,P=0.032)(见表2)。

3 讨论

尿路上皮癌是泌尿外科的最常见的肿瘤，近年来发病率有所升高，严重威胁人类的健康[4]。目前，针对恶性肿瘤的生物基因治疗已经成为继于手术、放疗和化疗之后的又一种主要的治疗手段。基因转染利用分予物学技术，把沉默目的基因导入肿瘤细胞，通过沉默目的基因以抑制肿瘤细胞的生长或增强其免疫原性，是肿瘤的基因治疗中一种行之有效的方法[5,6]。

端粒酶是一种由RNA和蛋白质组成的调控端粒长度的特殊逆转录酶，在维持细胞染色体稳定性方面有重要作用[7,8]。人端粒酶有3个主要的组成部分，即人端粒酶RNA(hTR)、人端粒酶相关蛋白1(hTEP1)和人端粒酶逆转录酶(hTERT)。其中hTERT是端粒酶的催化亚基，与hTEP 1复合物结合成全酶激活端粒酶的活性[7,8,9]。令人感兴趣的是，除了干细胞、生殖细胞、活化的淋巴细胞外，hTERT的表达几乎只限制在肿瘤细胞中。hTERT在超过85%的人类恶性肿瘤中调控端粒酶的选择性高表达，癌旁组织低表达，而在正常组织中，hTERT很少表达或不表达[10,11]。将hTERT基因导人端粒酶阴性的正常细胞中能诱导端粒酶的活性，使细胞的端粒延长并得以永生化。将hTERT基因的显性负性突变体导入人类永生化的细胞和肿瘤细胞中，引起端粒酶活性的完全抑制、端粒长度的缩短和细胞的死亡，这表明hTERT的表达是端粒酶活性和肿瘤发展中的限速步骤[11]。所以，就肿瘤的基因治疗而言，hTERT是一个很好的特异性靶点。

近年来的研究表明[5,9,10,11,12]，将m RNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使m RNA发生特异性的降解，导致相应的基因沉默，这种转录后基因沉默机制被称为RNA干扰(RNAi)。利用RNA干扰可以抑制基因的表达，研究基因的功能，治疗由于基因过度表达导致的疾病，RNA干扰具有高度特异性和高效性，可长期稳定表达并可传递给子代，属于转录后水平的基因沉默，直接针对m RNA作用，不受翻译抑制剂的影响，没有时间延搁，是一种较为理想的基因治疗手段[13,14]。因此，笔者针对hTERT基因设计RNA干扰片断，下调hTERT基因的表达，降低端粒酶的活性，以达到治疗尿路上皮癌的目的。该研究选择体外转录法，通过经济快速的合成大量针对hTERT基因的不同位点的RNA干扰片段，筛选出对该基因最有效的作用位点，从而为进一步稳定转染以及体内实验打好基础。BOZDOGAN[15]等对膀胱尿路上皮癌中hTERT的研究表明，hTERT在膀胱尿路上皮癌中的表达82.9%，明显高于膀胱炎性病变及正常粘膜组织仅为5.8%。MAVROMMATIS[16]等研究发现，膀胱尿路上皮癌组织中hTERT的m RNA表达阳性率高达93%，而膀胱炎性病变及正常黏膜组织却未能检测到hTERT的表达，提示hTERT m RNA仅存在于膀胱尿路上皮癌肿瘤组织中。综上所述，hTERT的表达是膀胱尿路上皮癌的早期事件，可能在启动膀胱尿路上皮组织向癌组织转化过程中起重要作用。因此，目前认为膀胱尿路上皮癌细胞的生长与端粒酶催化亚单位hTERT基因表达水平相平行，如果抑制hTERT基因的表达，则可明显抑制癌细胞生长。近年在鼻咽癌基因治疗方面利用si RNA特异性地下调hTERT的m RNA水平取得了一些进展。

在RNA干扰的研究中，如何才能选择到最有效的基因位点来设计si RNA片断，一直是困扰研究人员的一大难题。目前主要是在设计干扰片断时针对目的位置限定一些搜索条件，如要求在两个核苷酸突出处应包含尿嘧啶残基等，但总的来说，对靶区域的选择当前仍是一个“试误”(trail and error)的过程[9,10,12,13]。本实验中，荧光显微镜下可见si RNAd组检测到生长曲线明显降低，这是由于RNA干扰效应导致细胞凋亡所致。RT-PCR和Western Blot也显示：上述细胞干预后m RNA表达及蛋白表达下调最明显，这说明si RNAd所对应的hTERT上的区段(作用位点2 450-2 472)是RNA干扰的最佳作用位点，可以为今后长期稳定RNA干扰实验打下基础。另外，从MTT和FCM检查的结果可以看出，有效的si RNA还可以抑制T24细胞的增殖，影响细胞生长周期，并诱导细胞凋亡。从本实验中可以看出，针对有效位点的si RNA的确可以在膀胱尿路上皮癌细胞中发挥RNA干扰作用，诱导肿瘤细胞的凋亡，有望达到治疗膀胱尿路上皮癌的目的。研究人员正根据这次实验筛选出的这个位点设计针对hTERT基因的si RNA逆转录病毒载体，从而在细胞中长期表达si RNA，以达到长时间稳定抑制hTERT基因在膀胱尿路上皮癌细胞中的表达，为膀胱尿路上皮癌基因治疗研究奠定基础。但基因治疗的各个效应阶段信号转导、分子机制尚需要进一步阐明，临床应用前景还有待进一步深入全面地研究。

摘要：目的 探讨转染小干扰RNA抑制膀胱尿路上皮癌T24细胞hTERT基因表达及对膀胱尿路上皮癌动物模型抑瘤率的影响,以探讨抑制hTERT基因实现抗肿瘤的作用,为膀胱尿路上皮癌的基因治疗提供新思路。方法 以LipofectaminTM脂质体介导小干扰RNA转染膀胱尿路上皮癌T24细胞株,通过绘制细胞生长曲线、MTT比色法以及流式细胞仪检测观察小干扰RNA转染对T24细胞增殖的影响,PCR、Northern分析检测hTERT基因在T24细胞的表达,WesternBlot检测蛋白表达,T24细胞接种于裸鼠,分组给予抑制hTERT基因转染进行治疗,评价其抑瘤率。结果 小干扰RNA抑制hTERT基因的表达可以抑制T24细胞的体外生长,实验组细胞的生长曲线较对照组明显降低;MTT比色显示实验组的细胞活力与对照组相比有显著性差异(P<0.05);PCR及Northern分析提示小干扰RNA抑制hTERT基因表达,WesternBlot检测到蛋白低表达;流式细胞仪检测显示基因转染使瘤细胞的生长滞留在G0+G1期,S期细胞明显减少,并观察到细胞凋亡。动物实验小干扰RNA抑制hTERT基因肿瘤抑制率可达34.4%,显著高于对照组(P<0.05),且两组间差异具有显著性(P=0.032)。结论 小干扰RNA转染抑制hTERT基因表达对T24细胞具有体内外抗肿瘤的作用,提示小干扰RNA转染T24细胞抑制hTERT基因技术有可能为膀胱尿路上皮癌的基因治疗提供一种新的治疗策略与手段。

膀胱尿路上皮细胞癌 第7篇

1 材料与方法

1.1 标本收集

膀胱癌组织与配对的癌旁组织3对,来自2012年3~4月在我科进行手术的膀胱癌患者,膀胱癌组织经病理证实为尿路上皮癌,癌旁组织经病理证实为正常膀胱组织。

1.2 芯片的选择

利用Arraystar公司Arraystar Human mRNA 2.0_8X60k,覆盖目前NCBI Refseq、UCSC Known Gene、NRED、RNAdb等多个权威数据库的m RNA,总共约30000条。

1.3 探针设计

Arraystar mRNA芯片设计探针为40~60mer的长寡核苷酸,这些长寡核苷酸探针在高严格杂交条件下可得到高灵敏度及高特异性的理想实验结果。针对每条序列都设计了多条探针,增加了信号的可靠度。

1.4 样品总RNA抽提与检测

取100mg组织,加1ml的RNA抽提试剂TRIZOL(Invitrogen公司),按照试剂说明,分别从正常膀胱组织和膀胱癌组织抽提总RNA。用Agilent Nanodrop ND-1000紫外分光光度计分别测定OD260、OD280、OD230的吸光值,同时计算出RNA的浓度及纯度。用甲醛变性凝胶电泳观察RNA 5S、18S及28S的完整性。

1.5 cRNA标记、扩增和质检

利用Agilent公司的Quick Amp Labeling Kit单色RNA标记试剂盒进行双链互补RNA的标记,使用分光光度计检测荧光标记效率,以保证后续芯片实验结果的可靠性;利用Qiagen公司的RNeasy Mini Kit试剂盒进行扩增并提取总RNA;利用Agilent提供的Nano Drop ND-1000检测c RNA产量和特异活性。

1.6 芯片杂交和洗涤

利用Agilent Gene Expression Hybridization Kit试剂盒按照使用说明将芯片进行相应处理后与RNA样品杂交,接着使用Gene Expression Wash Buffer 1、2进行芯片洗涤。

1.7 图像采集和数据分析

利用Agilent基因芯片扫描仪(Agilent公司)扫描芯片的荧光强度,用Agilent Feature Extraction Software进行数据读取,使用Agilent Genespring GX(Agilent)软件中进行数据分析,数据经标准化处理后得出两组标记的信号比值(fold change),再经过t检验,筛选出信号比值≤0.5为表达显著下调基因,信号比值≥2的基因为表达显著上调基因(所有差异性基因均满足P<0.05)。

2 结果

2.1 样品RNA检测

OD260/OD230比值>2,OD260/OD280比值>1.8。甲醛变性凝胶电泳观察RNA5S、18S、28S条带清晰完整,无明显降解(见图1)。

注:1~3对照组,4~6肿瘤组

2.2 芯片杂交结果

正常膀胱组织及尿路上皮癌组织芯片杂交后的微点阵图片(见图2)。

注:1~3对照组,4~6肿瘤组

将膀胱癌组mRNA表达量与正常对照组比较,其中2倍以上变化、并且差异有统计学意义(P<0.05)的m RNA认为是差异表达的m RNA,2倍以上变化的共1636条;2倍以上升高为共1005条;2倍以上降低的共274条;5倍以上升高为共114条;5倍以上降低的共93条;10倍以上升高为共81条;l0倍以上降低的共45条;50倍以上升高7条,50倍以上降低的共17(见表1)。

3 讨论

随着生物研究技术的不断进步,目前的研究证明肿瘤的发生发展不是单一因素、单一基因作用的结果,而是一个复杂的多阶段、多因素、多步骤的过程,是多种肿瘤相关基因表达异常所致,膀胱尿路上皮癌的发生发展同样是多基因作用的结果[1~3]。膀胱尿路上皮癌同样也存在有基因突变、基因异常表达等异常现象,使用何种实验方法从中找出与膀胱肿瘤发生相关的差异表达基因就显得极为重要。20世纪80年代中期,基因芯片技术应运而生,它将大量的探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交,并通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的基因信息,能在一次实验中完成对成千上万基因的检测,可以对肿瘤的不同阶段、不同时期、甚至不同病理级别进行全面的基因分析,从而发现许多与肿瘤相关的基因[4]。

在本实验研究中,我们所采用的基因芯片含有约30000条人相关编码基因,以正常膀胱组织为对照,对膀胱尿路上皮癌组织的基因表达谱进行了研究。我们所使用的表达谱芯片中所含的基因种类包括分子调节、细胞组成及生物进程三大类。结果表明,与正常膀胱组织相比较,膀胱尿路上皮癌中有1207条基因表达明显上调,429条基因表达明显下调。我们认为,正常组织和癌组织存在基因表达上的差异,而且,膀胱尿路上皮癌分为浸润性和浅表性,两者也同样存在基因表达上的差异[5]。

我们进一步将所有差异性表达基因导入R package后,进行Gene Ontology分析和Pathway分析结果。发现在下调的基因中,CDO1、DNMT3A、IL4I1等基因参与蛋氨酸和半胱氨酸的代谢,通过调控丙酮酸代谢,参与碳水化合物合成,影响细胞的能量代谢过程[6]。相反,在上调的基因中,ATF4、BAK1、BAX、BCAP31等基因参与蛋白质在内质网上加工的过程,影响各种蛋白质、生物酶、细胞因子的合成,影响细胞的功能代谢[7,8]。从某种意义上讲,也许正是由于这些参与细胞生理过程的基因下调或上调表达,使得细胞正常的生命活动受到影响从而导致膀胱癌的发生。

综上所述,膀胱尿路上皮癌的发生发展是多基因异常引起多条信号通路异常,影响细胞的合成、代谢、转运、调控等多种生物学过程,导致肿瘤发生的结果。采用基因芯片技术对膀胱尿路上皮癌基因表达变化的研究,可以高效、系统、大规模的获取生物信息[9,10],为研究膀胱尿路上皮癌的发生发展提供新的思路。

参考文献

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