金属酶检测范文

金属酶检测范文（精选10篇）

金属酶检测 第1篇

关键词：耐亚胺培南铜绿假单胞菌,金属酶检测

随着我国医疗事业的快速发展, 临床对医学理论研究工作给予了足够的重视, 一些新药物及成分得到了普及推广, 在临床治疗中发挥了良好的治疗效果。β-内酰胺酶是医药学研究的重点内容, 其涉及到多个方面的要素构成, 而金属β-内酰胺酶 (metallo-β-lactamase, MBL) 是β-内酰胺酶的主要构成。一般情况下, 产酶细菌是一种较好的耐用药物, 其对青霉素类、头胞菌素类、碳青酶烯类等具有良好的用药效果, 但是除了单环β-内酰胺类 (氨曲南等) 之外, 这是临床使用需要注意的内容[1,2]。按照药物学理论研究成果, 铜绿假单胞菌 (pseudomonas aeruginosa, PA) 能够得到MBL基因, 但要借助质粒、整合子、转座子等作用。本次分析了耐亚胺培南铜绿假单胞菌临床分离株金属酶检测的结果, 具体如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源:

来自我院2003年1月至2013年12月临床送检标本 (包括痰、尿、伤口分泌物、血液) 中分离的PA亚胺培南耐药株159株。质控菌株:大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853。

1.2 抗生素纸片及培养基:

抗菌药物纸片亚胺培南 (IMP) 、美洛培南 (MEM) 、头胞他啶 (CAZ) 、MH琼脂均购自英国Oxoid公司。化学试剂EDTA-Na2由美国Sigma公司提供。

1.3 检测:

(1) 菌株鉴定:使用常规方法或VITEK系统GNI卡 (法国BioMerieux公司提供) 进行鉴定。 (2) 复合纸片法检测金属β-内酰胺酶:根据文献[3]用棉拭子将0.5麦氏单位菌悬液涂于2块90 mm MH平板上, 在一块平板上贴上IMP、MEM各2片, 纸片相互距30~40 mm, 并分别在一片IMP、MEM纸片上各加上10μL 0.5 mol/L (p H=8.0) EDTA;于另一块MH平板上贴上两片CAZ和一片空白滤纸片, 在一片CAZ和空白纸片上各加10μL EDTA, 二块平板35℃孵育24 h, 观察结果。

注:R耐药, S敏感

2 结果

2.1 CAZ-EDTA复合纸片法以抑菌圈增大≥4.0 mm为阳性, IMP-EDTA、MEM-EDTA的抑菌圈直径增大≥7.0 mm为阳性[3]。

对照菌株ATCC27853复合纸片法结果为阴性。见图1、图2。

2.2

159株铜绿假单胞菌亚胺培南耐药株金属酶检测有7种表型, 见表1。

3 讨论

经过较长时间的研究, 最终发现铜绿假单胞菌是金属β-内酰胺酶形成的主要来源, 其通过多方面的药物学运动产生MBL, 并且在特定条件下可以适当地调整。一般情况, PA对碳青酶烯类抗生素具有的耐药性, 多数来源于金属β-内酰胺酶, 这是实验室研究公认的成果。从结构形式划分, 金属β-内酰胺酶处在B类的范畴, 这种要素对MBL的机制特点产生了明显的影响。但是, 如果从Bush功能展开规划, 则又可属于Ⅲ类β-内酰胺酶, 这是利用半胱氨酸、组氨酸、天冬氨酸等, 采用离子间相互结合的形式, 最终生成了相应的产物。此次分析发现, 在本研究中, EDTA具有很强的金属离子特性, 对锌离子结合之后能减小相应的灵活性, 从而提升了药物病理学机制的发挥。由此可以看出, 金属β-内酰胺酶是经过多种要素变化的产物, 临床借助微生物实验室检测产MBL铜绿假单胞菌是十分有效的方法。

根据此次实验室结果发现, Opr D2通道丢失能够反映出Pa亚胺培南耐药株的耐药性能, IMP等碳青酶烯类抗菌药物 (MEM除外) 进入PA的主要特殊通道是D2, 这就说明了D2缺少的耐药表型为CAZ敏感/IMP耐药/MEM敏感/复合纸片检测阴性。除了这些之外, 外排泵出在PA耐碳青酶烯类抗菌药物中也有明显的药学作用[4]。为了进一步提升临床用药的准确性, 应根据患者实际治疗需求提出药物方案, 同时扩大各种药物之间的灵活性, 避免相应产物对病况治疗造成不当。因此, 金属β-内酰胺酶作为一种分离产物, 需要进行多方面的对比实验, 才能获得与其相对应的药性。

PA可产生多种金属酶和其他碳青酶烯酶[5], 已报道的主要有IMP、VIM两种类型, 最近在巴西发现一种不同于IMP和VIM的新的获得性金属β-内酰胺酶Spm-1[6]。表1的结果显示, 本组PA亚胺培南耐药株产4种金属酶, 其表型为IMP耐药/复合纸片试验阳性, 可能由于所产的MBL的类型不同, 其表型亦存在差异。另外有7株PA产其他β碳青酶烯酶, 其表型为CAZ敏感/IMP耐药/MEM耐药/复合纸片试验阴性。

表1可证明PA耐碳青酶烯类抗菌药物的主要机制并非是产生MBL, 然而绝大多数的金属酶是经由质粒介导的, 容易经由不同的菌株间来达到转导传播, 可对几乎所有β-内酰胺类抗菌药物具有高度的耐药性, 其中包括碳青酶烯类, 而对于此类细菌所导致的重度感染, 治疗方案尚没有理想选择。如果再联合其他耐药机制, 将会让抗生素的选择更加艰难。如果爆发此类铜绿假单胞菌导致的医院感染, 将会是非常难以处理的问题, 因此应对该问题投以高度的关注。

参考文献

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[3]顾剑, 彭少华, 李从荣.获得性金属β-内酰胺酶初筛方法的研究[J].中华医院感染学杂志, 2004, 14 (6) :603-606.

[6]张写, 张雅萍, 肖光霞.铜绿假单胞菌耐药机制的研究进展[J].国外医学微生物分册, 2001, 24 (4) :31-33.

[7]熊薇, 孙自镰, 申正义.铜绿假单胞菌的耐药性及其耐喹诺酮机制的研究[J].中华医院感染学杂志, 2003, 13 (2) :969-971.

金属酶检测 第2篇

重金属和多环芳烃复合污染对土壤酶活性的影响及定量表征

以土壤脲酶和脱氢酶为探针物质,室内培养条件下较为系统地研究了重金属(Cd、Zn、Pb)和多环芳烃(菲、荧蒽、苯并a芘)复合污染对土壤酶活性的影响及其定量表征.结果表明,复合投加上述污染物能使土壤酶活性受到不同程度的抑制,其中,脱氢酶最为敏感,其活性是表征重金属和多环芳烃复合污染的一项重要的参考指标.对复合污染模型的建立与分析表明,土壤环境中,重金属和多环芳烃复合污染的类型和强度与污染物的浓度和复合污染时间密切相关.影响土壤脲酶活性的主要因子依次为:Cd > Zn与苯并a芘的交互作用 > Zn > Pb > Zn和菲的交互作用.影响土壤脱氢酶活性的`主要因子依次为:Cd和Zn的交互作用 > Cd > Zn > 苯并a芘 > Cd和菲的交互作用.其中,Zn和苯并a芘相互作用对脲酶活性以及Cd 和Zn交互作用对脱氢酶活性的影响均表现为拮抗作用.Zn和菲,Cd和菲之间的交互作用,无论是对脲酶还是脱氢酶均表现为协同作用. 图1 表3 参18

作 者：沈国清 陆贻通 洪静波 SHEN Guoqing LU Yitong HONG Jingbo 作者单位：上海交通大学资源环境科学系,上海,01刊 名：应用与环境生物学报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF APPLIED & ENVIRONMENTAL BIOLOGY年，卷(期)：11(4)分类号：X171.5 S154.2关键词：复合污染 交互作用 土壤酶 重金属 多环芳烃 定量表征

金属酶检测 第3篇

摘 要：本文研究了金属离子对α-环糊精葡萄糖基转移酶发酵生产的影响。首先，采用单因素分析确定几种微量元素的最佳产酶浓度；其次，通过两水平析因试验确定了关键的影响因子及其最大响应区域，其分别是MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，MnSO4·H2O；最后，通过 Box-Benhnken中心组合试验建立数学模型，并采用响应面分析法获得了微量元素的最优配比参数为：MgSO4·7H2O 10.94 mmol·L-1，FeSO4·7H2O 6.48 mmol·L-1，MnSO4·H2O 0.51 mmol·L-1， CaCl2·5H2O 3 mmol·L-1。与对照组相比，酶活提高了1.4倍。

关键词：大肠杆菌；α-环糊精葡萄糖基转移酶；金属离子；响应面设计

中图分类号：Q93-335 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.12.003

α-环糊精葡萄糖基转移酶（α-Cyclodextrin Glycosyltransferase，简称α-CGT酶，EC 2.4.1.19）是糖基水解酶α-淀粉酶家族（家族13）中的重要成员，是微生物所产的胞外酶，能够催化4种反应——歧化反应、环化反应、偶合反应和水解反应[1-3]。

天然的CGT酶大部分来自嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱脂肪芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和软化芽孢杆菌，而构建的基因工程菌为大肠杆菌[4]。基因工程菌在生长和产酶过程中需要无机盐维持细胞的渗透压，并合成核酸等物质；一些微量元素如钙、铁、锌对酶活性中心或辅酶的生成以及酶激活剂的作用有着重要影响[5-8]。本研究采用单因素实验、两水平析因实验、中心组合设计实验和响应面分析法探讨了金属离子对α-环糊精葡萄糖基转移酶发酵生产的影响，并得到优化的配比，为α-环糊精葡萄糖基转移酶的生产具有一定的指导意义。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌种 重组大肠杆菌 E.coli BL21（DE3），由安琪酵母股份有限公司提供。

1.1.2 试剂 酵母浸出物 （FM818，简称YE）由安琪酵母股份有限公司生产；酵母蛋白胨由安琪酵母股份有限公司生产；其他试剂均为分析纯AR。

1.1.3 培养基 斜面培养基（g·L-1）：甘油 10.0，牛骨蛋白胨 9.0，酵母浸出物（FM818） 10.0， K2HPO4 16.4，KH2PO4 2.3，MgSO4·7H2O 0.5，琼脂粉16。

液体培养基（g·L-1）：甘油 10.0，牛骨蛋白胨 9.0，酵母浸出物（FM818） 10.0，K2HPO4 16.4，KH2PO4 2.3，MgSO4·7H2O 0.5。

1.2 方 法

1.2.1 种子培养 将斜面菌样接入装有50 mL液体培养基的250 mL三角瓶中，制备2瓶，在37 ℃和200 r·min-1 摇床上培养8 h。

1.2.2 发酵培养 将5 mL种子瓶菌样接入装有100 mL液体培养基的500 mL三角瓶中，制备6瓶，在30 ℃和180 r·min-1摇床上培养40 h。

1.2.3 菌体生物量的测定 采用分光光度计测定发酵液在600 nm波长处的吸光度OD600。

1.2.4 周质空间中α-CGT酶的制备 取一定量菌体的发酵液于4 ℃、6 000 r·min-1下离心10 min，倒去上清液。用蒸馏水洗涤细胞沉淀2遍，离心（同上）后取2 g左右菌体细胞，按照比例1： 10（m/v）加入对应体积的Tris-EDTA缓冲液混合均匀。细胞悬液使用超声波细胞破碎仪进行破碎后，于4 ℃、4 000 r·min-1下离心5 min，所得上清液为周质空间中α-CGTase酶活测定液。

1.2.5 α-CGT酶环化活力的测定 甲基橙法测定环化活性：取离心后并适当稀释的发酵上清液100 μL，加入装有900 μL预先用50 mmol·L-1的磷酸缓冲液（pH值6.0）配制的1%（W/V）麦芽糊精溶液的试管中，在40 ℃下反应10 min后，加入1.0 mL浓度为1.0 mol·L-1的盐酸终止反应，再加入1.0 mL的用50 mmol·L-1的磷酸缓冲液配制的0.1 mmol·L-1甲基橙溶液，20 ℃下保温15 min，在508 nm处测定吸光度。对应α-环糊精标准曲线计算出环糊精浓度，一个酶活单位（U）定义为在上述条件下每分钟生成1 μmol的α-环糊精所需的酶量[9-10]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

从10种微量元素中初步筛选出Mg2+、Fe2+、Mn2+、Ca2+这4种显著因素，分别以不同浓度加入发酵培养基中，以空白为对照，测定酶活，结果如表1所示。

从表1可以看出，4种金属离子在较低浓度情况下都对酶活有一定的提高作用，同时，在所设计的离子浓度梯度中，均发现了峰值。为了得出这4种金属离子的最佳配比浓度，需要做进一步的试验。

2.2 两水平析因实验及结果

在单因素试验基础上，利用Design Expert Software（Stat-Ease Inc.， Minneapolis， MN， USA， Version 8.0）软件设计24-2 两水平部分析因试验（FFD），考察MgSO4·7H2O（X1）、CaCl2·5H2O（X2）、FeSO4·7H2O（X3）、MnSO4·H2O（X4）4个因素对基因重组大肠杆菌生长和产酶的影响以及各因素之间的交互作用，以确定影响产酶的显著因素。各因素规范值与实际值的设定水平及试验结果见表2。

3

金属酶检测 第4篇

SOD是生物体内清除自由基的主要参与者,随Cr6+胁迫浓度的增加,其活性大多表现为先升高后下降的两个反应阶段。活性升高的原因可能是铬刺激了植物体本身存在的SOD或诱导合成新的SOD,下降的原因可能是酶对其保护作用有一定限度,超过此限度酶活性就下降。水稻[5]、罗汉果[6]、旱伞草[7]等植物幼苗由于保护酶系统耐铬胁迫能力较差,Cr6+胁迫浓度增加导致SOD活性一直下降。POD与CAT的活性随胁迫浓度的增加逐渐升高,在Cr6+胁迫时发挥了更大作用。POD活性升高是由于植物体内铬达到一定浓度时,膜脂过氧化作用增强,植物体内过氧化物(如过氧化氢等)浓度增加,即POD的底物浓度增加,从而使POD活性上升。CAT在低浓度Cr6+胁迫下活性增加缓慢,高浓度胁迫下增加较快。可能是因为高Cr6+胁迫下膜脂过氧化加剧、细胞受伤害程度增加,过氧化氢酶活性迅速升高以分解体内产生的大量的过氧化氢根离子,以此保护植物细胞。

铬胁迫对保护酶活性的影响与植物品种、抗性有关,如水稻[8]、罗汉果[6]受铬胁迫抵抗能力较差,各种保护酶活性在低浓度铬毒害时就几乎全部下降。保护酶活性也随植物本身的发育程度、器官、组织、部位而不同,如万永吉[9]等对秋茄幼苗根系及叶片的研究表明:在有效防御Cr6+胁迫伤害方面,秋茄幼苗的根系比叶片具有更大的耐受性。

综上所述,人们对于铬毒害下植物保护酶系统的响应机制已经有了比较透彻的了解,植物在铬胁迫下的反应特性可以作为检测土壤和水体受重金属污染程度的重要指标,为环境监测提供有用的参考资料。同时,随着对铬胁迫下植物自身响应机制和保护机制研究的不断深入,未来将会培育和筛选出更高抗性的植物资源并且实施到生产当中。

摘要：铬是重金属中最具危害性的元素之一,铬污染影响植物的生理生化特性。本文综述近年来重金属铬胁迫对植物酶系统影响的研究成果。

关键词：铬,酶系统,植物,研究进展

参考文献

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[3]Keunen E,Remans T,Bohler S,et al.Metal-induced oxidative stress and plant mitochondria[J].International journal of molecular sciences,2011,12(10):6894-918.

[4]Koussevitzky S,Suzuki N,Huntington S,et al.Ascorbate peroxidase 1plays a key role in the response of Arabidopsis thaliana to stress combination[J].Journal of Biological Chemistry,2008.

[5]徐芬芬.铬胁迫对水稻幼苗生长和生理特性的影响[J].杂交水稻,2012,27(3):76-8.

[6]张永霞,石贵玉,李霞,等.铬胁迫对罗汉果幼苗生理生化指标的影响[J].中国农学通报,2011,27(2):12-6.

[7]陈金发.铬胁迫对旱伞草生理生化特性的影响[J].湿地科学,2014,12(3):356-61.

[8]徐芬芬.铬胁迫对水稻幼苗生长和生理特性的影响[J].杂交水稻,2012,27(3):76-8.

检测水中有机磷农药的酶传感器 第5篇

检测水中有机磷农药的酶传感器

摘要：采用丝网印刷技术制作厚膜型电极,通过交联法将乙酰胆碱酯酶固定在电极上,开发快速检测水中有机磷农药的酶传感器.采用循环伏安法对电极所做的检测结果表明电极彼此间的差异在10%以内,具有较好的一致性.通过在交联剂、酶和底物等方面优化传感器的工作参数,确定了戊二醛、酶和底物的浓度分别为0.2%、0.5 mg/mL和10 mmol/L时,传感器响应最好.在交联固定酶的情况下,根据酶活受到有机磷抑制的原理,采用时间-电流法对特丁硫磷和对硫磷进行了检测.结果表明:这2种有机磷的.检测限都可以达到1 ng/mL,线性区间1～10 000ng/mL.在物理吸附固定酶的情况下,采用循环伏安法对特丁硫磷进行了检测.结果表明:采用循环伏安法检测的灵敏度比采用时间-电流法的灵敏度要高.作 者：陈向强 何苗 蔡强 朱仕坤 施汉昌 CHEN Xiang-qiang HE Miao CAI Qiang ZHU Shi-kun SHI Han-chang 作者单位：清华大学环境科学与工程系环境模拟与污染控制国家重点联合实验室,北京,100084期 刊：环境科学 ISTICPKU Journal：CHINESE JOURNAL OF ENVIRONMENTAL SCIENCE年，卷(期)：,27(8)分类号：X859关键词：酶生物传感器 丝网印刷电极 乙酰胆碱酯酶 有机磷农药

脂肪酶活力检测方法分析 第6篇

检测使用的材料和设备

扩张青霉菌脂肪酶、橄榄油、三丁酸甘油酯、三油酸甘油酯、乙酸对硝基苯酚酯和辛酸对硝基苯酚酯、聚乙烯醇等。

具体采用的设备有恒温水浴摇床、高速捣碎机、超声发声仪器、滴定电极及光度计。

检测方法比较

抽提酶的具体方法

准备检测所需数量的酶粉经过甘氨酸缓冲液实施溶解, 使用玻璃棒实施研碎, 在低温环境下静止放置, 将上清液全部放到容量瓶中, 可以把一定量的缓冲液与沉淀部分混合, 如此反复实施冲洗, 直至在容量瓶中放置所有的上清液, 同时实行定容, 摇晃均匀准备接下来使用。

制备底物乳化液

▲聚乙烯醇溶液

称取40 g聚乙烯醇, 添加800m L, 0.04 mol/Lp H9.4的甘氨酸缓冲液, 70~80℃溶解, 保持1 h温度之后进行冷却处理, 视情况进行过滤, 定容到100 m L。

▲制备乳化液

第一次制作乳化液选择高速捣碎机。将4%PVA溶液100 m L和底物混合, 可以在冰箱中静置5~10℃保持1~2 h, 随后向捣碎机转移, 这样操作9 min 3次, 乳化液可以保存在冰箱中, 在之后的每一次使用时重新实施乳化。

第二可以选择乳化液初步选择超声波制作方式, 充分混合4%PVA溶液100 m L和底物。将冰箱设置为5~10℃静止放置1~2 h, 在底部溶液中放置超声发生器变幅杆, 通过间歇方式, 在规定的功率下严格实施超声乳化处理, 在对底物乳化温度控制时可以考虑使用水浴, 在冰箱中储存乳化液, 再一次应用时需要重新实施乳化。

检测脂肪酶活力的方法

▲抽提正己烷方法

在甘氨酸缓冲液中放置1 m L橄榄油, 添加规定数量的酶液在37℃的情况下反应10 min, 利用乙醇-丙酮终止反应, 混合10 m L水饱和正己烷抽取产生脂肪酸, 将上层2.5 m L干燥的酚酞放置在锥形瓶中并且和乙醇溶液定形产生脂肪酸。当发生上述反应时, 认真定位每分钟催化形成的脂肪酸的酶量单位。

▲酸碱直接滴定法

将4 m L甘氨酸缓冲液和底物乳化液分别放置在三角瓶中, 并且在37℃水浴中放置5 min, 随后将1 m L酶液准确倒入, 保持10 min的温度, 立即加入乙醇直到反应停止, 在滴定之前可以采取水进行稀释。通过0.05 mol/LNa OH滴定水解产生游离的脂肪酸, 利用PH电极指示滴定终点。

▲光谱检测法

将硝基苯乙酯与乙腈相溶, 仅制作了2.5 mol/m L对硝基苯乙酯溶液。称量了2.75 m L通过一定温度进行保温的p H 9.4胺氨酸缓冲液, 添加200μl于90℃加热灭活20 min的酶液。再加入底物, 检测底物自从分解形成对硝基苯乙酯变化曲线, 相同情况下添加适当稀释的酶液。

结果分析

底物影响脂肪酶活力稳定性的情况

检测脂肪酶活力可以采用三丁酸甘油酯、三油酸甘油酯、橄榄油、乙酸对硝基苯酚酯与辛酸对硝基苯酚酯作为底物。由于存在着不同的检测原理, 可以分别对比这些底物。

通过对比可知, 辛酸对硝基苯酚酯拥有很快的水解速度, 因此, 对脂肪酶活力检测时, 会产生一定的误差。而乙酸对硝基苯酚酯拥有较为缓慢的水解速度, 实验误差相对较小。上述两种物质并非天然脂肪酶的底物, 一般也并不适合应用到脂肪酶活力检测过程中, 此外把乙酸对硝基苯酚酯作为底物, 对比来讲可以获得较为科学的检测活力。该物质具体应用在脂肪酶筛选或较小酶量的脂肪酸检测。另外, 由于该物质成本较高, 国内很少有人应用。

当底物是三丁酸甘油酯和三油酸油脂时, 可以得到比较稳定的脂肪酶活力检测结果;当橄榄油作为底物时, 检测结果误差依然比较大。可是因为这两种物质全部属于进口的脂肪酶底物, 成本相对较高。相对来讲, 国产橄榄油成本低廉, 可以将其作为反应底物。

乳化方法影响脂肪酶活力稳定性的情况

为了充分表现出脂肪酶的功能, 反应界面必须实现最大化, 一般利用搅拌与震荡通常会产生短期的不稳定乳化形态, 油珠无法获得所需的表面积, 与此同时也会出现很差的重复性。经过对乳化剂的持续加入, 同时搭配不断地搅拌与震荡和超声处理等, 能有效分散油的微粒形态, 形成的乳化剂也会拥有很好的稳定性。这样做的目的就是避免实验形成误差, 提升了检查脂肪酸活力的稳定程度。在检测脂肪酶活力的过程中, 采取橄榄油作为底物时, 结果一般缺乏稳定性, 具体原因便是乳化方法缺少科学性。

通过研究表明, 采取了乳化处理的稳定性显著比不采取乳化处理的要高, 乳化经过超声处理之后效果显著优于通过搅碎机搅拌的效果。此外, 乳化处理底物之后脂肪酶活力很显然好于乳化处理前。

检测方法影响脂肪酶活力稳定性

检测过程中将底物设置为橄榄油, 一般可以选择酸碱滴定作为检测方法, 也可以选择脂肪酸与铜离子产生的铜皂检测脂肪酶活力, 这一方法被称为分光光度法, 可是因为实验需要萃取的铜皂数量庞大, 污染问题很大并且危害人身安全, 所以很少人采取这个方法。在酸碱滴定法的应用过程中, 建议利用直接滴定, 此外, 采取疏水有机溶剂对脂肪酶活力进行检测时, 在实施滴定。由于缓冲液起到缓冲作用, 导致人们开始质疑是否需要采取直接滴定法。

而正己烷抽提法与直接酸碱滴定法比较, 前者的稳定性更好, 但是若比较脂肪酶水解活力则后者要好。因此检测脂肪酶水解活力较为适当的方法是正己烷抽提法。

结语

金属酶检测 第7篇

MMPs是一个大家族,因其需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子而得名。根据作用底物以及片断同源性,将MMPs分为6类,为胶原酶、明胶酶、基质降解素、基质溶解素、furin活化的MMP和其他分泌型MMP。明胶酶又称为Ⅳ型胶原酶,是其中重要的一类,它主要有两种形式,一种被糖化,分子量为92kD,命名为MMP-9;另一种非糖化,分子量为72kD,被称为MMP-2。当前对MMP-2、MMP-9的研究较深入。

1 MMPs的结构及生物学特性

MMPs是由癌细胞和内皮细胞、单核巨噬细胞、中性粒细胞、结缔组织细胞等正常人体细胞合成与分泌的一类蛋白水解酶[3],是目前为止发现的唯一能水解纤维类胶原的胶原酶。MMPs是一组具有类似化学结构和共同生物化学特性的金属依赖性蛋白水解酶超基因家族,可以降解几乎所有的ECM成分,是ECM的主要降解酶系统。MMPs由5个功能和结构不同的区域构成[4]:①信号肽与前肽区,MMPs的激活过程中至关重要一步就是前肽区的裂解,前肽区含有保守的Pro-Arg-Cys-Gly-Val/Asn-Pro-Asp (PRCGV/NDP)序列,其中保守的半胱氨酸残基在大多数MMPs酶原活化中起着至关重要的作用。②催化区,催化区包含有两个Zn2+结合区和一个Ca2+结合区,两个Zn2+结合区中一个是位于活性中心的催化性Zn2+,涉及MMPs的催化过程,另一个为结构性Zn2+,明胶酶在此区各有一个175bp残基的插入序列,其有助于明胶酶与底物的结合。③铰链区,铰链区可能与MMPs激活过程中分子折叠有关。④类血红素结合蛋白区,类血红素结合蛋白区与大多数MMPs底物特异性有关,同时在MMPs与组织金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)结合中起重要作用,MMP-7的C末端不含此区。⑤跨膜区,跨膜区只存在于MT-MMP,该结构可将MT-MMP固定于细胞膜上。MMPs成员上述结构的基础上各有特点。各种MMP间具有一定的底物特异性,但不是绝对的。MMPs通常具有下列特征[5]:①能降解ECM的一种或多种成分;②都含有一个锌离子,其能被鳌合剂所阻断③以酶原形式分泌,经活化后才能将蛋白水解;④酶最高的催化活性出现在中性PH时,并能被TIMPs抑制;⑤其具有相同的氨基酸序列。

2 MMP-2和MMP-9的活性调节机制

在癌细胞侵袭及转移过程中,基质金属蛋白酶活性调节发生在不同水平上,其中最关键的是基因转录水平、酶原的激活及基质金属蛋白酶抑制剂的调节。MMPs的合成是由其基因转录所决定,合成过程中依赖于某些生长因子和细胞因子的刺激。调节MMPs生长的因子需要某些调节介质,如PKC、RAS基因及SRC基因[6]。一些生物活性因子可下调MMPs的表达,如:转化生长因子β(TGFβ)、干扰素γ(IFNγ)及类固醇激素(包括糖皮质激素)[7]。基质金属蛋白酶原被激活后方可发挥降解ECM的作用。纤溶酶原被尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂(uPA)激活后,经一系列信号转导,促进MMP-9的分泌[8]。uPA与其受体uPAR结合后,通过激活MMP-3前体进一步激活MMPs系统[9]。基质金属蛋白酶之间可互相激活,如MT-MMPs可激活MMP-2,MMP-2进一步可激活MMP-9[10],MT1-MMP MT2-MMP在时间和空间上都调节着MMP-2的激活[11,12]。基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)是MMPs的天然抑制剂,TIMPs与MMPs结合,形成复合物来抑制MMPs的活性[13]。正常组织中MMPs与TIMPs保持着相对平衡,细胞外基质的降解,是MMPs/TIMPs表达失衡所导致的[14]。Theret等人报道TIMP-2与MMP-2、MT1-MMP结合形成三聚体,共同调节MMP-2的活性[15]。同样,国内外学者研究发现TIMP-2可抑制MMP-2的活性[16,17,18]。

3 明胶酶在HCC发展过程中的作用机理

MMP-9在癌细胞转移的过程中发挥着重要作用。研究发现MMP-9能激活转化生长因子-β1(transforming growth factor-β,TGF-β1),而TGF-β1在HCC生长及转化过程中发挥着重要作用。研究表明TGF-β1在HCC组织中表达高于癌周组织[19],同时TGF-β1的表达与肝癌的分化程度具有相关性。进一步的研究还发现MMP-9具有阻止细胞凋亡、降解ECM及促进血管形成的作用。早期HCC组织周围有明胶组成的ECM和BM,因此癌细胞不容易发生浸润、转移。而MMP-9可以降解ECM和BM,以利于恶性肿瘤的浸润及生长。此外,恶性肿瘤的生长主要取决于肿瘤内血管的形成,有研究指出,MMP-9可以诱导血管生成基因由静止状态转化为活化状态,而且MMP-9在癌细胞通过血管进入血液系统也发挥了重要作用,血中MMP-9的表达与恶性肿瘤的侵袭力呈正相关。研究表明HCC时在MMP-9的作用下,癌细胞能穿过血管内皮细胞的屏障,MMP-9也能诱导癌细胞分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial grouthfactor,VEGF),而VEGF本身具有降低血管内皮的屏障作用或增强血管的通透性。到目前为止,许多学者在恶性肿瘤患者的血液及积液中发现了高浓度表达MMP-9[20,21,22]。MMP-9溶解细胞基质蛋白而使恶性肿瘤周围组织及周围血管内皮细胞降解而促进肿瘤的生长及发育,在正常的肝脏中,其主要来自Kuffer细胞。Murawaki Y[23]通过临床研究发现MMP-9既可以作为肿瘤标志物应用于临床,也可作为肿瘤转移、术后复发标志物。检测HCC患者MMP-9基因表达水平发现其基因表达越高HCC预后差。也有学者通过研究血浆MMP-9含量发现HCC患者中血浆MMP-9浓度高于正常人,这可能与癌细胞或癌细胞周围组织Kuffer细胞产生的金属基质蛋白酶有关。

MMP-2是降解ECM及BM最重要的酶。在癌细胞侵袭、转移过程中,血管内皮细胞与癌细胞都能分泌蛋白水解酶来降解ECM,而MMP-2具有促使膜降解和内皮细胞表面局部胶原和层黏蛋白降解的作用。各种实验结果显示,RAS基因诱导的恶性肿瘤细胞株的MMP-2表达增加,激活MMP-2的单克隆抗体能促进A2058细胞株的侵袭能力[24]。有证据表明,许多细胞因子(如血管内皮生长因子、转化生长因子等)参与了新生血管的形成,进而激活MMP-2。Silletti等研究证实,在肿瘤结节内新生血管形成早期,MMP-2发挥着重要作用。研究结果显示,MMP-2有促进肿瘤血管形成的作用,但也有MMP家族的一些成员具有抑制血管形成作用的报道。因此,MMP与肿瘤血管的关系有待于进一步研究。

MMPs在恶性肿瘤侵袭性生长的机制可能与以下几个方面有关:①MMPs破坏肿瘤细胞周围的物理屏障;②MMPs可重塑癌细胞黏附力,使其易于向周围组织、脉管转移;③MMPs参与恶性肿瘤的免疫过程;④促进肿瘤血管的形成。

4 明胶酶与HCC的临床诊断

Hoyhyta M[25]发现HCC组织中MMP-2的表达明显高于癌旁组织。Hirovuki[26]研究认为HCC患者活化型MMP-2的表达水平与癌细胞有无假包膜浸润或血管侵犯有关。HCC中活化型MMP-2的表达水平与癌细胞的侵袭能力亦呈正相关。研究认为活化型MMP-2可能作为预测HCC复发的一个指标。Yamamoto研究发现存在门静脉癌栓、肝内转移、远处转移或术后复发的患者的MMP-2的表达要明显高于未发上述情况的肿瘤组织,表明MMP-2在人HCC的侵袭、浸润和转移中起重要作用[26]。

Ariis等人[27]检测了HCC组织及癌旁组织MMP-9mRNA的表达情况,结果发现被膜受侵的HCC中MMP-9的表达明显高于被膜未受侵的HCC,且其mRNA在肿瘤浸润前缘的组织中高表达,该研究表明MMP-9与HCC的侵袭、转移有密切关系。Ogasawara等[28]在外科手术切除的HCC组织中也检测到基质金属蛋白酶,结果显示MMP-2和MMP-9呈高表达。说明MMP-2和MMP-9与HCC的侵袭与转移存在某种密切相关的联系。

Chen等[29]对HCC组织标本中的MMP-9和MMP-2表达水平的临床意义进行了分析,结果发现相比MMP-2,MMP-9与HCC侵袭进展和预后关系更为密切。另外,其体外实验也显示MMP-9的表达在高侵袭力HCC细胞株中显著上调,而非MMP-2。在一项动物实验中,阻断MMP-9的功能可以有效抑制癌细胞的浸润、侵袭及转移[30]。赵占考等[31]研究发现MMP-9与HCC的转移、生存时间具有相关性,相反,MMP-2则与HCC的转移有关,而与生存时间无明显关联性。因此,MMP-9和MMP-2在HCC侵袭转移中的作用得到广泛认同。

5 明胶酶与HCC的临床治疗

Zhou研究高表达Notch 1和HCC高侵袭生存率之间的关系时发现,Notch 1的表达可降低癌细胞的侵袭能力,此过程通过调控MMP-9和MMP-2来完成[32]。之前Zhou等研究表明,抑制Notch信号途径,可以引起MMP-2/MMP-9下调抑制HCC细胞侵袭[33]。先前也有人研究证明Notch 1途径也与MMP-2/MMP-9的表达相关[34,35,36]。因此,可以通过增强Notch 1活性,间接抑制MMP-2/MMP-9活性,以治疗HCC的转移和复发。

谢斌[37]等采用免疫组化方法进行检测,评估c-Met的表达与HCC临床病理因素的关系及与MMP-2和MMP-9表达的关系,发现在HCC的转移中,HCF/c-Met与HCC的转移有关,并且与MMPs系统之间存在联系,可能影响MMP-2和MMP-9的表达,对于HCC的转移防治及预后具有一定的临床意义。Yodkeeree S[38]等学者研究发现,姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素的抗侵袭作用与抑制基质金属蛋白酶及uPA的表达有关,且3种药物的抗侵袭作用为:双去甲氧基姜黄素≥去甲氧基姜黄素>姜黄素。该研究将姜黄素及其衍生物刺激人纤维肉瘤HT1080细胞,运用明胶酶谱法检测MMP-2、MMP-9蛋白的表达,发现MMP-2、MMP-9蛋白的表达均受到抑制,且呈剂量依赖性。据以上事实,厉红元[39]等研究发现姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素均可显著抑制MMP-2和MMP-9的表达,诱导人肝癌HepG2细胞阻滞在GO/GI期,抑制癌细胞生长、侵袭、转移。以上研究为姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素等在临床应用提供理论基础。卢永刚等[40]研究表明无论MMP-2/9是处于细胞内mRNA和蛋白质阶段,还是分泌到细胞外环境的酶学活性阶段,茉莉酸甲酷都对其有抑制效应。茉莉酸甲酷能显著降低MMP-2/9启动子的活性及使MMP-2/9 mRNA表达水平下调。此外,明胶酶谱法和荧光活性测定法结果表明佛波醋能够诱导加强HepG2细胞的MMP-2/9蛋白水解活性,但是这一作用被茉莉酸甲酷有效逆转。近来有报道证实了茉莉酸甲醋具有抑制MMP-2/9表达的作用[41,42]。本研究发现茉莉酸甲酷能够抑制佛波酷诱导的HepG2细胞MMP-2/9表达上调,这表明茉莉酸甲酷具有抑制肝癌转移和侵袭的潜能。封云[43]研究发现用1个抗明胶酶scFv的CDR3结构域寡肤和力达霉素辅基蛋白的相结合的融合蛋CDR3-LDP,经免疫荧光分析表明,融合蛋白CDR3-LDP可以很好地和癌细胞表面的明胶酶结合,与力达霉素发色团AE组装后,表现了较之单独的力达霉素更强的细胞毒活性,可能是因为明胶酶结合的CDR3区域的存在增强了力达霉素的细胞杀伤活性,强化后的融合蛋白CDR3-LDP-AE对肿瘤细胞的杀伤呈明显的剂量相关性,与常用的临床化疗药物的杀伤曲线类似,未来可能具有更好的开发前景。

近年来随着研究的不断深入,MMPs的生物学特性、结构及活性调节机制更加明朗,并研究发现了一些明胶酶抑制剂,这些抑制剂包括天然物质、人工合成物质及抗体类物质。其中天然抑制剂主要指的是TIMPs,人工合成抑制剂包括视黄酸衍生物、糖皮质激素及四环素类等。抗体类物质指的是抗明胶酶的单克隆抗体(单抗)3G11,其作用机制为将其余各种抗癌药物连接,以其作为载体直接作用到肿瘤细胞。上述方法都有抑制肿瘤侵袭、转移的作用。从而为临床治疗HCC提供新的思路。

6 展望

金属酶检测 第8篇

由于我国施药机械和施药技术的不完善,导致农药的不合理使用,对环境、农产品和人类健康造成了较严重的危害[1]。因此,农药浓度检测技术得到广泛的关注,特别是农药残留浓度的快速检测技术。现今,我国农药浓度检测技术主要停留在实验室常规仪器检测阶段,其中气相及高效液相色谱-质谱联用法和分光光度计法应用广泛。例如,吴昊等[2]利用分光光度计检测空气中采集到的农药浓度,最低检出限为0.65μg/mL。由于以上监测仪器昂贵笨重,不适用于现场快速检测,因此基于酶抑制原理的显色变化速测卡法能够现场检测得到一定应用,但速测卡法只能对较高毒性的有机磷农药残留进行定性检测,不能进行定量分析。

国内外对酶生物电化学传感器的研究主要是通过电化学工作站,对酶的提取、酶的固定方法和酶电极制备进行优化和特性分析。例如,孙霞等对酶检测农药浓度的灵敏性进行测定;Sylvia[3]利用MSP430微处理器设计了便携装置,在电压为1.5V时检出电流信号为微安级,可用于农药浓度检测。

本文设计了基于丝网印刷酶电极传感检测农药浓度的便携式装置,能够完成恒定电位电解的农药浓度检测实验,具有轻便、快速和高精度的特点。

1 农药浓度检测原理

本文应用计时电流法,在电解池对电极和参比电极端施加恒定电压,并利用酶抑制原理,氯化硫代乙酰胆碱(ATCl)在乙酰胆碱酯酶(AChE)的催化。其中,i1为电极在无农药的底物溶液中测得的稳定电流值;i2为电极在含有一定浓度农药溶液中浸泡一段时间后,再放入底物溶液中测得的稳定电流值。

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进行多次定量农药浓度测量,绘制酶抑制率In(%)与定量农药浓度(μg/mL)的标准曲线。当检测未知浓度的该农药时,测量计算得到的酶抑制率In(%),依据标准曲线,即可得到该农药的浓度。

2 装置结构设计

装置由丝网印刷酶电极、SOC单片机和信号调理电路组成,如图1所示。

51系列单片机C8051F020是集成在一块芯片上的混合信号系统级单片机,芯片上有1个8位多通道ADC,2个12位DAC和电压基准等。单片机C8051F020主要实现实验机的控制与数据采集,片内DAC实现D/A转换,输出恒定控制电压,8位ADC实现信号采集。

信号调理电路完成模拟信号处理任务,采用 I/V转换放大电路。该电路将工作电极WE控制在地电位(虚地),检测微电流信号,并转换为电压信号供ADC采集。

其中,C8051F020芯片尺寸为12mm×12mm×1.2mm ,信号调理电路板为尺寸55mm×40mm 的PCB板,外设显示屏尺寸为80mm×36mm×12mm。

3 主要部件制备

3.1 丝网印刷酶电极制备

自制丝网印刷电极(工作电极和对电极材料为碳,参比电极材料为Ag/AgCl),如图2所示。

丝网印刷电极在pH为7.0的PBS溶液中进行循环伏安法筛选,由电化学裸电极特性条件选取丝网印刷电极。利用石墨烯-二氧化钛(Graphene-TiO2)复合材料配制溶液,取2mg/mL分散于2次蒸馏水中,取4μL分散液滴于丝网印刷电极工作电极表面,室温干燥,再滴4μLAChE。室温干燥后,放于4°C冰箱中储存备用。

3.2 丝网印刷酶电极接口

丝网印刷酶电极接口由USB-A型公口改装而成。公口接口处3根线,分别作为丝网印刷酶电极的工作电极端、对电极端和参比电极端。该接口方便酶电极插拔,另一端可以直接接到研制装置或CHI660B型电化学工作站上。

3.3 丝网印刷酶电极信号调理电路设计与校准

3.3.1 I/V转换放大电路

本文所设计电路选用ICL7650集成运算放大器作为一级放大,二级放大采用高精度低漂移的OP07运算放大器,电路如图3所示。图3中,R2和R5为输入平衡电阻,减小输入失调电流,对于精密MOS运放可忽略;并联电容C1和C2为消振电容。输入微电流Ii和输出转换放大电压Vo的关系为

undefinedi (2)

由于ADC采样的电压范围为0～2.5V,故电阻R1,R3,R4可取值为820kΩ,10kΩ,5kΩ。

3.3.2 调理电路的数字校准

电流信号校准如图4所示。用高精度电压源和一个阻值精确的大电阻作为工作电极提供输入电流,令电压源输出一组电压值V0,在均大于运放输入偏置电压的前提下,可认为输入电流为I0=V0/R0。通过C8051F020内ADC得到实际电压转换值VAD,用最小二乘法对I0和VAD进行线性拟合,求出系数k和b,使得VAD-(kI0+b)的均方和趋于最小,则得到校准后的输入输出关系为

VAD=kI0+b (3)

4 装置对比测试实验

4.1 实验装置及材料

研制速测装置包括:丝网印刷酶电极,电化学工作站(CHI660B,上海辰华仪器公司),乙酰胆碱酯酶AChE(C3389,500U/mg,Sigma),氯化硫代乙酰胆碱(Sigma),西维因carbaryl(Sigma),0.1mol/L PBS底液(由 0.1 mol/L H3PO4,NaH2PO4,Na2HPO4和NaOH配置而成)。其它试剂均为分析纯,所用溶液均用二次蒸馏水配制。

4.2 实验方法

1)控制电压由利用循环伏安法测定酶电极的出峰位置时的电压来确定,测定多组丝网印刷酶电极平均恒定电压,其值为0.68V。

2)将丝网印刷酶电极放入含有2mmoLATCl的5mLpH值为7.0的0.1mol/L的PBS溶液中,然后将该电极浸泡在浓度分别为0,0.005,0.01,0.05,0.1μg/mL的西维因农药溶液中,抑制3min后,由计时电流法获得抑制后的稳定响应值,并记录。

3)利用CHI660B型电化学工作站与研制装置分别进行以上测量,CHI660B型电化学工作站得到I-t曲线,研制装置得到稳定电压信号,记录数据。

4.3 实验结果分析

1)利用CHI660B电化学工作站计时电流法可测得电流随时间的变化,如图5所示。I-t曲线由上到下分别为在西维因农药浓度为0,0.005,0.01,0.05,0.1μg/ml的溶液中浸泡2min后,测得的电流随时间变化曲线如图5所示。

选取在不同浓度的西维因溶液中浸泡后测得的稳定电流值,平衡时间为160s处的电流值,电流值大小分别为4.58,3.89,3.45,2.89,2.38μA。

由式(1)计算得出在不同浓度的西维因溶液浸泡后的酶抑制率In(%),绘制农药西维因浓度与对酶抑制率的关系,如图6所示。

以上实验数据表明,在该酶的固定方法下利用酶电极和CHI660B电化学工作站能够检测西维因农药浓度的方法可行,能够检测西维因农药浓度范围为1ng/mL～1μg/mL,最低检出限为0.7ng/mL;测得微信号为趋于稳定的微电流信号,可以应用于农药浓度的检测。

2)利用研制装置在相同实验条件下进行测量,记录所得到的稳定电压信号,如表1所示。

由表1数据可得,自制装置测得的电压信号VAD与CHI660B型电化学工作站测得电流经式(2)转换放大后的理想电压值V0相比,最大偏差为0.002V,最大电流偏差值为0.19uA。

5 结论

本文在研究酶传感检测农药浓度方法的基础上,制备了丝网印刷酶电极,设计了用于恒电位电解的丝网印刷酶电极的配套电路,研制农药浓度速测装置,并通过与实验室仪器(CHI660B型电化学工作站)的对比实验,得出以下结论:

1)电化学实验结果表明丝网印刷酶电极制备方法可行,制备的丝网印刷酶电极能够检测西维因农药浓度范围1ng/mL～1μg/mL,最低检出限为0.7ng/mL,检出信号为趋于稳定的微安级电流信号。

2)研制装置对比测试结果表明,该装置电流测量精度达0.01μA,与CHI660B型电化学工作站测得电流值最大误差小于0.19μA,能够对农药浓度进行定量检测。

3)丝网印刷酶电极制备完成后,电解池内的反应时间在160s后趋于稳定,研制装置检出电流并转换放大为电压值的时间远小于160s,检出时间小于3min,实现了农药浓度的快速检测。该装置的设计尺寸小,为现场快速检测提供了一种便携式测量装置。

摘要：基于酶传感对农药浓度进行检测,设计了以丝网印刷酶电极作为敏感元件、由SOC单片机和微电流测量电路组成的检测装置。通过与CHI660B型电化学工作站测量对比实验可知:该装置对微电流测量的精度达0.01uA,最大误差小于0.19uA,检出时间小于3min;装置尺寸小,适合于现场农药浓度的快速检测。

关键词：农药浓度,丝网印刷酶电极,SOC单片机,微电流测量

参考文献

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细菌耐药分析及耐药酶的检测探讨 第9篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择我院2008年3月至2011年3月院门诊与住院部收治患者所取得的2650例细菌血培养标本, 其中分离出菌株为610株。

1.2 仪器与材料

铜绿假单胞菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌够买自福建迈新生物技术开发公司;血培养仪和相关配套培养瓶、哥伦比亚琼脂及M-H琼脂提供自法国生物梅里埃公司;真菌药敏试剂盒购买自温州康泰生物科技有限公司;药敏纸片购买自广州市乐通泰生物科技有限公司。

1.3 实验方法

根据患者病情, 科室采集标本进行无菌操作。其中, 对儿童的采血量为3～5mL, 对成人的采血量为5～10mL, 分别将采得血液注入儿童瓶与成人瓶, 并迅速送往微生物室放置进全自动血培养仪中。当仪器提示阳性, 转种培养有细菌生长为阳性, 当仪器提示阴性, 标本培养五天盲转。实验所有菌株全部采用API鉴定系统鉴定, 细菌使用K-B法药敏, 根据NCCLS2000年的判断标准进行结果判定。“中介”具有统计学意义。

2 结果

2650例血培养中, 阳性标本610例, 阳性率为23.0%。其中革兰阳性球菌403株 (66.1%) , 革兰阴性杆菌17株 (29.0%) , 真菌19株 (3.1%) , 革兰阳性杆菌6株 (0.98%) 。主要病原菌有凝固酶阴性葡萄球菌226株, 约占37.0%;大肠埃希菌104株, 占17.4%;金黄色葡萄球菌91株, 占14.9%;肠球菌61株, 占10%;肺炎克雷伯菌21株, 占3.4%。革兰阳性球菌药敏试验结果, 见表1。革兰阴性杆菌对哌拉西林、头孢噻肟、氨曲南、头孢唑啉、氨苄西林等耐药率高;真菌对于两性霉素B、制霉菌素、5-氟胞嘧啶具有较高敏感性, 对于伊曲康唑、咪康唑、氟康唑益康唑具有较高耐药率, 见表1。

3 讨论

本组数据表明, 血培养阳性菌株中, 凝固酶阴性葡萄球菌较多, 占比37.0%, 大肠埃希菌次之, 占比17.4%。随着抗生素在临床上的广泛应用, 细菌耐药率日渐高涨, 尤其是H L G R、M R S A、产E S B L s、M R C N S为代表的革兰阴性杆菌耐药问题, 这些问题并应引起足够重视。临床感染性疾病恶化甚至死亡的一大重要原因就是败血症与菌血症的产生, 提高对病原菌的检测水平, 以及合理使用抗生素是临床感染性疾病治疗的关键性因素。实践数据表明, 加强对血培养的监测, 并根据细菌药敏结果科学合理地选用抗生素, 对减少和延缓耐药菌株的产生具有及其重要的临床作用。

参考文献

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冠心病心肌酶谱检测及其影响因素 第10篇

1 心肌酶谱的检测及意义

1.1 肌红蛋白 (Mb/Myo) 及心肌肌钙蛋白 (c Tn) 只存在于心脏, 是目前诊断心肌损伤 (尤其是心肌梗死) 灵敏性和特异性最好的生物标志物, 也是国内外公认的诊断心肌损伤的确诊标志物。c Tn在急性心肌梗死发作后4~10 h升高, 12~48h达到高峰, 增高可持续7~10 d。特别有利于诊断迟到的心肌梗死和不稳定性心绞痛。目前指南强调患者入院后8-12 h期间应多次测定, 因为从心肌受损到血中出现c Tn有一个延迟期, 连续监测对于避免漏诊心肌梗死很重要。

1.2 血清乳酸脱氢酶 (LDH) 活性测定及意义正常参考值:速率法 (LDH-L法) :100~240 U/L;比色法:190~310 U/L。临床意义:心肌梗死后9~20 h开始上升, 36~60 h达到高峰, 持续6~10 d恢复正常, 因此可作为急性心肌梗死后期的辅助诊断指标。

1.3 血清肌酸激酶 (CK) 同工酶测定及意义正常参考值:免疫抑制法测定CK-MB或CK-B (包括非M-CK) :血清中正常水平CK-MB<10 U/L;CK-MB/总CK<5%。急性心肌梗死时CK-MB>15 U/L (做测定空白) 。如不做空白时, CK-MB>25 U/L。

临床意义:血清CK-MB测定的最重要意义在于诊断急性心肌梗死, 它是至今为止诊断心肌梗死最佳的血清酶指标。急性心肌梗死胸痛发作后4~6 h, 患者血清CK-MB先于总活性开始升高, 12~36 h达峰值;多在72 h内恢复正常。如果梗死后3~4 d, CK-MB仍持续不降, 表明心肌梗死仍在继续进行, 如果已下降的CK-MB再次升高, 则提示原梗塞部位病变扩展或有新的梗死病灶。

1.4 谷草转氨酶 (GOT) 测定及意义谷草转氨酶在心肌细胞中含量最高, 临床一般常作为心肌梗死和心肌炎的辅助检查。

正常参考值:速率法:8~40 U/L;赖氏法:8~28卡门单位。

临床意义:心肌梗死发病6~12 h显著升高, 增高的程度可反映损害的程度, 并在发作后48 h达到最高值, 约3~5 d恢复正常。

2 心肌酶谱检测的注意事项及影响因素

2.1 检测试剂及仪器的质量控制

心肌酶谱检测的准确性, 需要有一系列的质量控制过程。其质量控制过程包括实验前、中、后三个阶段。检测前包括患者药物准备、采血时间等方面;检测环节包括仪器调校、试剂配制、实验温度、定标及质控等方面, 检测后环节包括报告审核、临床信息反馈、结果追踪观察等。其中实验室检测环节尤为重要。检测仪器调校不当、定标不准、质控报警失控、试剂失效、仪器维护保养不到位等因素, 均会导致测定结果波动, 甚至失真。临床检测中必须严格遵守SOP文件, 做好室内质控和室间质评工作, 确保测定结果准确可靠。

2.2 血标本的收集及放置

急性心肌梗死发生后, 心肌的损伤是一个渐进的过程, 因此血清酶活性的升高有一个延缓期, 与梗死区的大小、酶从受损心肌释出的速度以及酶在血液中的稀释和破坏程度有关, 各种酶的延缓期、高峰期及维持时间各不相同, 故采血必须在延缓期之后、维持时间期间进行, 否则检测结果必然不会准确。

2.3 几点注意事项

①Mb在胸痛发生后1~3 h内即可升高到有诊断意义的水平, 并于24 h内恢复正常。可用于再梗和溶栓的监测。但是, 此检验缺乏特异性, 骨骼肌损伤时也明显增高。②CK-MB在胸痛后4 h上升, 24 h达高峰, 48 h后恢复正常, 排除骨骼肌损伤后, 可做为AMI诊断的主要生化指标。肌酸激酶 (CK) 对心肌缺血和心内膜下心肌梗死的诊断比其他酶灵敏。③c Tn I在胸痛后4~6 h上升, 12 h达高峰, 7 d后才恢复正常, 特异性强, 是目前诊断AMI的生化“金指标”。④目前对于心肌标志物的应用, 临床推荐的常用方案是两种标志物的联合使用, 即将一种快速升高的早期标志物 (如Mb) 与另一种为持续升高且特异性高的确诊标志物 (如c Tn) 联合使用。此方案有助于快速鉴别非心肌梗死的胸痛患者。