ELISA法范文

ELISA法范文（精选12篇）

ELISA法 第1篇

1 材料与方法

1.1 材料

HBsAg ELISA法试剂盒由上海科华公司提供, 批号:20090118;HBsAg标准品 (2IU/mL) 由省临检中心提供。

1.2 方法

ELISA双抗体夹心法, 参照第3版《全国临床检验操作规程》, 严格按照试剂盒说明操作。

2 结果

2.1 内源性物质干扰

2.1.1 溶血

取HBsAg强阳性标本, 分离未溶血血清350uL, 再以洁净竹签人为破坏RBC制出溶血血清, 分离350uL, 同时检测HBsAg, 测吸光度值 (A) , 将2组A值作t检验, 见表1。

2.1.2

乳糜血 (TG) , 类风湿因子 (RF) , 自身抗体等随机选取相关指标高于参考值且HBsAg阴性的标本 (TG4.2±0.5mmol/L, RF强阳性) 血清5ug/L HBsAg, 标准品作1∶1稀释, 另用5ug/L HBsAg标准品作1∶1稀释, 另用5uL/L HBsAg与正常人血清作1∶1稀释作为对照, 检测HBsAg, 以A值作t检验, 结果见表1。

2.2 外源性物质干扰

分离肝素, EDTA抗凝正常人血浆与5uL/L HBsAg标准品作1∶1稀释, 另用5ul/L HBsAg标准品与相应未抗凝血作1∶1稀释作为对照, 测吸光度值A, 2组A值作配对t检验, 结果见表1。

2.3 不同时间不同温孵方式的边缘效应

2.3.1 以2IU/mLHBsAg标准品作为样本, 采用37℃水浴0.5h、1h, 37℃孵箱0.5h、1h, 室温 (20～23℃) 放置1h、2h三种不同的温育方式, 检测HBsAg, 读取吸光度A值。将周围孔 (96孔板周边38孔) 和中央孔A值作成组配对t检验, 结果见表2。

3 讨论

内源性物质干扰因素, 从表1中可以看出溶血和非溶血, 乳糜血与非乳糜血两组样本测定吸光度A值无统计学意义, 即两者对检测结果没影响。但有的患者存在免疫系统疾病, 如类风湿患者体内存在RF或其他自身抗体, 样品中的吸光度值明显高于对照组吸光度值, 具有统计学意义。这可能RF和某些自身抗体与固相上包被的特异性抗体IgG以及加入的酶标特异抗体IgG结合而造成假阳性。而两种抗凝标本吸光度值与非抗凝对照组吸光度值有显著性差异, EDTA影响相对较小。

不同时间、不同温孵方式的边缘效应, 大量实验研究证实在温育过程中中央孔与周围孔存在热力学梯度导致的, 从表1看出三中不同时间, 不同温育方式均会导致边缘效应, 中央孔与周围孔吸光度有显著性差异, 但水浴温育比较稳定, 边缘效应相对较小, 孵育法较大, 室温最为明显。另外在同一温育温度下, 所被检测血清的S/CO值随着测定温育时间的延长而增大, 浓度越低表现越为明显。

摘要：分析内源性干扰物质, 外源性干扰物质, 边缘效应, 温度和时间等对酶联免疫吸附实验 (ELISA) 测定结果的影响, 为进一步临床检验提供最佳参考方案。结果实验表明溶血、脂血的标本用ELISA检测HBsAg吸光度值无统计学意义, 对检测结果无影响。而边缘效应的中央孔和周围孔在3种不同时间, 不同的温孵方式中, 吸光度值显著差异, 水溶相对较小, 孵育较大, 室温最为明显, 而且同一温育温度下, 所被检测血清的S/CO值随测温育时间的延长而增大, 浓度越低表现越为明显。

关键词：酶联免疫吸附试验,内源性干扰物质,外源性干扰物质,边缘效应

参考文献

[1]李金明.临床酶免测定技术[J].临床ELISA测定操作中注意事项, 2008, 4 (1) :87.

[2]曹文飞.酶联免疫测定干扰因素与对策[J].中国实验临床免疫学杂志, 1998, 10 (3) :60.

乙肝表面抗原ELISA检测程序 第2篇

1检验目的及原理

1.1检验目的：乙型肝炎病毒表面抗原是乙型肝炎病毒感染的最主要免疫指标，乙型肝炎肝病毒的感染带来了严重的公共卫生问题。母婴传播、性传播和血液传播是最主要的传播途径。尽早的发现感染可以有效减少疾病的传播。1.2检验原理：两步双抗体夹抗原ELISA试验

用于检测HBsAg的酶免疫检测法，是在1971年，首先由Engvall，Perimann1，VanWeemen以及Schuurs进行描述的。在1976和1977年，建立了固相“夹心”酶免疫检测法。HBsAg在包被有多克隆抗体（Anti-HBsAg）的固相上被捕获，随后由酶标Anti-HBs进行检测显示。在二十世纪80年代早期，开发了基于单克隆Anti-HBs的HBsAg检测法。

本实验采用单克隆Anti-HBs的两步夹心ELISA试验，微孔板上所包被及酶结合物所用分别为针对表面抗原不同位点的抗体。如果被检测血清中存在表面抗原，则可通过双抗体夹心的桥联将辣根过氧化物酶（HRP）连接到微孔板上，使TMB呈色。方法性能参数

2.1两步双抗体夹抗原ELISA试验(1)敏感性：

样品中HBsAg浓度达到0.5ng／m1，即可得到阳性结果。(2)特异性：

使用血浆、被检测者因各种病理因素而使血液中含有过高纤维蛋白原或者异嗜性抗体时，可能引起检测结果的假阳性。

标本

3.1乙型肝炎病毒表面抗原的适宜检材为新鲜血液样本分离出的血清，不适合于混合血清、血浆或其他体液样本，特殊检材的要求及结果判断见其具体要求，不适用本程序。3.2血液标本用不含添加剂的干燥洁净试管采集，采集后在37℃孵育1.5～2小时，2000 RPM以上离心5分钟，分离血清。

3.3采用含有分离胶和促凝剂的试管采集的血液样本，采集后在37℃孵育0.5～1小时，2000 RPM以上离心5分钟，分离血清。

3.4严重脂血、严重溶血原则上不会影响检测结果，但洗涤一定要彻底、干净。检测系统

4.1 组成

乙型肝炎病毒表面抗原两步夹心ELISA试验试剂盒(英科新创科技有限公司)主要组成成份：包被HBsAb的预包被微孔板、HRP标记抗体、HBsAg阳性对照、HBsAg阴性对照、HBsAg样品稀释液（含BSA缓冲液）、浓缩PBS-T缓冲液、底物A（含H2O2）、底物B（含TMB）、终止液（含2 M H2SO4）、封板膜，自封袋。

试剂信息：以上构成仅对英科新创（厦门）科技有限公司的试剂盒有效，批准文号（国药准字S10910148），试剂储存于2-8℃避光保存，有效期六个月。4.2 试剂配制

（1）PBS-T缓冲液：取浓缩PBS-T缓冲液若干，以蒸馏水或去离子水按照20倍稀释成应用液。

试剂保存：室温。4.3主要仪器

Tecan Sunrise酶标仪、汇松PW-960酶标洗板机、20～200 ul可调式微量移液器、25～56℃可调式气浴恒温振荡器。校准

可调式微量移液器由武汉市技监局校准完成，酶标仪、酶标洗板机、气浴恒温振荡器均由仪器生产厂家的技术支持部门负责每年一次技术校准。检验程序

6.1 操作步骤

6.1.1、平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温（18～25℃），微孔板开封后，余者及时以自封袋封存。

6.1.2、编号：取所需要数量微孔固定于支架，按序编号。6.1.3、稀释：每孔加入20 ul样品稀释液。

6.1.4、加样：分别在相应孔中加入100 ul待测样本血清、阴阳性对照血清或质控血清。6.1.5、温育：置37℃温育60分钟。

6.1.6、洗涤：用PBS-T缓冲液充分洗涤5次，洗涤后扣干，每次应保持30～60秒的浸泡时间。

6.1.7、加酶：在每一微孔中加入酶标记抗体50 ul。6.1.8、温育：置37℃温育30分钟。

6.1.9、洗涤：用PBS-T缓冲液充分洗涤5次，洗涤后扣干，每次应保持30～60秒的浸泡时间。

6.1.10、显色：每孔加底物A、底物B各50 ul，轻轻振荡混匀，37℃暗置30分钟。

6.1.11、终止：每孔加入终止液50 ul，混匀。

6.1.12、测定：用酶标仪双波长法450nm/630nm测定每一微孔OD值，记录结果。6.2 结果判断

6.2.1、临界值Cut off（CO）的计算：CO = 阴性对照OD均值×2.1 阴性对照OD均值低于0.05时，以0.05计算，高于0.05按实际OD值计算。

6.2.2、样品OD值S / CO ≥ 1者，结果阳性

样品OD值S / CO ＜ 1者，结果阴性

6.2.3、如果阴性对照OD均值 >0.1或阳性对照OD均值< 0.4时，则表明不正常的操作或试剂盒已经变质损坏不能使用，需要重新试验，若问题仍然存在，应该立即停止使用该批号产品，并与试剂厂商联系。

6.2.4、注意：

A.通过以上检测阴性的样品，由于方法学以及其他不可控因素影响，不能绝对保证样本中没有低滴度抗原的存在，不能完全排除HBV感染的可能。

B.过以上检测阳性的样品，应通过人Anti-HBs的中和试验予以确认。如果样品在确证试验中发生中和，则该样品可以视为HBsAg呈阳性，无需进一步检测。质量控制

7.1 室内质量控制

室内质量控制血清的两个浓度值分别为：1 ng/ml、2 ng/ml，均购自卫生部临床检验中心，每批次试验加入两个水平质控血清各一孔，同其他待测样本一同记录S/CO值。

7.2室间质量控制：每年参加卫生部、湖北省以及武汉市临床检验中心乙型肝炎病毒表面抗原的质量评价。

7.3尽可能排除干扰因素对试验的影响。干扰因素及变异的潜在来源

以下类型的冻融过的样品可能会引起本实验结果的假阳性：含高滴度免疫球蛋白（IgG 骨髓瘤，IgM骨髓瘤，怀孕前3个月的妇女，流感疫苗受体），大肠杆菌抗体，抗-CMV阳性，抗-EBV阳性，抗-HSV阳性，风疹抗体阳性，霉菌感染，抗核抗体阳性，梅毒阳性，类风湿因子及弓形虫抗体阳性。结果计算及测量不准确度

无结果计算及测量不确定度 生物参考区间

无 患者检验结果可报告区间

阴阳性 警告/危急值

阳性为警告 安全性预警措施

13.1所有样本、试剂和各种废弃物应按传染物处理，潜藏有传染成分。目前尚没有已知的方法，能够确保人源制品或灭活微生物无传染性。因此，所有取自人源材料必须视为潜在的污染物质。

13.2强烈建议严格按照有关血液滋生病原体的标准对检测系统所使用试剂和人源标本进行处理。对于含有或怀疑含有污染物的制剂材料适用生物安全2级或其他相应的生物安全措施。这些预防措施应包括但不局限于以下内容：

A.处理样本或试剂时，佩戴手套。B.不要用嘴吸液。

C.不要在处理这些材料的区域内吸烟，吃东西，饮水，使用化妆品或戴取隐形眼镜。D.使用杀菌消毒剂，如0.5％次氯酸钠、84或其他相应的消毒剂，对样本或试剂的所有溢出物进行清洁和消毒。

E.按照当地政府规定，对所有样本，试剂和其他潜在传染材料进行去污和处理。13.3安全预防措施：终止液含有较低浓度H2SO4,对皮肤、眼睛有损伤。如果溶液不慎接触眼睛，立即用清水冲洗。如果刺激依然存在，则请求医护人员帮助。临床意义

乙型肝炎病毒属于嗜肝DNA病毒科。完整的病毒称为Dane颗粒，直径42 nm，球形，其外层包膜即HBsAg，由病毒S基因编码，是病毒衣壳蛋白，包括S、前S1和前S2蛋白；HBsAg是病毒感染的主要标志。除Dane颗粒外，感染者血液中还存在16 – 25 nm的球状和杆状体，是病毒组装过剩的HBsAg。

ELISA法 第3篇

【摘要】人群中的HBV感染普遍存在,我院多年来使用酶联吸附法(ELISA)检测HBV血清标志物。今年,我们对ELISA法和免疫层析法(GICA)测定乙肝两对半的血清标本进行了比较研究,研究发现少数HBsAg阳性的血清标本免疫层析法测定呈现阴性结果(实际为假阴性)。虽然这种情况的比率只有1.25%,但是仍然应该引起足够的重视。因此,免疫层析法的准确度、灵敏度也受到临床医学的广泛重视。免疫层析法能否代替ELISA法也成为检验医学一个十分关注的问题。

【关键词】乙肝二对半;酶联吸附法;免疫层析法

1 材料与方法

1.1 标本来源:我们将免疫层析法和ELISA法试剂同时检测同一个血清标本乙肝两对半的试验,试验结果报告如下

2008年3月1日～2008年9月10日期间,在我院门诊和住院患者中依次选取2000份患者空腹抽取的静脉非抗凝血3~5ml,2000转/min离心5min,留取血清备用。

1.2 试剂和仪器:乙型肝炎病毒标志物(乙肝两对半)酶联免疫法体外诊断试剂盒为上海科华生物技术有限公司产品。

乙型肝炎病毒标志物(乙肝两对半)免疫层析法试剂盒艾康生物技术(杭州)有限公司产品。

仪器为郑州安图生物工程有限公司的anthos fluido自动洗板机,安图2010酶标仪。

1.3 方法:2000份血清标本同时用ELiSA法和GICA法平行检测乙肝二对半,均严格按操作说明进行操作.对于两种方法检测均为阴性标本,再次应用ELiSA法进行2孔重复测定后确认为阴性;对于用ELiSA法检测为阳性,而GICA法检测为阴性的血清标本,再用ELiSA法进行2孔以上复查,进一步确认是否为阳性。其中任意一孔s/co≥2.1即可确定为阳性,而GICA法阴性的血清标本同样经过2次复查后才可确认为阴性。

2 结果

本次研究检测的2000份血清标本中,ELiSA法检测出HBsAg阳性的血清236份,阳性率为11.8%,GICA法检测出HBsAg阳性的血清有219份,阳性率为10.95%,两种方法检测均为阴性的血清标本1764份。GICA法有17份血清标本漏检,二者检测符合率为98.75%。GICA法血清标本漏检率为1.25%。

这说明在检测HBsAg中,GICA法较ELiSA法敏感性低,容易造成假阴性结果。在检测乙肝两对半时其它项目的结果如下:

ELiSA法检测出HBsAb阳性768份,阳性率384%;GICA 法检测HBsAb阳性707份,阳性率为35.35%,两者符合率为96.95%。ELiSA法检测出HBeAg阳性76份,阳性率38%,GICA法检测出HBeAg阳性81份,阳性率为45%,二者符合率为99.75%。ELiSA法检测出HBeAb阳性93份,阳性率为4.6%,GICA法检测出HBeAb阳性99份,阳性率为499%,二者符合率为99.85%;ELiSA法检测出HBcAb阳性318份,阳性率为15.9%,GICA法检测出HBcAb阳性333份,阳性率16.65%,二者符合率99.25%。

由此可见,ELiSA法和GICA法在检测乙肝二对半时,存在着一定的差异。以下是两种方法的检测结果报告,见表1。

3 讨论

免疫层析法和ELiSA法均属于免疫学检测范畴,方法特异,敏感度好,尤其是固相载体酶免技术与胶体金技术等的结合,使市场上出现了一大批适于家庭及床旁检测的快速试剂盒,在很大程度上方便了人们的自我保健和临床的快速诊断[1]。然而,有报道称GICA的敏感度低于ELiSA法[2]。应用两种方法同时检测HBsAg的临界值血清为1ng/ml和5ng/ml,GICA均为阴性,ELiSA均为阳性。两者符合率为9000%[2]。低于其它文献[3]报道的98.8%的符合率。又有报道称GICA的敏感度可达1ng/ml[4]。本组两种方法检测HBsAg的符合率为98.75%,与有关文献报道基本一致(9894%)[5]。尽管两种方法的符合率较高,GICA还是有漏检存在。在17份HBsAg阳性的漏检标本中,有一份血清是S/CO=208的强阳性标本。其它16份标本S/CO值均小于4。这是一份非常明显的HBsAg漏检标本,所以,GICA还是有漏检存在的,漏检率为1.25%,与有关文献报道基本一致(106%)[5]。另外,本次在HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb四项的对照研究中,GICA法和ELiSA法相比较,既存在ELiSA法检测阳性,而GICA法检测为阴性的现象,也存在着ELiSA法检测为阴性而GICA法检测为阳性的现象。所以,在应用ELiSA法和GICA法同时检测HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb时,两种方法确实存在显著差异.综上所述,GICA方法有其局限性,是不能代替ELiSA法的,也不能用于献血人员筛查。GICA五连扳可用于大规模普查人群乙肝感染情况,也适于临床急症标本等快速检测需要。尤其适于标本量少的一些个体医院和个体诊所的初筛实验。随着医疗节奏的逐渐加快,我们更应该高度重视GICA法与ELiSA法之间的显著差异。在我院,对于ELISA检测HBsAg阳性的标本,再用免疫层析五连板复查。有效地保证了两对半结果的可靠性,同时也方便了工作。

随着免疫学及免疫学技术的飞速发展,乙肝两对半诊断实验不论是方法学还是临床应用,都取得了日新月异的进展,但每一种方法都有其各自的优缺点,特别是在临床普及以及结果可比性方面,我们期待着尽快改善GICA法的局限性,缩小ELiSA法和GICA法的差异。

参考文献

[1] 王兰兰.临床免疫学和免疫学检验(第3版).北京:人民卫生出版社,2004:97

[2] 王健,闵福援.乙肝病毒血清标志物的检测方法及临床意义[J].中华检验医学杂志,2005,28(1):113-115

[3] 骆铁桥.胶体金免疫层析法不宜用于献血员乙型肝炎表面抗原检测[J].上海医学检验杂志,2001,16(5):267

[4] 陈向阳.胶体金免疫层析法与ELiSA检测HBsAg的比较[J].上海医学检验杂志,2001,16(5):305

[5] 王良玲.胶体金免疫层析法与ELiSA法检测HBsAg结果比较[J].中国基层医药,2005,12(11):1569



作者单位:113006 辽宁省抚顺市中心医院1

ELISA法 第4篇

为了更好的完成“瘦肉精”问题的监督检查工作, 辽宁省县级以上相关部门使用ELISA (酶联免疫法) 快速检测法来辅助“瘦肉精”问题的监督检查工作。ELISA检测法相对早先的快速检测卡, 有着准确度高, 适用范围广的特点, 对“瘦肉精”问题的监督工作起到很大推进。但相对于早期“瘦肉精”快速检测卡的胶体金法, ELISA法需要更专业的操作, 操作人员需要经过更细致的培训。针对初学者容易出现的错误我与大家分享下关于“瘦肉精”ELISA快速检测工作的几点体会。

1 树立检测工作的责任心

作工作前先要有一个正确的心态、端正的态度, 要对检测工作的重要性充分了解。检测工作是一件非常重要的工作, 检测结果是后续工作的重要依据, 错误的检测结果很可能导致重大的不良后果。所以做检测工作一定要树立责任心。

2 认真阅读试剂盒说明书

试剂盒的生产公司有很多, 国内的国外的各不相同。具体检测的药物多种多样, 比如“盐酸克伦特罗”、“沙丁胺醇”、“莱克多巴胺”等。这些不同生产公司生产的、检测不同药物的试剂盒具体操作有很大的区别。这就要求我们在使用前一定要认真阅读说明书, 确认检测的操作过程, 否则极可能得出错误的检测结果。

在说明书中大家要着重注意以下几个关键的地方:一是确认试剂盒中各种试剂的名称、用途, 必要的话可以用记号笔在试剂瓶上加以标记防止出错。二是注意试剂盒的储存条件, 如果试剂盒因保存不当而失效, 后续的工作将无法进行。三是注意各种试剂的配置说明, 不同的试剂盒配置比例并不相同。四是注意待检测的样品的处理, ELISA快速法检测的可检测样品有很多, 比如尿样、饲料、肌肉、肝脏等等, 每种样品的不同的试剂盒处理方式不同, 处理方法错误, 得出的结果自然不会正确;另外要特别注意, 特定的一种ELISA快速检测试剂盒不一定能够检测所有种类的样品, 在选用试剂盒的时候一定要确认该试剂盒能够检测待检测样品。五是酶联反应测试步骤, 这是ELISA快速检测法最关键的部分, 简单来说就是按照说明书的操作一步步的进行, 但是初学者很容易手忙脚乱的出现失误。如果有需要的话可以在纸上做一个更详细的操作流程来辅助操作。在本文的后面我会详细说明自己的辅助记录供大家参考。

3 规范检测操作

ELISA法快速检测需要精确地操作, 任何一点微小的操作失误都可能导致结果的巨大差距。检测操作中要特别注意以下几点容易出现错误的地方。

3.1 样品处理时要注意不要交叉污染, 用于处理样品的器械使用后一定要清洁后才能用以处理另一份样品。

3.2 不要混用不同批次的试剂盒。

3.3 保持试剂盒说明书要求的室温环境。

3.4 水的质量很重要, 确保使用蒸馏水或去离子水。

3.5 加入样品或者试剂到微孔时, 移液器要竖直添加不要倾斜, 用力要均匀, 防止样品或试剂溅出微孔。吸取样品或试剂时移液器吸头中不要有气泡, 添加后吸头内不要有残留。

3.6 添加不同样品或试剂时要更换吸头。如果吸头碰触微孔内液体, 即使添加相同试剂也要更换吸头。

3.7 添加样品或试剂后, 如果说明书上有混匀要求的, 要在振荡器上震荡混匀, 没有振荡器的情况可以轻敲微孔板边缘混匀, 注意不要使微孔内的液体溅出。

3.8 洗板时, 甩出微孔板液体的操作翻转微孔板一定要迅速, 防止微孔板内液体流入其他微孔板造成交叉污染。

4 规范记录填写

4.1 规范填写检测记录

填写检测记录可还原检测过程, 保障了检测结果的真实可靠, 同时减少了出现错误的可能。检测记录要包括:检测时间, 检测时室内的温度、湿度, 检测的样品, 检测的项目, 试剂盒名称、批号、生产单位, 样品处理简要过程, 标准曲线, 样品编号, 试样质量, 检测结果, 检测人签字, 同时附带酶标分析仪的吸光光度值打印记录和计算机的计算结果打印记录。

4.2 规范填写仪器设备的使用记录

试验前后检查设备的工作情况, 填写仪器设备的使用记录能有效避免仪器设备故障导致的试验结果错误。

5 快速掌握ELISA检测操作步骤

5.1 通过模拟操作来熟练检测操作

初学ELISA快速检测时, 可能因为操作不熟练导致出现各种的错误, 为了减少在实际工作中出现错误, 我们可以通过模拟操作来熟练检测操作。简单来说就是将用过的微孔板清洗干净, 在若干干净的瓶中加水替代各种试剂, 然后一切的操作按照正常的检测程序进行。这样能多次练习, 快速掌握操作技巧, 减少因操作失误造成的试剂盒浪费。

5.2 编写更详细的检测过程

为了初学时使操作更有条理减少失误, 可在纸上编写更详细的检测过程。编写的辅助操作过程包括以下几点。

5.2.1 各种试剂的使用量, 稀释倍数, 添加的蒸馏水体积。

5.2.2 样品处理过程, 包括:样品使用量, 添加试剂的体积, 涡旋震荡、离心等过程。

5.2.3 微孔板中添加标准品和样品的指定位置和添加体积。

5.2.4 添加一抗的体积, 添加一抗的时间点, 需要孵育等待的时间, 孵育结束的时间点。

5.2.5 洗板的次数。

5.2.6 添加二抗的体积, 添加二抗的时间点, 需要孵育等待的时间, 孵育结束的时间点。

5.2.7 添加TMB底物的体积, 添加TMB底物的时间点, 需要孵育等待的时间, 孵育结束的时间点。

5.2.8 添加终止物的体积, 在指定波长下读取吸光光度值, 计算机软件计算检测结果。注意不同的试剂盒操作程序有差别, 大家要根据具体的试剂盒说明书来确定操作过程。

ELISA法 第5篇

?Qué bien lo pasaban aquellos ni?os! Lástima que aquella felicidad no pudiese durar siempre.

Su padre, Rey de todo el país, casó con una reina perversa, que odiaba a los pobres ni?os. Ya al primer día pudieron ellos darse cuenta. Fue el caso, que había gran gala en todo el palacio, y los peque?os jugaron a ?visitas?; pero en vez de recibir pasteles y manzanas asadas como se suele en tales ocasiones, la nueva Reina no les dio más que arena en una taza de té, diciéndoles que imaginaran que era otra cosa.

A la semana siguiente mandó a Elisa al campo, a vivir con unos labradores, y antes de mucho tiempo le había ya dicho al Rey tantas cosas malas de los príncipes, que éste acabó por desentenderse de ellos.

-?A volar por el mundo y apá?ense por su cuenta! -exclamó un día la perversa mujer-; ?a volar como grandes aves sin voz!

Pero no pudo llegar al extremo de maldad que habría querido; los ni?os se transformaron en once hermosísimos cisnes salvajes. Con un extra?o grito emprendieron el vuelo por las ventanas de palacio, y, cruzando el parque, desaparecieron en el bosque.

Era aún de madrugada cuando pasaron por el lugar donde su hermana Elisa yacía dormida en el cuarto de los campesinos; y aunque describieron varios círculos sobre el tejado, estiraron los largos cuellos y estuvieron aleteando vigorosamente, nadie los oyó ni los vio. Hubieron de proseguir, remontándose basta las nubes, por esos mundos de Dios, y se dirigieron hacia un gran bosque tenebroso que se extendía hasta la misma orilla del mar.

La pobre Elisita seguía en el cuarto de los labradores jugando con una hoja verde, único juguete que poseía. Abriendo en ella un agujero, miró el sol a su través y le pareció como si viera los ojos límpidos de sus hermanos; y cada vez que los rayos del sol le daban en la cara, creía sentir el calor de sus besos.

Pasaban los días, monótonos e iguales. Cuando el viento soplaba por entre los grandes setos de rosales plantados delante de la casa, susurraba a las rosas:

-?Qué puede haber más hermoso que ustedes?

ELISA法 第6篇

硝基呋喃类抗菌剂（Nitrofurans）是一种广效性抗生素，对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、某些真菌和原虫均有作用，因其价格低廉且对动物性传染病的预防与治疗具有良好的效果而曾经在养殖业中较为广泛应用。但是，经研究证明，含有硝基呋喃类抗菌剂及其代谢物的食物被人类长期食用后，有致癌、致畸胎等健康危害，因此已被大多数国家明令禁止在人类可食用的动物源性食品中使用。

硝基呋喃类抗菌剂原型药在生物体内代谢迅速，无法检测；而其代谢物呋喃唑酮（Furazolidone）、呋喃咜酮（Furaltadone）、呋喃西林（Nitrofurazone）和呋喃妥因（Nitrofurantoin）能与组织蛋白质紧密结合而相当稳定，故利用其代谢物的检测可反映硝基呋喃类抗菌剂的残留状况。

目前，动物体内硝基呋喃类代谢物残留的检测方法主要有液相色谱法、液相色谱—质谱法和液相色谱—串联质谱法，上述方法虽然灵敏度高、准确性好，常作为药物残留检测的确认方法。然而此类方法对仪器和操作人员要求都较高；每个样品检测费用大；前处理过程均需过夜衍生，耗时较长，不能满足现场抽检的需求和推广应用。ELISA技术与上述仪器分析方法相比，具有以下优点：一是样本前处理过程相对简单，对仪器和人员要求不是很高，检测人员经过短期培训即可上岗；二是样品整个检测过程中所用试剂多数为无机试剂，与有机试剂相比，对人体伤害和环境污染威胁小，检测人员无需特殊防护用具；三是该方法耗时短，检测过程只需要不到1 h，适于现场检测和大量样本筛查；四是检出限低，灵敏度高，可达到μg/kg或ng/kg水平，符合药物残留检测分析的要求。

基于以上特点，ELISA法已成为目前药品残留检测的有效检测方法之一。

近几年来，本中心利用ELISA法承担上级渔业主管部门下达的水产品国家违禁药物残留的筛查任务，筛选出的阳性样品，分别经山东省水产品质量检测中心和中国水产科学研究院黄河水产研究所用大型仪器分析方法确证，准确率为100%。在圆满完成上级渔业主管部门下达的筛选任务的同时，本中心取得了一定的操作经验，现将经验小结，与大家共勉。

1 加标回收

样品在萃取、转移及净化处理等过程中，会有基体干扰或待检成分的损失情况。因此，加标回收率的测定是实验室内经常用以自控的一种质量控制技术，以验证检测结果的准确度。

1.1 样品空白的选取

样品空白是指在检测程序中，使用某个浓度的样品作为仪器的零基准。样品空白可以抵消加入测试试剂前由于样品自身含有待测成分引起的正误差。空白样品的选择对检测结果的准确性至关重要。

加标回收分空白加标回收和样品加标回收两种，几年来，本中心针对这两种加标回收做了大量的验证试验。结果发现，样品加标回收，如果待测样品背景值较高，所得回收率会出现不稳定现象。本中心利用同一样品对呋喃西林和呋喃咜酮两个项目同时做加标回收试验，试验结果得知，该样品中呋喃咜酮背景值很低，两个添加浓度的加标回收率均在80%～110%之间；而呋喃西林项目由于背景值较高，两个添加浓度的回收率分别为207和81.7，出现不稳定现象。试验结果如表1所示。

本中心还请教了省级水产品检测中心等权威检测机构经验丰富的专家，得出的结论与本中心所做验证试验结果一致。所以本中心一般选择空白加标回收，所得结果准确率为100%。

表1 同一样品不同项目的加标回收率试验结果

试验

项目 试样测定值

/μg•kg-1 加标浓度

/μg•kg-1 加标试样测定

值/μg•kg-1 加标回

收率/%

呋喃咜酮 0.082 0.5 0.548 93.2

1.0 0.974 89.2

呋喃西林 0.242 0.5 1.281 207

1.0 1.059 81.7

1.2 加标试验应遵循的几条原则

1.2.1 一致原则 样品与加标试样按相同的操作步骤和方法同时测定，保证试验条件一致。为保证准确度，样品和加标样分别进行平行测试，以平均值带入计算。

1.2.2 可比原则 加标样中原始样品的取样量、稀释倍数及测试体积，尽可能与测试样品一致。

一般文献上要求加标量不宜过大，一般为待测成分含量的0.5～2.0倍，且加标后的总含量不应超过方法的测定上限。要想做到这一点，需要检测人员正确估量样品中待测成分的含量，这对于经验不是很丰富的检测人员来说难度有点大。本中心一般选取标准曲线范围的中间浓度做加标浓度。

1.2.3 不变原则 加标物的浓度宜高，加标体积宜小，一般不超过原始试样体积的1%，保持样品的基体不变。

1.2.4 适用原则 容易实施，便于回收率的计算。

加标回收率=

（加标式样测定值-式样测定值）加标浓度×100%

2 加标回收率的意义

加标回收除了考察待测样品前处理及上机测试全过程中所测成分的破坏或损失情况，更重要的一点，对于国家食品安全有残留限量的药物残留，需要用加标回收率折算检测结果，以防止不合格样品流向市场，给广大消费者造成伤害。例如，某种兽药的限量值为1.0 μg/kg，如果某个样品的检测结果为0.9 μg/kg，在不做加标回收的情况下可以判定该产品合格。但是，如果做了加标回收，加标回收率为80%，通过检测结果和回收率折算，该产品的兽药浓度为1.1 μg/kg，该产品应被判定为不合格。

3 标准曲线的分析利用

目前市面上ELISA试剂盒的价格普遍较高，一般96孔的试剂盒的价格在四五千元左右。进行样品检测时，一般要求标准曲线的相关系数达到0.99以上才可以对样品中待测成分进行准确定量，但有时候难免出现标准曲线系数做的比较低的情况。为了节约试验经费，我们一般通过对相关系数比较低的曲线各个标准点进行分析。如果一条曲线相关系数的偏离只是因为极个别的标准点，其他的几个点的线性关系良好，那么，只要是位于这几个点浓度范围内的所检样品的检测值是可信的。

4 ELISA方法操作过程中注意事項

4.1 样品前处理

提取试剂的添加要准确，涡旋混匀的时间要严格按照说明书操作，时间过长，容易造成乳化现象和溶解出更多的杂质成分；时间过短，容易造成混合不均匀、提取不充分，造成假阴性。离心转速或离心力应达到说明书要求，样品氮吹时，应尽量吹干，不要残留有机溶剂。去除上层正己烷等脂肪层时，应确保去除干净，防止对结果造成干扰影响。

4.2 试剂盒保存

试剂盒应当在2～8 ℃的温度下储存（试剂盒说明书有特殊规定的，严格按照规定的储存条件执行），不能在过热或过冷的温度下放置时间太长。

微孔板应尽量真空、干燥保存以保持更好的稳定性，因此剩余的微孔板要尽快放回密封袋保存；标准物质和无色的显色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

4.3 试剂盒平衡

每个试剂盒都有相应的最佳反应温度，用前一般需在室温放置20～30 min以上。试剂及样本没有回复至室温20～25 ℃，将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。冬季室温低，可将试剂盒置37℃温箱20 min。如果试剂体积较大则需要回温时间较长，不能用温水浴回温。

4.4 保证标准品与样品的同步性

为了保证样品检测结果的准确可靠，应力求与标准品同步检测；

加入标准品、样品、酶结合物应用液、底物应用液以及各种试剂时，为确保时间的一致性，应使用定量多道加液器，且加液过程要迅速完成；

定量多道加液器应定期校准，并且用前检查吸嘴是否套紧，确保吸液量一致；

从低浓度到高浓度地添加标准品，降低影响标准曲线质量的风险；

一个人操作时，一个项目一次不宜多于两块板同时测定。

4.5 避免板内差异性大应注意的问题

加液器有两档，为了保证微量加样的准确性和均匀性，我们一般采取“吸二打一”的手法，即吸液时推到二档，出液时推到一档；

加液后若出现气泡会导致反应液界面有差异，在孵育前一定要将气泡用枪头扎破；

加液过程中若有液体溅出，不但对邻近孔造成污染，而且会流到板底，影响吸光度，从而影响检测结果的准确性；

加样应尽量垂直悬空加样，将所加液体按规定的量加入微孔板的1/3处，避免加在孔壁上部，以保证加样的准确性。

4.6 试剂盒操作的环境条件

确保在标准室温20～25 ℃下操作，避免在空调风口或者窗口进行操作，温度过低，会出现吸光度值偏低的现象；如果在阳光直射下试验，不但会因为过热造成试剂蒸发，而且会造成吸光度值偏高等导致试验结果失准的现象。如果操作台温度过低，应铺垫纸巾或者其他物料。

4.7 样品和试剂的混匀

稀释前、后的试剂及样品在加样前混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

4.8 孵育

孵育是ELISA测定中影响测定成败的关键因素之一；

孵育的温度和时间应按规定力求准确，以免出现吸光度值偏高或偏低的现象，导致试验结果出现偏差；

孵育过程中，反应板不宜叠放，以保证各孔的温度都能迅速达到孵育要求；

如果样品量少，一次测定只用少量微孔板，这种情况下，建议将板孔放在板架中间位置较好，这样可以很容易地排除“边缘效应”，以提高测定的重复性。

4.9 洗板

在ELISA分析中的再現性，很大程度上取决于洗板的一致性；

洗板次数以及每次每孔洗液的加入量要规范，以免因洗涤不当而造成吸光度值过高的现象，并且吸液量不要溢出孔外，以免影响吸光度的准确性；

最后一次洗涤后进行下一步操作前，甩去板孔中洗液后，一定要在吸水纸上将板孔拍干，否则可能影响试验结果；

板孔干燥时间过长，会出现标准曲线相关系数低、重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

4.10 显色

ELISA法测定中，若出现0浓度标准溶液的吸光度值低于1或高于2.5的情况时，即使标准曲线的相关系数达到要求亦不能采用。为了避免出现这种情况，在定量测定中，显色时间一般根据试剂盒说明书控制。也可依据经验，在显色较深时，适当提前2～3 min终止反应；在显色较浅时，适当延长2～3 min显色反应时间。

4.11 假阳性与假阴性的产生原因及处理方法

见表2。

表2 假阳性与假阴性的产生原因及处理方法

问题 原因 解决方法

假阳性

假阴性 水质原因

试验操作

原因

实验仪器

原因

衍生化试

剂原因

曲线原因

点复溶液验证 应确保纯水

现制现用

离心不彻底 延长离心时间或

改变转速

样本污染 更换样本

吸取到其他相层 准确吸取相层

乳化未完全处理 70℃水浴处理

未清洗干净 正确的洗涤器皿

有机试剂干扰 更换试剂

有机试剂变质 更换试剂

曲线不好 保证曲线正常

综上所述，尽管ELISA测定的操作步骤非常简单，但有可能会影响测定结果的因素却较多，分布在测定操作的各步骤之中，本文特对常见问题及原因归纳总结，供同行借鉴。

ELISA法 第7篇

1 试验前的质量控制

试验前的质量控制包括仪器设备、试剂盒、消耗材料、质控品、标本采集和标本处理。

1.1 仪器设备

仪器设备包括加样器、水浴箱、孵育箱、冰箱、冰柜、洗板机、酶标仪以及生物安全柜.每件仪器设备均按医学实验室认可准测的要求, 配备标准操作规程及简易操作卡, 并且还要做到以下三点: (1) 加样器要求定期进行调试校正, 并做好记录; (2) 孵育箱及冰箱每天要在早、晚两次记录好温度, 以达到实验要求; (3) 洗板机、酶标仪要定期维护, 并做好保养记录。

1.2 试剂盒

我科过去曾经使用过北京产的万泰试剂盒, 目前一直使用上海科华公司的试剂盒。

1.3 消耗材料

消耗材料包括吸头、蒸馏水和生理盐水, 吸头一次性使用, 防止交叉污染;蒸馏水符合质量标准, 确保无污染。

1.4 室内质控品

室内质控品由江苏省检验中心提供的抗HIV 2N cu/ml, 统一批次的质控品存放于-20℃冰箱保存, 有效期1年, 使用单只置于温度为4℃的冰箱冷藏, 室温条件下重复使用不超过5次。

1.5 标本采集

首先确定申请单上检查项目, 再采集血样, 并贴上条形码或写上被采集者的信息.采集血样时, 量要足, 并做到不溶血, 因为红细胞破坏可放出过氧化物酶, 干扰结果, 造成假阳性[3]。病区标本采集时要做到患者姓名、床号、病历号等信息齐全, 并与申请单上相关信息一致, 安排专人及时送到检验科集中处理。

1.6 标本处理

免疫室在收到标本后, 按以下的程序进行处理。

1.6.1 核对标本严格执行标本查对制度, 血样标本试管上的

姓名、床号、标签和申请单上的信息必须一致, 如有不同, 及时退回并做好记录.核对标本是质控至关重要的一步.对于检测样本处于节假日, 间隔时间长的须及时分离血清, 冰箱2~8℃保存[4]。

1.6.2 检查血样血清样本一定要离心充分, 一般3500r/min离心6~8min, 避免纤维蛋白对实验结果的影响。

一般地, 轻度溶血、中度脂血样本不影响试验结果, 而含有纤维蛋白、严重溶血、脂血黄疸的标本影响试验结果.采血量偏少、严重溶血、严重脂血的标本均属不合格标本, 一般均需重新抽取血样, 同时防止因输液因素而稀释标本。

2 实验中的质量控制

2.1 仪器设备的常规检查

在实验前, 要检查以下几项设备: (1) 孵育箱温度是否为37℃; (2) 洗板机洗冲管是否堵塞, 冲出的水柱是否垂直; (3) 生物安全柜是否运行正常; (4) 试剂盒使用前, 需在室温下平衡30min以上, 以保证反应时间的准确性和一致性。 (5) 室温应保持在18~25℃, 以确保结果可靠, 尤其是温度偏高时S/CO值偏大, 易出现假阳性[5]。

2.2 使用正确的加样技术

在进行加样操作时, 要注意以下几点: (1) 加样尽量加入孔底壁, 所有吸头一次性使用, 即一个标本使用一个吸头, 防止因交叉污染而造成试验结果的误差。 (2) 加试剂前一定要充分地摇匀试剂, 加试剂时要去掉第一滴试剂, 并将试剂加入到每孔的正中, 避免将试剂溅到孔外.此外, 实验人员还要保持相同的加样姿势, 以保证加样量相等。

2.3 孵育

孵育时要贴封片, 避免因液体蒸发而使样本和试剂附着于孔壁, 难以彻底清洗.孵育时间要准确, 时间过短会导致特异性结合不够, 实验值偏低;时间过长, 会导致非特异性结合物紧附于反应孔, 难以清洗, 实验值偏高。

2.4 洗板

聚苯乙烯微孔板的彻底清洗是ELISA实验的关键, 高浓度的抗HIV抗体阳性标本可跨板携带污染[6], 洗液应于当天稀释配制, 并注意以下几点: (1) 标本量少时用手工洗板, 洗液要一孔一孔加入, 尽量不要留有气泡, 中途静置30~60s, 再扣干, 洗5~6遍, 确保洗得彻底干净。 (2) 标本量多时用洗板机洗板, 要保证洗板针畅通, 每隔一段时间要用细针清理洗板针孔, 保证冲吸充分。

2.5 显色

使用随试剂盒配发的显色剂, 不使用放置过久或过期的显色剂。显色孵育的时间一定要准确, 过长或过短都会影响试验结果。

2.6 终止

加终止液要做到液量准确, 并避免产生气泡。

2.7 读板

加终止液后要及时读板, 尢其高浓度结果终止15分钟后易产生絮状沉淀, 影响结果, 建议终止15分钟内及时比色[7]。并且保证板底无沉渣、无裂纹、清洁无污物。

3 实验后的质量控制

3.1 质控结果

ELISA室内质控方法一般沿用生化L-J图进行, 利用Westgard规则判断结果是否在控.一般以X靶值土2S为警告限以X靶值土3S为失控限.质控血清最好用临界值血清, 可以灵敏地反映试剂盒的检出水平, 可预防弱阳性标本的漏检, 这样既反映ELISA的灵敏度又兼顾它的特异性.每天将质控结果S/CO值直接传入质控程序内, 同一批号的20个结果可求出均值、标准差、变异系数.选定检测项目输入均值、SD及质控年月, 点击质控图自动以S/CO为纵坐标、日期文横坐标画出当月的质控图.“警告”和“失控”状态下均需要查找原因。

3.2 报告结果

根据编号对应输入检验单上的有关信息, 如姓名、床号、病历号等, 先审核结果无误后再进行打印。一般报告的都是抗HIV阴性的结果, 如果遇到抗HIV阳性的结果还需复查, 出“抗HIV抗体阳性待复查”报告, 并将相关标本送南京市疾控中心进一步复检.自从我科开展抗HIV抗体检查以来共检查出2例抗HIV抗体阳性, 并及时将2例阳性标本送南京市疾控中心复检, 均得到南京市疾控中心的复检确认.我科每年参加卫生部临床医学检验中心的室间质评, 室间质量评价可以反映一个实验室的水平[8]。在2005~2008年卫生部临床医学检验中心开展的抗HIV室间质评中, 所在科室检测的共24批次标本检测合格率为100%[9]。

3.3 已处理标本的保存

已处理的标本都需吸出血清, 封闭并注明日期、编号、项目, 置于冰箱内保存。

综上所述, 任何一个实验室的质量控制结果是报告单发出的基础, 说明检测实验是可靠的、可重复的, 这是检验界老前辈叶应妩教授在80年代初提出的室内质控 (IQC) 的概念[10]。实验室的质量管理是一个庞杂的体系, 医技人员的执行力是有效运行质量管理体系的前提[11], 因此检验人员就须把好质控关, 认真做好工作记录和失控原因分析, 使HIV抗体的检验不断得到完善和提高。

参考文献

吴尊友.中国爱滋病疫情监测面临的挑战[J].疾病监测, 2009;24 (11) :819~821

廖风兰.妊娠合并HIV/AIDS 53例临床分析[J]..中国医药导刊, 2010;12 (9) :1499~1500

雷秋香.ELISA法对HIV抗体的检测[J].检验医学与临床, 2007;4 (3) :35

魏志武, 居军.样本接力跟踪检测质量控制法的初步应用[J].现代检验医学杂志, 2011;26 (2) :15~18

张玲, 杨茂, 室温对抗HIV的ELISA试验结果的影响[J], 中国输血杂志, 2003, 16 (3) :196

夏挺, 胡伟, 毕永春, 等.高浓度抗HIV抗体阳性样本致跨板携带污染1例[J].临床检验杂志, 2012;30 (1) :77

田昱, 邹荣良, 陆伟石.四甲基联苯胺作色原的ELISA两种波长测定[J].临床检验杂志, 1995;13 (3) :140

郑怀竞.临床免疫学检验质量保证[M], 第1版, 北京:北京医科大学-中国协和医科大学联合出版社.1995, 57~91

曹晓芸.临床免疫室间质量评价结果分析[J].数理医药学杂志, 2009;22 (6) :688

杨振华.室内质控是实验室质量管理的基础[J].检验医学, 2004;14 (1) :1~5

ELISA法 第8篇

1 实验前影响因素

1.1 试剂盒选择及保存

试剂盒质量是决定实验结果准确性的必要保障, 各实验室使用的ELISA试剂盒均应为国家有关部门检定合格的产品, 但各厂家试剂盒质量还存在良莠不齐的情况, 试剂盒灵敏度、特异性、精密度、稳定性和操作简便性有一定的差异。可根据实验室情况选择选择特异性强、灵敏度高、操作步骤简单, 达到检验质量保证要求的ELISA试剂盒。ELISA试剂盒保存要求在2℃~8℃环境, 必须做好存储冰箱的温度记录。有实验显示试剂盒存放在37℃环境下一天有效功能衰减程度相当于在2℃~8℃条件下保存一个半月。实验时将试剂盒必须放到室温平衡半个小时, 以保证反应时间准确性和一致性。

1.2 上岗培训

上岗前应该做好培训工作, 使操作者掌握ELISA法实验原理;熟悉所用试剂盒性能;熟悉操作中易出现问题的实验环节;掌握乙肝两对半各标志物之间存在意义, 对乙肝两对半各种模式结果准确理解;掌握ELISA用于乙肝两对半测定的质控方法原理及失控处理原则;测定仪器及加样器正确使用操作方法。掌握检测仪器系统工作站软件功能和使用方法。

1.3 标本的处理

1.3.1 标本的采集

标本采集时应尽量避免溶血, 红细胞破裂可释放过氧化物酶活性物质干扰与显色剂发生显色反应, 可造成实验结果假阳性或假阴性;生长菌的标本同样的道理也产生结果不准确。抗凝不完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造成假阳性, 建议尽量不用抗凝血尤其不可用肝素抗凝血。ELISA法敏感性属于ng级, 重复使用试管或与生化室共用标本极易交叉污染引起假阳性, 塑料试管吸附抗原性物质会造成假阴性。实验室尽可能使用一次性非抗凝真空试管。标本必须完全凝固后离心, 以免未完全凝固的纤维蛋白影响结果。

1.3.2 标本保存

对不能及时完成检验的标本储存血液标本保存在2℃~8℃条件下, 但存放不能超过一周, 时间过久易产生IgG冷凝集现象造成结果不准确。如一周内不能检测要分离出血清存放在-20℃条件下可保存一年。冷冻标本不可反复冻融使用, 因机械裁剪力对蛋白分子的破坏影响检测结果。冷冻标本复融平衡至室温后反复颠倒混匀后使用。

1.4 质控方法选择

ELISA法检测乙肝两对半定性检测法质量高低意义在于是否能够检出病原体或抗体。因此, 检测乙肝两对半定性实验的室内质控应该同时监控实验的灵敏性和特异性。多年来免疫定性技术一直在寻求适合的室内质控方法。实验过程中试剂盒内对照的阴、阳性对照血清OD值稳定是所有质量保证的根本。将“Levey-Jennings质控图法”和“即刻法”室内质控法简单的套用在ELISA法乙肝两对半检测过程还存在一定的片面性, 对实验的特异性无法控制。实验过程中“钩状效应 (HOOK effect) ”即检测过程随着标本中待测物浓度的增加, 抗原抗体结合物就会增加, 而升高至一定后, 测定吸光度即随抗原浓度的增加而开始下降直至不显色, 用“Levey-Jennings质控图法”和“即刻法”室内质控不能很好的显示出来。在实验过程中除失控标本需复验, 还应对乙肝标志物低滴度样本 (按试剂盒国家标准精密度要求设置灰区) , 对灰区结果也要采取复验、登记后报告, 以保证结果正确率提高。积极参加上级部门组织的室间质评工作, 找出差距及时纠正。

2 实验过程

2.1 加样 实验时严格执行加样器使用操作规程。加样器使用必须按要求经常校准 (用分析天平称重法5~100 μl应在±10%) 。由于吸头是一次性使用, 使用时需用所加标本吸打三次后吸样。个别厂家生产的吸头因质量问题与加样器接触不够严密, 吸头尖内孔径粗细不均难以保证准确吸样量, 选择吸头时要观察比较选择符合质量要求的吸头保证吸样精准性。向反应孔加标本时应将吸头尖触及到反应孔侧壁下1/3处打出, 决不能污染其他反应孔。放到温育箱前, 必须将所加样用振荡器混匀30 s以上。

2.3 温育 加入板孔中的标本, 一般情况下只有最贴近孔壁的一层溶液中的待测成分直接与其接触, 抗原抗体结合反应在室温反应很慢, 需37℃环境经过一定时间扩散才能达到反应平衡。平时使用的96孔酶标反应板结构特别, 干育时容易产生周边效应, 即反应板周边孔温度与中间孔温度差异, 这样升温速率差会影响到结果准确性。在实验操作中应该采取水育使反应孔底部接触到恒温水, 尽量保证整板温度迅速达到温度平衡, 减少边缘效应造成的误差。每次温育都应贴密封膜, 防止污染物侵入。

2.4 洗板 ELISA法是靠洗涤来达到分离结合与未结合抗原抗体复合物及酶标记物的目的, 同时通过洗涤可以把非特异性吸附蛋白质、血球、细菌中酶等干扰去掉。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液, 聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的, 非离子型洗涤剂既含疏水基团, 也含亲水基团。每次洗板都应使用新鲜制造的蒸馏水或去离子水稀释洗涤剂, 防止洗涤液受污染影响洗板效果。多条反应孔洗涤时最好把洗板机清洗功能设置成板洗, 减少条洗造成的洗涤时间差。操作时必须将反应孔底部保持平整, 每次放液、吸液才能确保加满吸净。注意观察各孔加液量一致, 发现液量有差别应检查清洗头是否有堵塞, 及时处理保持冲洗管道畅通。洗净后拍干时保证吸水纸洁净防止污染。用含氯消毒剂是一定要格外小心, 含氯消毒剂污染到反应孔会使反应显色造成误差。不同厂家试剂盒洗涤液不能混用。手工洗板注意操作时, 要避免孔内洗涤液外溢, 以防相邻孔互相污染。

3 显色

显色是ELISA法测定乙肝两对半中最后一步温育。温育使反应孔内的酶标物质辣根酶 (HRP) 催化底物生成有色产物。此过程受温度、时间和光线等条件影响。通常底物显色在37℃反10~40 min反应彻底完成, 延长时间颜色也不会再加深, 只能造成本底A值增高。底物液 (TMB) 受光照会自行变色, 显色反应需在避光环境进行。显色完成应及时加终止液终止反应, 终止后反应孔内的颜色可稳定40 min, 随时间延长颜色逐渐减退, 所以应在规定时间内完成比色。

4 比色 (读板) 前面的步骤完成后及时读板

读板必须使用读扳机, 不可目测。读板时防止粘附在反应孔底部污物干扰, 先用洁净的吸水纸将反应孔底部擦拭干净, 再放到读板机上否则吸光度易出现负值或损坏滤光片。读板过程是测定的反应孔内光密度, 读扳机性能必须稳定, 洗板机比色前先预热15 min, 待设备性能达到稳定后进行读板。读板采用双波450 nm/650 nm第二波长650 nm能消除操作过程中留在反应孔底部划痕和手印干扰。读扳机性能测定应以每年当地技术监督局检测合格为依据。

5 审核报告结果

ELISA法测定乙肝两对半结果要依据内外对照和质控情况, 严格审核后报告。记录内对照阴阳性对照孔光密度值。对“Levey-Jennings质控图法”质控测定值超过±2 s按失控处理。标本检测值在灰色区 (设置为CO× (1±CV) CV为该试剂盒批内批内CV值) 范围, 复检结果仍为灰色区, 报告阳性结果。对特殊乙肝两对半结果组合模式应重检后报告。所有复检要有详细记录。

6 ELISA法测定

乙肝两对半操作的全过程都应认真详细记录每一操作步骤, 每次报告前, 都先查看和整理好记录, 在整理实验记录时有时可以发现操作过程中的一些失误。确认记录内容完全符合操作过程, 方可报告检测结果。实验记录长期保存。

参考文献

ELISA法 第9篇

1资料与方法

1.1一般资料

选取我院2013年6月至2015年6月门诊和住院治疗的疑似结核病患者86例,男52例,女34例,年龄19~76岁。

1.2方法

1.2.1诊断标准以中华医学会结核病学分会制定《肺结核诊断和治疗指南》为临床诊断标准。

1.2.2仪器与方法选择ELISPOT的试剂盒采用上海复星代理的进口T-SPOT试剂盒,ELISA法试剂盒采用北京万泰生物药业股份有限公司的IGRA-ELISA技术试剂盒,采血管采用美国BD公司的肝素锂抗凝真空采血管。另外所需的仪器包括有移液器、恒温培养箱、离心机、洗板机、酶标仪、细胞计数设备及CO2培养箱等,实验方法和操作过程均严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.3纳入与排除标准按诊断标准,疑似结核病患者86例全部纳入研究。

1.3统计学方法

采用SPSS22.0统计软件进行统计处理。包括配对卡方检验和一致性检验(Kappa检验)。其中配对卡方检验P<0.05为差异具有统计学意义。Kappa一致性检验中,采取Kappa值>0.75表示两种诊断试验一致性好,0.4<Kappa值≤0.75表示一致性中等,Kappa值≤0.4表示一致性差。

2结果

2.1两种方法结果的基本情况及符合率

8 6例疑似患者,两种方法检测的结果分别为ELISPOT,阳性69例,阴性17例;ELISA法,阳性67例,阴性19例。两种试剂盒阳性符合率为92.5%(62/67),阴性符合率为63.2%(12/19),总符合率86%(74/86)。

2.2两种方法的一致性比较结果

有效观察值个数数值为86,两种方法结果经过配对卡方检验,P值为0.774,>0.05,不拒绝H0,二者无差异。Kappa一致性检验,Kappa值为0.579,0.4<Kappa值≤0.75表示一致性中等。见表2。

3讨论

临床上有很多种结核病检查方法(结核菌素试验,结核特异性抗体的检测,痰涂片查抗酸杆菌等),肺结核患者还可以通过影像学的手段进行检查。这些检查中,结核杆菌的培养一直被认为是诊断结核病的临床金标准,但培养时间长,阳性检出率不高,假阴性比例较高[8],因此临床上迫切的需求找到一种对结核病诊断相对简便易行,结果又准确可靠的检验方法。近年来,r干扰素释放试验(interferon-gamma release assays,IGRAs)开始应用于临床,它以其显著的敏感性、特异性和快速等优势得到了广泛推广和应用。IGRAs是结核分枝杆菌感染检测的一种新方法,辅助诊断机体是否存在结核分枝杆菌感染,据相关报道,IGRAs不仅对诊断肺结核有较高的敏感度和特异度,对肺外结核也有很好的检出效果,可作为结核菌感染的筛查和结核病治疗的评估[9]。对于IGRAs,ELISPOT和ELISA法是目前比较主要的两种检验方法,哪种方法更适用呢?地域和实验条件的不同,方法的选择也不同,充满了争议。本研究中选取86例疑似结核病患者,同时行两种方法的检验,进行比较,给予临床价值评价。

本研究结果的基本情况和符合率,86例疑似患者,两种方法检测的结果分别为ELISPOT,阳性69例,阴性17例;ELISA法,阳性67例,阴性19例。两种试剂盒阳性符合率为92.5%(62/67),阴性符合率为63.2%(12/19),总符合率86%(74/86),其中阳性符合率和总符合率都较高,阴性符合率较为满意,低于相关文献报道。目测数据分析ELISPOT的检测结果稍微优于ELISA法。对于两种方法的一致性比较,笔者做了配对卡方检验和Kappa一致性检验,配对卡方检验结果P值为0.774,>0.05,不拒绝H0,说明两种检验方法无差异。Kappa一致性检验,Kappa值为0.579,0.4<Kappa值≤0.75表示两种检验方法的一致性中等。研究结果和相关研究比较发现虽然符合率和一致性检验稍差于相关报道,但综合统计结果后分析,两种方法的一致性是较好的,虽然目测分析ELISPOT的检测结果稍微优于ELISA法,但从统计学意义上分析两者是无差异的,都可较好被临床应用。另外,结合实验的操作性和方便性,ELISA法较ELISPOT简便易行,对仪器设备的要求以及操作人员的素质要求均较低。因此,笔者认为比起ELISPOT,ELISA法更适合应用于临床检查诊断。

摘要：目的:探讨酶联免疫斑点法(ELISPOT)和ELISA法诊断结核病的临床价值。方法:86例疑似结核病患者,同时行ELISPOT和ELISA法的检验,对结果做配对卡方检验及Kappa一致性检验,比较两种方法的检验的结果,探讨临床诊断应用的价值。结果:配对卡方检验,P值为0.774,>0.05,不拒绝H0,二者无差异。Kappa一致性检验,Kappa值为0.579,0.4<Kappa值≤0.75表示一致性中等。结论:两种方法检验结果差异无显着性,具有一致性,结合实验操作性,方便性,ELISA法更适合应用于临床。

关键词：结核病,酶联免疫斑点法,ELISA法,临床价值

参考文献

[1]张丽帆,张月秋,刘晓清.γ干扰素释放分析在结核病中的诊断价值[J].中华实验和临床感染病杂志(电子版),2012,6(6):633-635.

[2]全国第五次结核病流行病学抽样调查技术指导组,全国第五次结核病流行病学抽样调查办公室.2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告[J].中国防痨杂志,2012,34(8):485-508.

[3]李智琼,邓尚廉,孙承谋.酶联免疫斑点法和ELISA法诊断结核病价值临床比较研究[J].医学信息,2014,27(12):83.

[4]Ling DI,Pai M,Davids V,et al.Are interferon-release assays useful for diagnosing active tuberculosis in a high-burden setting[J].Eur Respir J,2011,38(3):649-656.

[5]Qian F,Wang W,Qiu Z,et a1.Evaluation of a new tuberculosis-related interferon gamma release assay for tuberculosis infection diagnosis in Huzhou,eastern China[J].Indian J Pathol Microbiol,2013,56(2):125-128.

[6]刘佳文,康丽军,翁绳凤,等.干扰素体外释放酶联免疫法在结核病诊断中的价值[J].中国防痨杂志,2011,33(9):600-603.

[7]张华,黄圣文,罗振元.结核分枝杆菌γ-干扰素体外释放定量试验诊断结核感染的临床应用[J].中华医院感染学杂志,2009,19(14):1898-1899.

[8]Nicol MP,Davies MA,Wood K,et al.Comparison of T-SPOT.TB assay and

[9]tuberculin skin test for the evaluation of young children at high risk for tuberculosis in a community setting[J].Pediatrics,2009,123(1):38-43.

ELISA法 第10篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择我院2005年6月~2010年11月健康体检患者220例,其中,男140例,女80例;年龄23~50岁,平均38.5岁。抽取患者静脉血,分离血清,低温(15℃)保存待检。

1.2 方法

1.2.1 检测试剂

检测试剂盒分别购自上海江莱生物科技有限公司(简称江莱),北京万泰生物药业股份有限公司(简称万泰)、英科新创(厦门)科技有限公司(简称新创)。其中包括96孔(48人份)酶标板,阴性对照1 m L,阳性对照1 m L,酶结合物6 m L,显色剂A 6 m L,显色剂B 6 m L,20倍洗涤液40 m L,终止液6 m L,说明书1份,不干胶3张,自封袋1个。抗HBV金标试纸条购自新创。

1.2.2 检测仪器

振荡器(型号ZD-8800),磁力搅拌器(型号JB90-D)均购自上海精密仪器仪表有限公司,酶标仪购自郑州安图生物工程有限公司,型号:Anthos2010。

1.2.3 检测方法

采用ELISA法检测。严格按照试剂盒操作步骤进行,即:(1)使用前,充分混匀所有试剂,勿产生泡沫。(2)根据待测样品数量确定所需酶标板数量。每次实验设空白对照孔1孔,阴性对照、阳性对照各2孔。待检标本用稀释液1∶1稀释后加入50μL于酶标板反应孔内。采用棋盘法做倍比稀释,使标本浓度依次为40、20、10、5.0、2.5、1.25、0 IU/L。同样方法稀释阴性血清。(3)加入稀释好后的标准品及阴性血清50μL于反应孔,待测样品50μL于反应孔内,立即加入50μL的生物素标记的抗体。盖上膜板,轻轻振荡混匀,37℃孵育1 h。(4)甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30 s,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作5次。(5)每孔加入80μL的亲和链酶素-HRP,轻轻振荡混匀,37℃孵育30 min。(6)重复步骤(4)1次。(7)每孔加入底物A、B各50μL,轻轻振荡混匀,37℃温育10 min。避免光照。(8)取出酶标板,迅速加入50μL终止液,加入终止液后应立即测定结果。(9)在450 nm波长处测定各孔的OD值。分别用3个不同公司的试剂盒进行初测,初测ELISA阳性标本再采用胶体金法测定1次。金标试纸条于检测线及对照线位置处各出现一条紫红色线条为阳性,只于对照线位置出现1条紫红色线条为阴性,未出现任何线条表示金标试纸条失效。

1.3 结果判定及观察项目

测定孔OD值/阴性对照孔OD值(S/N)大于2.1判为阳性。比较3个不同公司ELISA检测灵敏度、特异性及与胶体金法检测的一致性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行,计数资料采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

江莱、万泰、新创三家厂家生产的试剂盒检测HBs Ag阳性率分别为12.3%(27/220)、9.5%(21/220)、13.6%(30/220)。新创阳性率最高。阳性血清经金标试纸条检测阳性结果分别为24、18、27例。新创试剂盒ELISA法检测抗原包被浓度为1.25 IU/L时,仍可检出阳性标本。其他两个试剂盒最低检出浓度为2.5 IU/L,差异无统计学意义(χ2=1.25,P>0.05)。

3 讨论

慢性乙型肝炎为世界性医学难题之一,为世界范围内引起慢性肝脏疾病的主要病原之一,起病缓慢,感染率高,我国为HBV感染的主要流行病区,截至2011年有慢性HBV携带者约1.2亿,慢性乙型肝炎患者约3 000万例,以每年新增病例10万~25万的速度增长。大多数患者无明显症状,并可导致肝硬化、肝癌等终末期肝病,目前尚无治疗特效药。主要通过血液、母婴及性接触传播。乙肝疫苗为控制及预防乙型肝炎的主要措施。HBs Ag血清中HBs Ag阳性是HBV感染的标志。本身有抗原性,无传染性。但由于HBs Ag常与HBV同时存在,通常认为是传染性标志之一。HBV标志物检测是临床诊断乙肝感染的重要依据,也是抗病毒治疗检测的重要指标之一。临床通常采用免疫学检测及核算检测两类方法进行。基于免疫学检测的酶联免疫吸附试验因操作方便、灵敏度高、特异性好而较多用于乙肝患者的初筛。

胶体金是由氯金酸(HAu Cl4)在还原剂作用下,聚合成一定大小的金颗粒,由于静电作用形成一种稳定的胶体状态,在弱碱性环境下可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固结合,这种结合为静电结合,不影响蛋白质的生物学性质[3]。单克隆抗体包被于检测线处,抗金标抗体包被于对照线处,金标抗体吸附于固相载体无纺纱上。利用抗原抗体特异性结合的免疫反应原理,在检测线处形成抗体-待测抗原-金标抗体复合物,在对照线处形成抗金标抗体-金标抗体复合物。具有特异性强、灵敏度高、使用方便等优点。但常因判断结果时间不够、反应不充分、温度低、样本加样问题、过滤膜破损等原因导致判断失误,也可因临床医师经验不足把隐约可见的阳性线误判为阴性等不正常结果发生。

酶联免疫吸附试验检测HBV抗体为较简便、快速的检测方法。临床检测通常检测HBs Ag及HBs Ab[4]。HBs Ag为病毒外膜蛋白的重要组成成分,为HBV感染的最主要的血清学检测指标。HBs Ag阳性提示HBV现症感染,阳性持续时间超过6个月则为慢性HBV感染。目前国内HBs Ag检测使用的ELISA法多为定性检测,只能初步判断阴性或者阳性,也有半定量检测的ELISA试剂盒,通常以信号/临界值(singal cut-off,S/CO)或临界指数表示。ELISA试剂盒评价指标为检测灵敏度及检测广谱性[5]。目前国产HBs Ag ELISA试剂盒灵敏度在0.2~0.5 U/m L之间。HBV 9种不同血清型ayw1、ayw2、zyw3、ayw4、ayr、adw2、adw4、adrq+、adwq-,分别位于HB-s Ag第2、3跨膜区亲水区的a表位为各血清型病毒共有的免疫优势表位。正是由于不同血清型a表位氨基酸组成的差异,导致同一试剂对不同血清型病毒检测能力存在差异。本组研究中新创公司生产的ELISA试剂盒灵敏度略高于其他两个公司,差异无统计学意义(P>0.05)。不同厂家生产的ELISA试剂盒检测HBs Ag结果存在不一致性,可能与厂家用于检测时包被的乙肝病毒基因片段不一致有关。

本组实验结果表明,不同厂家ELISA试剂盒检测结果存在差异,临床检测时需综合几个试剂盒结果及其他试验进行验证。

摘要：目的 探讨ELISA法检测健康体检者血清中HBsAg的临床效果。方法 用三个不同公司生产的乙肝表面抗原(HBsAg)检测试剂盒,通过ELISA法检测220例健康体检患者血清中HBsAg水平,检测出的阳性标本再用免疫胶体金试纸条检测,比较三个不同公司生产试剂盒检测阳性率及与金标试纸条法检测的一致性。结果 江莱、万泰、新创三家厂家生产的试剂盒检测HBsAg阳性率分别为12.3%(27/220)、9.5%(21/220)、13.6%(30/220)。新创阳性率最高。阳性血清经金标试纸条检测阳性结果分别为24、18、27例。新创试剂盒ELISA法检测抗原包被浓度为1.25 IU/L时,仍可检出阳性标本。其他两个试剂盒最低检出浓度为2.5 IU/L,差异无统计学意义(χ2=1.25,P>0.05)。结论 不同厂家ELISA试剂盒检测结果存在差异,临床检测时需综合几个试剂盒结果及其他试验进行印证。

关键词：ELISA法,胶体金法,乙肝,诊断

参考文献

[1]顾志冬,吴倩文,冯晓静,等.用于国产一步法HBsAg ELISA试剂及确认试验试剂的改进方法[J].检验医学,2011,26(1):32-35.

[2]陈慧英.对应用酶联免疫吸附试验检测肝炎病毒血清标志物临界结果报告的探讨[J].检验医学,2006,21(Z1):54-56.

[3]祝继华,严立,陈瀑,等.ELISA法在检测乙肝标志物中的应用和评价[J].重庆医科大学学报,2009,34(10):1397-1399.

[4]孙宝春,付春祥.三种不同厂家试剂检测血清HBsAg、HBsAb结果比较[J].山东医药,2010,50(27):89.

ELISA法 第11篇

关键词：微囊藻毒素；单克隆抗体；间接竞争ELISA；检测

中图分类号： X17文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0340-04

我国是世界上藻灾最为严重的国家之一，藻毒素严重威胁居民饮水安全和食品安全。我国主要的淡水藻毒素是微囊藻毒素（microcystin，MC），微囊藻毒素是淡水蓝藻产生的一类生物活性物质，能够对人体多个器官产生危害，危害最严重的靶器官是肝脏，长时间低剂量接触MCs会导致肝损伤和诱发癌症[1-2]。有研究表明，我国肝癌多发区与当地水中高含量的微囊毒素有关[3-4]，MCs引发的急性肝中毒症状表现为肝细胞损伤、肝出血[5]。

预防藻毒素侵害最主要是保持水体清洁，防止藻类过量生长；同时，能够精确及时地检测毒素也是预防毒素污染的有效方法。我国淡水微囊藻毒素污染严重，但迄今为止尚没有一种较合适于现场使用的藻毒素检测方法，因此研制我国自主知识产权的检测淡水中微囊藻毒素的方法已成为当务之急。

藻毒检测方法主要有色谱检测、生物检测、细胞检测[6-8]，这些检测技术或是需要昂贵的仪器、或是需要较长的检测时间、或是准确率不够。与其他检测方法相比，酶联免疫法具有灵敏度高、特异性好、重复性高和检测准确快速的优点，在现场快速检测上具有开发前景，近年来在赤潮藻毒素快速检测方面得到重视和发展。笔者所在实验室在成功制备高效价MC-LR单克隆抗体的基础上，初步建立了检测 MC-LR 的间接竞争酶免疫学检测方法，为研制具有自主知识产权的相关检测试剂盒奠定了基础。

1材料与方法

1.1材料与试剂

微囊藻毒素单克隆抗体由笔者所在课题组研制；其他试剂均为国产分析纯。

1.2包被抗原的制备

用兔血清白蛋白（rabbit serum albumin，RSA）制备包被抗原MC-LR-RSA[9]，冰箱保存备用。

1.3抗原、抗体最佳稀释浓度的确定

在96孔ELISA板上，检测抗原按纵向排列，抗体按横向排列。检测抗原用包被缓冲液（pH值9.6，0.05 mol/L碳酸盐缓冲液）稀释为1 ∶1 000、1 ∶2 000、1 ∶4 000、1 ∶8 000这4个浓度，每浓度3个重复，每孔100 μL，4 ℃过夜；洗涤液后静置1 min，重复洗涤3次；用0.1% BSA（用包被液进行稀释）的封闭液进行封闭，每孔120 μL，37 ℃1 h，洗涤3次，拍干。

MC-LR抗体浓度调为7.5 mg/mL，用高纯水稀释成如下梯度浓度：0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、20 μg/L共11个点；依次加入酶标板上的1号至12号孔中，抗体体积为100 μL/孔，37 ℃温育后洗涤3次；加入HRP标记的羊抗鼠IgG，酶标二抗羊抗鼠IgG浓度选择为1 ∶6 000，每孔加入100 μL，37 ℃温育1 h，洗涤4次；显色液为TMB；终止液为 2 mol/L H2SO4。在酶标仪上测定D450 nm值，确定最佳包被抗原与抗体浓度。

1.4标准曲线的测定

根据“1.3”节所得到的最佳包被抗原浓度和最佳抗体稀释倍数，以及最佳二抗浓度，用标准系列稀释的MC-LR（0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、20 μg/L），按照间接竞争ELISA测定。采用n=3个平行试验，获得标准曲线。

1.5一抗最佳反应时间的确定

根据“1.3”节试验选取最佳的抗原、抗体稀释度，包被抗原浓度为0.5 μg/mL，对应的抗体稀释度为1 ∶20 000，作为ELISA的反应条件。将MC-LR标准品用高纯水配制成如下梯度浓度：0、0.2、0.5、1、2、4 μg/L，共6个点，进行标准曲线测定，每孔50 μL标准品；同时加入用PBS配制好的单抗溶液，每孔50 μL，放入37 ℃培养箱中温育，一抗反应时间设定为30、60、90 min 3个组，每组3个平行；二抗体反应时间固定为60 min。每个时间内标准曲线设置2个平行。反应结束后分别洗涤3次，拍干。

加二抗：酶标二抗采用HRP标记的羊抗鼠IgG，采用PBS稀释，每孔加入100 μL，37 ℃温育1 h，洗涤4次，拍干。

显色：加入新配制的底物液（TMB-H2O2），每孔100 μL，室温下固定反应10 min。测定D450 nm值，选择最佳一抗反应时间。

1.6实际水样的检测（准确度和精密度验证）

1.6.1水样的采集和预处理选取上海市不同来源的水样，包括饮用水、地下水、景观娱乐用水（游泳池和公园水样）以及地表水（城市河道水体）14个样品，每个水样采集体积为10 mL，对较混浊的样品采用0.45 μm的滤膜过滤。

1.6.2水样的添加-回收测定在14个水样中添加标准微囊藻毒素，每个样品毒素的最终浓度分别为0.2、0.5、1.0 μg/L ，共3个不同浓度。采用直接竞争ELISA测定样品中毒素含量，每个水样平行测定5次，根据标准曲线计算水样中MC-LR浓度。同时测定原水中的毒素含量，结果进行比较，并计算回收率。回收率的计算方法如下：每个样品平行测定5次，计算吸光度的平均值，样品添加浓度（最终浓度）用X表示，未添加标准品的样品测定平均值为x1，添加了标准品的样品测定平均值为x2，则回收率计算如式（1）。当原水样ELISA测定浓度超出本方法的检测限，即小于0.1 μg/L时，视为未检出，此时均按照x1=0计算回收率。

回收率=x2-x1X×100% 。（1）

1.7一致性检验

按照确定的ELISA标准曲线测试方法，对所包被的单条可拆酶标板，同一个人分3 d（2014年4月7—9日）进行同样的试验。

试验过程描述如下：包被抗原浓度为0.5 μg/mL，对应的抗体稀释度为1 ∶20 000，微囊藻毒素-LR标准品：0、0.2、05、1、2、4 μg/L共6个点，进行标准曲线测定，每孔50 μL标准品；同时加入用PBS配制好的单抗溶液，每孔50 μL，放入37 ℃培养箱中温育，时间60 min；每个标准品设置2个平行。反应结束后洗涤3次，拍干。加二抗：酶标二抗采用HRP标记的羊抗鼠IgG，采用PBS稀释，每孔加入100 μL，37 ℃温育1 h，洗涤4次，拍干。显色：加入新配制的底物液（TMB-H2O2），每孔100 μL，室温下固定反应10 min。终止：向每孔中加入50 μL的2 mol/L的硫酸溶液。测定：用酶标仪测定其在450 nm的吸光度D450 nm。

2结果与分析

2.1包被抗原和抗体最佳浓度的确定

本试验结果包被抗原浓度为0.5 μg/mL，对应的抗体稀释度为1 ∶20 000左右，可以作为ELISA良好的反应条件。酶标二抗工作稀释度为选择1 ∶6 000。

2.2标准曲线的绘制和分析

间接竞争ELISA的标准曲线如图1所示，误差线为n=3次平行试验的标准偏差，试验重复性良好，相对标准偏差（变异系数）均在10%以内。从图1可以看出，曲线呈现明显的反S形。

由标准曲线可以分析：（1） 半抑制浓度IC50=（0.81±0.05） μg/L。（2） 检测限。间接竞争ELISA的最低检测限LOD是结合率y=10%时所对应的目标物质的浓度，即LOD=0.10 μg/L；最高检测限HOD是结合率y=90%时所对应的目标物质的浓度，即HOD=8.00 μg/L。（3） 定量检测区间。靠近中点处（x0）的一段区间是线性的，称之为定量检测区间，间接竞争ELISA的定量检测区间是结合率为80%～20%所对应的目标物质的浓度区间，即LQD为0.20～4.00 μg/L。

2.3最佳一抗反应时间的确定

一抗反应30 min的结果（图2）表明，吸光度偏低，同时在较高浓度范围内，吸光度变化不是太明显，标准曲线有拖尾的现象。一抗反应60 min的结果（图3）表明，标准曲线线性较好，能满足实际检测的需要。

一抗反应90 min的结果（图4）表明，吸光度较高，说明反应充分；同时标准曲线的线性度也较好，也能满足实际检测要求。但是90 min相对来说时间较长，不推荐在实际操作中应用。

2.5一致性试验

试验结果（图5、图6、图7）表明，各标准曲线的斜率较为接近；吸光度虽然略有差异，但这应该是由试验过程中显色-终止时间的微小差异决定的，不可避免。总体来说，所建立的微囊藻毒素ELISA方法，一致性较好。

3讨论

微囊藻毒素目前已经分离出80多种异构体[10]，其中MC-LR是目前毒性最大、存在最广泛、研究最多的一种，也是我国最常见的微囊藻毒素种类[11]。目前MC-LR被定为检测微囊藻毒素污染的指标。为了降低MCs对人和水生动物的毒性及潜在危害性，世界卫生组织（WHO）推荐水中微囊藻毒素的安全指导值MC-LR是1 000 ng/L[12]。

常用的藻毒素检测方法是高效液相色谱法（HPLC）、免疫学法以及生物毒性法（MBA）。HPLC法精确灵敏，但需要复杂的设备和专业的操作人员；MBA法简单直观，但精确性和灵敏性较差。免疫学技术利用抗原抗体之间的特异性进行样品捕获和检测，被应用于检测领域后取得了显著的效果，具有快速、

灵敏、操作简单、不需要复杂仪器设备、价格低廉、便于制成可携带的检测纸板和试剂盒等优点，成为我国攻克藻毒素现场快速检测的首选方法。国际上已经有关于免疫检测技术在藻毒素检测的研究报道，并且已经制备出了部分藻毒素的ELISA试剂盒，如美国、日本、欧洲一些国家有微囊藻毒素（microcystin）[13-14]和软海绵酸（okadaic acid，OA）的ELISA检测试剂盒销售[15-16]，但价格昂贵，检测成本高，不适合大量样品的检测；近年我国也有学者研究藻毒素的免疫检测技术，如盛建武等将MC与BSA偶联制备免疫原MC-LR-BSA，用其研制的抗体建立的ELISA，最低的检测限为 10 ng/L[17]。赵晓联等采用人KLH作为载体制备免疫原MC-LR-KHL，其抗体建立的ELISA最低检测限为0.01 ng/mL[18]。

本研究选取我国典型微囊藻毒素（microcystin-LR）为研究对象，采用碳二亚胺缩合方法分别合成了毒素的完全抗原MC-LR-KLH，利用制备的单克隆抗体发展建立了有效的MC-LR间接竞争酶联免疫检测，最佳包被抗原浓度为 0.5 μg/mL，对应抗体稀释度为1 ∶20 000左右，酶标二抗工作稀释度选择为1 ∶6 000；检测区间LQD为0.20～4.00 μg/L，最低检测限LOD为0.10 μg/L，最高检测限HOD为8.00 μg/L，特异性较好。

应用该方法对4个加标水样进行检测，各水样原水均未检测出MC-LR（<10 ng/L），检测结果相对标准偏差均小于10%，与投加的标准MC-LR相关系数大于0.98，样品的回收率在综合回收率为（98.0±10.7）%。该ELISA方法准确度良好，精密度优良。

参考文献：

[1]许川，舒为群，曹佳. 我国水环境微囊藻毒素污染及其健康危害研究[J]. 癌变·畸变·突变，19（3）：202-205.

[2]隋海霞，严卫星，徐海滨，等. 武汉东湖微囊藻污染及其在鱼体内的动态研究[J]. 卫生研究，2004，33（1）：39-41.

[3]陈刚，俞顺章，卫国荣. 肝癌高发区不同饮用水类型中微囊藻毒素含量调查[J]. 中华预防医学杂志，1996，30（1）：6-9.

[4]张明东，俞顺章，梁任祥. 广西扶绥县原发行肝癌病例对照研究[J]. 中华流行病学杂志，1993，14（1）：14-17.

[5]俞顺章，赵宁，资小林. 饮水中微囊藻毒素与我国原发行肝癌关系的研究[J]. 中华肿瘤杂志，2001，23（2）：96-99.

[6]Poon G K，Griggs L J，Edwards C. Liquid chromatography-electrosprayionization-mass spectrometry of cyanobacterial toxins[J]. Journal of Chromatography，1993，628（2）：215-233.

[7]Mails M，Budde W L. LC/MS methord for the determination of cyanobacteria，toxins in water[J]. Analytical Chemistry，2004，76（5）：1342-1351.

[8]Quilliam M A，Wright J L C. The amnesic shellfish poisoning mystery[J]. Analytical Chemistry，1989，61（18）：1053-1059.

[9]盛建武，何苗，钱易，等. 微囊藻毒素-LR完全抗原的设计及制备[J]. 环境科学，2005，26（3）：33-37.

[10]An J，Carmichael W W. Use of a colorimetric protein phosphatase inhibition assayand enzyme linked immunosorbent assay for the study of microcystins and nodularins[J]. Toxicon，1994，32（12）：1495-1507.

[11]Shen P P，Shi Q，Hua Z C，et al. Analysis of microcystins in cyanobacteria blooms and surface water samples from Meiliang Bay，Taihu Lake，China[J]. Environ Int，2003，29（5）：641-647.

[12]WHO.Guidelines for drinking-water quality[R]. Geneva：World Health Organization，1998.

[13]Chu F S，Huang X，Wei R，et al.Production and characterization of antibodies against microeystin[J]. Appl Environ Miembiol，1989，55：1928-1933.

[14]McDermott C M，Feola R，Prude J.Detection of cyanobaeterial toxins（microcystins） in waters of northeastem Wisconsin by a new immuno-assaytechnique[J].Toxicon，1995，33：1433-1442.

[15]Tagmouti-Talha F，Moutaouakkil A，Taib N，et al. Detection of paralytic and diarrhetic shellfish toxins in moroccan cockles（Acanthocardia tuberculata）[J]. Bull Environ Contam Toxicol， 2000，65：707-716.

[16]Llamas N M，Stewart L，Fodey T，et al . Development of a novel immunobiosensor method for the rapid detection of okadaic acid contamination in shellfish extracts[J]. Anal Bioanal Chem，2007，389（2）：581-587.

[17]盛建武，何苗，余少青，等. 水体中微囊藻毒素-LR的间接ELISA检测[J]. 环境科学，2006，27（6）：1166-1170.

ELISA法 第12篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2009年1月至2009年9月在我院检验科体检人员的血液标本200例作为观察对象, 其中男性115例, 女性85例, 年龄20~65岁, 平均年龄 (36.1±10.2) 岁, 所有均进行一次HIV抗体初筛, 初筛结果均为阴性, 同时200例标本均为无脂血、乙肝阳性、丙肝阳性, 并排除一些ELISA实验过程中人为操作、实验室温度及仪器使用方面对ELISA结果影响的因素。

1.2 方法

1.2.1 溶血标本的制作

健康体检者每人早晨空腹抽取静脉血4毫升两管, 一管用于HIV抗体初筛、血脂、乙肝、丙肝等结果的检测;另一管血液标本通过物理震荡或反复冻融的方式造成不同程度的溶血, 然后分离血清和血细胞以保证溶血程度的稳定防止进一步溶血, 溶血程度以血浆游离血红蛋白 (FHb) 为计。

1.2.2 HIV抗体的检测

HIV抗体检测过程, 严格按照试剂盒使用说明书进行操作, 试验设阳性对照2孔, 阴性对照3孔, 外部质量控制2孔, 每份非溶血标本均做平行样;然后按照相同操作步骤测定溶血标本的HIV抗体, 所有标本依据溶血程度的不同1g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、40g/L分为6组, 比较各组阳性率出现情况, 各组标本的HIV抗体初筛结果、血脂、乙肝、丙肝的OD值经统计学分析比较, 均无显著性差异, (P>0.05) , 具有可比性, 比较不同程度溶血标本HIV抗体假阳性率情况。

2 结果

不同程度溶血标本HIV抗体假阳性率情况分析 (表1) , 血浆游离血红蛋白≥10g/L出现HIV抗体假阳性, 同时随着血浆游离血红蛋白的增高HIV抗体假阳性率逐渐增高。

3 讨论

近年来, 中国艾滋病的打动与发病人数也增长较快, 据并合国驻华机构晓示的数据, 眼前中国艾滋病病毒打动者约84万人, 加上已经卧病过世的24万人, 总数理应在100万人左右。提示对艾滋病患者的筛查显得尤为重要。ELISA法作为检测HIV抗体较常用的方法, 主要采取双抗原夹心法原理, 通过酶催化底物反应的放大作用, 用来提高特异性抗原抗体反应的敏感性[2]。虽然随着ELISA试剂盒技术的不断发展, 其敏感性和特异性有了明显的提高, 但是ELISA法除了受到实验原理、试验条件及操作人员等因素的影响以外, 血液标本的溶血也会影响HIV抗体的检测结果, 随着溶血程度的升高, 反应孔上非特异吸附的血红蛋白的量会增加, 标本的OD值也会随之高, 导致试验结果的假阳性的出现[3]。本研究通过对我院检验科收集的200例血液标本人为的溶血, 对不同程度溶血标本HIV抗体假阳性率情况分析, 结果表明, 血浆游离血红蛋白≥10g/L出现HIV抗体假阳性, 同时随着血浆游离血红蛋白的增高HIV抗体假阳性率逐渐增高。因此应尽量避免假阳性标本的出现, 从而保证检测结果的真实可靠性。

摘要：目的探讨溶血对ELISA法检测HIV抗体影响。方法采用回顾性分析的方法, 分析200例血液标本, 不同溶血程度对检测HIV抗体的影响。结果血浆游离血红蛋白≥10g/L出现HIV抗体假阳性, 同时随着血浆游离血红蛋白的增高HIV抗体假阳性率逐渐增高。结论ELISA法检测HIV抗体应尽量避免假阳性标本的出现, 从而保证检测结果的真实可靠性。

关键词：溶血,ELISA,HIV抗体

参考文献

[1]余育胜, 郑曦.红细胞内液对ELISA OD值的影响观察[J].公共卫生与预防医学, 2006, 17 (3) ∶62～63.

[2]胡静云, 陈善昌.溶血对ELISA法测定HIV抗体假阳性的观察[J].实验与检验医学, 2009, 27 (4) ∶427～428.