小鼠肿瘤范文

小鼠肿瘤范文（精选7篇）

小鼠肿瘤 第1篇

芦笋学名石刁柏,又名龙须菜、文山竹、索罗罗、细百叶部是百合科天门冬属多年生草本植物。研究发现,芦笋活性成分具有抗肿瘤、免疫调节、抗衰老抗疲劳、降血脂、保肝解毒等特殊的生物学功能。营养学家和素食界人士均认为它是健康食品和全面的抗癌食品。用芦笋治淋巴腺癌、膀胱癌、肺癌肾结石和皮肤癌有极好的疗效。对其它癌症、白血症等,也有很好效果[1,2,3]。芦笋汁及其制成的饮料对胃癌、白血病、肝癌、小鼠肺腺癌、人鼻咽癌、人宫颈癌和人食管癌细胞均有明显的减细胞毒作用[4,5],可使细胞发生营养障碍,从而抑制肿瘤细胞的生长增殖,同时对于患者的恶性肿瘤的化疗有增效减毒作用。

乳腺癌是一种严重危害妇女健康的恶性肿瘤,近年来,我国乳腺癌的发病率呈逐年上升趋势,大中城市尤为突出,在女性恶性肿瘤中居首位,是威胁当今女性健康的主要疾病之一。全世界每年约有120万妇女发生乳腺癌,有50万妇女死于乳腺癌,在西方发达国家已成为妇女的第一位死亡原因。大量研究表明,环氧化酶(cyclooxygenase,COX),尤其是COX-2在恶性肿瘤,如前列腺癌、乳腺癌、结直肠肿瘤的发病机制中起着非常重要的作用[6,7,8,9,10,11]。乳腺癌是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤[12]。目前我国乳腺癌发病率仍呈逐年上升趋势,本研究拟通过建立乳腺癌小鼠动物模型,观察芦笋抑制乳腺癌肿瘤生长的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

BALB/c小鼠,SPF级,由国家噬齿类种子中心-中国药品生物制品检验所实验动物中心提供,合格证号:SCXK(京)2005—004。实验动物饲养在江西省药物研究所,使用许可证SYXK(赣)2008—0005。BALB/c小鼠,雌性,鼠龄5～6周龄,体重18～20克。饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供,饲料、饮水、垫料均经高压蒸汽灭菌121°20min,取出垫料再放入电热鼓风干燥箱干燥后使用。

1.2 受试物

芦笋混悬液:将新鲜芦笋加蒸馏水(芦笋1g:水1ml)捣碎匀浆,配制而成;4℃冰箱保存备用。

阴性对照组:蒸馏水。

1.3 乳腺癌细胞株

乳腺癌细胞株来源于BALB/c小鼠自发性乳腺癌。

1.4 实验方法

(1)荷瘤鼠模型的建立

将乳腺癌细胞2×107细胞悬液接种小鼠乳垫,待小鼠乳垫处肿瘤长到直径为1cm大小时开始给药。

(2)分组

芦笋组:5只,每日用芦笋混悬液灌胃,0.4ml/只,每日1次,连续20天;

对照组:5只,每日用蒸馏水灌胃,0.4ml/只,每日1次,连续20天。

1.5 观察指标

(1)测量体重与肿瘤大小

给芦笋前称小鼠体重并测量肿瘤大小,给芦笋后每周称量体重,测肿瘤大小两次;小鼠死亡当天或最后一次给药次日处死荷瘤鼠称体重,测量肿瘤大小,计算肿瘤体积。

肿瘤体积:V=π/6×a×b×c(a、b、c为肿瘤的长、宽、高)

(2)计算抑瘤率

(3)计算小鼠平均存活天

(4)统计学方法

采用spss14.0软件统计分析。

2 结果

2.1 荷瘤小鼠模型的建立

将乳腺癌细胞2×107细胞悬液接种小鼠乳垫(原位移植)。第7天,小鼠乳垫肿瘤均长到大约直径为1cm大小(见图一),开始灌胃给药。

2.2 芦笋组和对照组小鼠体重结果

荷瘤小鼠模型建立后,两组体重、肿瘤大小未见显著差异(P>0.05),给芦笋后两组体重、肿瘤大小结果见表一、图二。

(*P<0.05,存在显著性差异)

第14天,两组体重存在显著性差异(p<0.05)。对照组:第9天死亡2只,第10天死2只,待第28天时对照组仅存活1只小鼠;芦笋组未见死亡。

2.3 芦笋组和对照组小鼠肿瘤大小的比较

芦笋组和对照组中肿瘤随存活时间的增长而增大,但给芦笋后肿瘤增长明显小于对照组,两组比较有非常显著性的差异(见表二)。第4天芦笋组肿瘤明显小于对照组并有显著性差异(P<0.05),第7、10天,肿瘤出现非常显著性差异(P<0.01)。

(注:与对照组比较*P<0.05;**P<0.01)

2.4 芦笋组和对照组肿瘤重量的比较

给芦笋后的第28天处死荷瘤鼠,芦笋组和对照组肿瘤重量的比较见表三、图四。两组肿瘤重量存在显著性差异(P<0.01)。结果表明芦笋不仅能抑制肿瘤生长大小,而且能抑制肿瘤重量的增加,抑瘤率为30%。

(注:与对照组比较P<0.01)

2.5 小鼠平均存活天数

芦笋组小鼠全部存活,而对照组在实验结束时仅存小鼠1只。对照组平均存活17.8天,芦笋组平均存活28天,两组小鼠存活天数存在显著性差异(P<0.01),

3 讨论

小鼠肿瘤 第2篇

1.1 药品与试剂

鲜品中华芦荟A.vera L var.chinensis (Ha W.) Berger (湖南省药材公司提供, 经湖南中医药大学中药鉴定教研室鉴定为正品) , 提取、分离得到, 为浅棕黄色颗粒状粉末, 易溶于热水, 近似分子量为1400Da。生理盐水溶解后高压灭菌备用。环磷酰胺 (CTX) 为上海华联制药有限公司产品, 批号050313, 临用前以灭菌生理盐水稀释。

1.2 动物和瘤株

动物:昆明种小鼠, 雌雄各半, 体重 (20±2) g, 由湖南中医药大学动物实验中心提供, S180、EAC瘤株由中山医科大学肿瘤研究所提供。

2 方法与结果

2.1 对S180荷瘤和EAC小鼠瘤株生长的影响

无菌条件下抽取将传代7d的S180荷瘤小鼠腹水, 无菌0.9%氯化钠溶液按1:3的比例稀释成瘤细胞悬液。取纯系昆明种小鼠40只, 每鼠右前肢腋部皮下接种S180肉瘤细胞悬液0.2mL (含瘤细胞1×108/mL) 。EAC瘤株按常规接种肿瘤法, 将瘤株接种到每只小鼠。接种2 4 h后, 随机分4组, 每组l0只, 中华芦荟多糖高剂量组0.1g/ (10g·d) , 中华芦荟多糖低剂量组0.05g/ (10g·d) , CTX组CTX0.25mg/ (10g·d) , 模型对照组给予等容量0.9%氯化钠溶液, 各药物均为灌胃给药。1 d 1次, 连续10 d, 次日处死动物, 测瘤重并计算抑瘤率, 然后观察记录抑瘤率、体重的差异。其中, 抑瘤率 (%) = (对照组平均瘤重-用药组平均瘤重) /对照组平均瘤重×100%。数据结果用SPSS13.0进行统计分析, 见表1

注:每组数据均为3批实验的平均值, 每组动物10只;与荷瘤组 (NS) 比较*P<0.05, **P<0.01

2.2 对荷瘤动物肿瘤坏死因子 (TNF) 的影响

腹腔M中肿瘤坏死因子含量的测定采用酶联免疫吸附法, 可得各待检孔的相应TNF含量。数据结果用SPSS13.0进行统计分析, 见表2。

注:每组数据均为3批实验的平均值, 每组动物10只;与荷瘤组 (NS) 比较*P<0.05, **P<0.01

2.3 对CTX的增效减毒作用 (以脾系数为指标)

实验结果见表3, 表明中华芦荟多糖0.05mg/ (10g·d) 可以显著改变机体的整体机能, 使荷瘤小鼠体重增加, 脾系数提高 (脾系数=脾脏重量/体重×10) , 可显著改善CTX引起的机体生理机能紊乱, 提高其抑瘤作用, 与CTX组比较P<0.0 1。数据结果用SPSS13.0进行统计分析。

注:与模型对照组比较*P<0.05, **P<0.01

3 讨论

小鼠肿瘤 第3篇

关键词：肝癌,低能量激光,环磷酰胺,血管新生,增殖细胞核抗原

复发和转移一直是困扰临床医生的重大问题。放疗和化疗出现的严重毒副作用,使得治疗效果不尽人意。血管生成在肿瘤增殖中起着重要作用,而生物学治疗给人类带来了新的希望,目前用激光生物学疗法治疗疾病已成为国内外学者研究的热点。本研究通过分析低能量激光照射与环磷酰胺(CTX)联合应用对肿瘤细胞增殖及血管生成的影响,探讨可能的抑瘤机制,以期对肿瘤治疗开拓新的研究方向。

1 材料与方法

1.1 实验试剂及设备

CTX由江苏恒瑞医药股份有限公司提供,批号05010821;血管内皮生长因子(VEGF)mRNA原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物制品公司;增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体、免疫组化SP检测试剂盒购自福建迈新生物技术开发有限公司;肝癌细胞H-22株由北京大学肿瘤研究所引进;JD-Ⅲ型激光治疗机为南京医用激光仪器厂生产。

1.2 实验动物

KM小鼠43只(其中3只进行种植瘤培养),购自内蒙古大学动物实验中心,许可证号:SCXK(蒙)2009-0001,体重18～22 g,雌雄各半。

1.3 实验方法

1.3.1 模型建立

3只KM小鼠腹腔注射0.5 mL肝癌细胞H-22株进行培养,1周后取腹水生长良好的小鼠无菌条件下取腹水10 mL,置冰盒内,用生理盐水按1∶2稀释成细胞悬液,调节细胞浓度为2.5×107细胞/mL,按0.2 mL/只接种于小鼠右腋部皮下,制成荷瘤小鼠模型。

1.3.2 动物分组

40只KM小鼠接种肿瘤细胞4 h后,随机分为4组,每组各10只。(1)生理盐水(NS)组:NS 20 mL/(kg·d)灌胃。(2)低能量激光照射组(JG组):激光照射小鼠脾区。(3)环磷酰胺组(CTX组):15 mg/(kg·d)灌胃。(4)低能量激光照射联合环磷酰胺组(JG+CTX组):激光照射小鼠脾区联合CTX 15 mg/(kg·d)灌胃。

1.3.3 激光照射

激光仪输出光波功率12 mW,激光波长632.8 nm,光斑直径0.6 cm,照射剂量25.48 J/cm2。接种肝癌细胞H-22株24 h后JG组和JG+CTX组用激光照射小鼠,部位为脾区,激光照射经过扩束后垂直距离30 cm,照射10 min/(次·d)。各用药组于接种24 h后开始给药,连续10 d后处死小鼠。

1.4 标本采集及观察指标

1.4.1 一般情况观测

小鼠皮下接种肝癌细胞H-22株分组后称量各组初始体重。小鼠接种肝癌细胞H-22株后成瘤率为100%,每天观察小鼠的饮食、活动、毛色等一般情况的变化,每3天测量体重1次。以用药时间(d)为横轴,各组体重均值(g)为纵轴描记各组小鼠的体重变化趋势曲线。

1.4.2 抑瘤率及脾指数照射

给药结束后第2天处死小鼠,测量荷瘤小鼠的体重,然后迅速将肿瘤组织完整剥出,称重、计算抑瘤率;摘取脾脏,称重、计算脾指数,公式如下:抑瘤率=[(NS组平均瘤重-干预组平均瘤重)/NS组平均瘤重]×100%。脾指数=脾脏重(mg)/体重(g)。

1.4.3 原位杂交法检测瘤细胞VEGF mRNA表达肿瘤组织

称重后,将肿瘤组织置于10%中性甲醛中固定,常规石蜡包埋,5μm切片,使用VEGF mRNA原位杂交检测试剂盒,检测肿瘤VEGF mRNA。NS组用磷酸盐缓冲液(PBS)代替原位杂交探针,结果肿瘤细胞中无阳性表达,提示本实验检测VEGF mRNA是特异性表达。在图像分析系统下观察各组瘤细胞VEGF mRNA表达。

1.4.4 肿瘤微血管密度(microvessel density,MVD)的检测

免疫组化SP法染色血管,经染色后内皮细胞褐染,血管呈黄褐色,易于辨认。先在低倍视野下选取肿瘤内新生血管最丰富的区域,即“热点”,然后在200倍视野范围,计数被染成棕色的微血管数目,取5个视野的平均值作为MVD值。

1.4.5 瘤组织增殖细胞核抗原PCNA表达

采用免疫组化SP法检测,按照试剂盒说明书进行操作。每个标本切片低倍视野下观察,确定有代表性的PCNA染色阳性部位,选择5个视野,400倍镜下每个视野选取200个肿瘤细胞,观察并计算阳性细胞总数。细胞核着色呈棕褐色或棕黄色为阳性细胞,PBS为一抗的阴性对照片无棕黄色染色。

1.5 统计学方法

采用统计软件SPSS 15.0对数据进行分析,正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组一般情况与体重变化比较

各组小鼠鼠给药第1天体重差异无统计学意义(P=计学差异,提示PTEN蛋白表达下降与宫颈癌的发生有关,这可能是由于PTEN基因的功能缺失使其对肿瘤细胞生长抑制及对细胞黏附的控制减弱,有助于宫颈癌的发生[7]。PTEN的表达量与宫颈癌的病理分级、临床分期、淋巴结有无转移无关。

小鼠肿瘤 第4篇

关键词：穿心莲内酯,S180,抗肿瘤,巨噬细胞

穿心莲为爵床科植物穿心莲Androyraphispaniculata (Burm.f) Nees的干燥地上部分, 具有清热解毒、凉血、消肿等作用, 可用于感冒发热、咽喉肿痛、口舌生疮、顿咳劳嗽、泄泻痢疾、热淋涩痛、痈肿疮疡、毒蛇咬伤等[1]。研究表明穿心莲的二萜内酯类成分含量较高, 是其主要活性成分, 如穿心莲内酯 (Andrographolide, AD, 穿心莲乙素) 、脱水穿心莲内酯和新穿心莲内酯 (穿心莲丙素) 等[2]。近年来研究发现AD除具有免疫调节、抗糖尿病等作用外, 具有明显的抗肿瘤作用[3], 对胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、食管癌等具有明显的抑制作用[3—6]。为了进一步揭示AD的抗肿瘤作用, 本研究用小鼠S180肿瘤模型观察AD对移植性肿瘤的抑制作用, 并对抗肿瘤作用的机制进行了初步探索, 以期为AD抗肿瘤药物的研发积累资料。

1材料与方法

1.1仪器

DG 3022型酶标仪为美国BioRad公司产品;Nu—3500E型CO2培养箱为德国Nuaice公司产品;YJ.875医用超净台购自吴江市空气净化设备厂;P13203—N分析天平为MettlerToledo公司产品。

1.2药品与试剂

AD购于中国药品与生物制品检定所;环磷酰胺购于恒瑞医药股份有限公司。噻唑蓝 (MTT) 、二甲基亚砜 (DMSO) 为Sigma产品;RPMI1640、胰蛋白酶及小牛血清为Gibco产品。肿瘤坏死因子- (TNF-α) 检测试剂盒为R&D公司产品。其余试剂均为国产分析纯。

1.3动物、细胞株及动物瘤株

ICR小鼠, 体重 (18～22) g, 雌雄各半, 陕西省中医药研究院实验动物中心提供, 合格证号:医动字第08—24号。小鼠肉瘤S180购自陕西省中医药研究院实验动物中心。细胞培养使用RPMI 1640培养液 (含10%灭活的小牛血清、100U·mL-1青霉素和100mg·L-1链霉素) , 置于37℃、5%CO2孵箱中培养。

1.4对体外培养的小鼠S180细胞的抑制作用

取对数生长期的细胞, 以5×107/L的密度接种于96孔板, 每孔100μL, 在37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养12h。试验设阴性对照组、DMSO溶剂对照组、不同浓度给药组。每个培养孔加入 (2～600) μg/mL的AD (用DMSO溶解, 终浓度≤0.5%) 100μL, 使终浓度为 (1～300) μg/mL, 每个浓度设8个复孔, 37℃、5%CO2饱和湿度孵箱内培养48h, 每孔加入MTT液 (5g/L) 20μL, 培养4h后, 吸弃培养液, 每孔加入150μL二甲基亚砜, 轻度振荡溶解结晶, 置自动酶标仪570nm波长处测OD值, 按下列公式计算细胞生长的抑制率:细胞生长抑制率/%= (1-给药组OD值/对照组OD值) ×100%, 实验重复3次。

1.5对S180肉瘤的抑制作用和对免疫器官的影响

ICR小鼠4只, 取接种7d的腹水S180瘤株制成1×107mL的瘤细胞悬液, 每鼠右后背部接种0.2mL, 24h后将小鼠随机分成对照组 (0.5%CMC-Na溶液) 、阳性对照组 (20mg/kg环磷酰胺) 、AD 2个剂量 (25、50mg/kg) 共4组, 每组各10只, 每日小鼠称重后, 按体重灌胃给药1次, 14d后小鼠称重, 处死, 取瘤块, 称质量, 按公式计算抑瘤率:

取胸腺和脾脏, 按公式:脏器指数=脏器重量/体重, 计算胸腺指数和脾指数。

1.6对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定[7]

小鼠颈椎脱臼处死, 酒精消毒, 腹腔注射RP-MI1640培养液约3mL, 轻揉腹腔 (2～3) min, 收集腹腔液, 以1 000r/min离心5min, 弃上清, 用RP-MI1 640培养液调整细胞浓度至2×109/L。将巨噬细胞悬液接种于96孔细胞培养板中 (100μL/孔) , 置37℃, 5%CO2培养箱中孵育3h, 吸弃培养液, 用RPMI1 640培养液洗去未贴壁的细胞, 即得纯化的小鼠腹腔巨噬细胞。将分离的细胞分为对照组和不同剂量的给药组。向96孔板巨噬细胞中加入030、100、300μg/mL AD的RPMI1 640培养液200μL, 对照组加入等体积的含终浓度≤0.5%DM-SO的RPMI1 640培养液, 于37℃培养24h, 弃上清, 每孔加入0.1%中性红溶液100μL续培养30min, 弃去上清, 用PBS洗3次, 每孔加入200μL细胞溶解液 (乙酸∶无水乙醇=1∶1) , 混匀10min, 在分光光度计上测550nm处的吸光度 (A550nm) 值。

1.7巨噬细胞TNF-α含量的测定

96孔培养板中的巨噬细胞分为阴性对照组、阳性对照组和不同剂量的给药组, 吸弃细胞培养上清液, 给药组每孔分别加入0、30、100、300μg/mLAD的RPMI1 640培养液150μL阳性对照组加入10mg/L多糖 (LPS) 的RPMI1 640培养液150μL, 阴性对照组加入等体积的RPMI1 640培养液, 37℃培养48h后, 吸取上清以双抗夹心ELISA法, 测定培养上清中TNF-α的水平, 操作步骤按检测试剂盒中的说明书进行。

1.8统计学分析

数据以x±s表示, 采用SPSS软件进行方差分析。P<0.05表示两组差别具有显著性意义。

2结果

2.1 AD对体外培养的S180细胞增殖的抑制作用

MTT法测定结果见图1。AD可以剂量依赖性的关系抑制S180细胞的增值。300μg/mLAD作用48h, 抑制率可达53.7±7.2%。

2.2 AD对小鼠S180的抑制作用

连续给药14 d后, 各组荷瘤鼠的瘤重、抑制率见表1。二个剂量组 (25 mg/kg和50 mg/kg) 的小鼠的一般状态比阴性对照组好。二种剂量的AD均能显著抑制肿瘤在小鼠体内的生长, 且呈剂量依赖关系 (P<0.05) 。

与阴性对照组相比, *P<0.05, 与环磷酰胺组相比, #P<0.05。

2.3 AD对小鼠免疫器官指数的影响

结果见表2:环磷酰胺组胸腺指数和脾脏指数与对照组比较均明显下降 (P < 0.05) , 二个剂量的AD治疗组的胸腺指数和脾脏指数与阴性对照组均无显著性差异, 但明显高于环磷酰胺组 (P < 0.05) 。

2.4 AD对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

培养的小鼠巨噬细胞以不同浓度的AD刺激后, 可剂量依赖性的增加巨噬细胞吞噬中性红的能力。300 μg/mL的浓度时, 吞噬活性最高 (见图 2) 。

2.5 AD对小鼠巨噬细胞产生TNF-α的影响

巨噬细胞给予不同浓度的AD培养48 h后, 取细胞培养上清液, 用ELISA法测定TNF-α的浓度, 结果见图3。AD可剂量依赖性的增加巨噬细胞TNF-α的释放量, AD浓度为0、30、100、300 μg/mL时, 培养上清中TNF-α的浓度分别为68.65±10.27、118.64±40.23、163.82±3.93 ng/L, 呈剂量依赖性。

3 讨论

AD又称穿心莲乙素, 是中药穿心莲的主要有效成分之一。以往AD的药理研究多侧重于其抗菌消炎方面, 近年来, 随着研究的不断深入, 其在提高免疫力、抗肿瘤等方面的功效逐渐被认识, 并引起了广泛的关注。研究表明, AD与硫酸氢钠制备的莲必治注射液 (LBZ) 在体外研究与动物实验中均对胃癌、肝癌、肺癌、乳癌等有明显的抗癌作用[8]。Rajagopal等[9]人报道AD具有直接、间接抗肿瘤的活性。应用单体制剂莲必治治疗实体S180瘤小鼠模型实验表明, 莲必治与淋巴因子激活的杀伤细胞 (LAK) 组合用药, 抑瘤率达92.12%;能明显延长荷瘤鼠的生存时间, 并有明显保护胸腺、恢复脾损伤的作用[10]。以上研究表明AD在体内、体外均有抗肿瘤作用, 其作用机制可能是直接抑制肿瘤细胞生长和调节机体的免疫功能的双重作用。

在本研究中, 我们对AD抑制S180细胞增殖的作用进行了测定, 发现AD能明显抑制S180细胞的增殖, 抑制率随着药物浓度的增加而增大, 具有剂量依赖关系。此外, 随着作用时间的延长而增加, 具有时间依赖关系。镜下观察, 可看到给药组的细胞变圆, 出现大量死细胞。提示AD的抗肿瘤作用与其直接抑制肿瘤细胞生长有关。

我们对AD的体内抗肿瘤作用进行了进一步的研究, 发现两个剂量的AD治疗组的胸腺指数和脾脏指数与阴性对照组无显著性差异, 但AD有增加荷瘤小鼠脾脏指数和胸腺指数的趋势, 提示AD具有调节机体的免疫功能从而抗肿瘤的作用。因此我们进一步探讨了AD对免疫细胞的作用。巨噬细胞是体内执行非特异性免疫的主要细胞, 是早期肿瘤免疫监视机制中起重要作用的效应细胞, 活化的巨噬细胞吞噬功能显著增强, 并可分泌多种生物活性物质 (如TNF-α及活性氧等) , 对肿瘤细胞有一定的杀伤作用。本实验发现, AD能显著增加巨噬细胞的吞噬功能, 并刺激小鼠巨噬细胞分泌TNF-α, 这可能是其发挥抗肿瘤作用的重要机制之一。

参考文献

[1]江苏新医学院.中药大辞典.上海:上海科学技术出版社, 1977:1728

[2]肖树雄, 王晓钰, 郑剑红.穿心莲的成分及其分析方法研究概况.中国药师, 2002;5 (11) :693—694

[3]刘新建, 王一飞, 李贵生.穿心莲内酯及其衍生物的药理研究进展.中药材, 2003;26 (2) :135—137

[4]Rajagopal S, Kumar R A, Deevi D S, et al.Andrographolide, a poten-tial cancer therapeutic agent isolated from Andrographis paniculata.J Exp Ther Oncol, 2003;3 (3) :147—158

[5]Satyanarayana C, Deevi D S, Rajagopalan R, et al.DRF3188a novel semi-synthetic anolog of andrographolide:cellular response to MCF7breast cancer cells.BMC Cancer, 2004;18 (4) :26

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[7]梁艳, 卢彦, 沈萍萍.微囊藻毒素2LR对小鼠巨噬细胞吞噬功能及活性氧水平的影响.中国药理学与毒理学杂志, 2007, 21 (1) :55—58

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[9]Rajagopal S, Kumar R A, Deevi D S, et al.Andrographolide, a poten-tial cancer therapeutic agent isolated from andrographis paniculata.J Exp Ther Oncol, 2003;3 (3) :147—158

小鼠肿瘤 第5篇

1 资料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株:

KATOⅢ细胞株 (ATCC) 来源于中国科学院上海细胞库;IMDM培养基, 胎牛血清:Gibco公司;1ml注射器, 游标卡尺, 眼科剪, 套管针。

1.1.2 动物:

CB17 SCID小鼠, 雌性, 鼠龄6~8周, 体质量19~20g;购于北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK (京) 2002-0001], 饲养于上海中医药大学动物实验中心。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:

KATOⅢ细胞体外悬浮培养, 培养条件为IM-DM培养基中加20%热灭活胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素, 于37℃含5%CO2培养箱中培养, 每周2次传代处理。当细胞呈指数生长期时, 收取细胞, 计数, 接种。

1.2.2 肿瘤接种

1.2.2. 1 KATOⅢ细胞悬液接种:

取对数生长期细胞, 离心去上清液, 之后用无血清IMDM培养液离心洗涤2次, 细胞计数, 调整细胞浓度, 将细胞悬浮于PBS和基质胶 (Matrigel) 混悬溶液 (PBS:Matrigel=50%:50%) 中, 细胞浓度为1.0×107个细胞。然后用1ml的注射器抽取细胞悬液0.2ml, 接种于CB17SCID小鼠背部右侧皮下。接种数量为6只。

1.2.2. 2 KATOⅢ肿瘤组织块接种:

经细胞接种而成功的移植瘤, 进行CB17 SCID小鼠肿瘤异体移植。按每只小鼠注射0.2ml的剂量, 将2.5%戊巴比妥溶液注入CB17 SCID小鼠腹腔, 在严格无菌的条件下于超净T作台E切取适当大小的肿瘤组织, 修剪肿瘤组织, 去除脂肪和坏死肿瘤组织。将其剪成约30mm3大小的瘤组织块, 待接种时用。接种前, 用75%乙醇消毒接种部位的皮肤, 先用眼科剪将要接种的CB17 SCID小鼠背部皮肤剪开约2~3mm, 然后用眼科镊钳取一小瘤块放置于套管针上, 接着沿已经剪开的皮肤处进入皮下, 用已准备好的眼科专用缝线缝合皮肤。接种数量为6只。

1.2.3 肿瘤的观察和测量:CB17 SCID小鼠接种完毕后, 置恒温 (20~26℃) 、恒湿 (40%~70%) 、SPF级动物房以IVC (独立送风系统) 笼具饲养, 定期观察小鼠精神, 饮食和排便, 用游标卡尺测量肿瘤结节的直径, 肿瘤体积的计算公式为:V=0.5 a×b2, a和b分别表示肿瘤的长径和短径。

1.2.4 病理组织学检查:

处死CB17 SCID小鼠。详细观察移植瘤的大体形态, 并取肿瘤组织固定于4%的多聚甲醛溶液中, 石蜡包埋, 组织切片, 常规HE染色, 作病理学检查。

2 结果

2.1 荷瘤小鼠体质量的变化通过肿瘤组织块接种至CB17SCID小鼠皮下后, 随着肿瘤的生长, 没有引起荷瘤小鼠体质量的明显降低。此外, 实验过程中所有小鼠未表现出异常的临床症状。荷瘤小鼠的平均体质量变化见图1所示。

2.2 肿瘤的生长曲线采用细胞悬液直接接种至CB17 SCID小鼠皮下, 接种后第8天开始对每只荷瘤小鼠的肿瘤体积进行测量, 至第50天时, 所有荷瘤小鼠的平均肿瘤体积为2 0 4. 1 5 mm3, 肿瘤生长曲线见图2。此时对所有小鼠通过2. 5%戊巴比妥溶液腹腔注射进行麻醉后, 剥离肿瘤, 将肿瘤组织块再次接种至待用的CB17 SCID小鼠皮下, 从接种后第8天开始对每只荷瘤小鼠的肿瘤体积进行测量, 至第50天时, 所有荷瘤小鼠的平均肿瘤体积为834.70mm3, 肿瘤生长曲线见图3。

2.3 病理组织学检查通过肿瘤组织块接种CB17 SCID小鼠背部皮下后可见到明显的肿瘤组织块, 在接种第50天时, 对所有小鼠进行安乐死, 手术分离肿瘤组织, 肉眼可见部分肿瘤组织中心有坏死。光镜下肿瘤组织表现为:HE染色切片中均可见肿瘤细胞排列紊乱, 周边细胞呈栅栏状排列, 肿瘤团块与周围基质间常有间隙;细胞核多呈圆形或多角形, 核大, 染色质丰富, 深染, 多见分裂相, 间质结缔组织增生, 并伴有坏死灶。病理组织学检查结果表现出明显肿瘤细胞的特征。见图4。

3 讨论

CB17 SCID小鼠作为一种T细胞和B细胞联合免疫缺陷小鼠, 目前广泛应用于肿瘤学、免疫学、毒理学等各个领域的研究工作中。本研究构建的胃癌模型是将人源性KATOⅢ细胞接种到CB17 SCID小鼠皮下, 形成皮下移植瘤。之后将皮下移植瘤再接种至待用的CB17 SCID小鼠皮下, 从而建立KATOⅢ皮下肿瘤模型。虽然肿瘤细胞悬液接种构建的胃癌模型其成瘤率为100%, 且CB17 SCID小鼠自身状况良好, 然而形成的肿瘤生长却非常缓慢, 而通过移植瘤的皮下再接种, 其成瘤率也为100%, 并且小鼠的肿瘤生长情况良好, 生长速度要明显优于前者。胃癌是目前世界范围内与肿瘤相关的主要致死原因之一[6], 本次实验是通过建立KATOⅢ皮下胃癌模型, 为将来抗肿瘤药物的研究提供更为良好的实验工具, 并为相关动物肿瘤模型的研究提供参考和依据。

摘要：目的 建立CB17 SCID小鼠KATOⅢ胃癌皮下肿瘤模型, 为胃癌的临床前研究提供更有效的动物模型。方法 将KATOⅢ细胞接种至雌性CB17 SCID小鼠皮下, 待肿瘤长至约200mm3时, 取出肿瘤切成约30mm3小块后再次接种到雌性CB17 SCID小鼠皮下, 观察肿瘤的生长情况, 并研究肿瘤的组织病理学特征。结果 该肿瘤模型成瘤率为100%, 肿瘤生长情况良好, 组织病理学检查完全符合胃癌细胞的形态学特征。结论 通过肿瘤组织块异体移植的方法建立KATOⅢ胃癌皮下肿瘤模型可以缩短肿瘤的生长时间, 为临床前胃癌的研究提供可靠的动物模型。

关键词：KATOⅢ细胞株,胃癌,动物模型,肿瘤生长曲线,病理学特征

参考文献

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小鼠肿瘤 第6篇

红景天为景天科景天属(Rhodiola L)多年生草本或亚灌木植物,主要分布在北半球的喜马拉雅山区、亚洲西北部和北美洲,能在恶劣而多变的自然环境中生长,具有极强的环境适应能力和生命力。我国应用红景天很早,在藏医《四部医典》和《本草纲目》均有记载。目前从红景天植物中先后分离出40多种化学物质,其主要化学成分为红景天苷(salidroside)、苷元酪醇(tyroso1)及超氧化物歧化酶(SOD)等生物活性物质,此外还含有甾醇、酚性化合物、黄酮、水溶性挥发油等[1,2]。药用植物红景天苷具有抗缺氧、抗自由基、调节神经内分泌免疫网络的作用[3,4,5,6],临床运用已取得满意效果。但对其通过提高免疫功能及抗肿瘤活性的研究尚待研究。本实验通过荷瘤小鼠模型观察红景天苷的抗肿瘤活性,探讨其提高免疫功能的作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF级BALB/c小鼠由第四军医大学实验动物中心提供,人胃腺癌BGC—823细胞(美国ATCC);RPMI—1640培养液(美国Gibco公司);胰蛋白酶、青链霉素、HEPES(上海生工生物公司);胎牛血清(杭州四季青公司);红景天苷(中国药品生物制品检定所);环磷酰胺(江苏恒瑞制药公司);刀豆素A(美国Sigma公司);CO2恒温培养箱(日本Yamato公司);超净工作台(苏州净化有限公司)。

1.2 人胃腺癌BGC—823荷瘤小鼠模型建立

细胞株BGC—823,培养于RPM1640培养液中,于37℃5%CO2饱和湿度培养箱内培养,细胞处于对数生长期时,用0.25%的胰蛋白酶+0.02%的EDTA消化传代,每34 d传代1次。小鼠适应环境5 d,将对数生长期的BGC—823细胞消化后制成2.5×10/m L细胞悬液,在BALB/c小鼠背部皮下各注射0.2 m L。瘤块长到直径长为(3-6)mm时将小鼠随机分为5组,每组12只。红景天苷高、中、低剂量组,给药剂量分别为0.96,0.48,0.24 g·kg;阳性对照组,给药剂量为0.052 g·kg,均按20 m L·g体重ig给药,每天1次,连续12 d,每周监测瘤体积,停药次日,剥取皮下实体瘤瘤块,分别称重,计算出瘤重及抑瘤率。

1.3 脾脏系数和淋巴细胞转化率测定

在无菌条件下取出脾脏,称重,脾脏系数=脾脏重量(mg)/小鼠体质量(g)。将脾脏研成细胞悬液,过200目不锈钢筛,计细胞数,调整细胞浓度为1×107/m L的脾细胞悬液。取脾细胞悬液50μL(5×105个细胞)加入96孔平板中,加刀豆素A(Conconvalina,Con A)2μg/孔,平行样3份培养72 h。用MTT法测定小鼠脾淋巴细胞转化实验,即用加ConA孔的光密度值减去不加ConA的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力。

1.4 IL—2活性测定

制备各组小鼠脾细胞悬液5×109/L,加到24孔板中,再加ConA(终浓度为5 mg/L),培养48 h后,离心后吸取上清,即获得IL—2粗制剂,-20℃冻存。测定时无菌摘取小鼠胸腺,制备5×109/L的细胞悬液,加到96孔板中,使ConA终浓度为3 mg/L,然后加入IL—2上清,培养72 h,结束前6 h加入1.85×104Bq/孔3H-TdR。收集细胞,液闪仪计数每分钟脉冲数。

1.5 统计学方法

计量数据用x±s表示,应用SPSS10.0统计分析软件,多组间比较统计方法采用方差分析(ANO-VA)和t检验,P≤0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 红景天苷对荷瘤小鼠质量的影响

由图1可知,实验前各组小鼠体质量的差异无统计学意义(P>0.05);与无菌生理盐水阴性空白对照组比较,红景天苷用药组实验后小鼠体质量显著增加,而CTX阳性组实验后小鼠体质量显著减少(P<0.05);与CTX阳性组比较,红景天苷用药组实验后小鼠体质量显著增加(P<0.05)。表明红景天苷能提高小鼠的体质量,不同剂量用药组亦有差异,以大剂量组效果最为明显。

2.2 红景天苷对肿瘤生长的抑制作用和脾脏系数的影响

红景天苷各剂量组和CTX阳性组肿瘤重量均低于阴性组,其中CTX阳性组瘤重最低(P<0.01),而红景天苷大、中剂量组之间差异无统计学意义(P>0.05),表明各浓度红景天苷对小鼠肿瘤细胞具有明显抑制作用(P<0.05),其抑瘤作用与红景天苷浓度成正相关(P<0.05)。与空白对照组和CTX阳性组比较,红景天苷大、中剂量组脾系数明显升高;与红景天苷大剂量组比较,小剂量用药组脾系数较低(表1)。

(±s)

*P<0.05,**P<0.01 vs空白对照组;#P<0.05 vs空白对照组和CTX组;△P<0.05 vs大剂量组,n=9。

2.3 体液免疫功能实验

与空白对照组和CTX组比较,红景天苷各剂量给药组的脾系数均显著升高(P<0.05),各剂量给药组的脾淋巴细胞转化率和脾细胞IL—2分泌均显著提高(P<0.05),其中以大剂量红景天苷给药组对脾细胞IL—2分泌作用最为明显(P<0.01)。表明各剂量组能从提高胸腺系数,增加脾淋巴细胞转化率,加大IL—2活性等方面提高体液免疫功能,而环磷酰胺阳性对照组的体液免疫功能则显著下降(表2)。

(±s)

*P<0.05,#P<0.05,△P<0.05,△△P<0.01 vs空白对照组和CTX组,n=9

3 讨论

恶性肿瘤是一种严重威胁人类生命和健康的常见病、多发病。目前,肿瘤的治疗取得了较大进展,外科手术、放射治疗,特别是化疗药物使肿瘤的治愈率有所提高。但是,化疗药物严重的毒副作用大大限制了它的广泛应用和疗效的发挥。生物反应调节剂等药物的研究与开发正在成为目前有前景的新领域,它可单独或与化疗药物同时应用,可提高化疗药物的疗效,降低化药的不良反应,可使肿瘤患者的治疗水平提高,有助于病人生存质量的改善[7,8]。筛选新的抗癌天然药物,首先要经过移植瘤的验证。移植瘤最大的优点是接种成活率高,生长速率比较一致,对宿主生存时间、机体反应等的影响也类似,根据对瘤体的监测易于客观评价效果。人癌细胞株小鼠移植是目前抗肿瘤实验应用较广的肿瘤模型,该模型技术成熟,较好地反映药物对肿瘤的抑制能力,同时也可以使实验结果与其他同类实验结果相比更具有可比性[9,10]。

本研究人胃腺癌细胞移植小鼠模型显示,红景天苷和传统化疗药物CTX均能减轻肿瘤重量。不同浓度的红景天苷对肿瘤的抑制作用,以大、中剂量组抑癌作用较好,在不同程度上抑制肿瘤的形成、发生和发展,达到控制和治疗肿瘤的目的。本研究结果显示,红景天苷能提高小鼠的体质量,不同浓度红景天苷给药组提高体质量作用亦有差异,以大剂量组效果最佳。但CTX阳性组小鼠体质量下降明显,其毒性随抑瘤效果增大而相应增加,使整体生理机能降低。本研究结果表明,红景天苷灌胃小鼠后能明显促进ConA对小鼠脾细胞的增殖反应,增强脾细胞对IL—2的反应性,增加小鼠脾细胞对T细胞分泌的淋巴因子IL—2的分泌,从而表现出红景天苷具有明显调解和增强机体免疫力的功能。脾脏系数、脾淋巴细胞转化率、IL—2为一个整体,由脏器到细胞,最后到分子水平IL—2,提示红景天苷通过提高体液免疫功能而发挥抑瘤作用。红景天苷增加小鼠体质量,减少肿瘤重量,和提高体液免疫功能的结果一致显示,红景天苷较传统化疗药物CTX能更好地改善整体机能状态。有关临床研究数据表明,口服红景天对鼻咽癌同步放化疗期内生存质量能明显有效提高[11]。

癌症是一类细胞周期性疾病,其发生和发展与细胞周期正负调控因子失衡所致的细胞周期运转速率加快和凋亡减少密切相关[12]。抗癌药物抑制肿瘤的生长是非常复杂和精细的过程。本研究为红景天苷在抗肿瘤活性方面的研究和新药开发方面提供依据,但关于红景天苷的抑瘤机制还有待进一步的深入研究。红景天应用范围广泛,疗效显著,不良反应少,价格便宜,需求量大。随着研究的不断深入,红景天的应用对医药学将有潜在的重大意义。

摘要：研究红景天苷抗肿瘤活性及其提高免疫功能的机制。用胃腺癌BGC-823在BALB/c小鼠建立皮下肿瘤模型。分别用大、中、小剂量红景天苷灌胃,以环磷酰胺(CTX)为阳性对照组,连续给药12 d后处死小鼠,称小鼠体质量、瘤重,计算脾脏系数,同时测定脾淋巴细胞转化率和IL—2活性。各剂量红景天苷给药组均能显著提高小鼠的体质量,且能明显抑制荷瘤小鼠肿瘤生长,以大、中剂量组比较明显,而环磷酰胺组体质量明显下降(P<0.05)。各红景天苷给药组均能提高脾脏系数和脾脏细胞功能,增加脾淋巴细胞转化率和IL—2活性,以大剂量给药组作用最明显,而环磷酰胺阳性对照组的体液免疫功能则显著下降。红景天苷能明显抑制BGC—823肿瘤的生长,同时能增加小鼠体质量,提高治疗肿瘤的药物耐受性,改善体液免疫功能而发挥抗癌作用,高效低毒,可与化疗药物合用提高其疗效。

关键词：红景天苷,肿瘤,免疫,脾脏系数,淋巴细胞

参考文献

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[9]石磊,陈平,赵伟,等.豆蔻提取物对人胃癌裸鼠移植瘤生长及血管生成的影响.肿瘤学杂志,2010;16(10):776—778

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[11]郑荣辉,李健,黄赖机,等.红景天对鼻咽癌同步放化疗期内患者生存质量的影响.现代医院,2010;10(10):26—28

小鼠肿瘤 第7篇

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

6周龄的DBA/2雌鼠购自北京维通利华公司, 实验开始前在观察室喂养一周以观察其状态, 饲养室由山西医科大学动物培养中心提供;KLN-205鳞癌细胞由上海肿瘤细胞库提供;OK-432注射用粉剂由中外制药株式会社 (日本) 提供, 其计量为5KE (Klinische Einheit) , 1KE等量0.1mg的冻干链球菌, 使用时需要PBS溶解。RPMI-1640培养基购自Gibco公司;青链霉素购自Solarbio公司;胰蛋白酶 (含EDTA) , 无菌PBS, D-Hanks缓冲液, 红细胞裂解液以及ELISA试剂盒均为BOTER公司出品;无支原体胎牛血清为浙江天杭生物科技有限公司出品。

1.2 模型建立及动物处理方法

(1) 肿瘤细胞培养:KLN-205肿瘤细胞在37℃, 5%CO2恒温箱传代培养, 每次使用的培养液按照45mL的RPMI-1640培养液加入5mL胎牛血清, 0.5mL的双抗的比例配制。选取培养4代以上活力旺盛的肿瘤细胞作为靶细胞。 (2) 脾脏淋巴细胞培养:将48只DBA/2小鼠随机分为OK-432组, PBS对照组, OK-432肿瘤疫苗组, 每组16只。分别于小鼠右侧腹腔注射以下试剂, OK-432组注射0.7KE/100μl;PBS对照组注射PBS液100μL;OK-432肿瘤疫苗组注射OK-432疫苗5×105/100μL, 每周一次, 连续注射3周。分别在3次注射试剂结束后于第1天, 第3天, 第5天, 第7天取出脾脏。将取出的脾脏置于Hanks液中, 按所分组分别剔除筋膜组织以及周围脂肪组织, 用眼科手术剪剪碎, 用玻璃研磨器进行研磨, 用Hanks液冲洗后用200目滤网过滤。将滤液收集至15mL离心管中, 2000r/min离心3min弃上清。加入红细胞裂解液, 混匀脾细胞, 静置3～4min, 待红细胞完全破碎后, 2000r/m离心3min, 弃上清去除红细胞, Hanks液冲洗, 1500r/m离心3min, 弃上清, 用RPMI-1640培养液重悬细胞, 计数板计数, 调节细胞浓度为5×106/mL, 台盼兰染色检测脾细胞存活率>95%;接种至培养板中, 标记好分组, CO2恒温培养箱中培育72h。用计数板计数培育72h的脾脏细胞, 调整其浓度为2×106/2mL。加入培养四代以上的KLN-205肿瘤细胞作为靶细胞。效靶比例为50︰1、100︰1。在CO2恒温箱中共同培育24h。将培育好的细胞混合液收集至离心管中, 1500r/m, 3min离心, 取上清液。

1.3 细胞因子测定

采用夹心ELISA法测定IFN-γ, IL-2, TNF-α在培养液中的含量。每次测定值为三个复孔的平均值。运用ELISACalc软件进行Hill曲线拟合, 生成曲线方程, 根据所得OD值得出培养液中各因子的含量。

1.4 统计分析

应用SPSS16.0软件采用重复测量方差分析对所得数据进行统计学分析。

2 结果

在肿瘤细胞的刺激下, 体外培养72h后的脾淋巴细胞OK-432组及OK-432疫苗组均可以诱导产生细胞因子IFN-γ, IL-2, T N F-α。如图1所示, 在疫苗组中I F N-γ与T N F-α的含量要高于IL-2在培养液中的浓度, 其中TNF-α的浓度最高。图2显示, IFN-γ在三组中总体呈上升趋势, 且在不同的实验组中含量明显不同。在不同时期脾淋巴细胞培养液中, 细胞因子IL-2以及INF-γ的浓度也是有所变化的, 第一天的细胞因子含量要略低于其后几天的细胞因子含量, 在第7天时达到最大值。另外TNF-α的变化较为有特点, 在第1天后显著提升, 在第3～5天阶段较为平稳, 在第7天时出现回落。同时, 如图3所示, 当我们将靶细胞浓度提升1倍时, 效应细胞的免疫作用也相应的提高, 经检测后发现细胞因子的浓度也相应提升1倍左右。

3 讨论

OK-432作为一种细菌类非特异性免疫赋活剂, 已经广泛的应用于肿瘤的研究与治疗, 除了诱导活化CD3+, CD4+等免疫细胞表面HLA-DR, LFA-1和ICAM-1的表达, 促进CD4+, T细胞分泌IFN-γ, TNF-α, IL-6等细胞因子以外, 经OK-432诱导培养后的树突状细胞[11] (OK-DC) 还可以表现出特异性的抗肿瘤细胞毒性[12]。本试验表明, OK-432组以及OK-432肿瘤疫苗组中小鼠的脾脏淋巴细胞在经KLN-205肿瘤细胞刺激后, 可以产生IL-2、TNF-α、INF-γ。在相同的培养条件下, 以及一定的生长环境中, 在不同浓度的靶细胞刺激下, 各个细胞因子呈现出一定的增高趋势。其中, IL-2在所提取的培养液中的浓度比较低, 出现这一现象可能是由于OK-432刺激了机体中IL-2受体的表达, 所以导致了在培养液中IL-2的消耗增加[13]。INF-γ以及TNF-α在培养液中浓度较大, Th1细胞受到靶细胞刺激后, 使得其INF-γ分泌增加, 同时巨噬细胞也大量的分泌TNF-α, 使得其浓度随着靶细胞的增量而成正相关。我们还发现, 在注射后第一天收集的淋巴细胞经72h培养后对靶细胞的刺激敏感性不是最强, 而在第三天到第五天收集的脾脏淋巴细胞的应答反应呈上升趋势, 同时TNF-α在第7天时出现下滑趋势, 出现这种结果可能是在早期条件培养液中的脾脏淋巴细胞受到刺激后, 增强了其细胞免疫功能, 因子浓度有升高的趋势, 随着时间的推移, 淋巴细胞负荷的增加, 脾淋巴细胞中的抑制性因素增大, 使得条件培养液中的细胞因子消耗阶段性增大所导致的TNF-α浓度表现为阶段性下滑的趋势。