细胞色素b基因（精选4篇）
细胞色素b基因 第1篇
哈尔滨师范大学生物化学与分子生物学实验室于2013 年8 月份在吉林省白山市抚松县露水和镇附近捕捉了1 条虎斑颈槽蛇( 命名为J - 01) ,其颈部及其后一段距离的黑斑间为蓝色,与正常虎斑颈槽蛇的红黑相间有明显差异,推测该蛇可能受环境因素等影响而产生变异。故本研究参照参考文献[3]利用酚- 氯仿抽提法提取该蛇的基因组DNA,用PCR技术扩增细胞色素b( Cytb) 基因部分片段并测序,拟通过绘制分子进化树研究J - 01 与其他同亚科不同属游蛇的系统发生关系,以判断J - 01 的分类学地位。
1 材料
1. 1 组织样品
取虎斑颈槽蛇J - 01 尾部肌肉组织- 80 ℃ 保存,备用。
1. 2 试剂
裂解液(100 mmol/L EDTA,p H值为8.0;10 mmol/L Tris,p H值为8.0;1%SDS),自制;25 mg/m L蛋白酶K、DL-2 000 Marker、d NTPs、Taq酶、San Prep柱式DNA胶回收试剂盒,均购自上海生工生物工程股份有限公司。其他试剂为分析纯。
1. 3 引物
根据Gen Bank中登录号为GQ281785. 1 的来源于中国辽宁的虎斑颈槽蛇Cytb序列,设计出预计片段为350 bp的第1 对引物,序列为上游引物Rht 15' - CCACAGGCTTCTTCTTAG - 3',下游引物Rht 25' - AGTAGTGAGCGTGTTTCC - 3'; 再根据测序结果设计出预计片段为620 bp的第2 对引物,序列为上游引物Rht 5 5' - GCCTCTATTACGGCTCCTA - 3',下游引物Rht 6 5' - GGGTGAATGGCATGGTTA - 3'。
2 方法
2. 1 基因组DNA的提取
取150 mg蛇尾部肌肉组织,充分剪碎,按照酚-氯仿抽提法,加入裂解液500 μL,25 mg /m L蛋白酶K3 μL,55 ℃ 消化12 h至完全裂解; 再用酚- 氯仿多次抽提; 加Na AC和无水乙醇沉淀得到基因组DNA,置于- 20 ℃保存,备用。
2. 2 目的片段的PCR扩增
PCR反应体系(50μL):10×Buffer 5μL,d NTPs,4 μL,上游引物Rht 1 1. 6 μL,下游引物Rht21. 6 μL,Taq酶0. 25 μL,灭菌双蒸水32. 55 μL,DNA模板5 μL。PCR循环参数: 94 ℃ 预变性3 min;94 ℃ 变性45 s,50 ℃ 退火45 s,72 ℃ 延伸1 min,共35 个循环; 72 ℃ 再延伸10 min。PCR扩增产物用San Prep柱式DNA胶回收试剂盒回收纯化后,送上海生工生物工程股份有限公司进行双向测序。
2. 3 数据的统计分析
将双向测序得到的J - 01Cytb基因片段序列拼接,其他17 种参考钝头亚科的游蛇Cytb序列登录号见表1。用CLUSTAL X( 1. 8) 软件分析Cytb基因序列的同源性并进行同源序列比较[4],选择首末段对齐位点,舍去5'和3'端不对齐部分,不进行后续数据分析。用MEGA4. 0 软件计算上述DNA序列间差异[5],用最大简约( MP) 法构建各物种间分子系统树,用Bootstrap进行置信度检验。同时,用MEGA软件中的Statistics程序也可进行序列的碱基组成分析。
3 结果
3. 1 虎斑颈槽蛇J - 01Cytb基因片段的PCR扩增
利用Rht1 和Rht2、Rht5 和Rht6 这2 对引物,分别扩增出350 bp和620 bp的Cytb基因片段,拼接后得到970 bp的碱基序列,与预期相符,见图1。
3. 2 J - 01 Cytb基因片段的同源性比较
将虎斑颈槽蛇J - 01Cytb基因片段与其他17 种同亚科游蛇Cytb基因序列进行同源性比较,结果见表2。
由表2 可见,J - 01 序列与虎斑颈槽蛇序列同源性最高,达99. 1% ,而与虎斑颈槽蛇T - 01 同源性较低,只有90. 5% 。其中,虎斑颈槽蛇来源于中国辽宁,属于虎斑颈槽蛇大陆亚种; T - 01 来源于台湾,属于虎斑颈槽蛇台湾亚种,说明不同亚种间Cytb基因序列有明显差异。同时表2 中数据充分证明了Cytb基因高度保守,因此Cytb基因是分析物种系统进化的重要分子标记。
M1.DL-2 000 Marker;M2.DL-750 Marker;1.水对照;2.PCR扩增产物。
通过对Cytb部分基因片段的同源性比较计算分析可知,变异的虎斑颈槽蛇和9 种钝头蛇亚科游蛇之间有37 个多态性核苷酸位点,29 个碱基转换位点,8个碱基颠换位点,碱基发生转化的频率比颠换频率高[6,7,8],见表3。
3. 3 Cytb基因片段核苷酸组成分析比较
利用MEGA4. 0 软件分析本试验测得拼接后的J- 01 和前文所述的17 条蛇的Cytb基因片段具体核苷酸组成,结果见表4。由表4 可见,虽然18 条序列中碱基A、T、C、G占总碱基数的比例十分相似,但几乎没有完全一致的现象。由此可推测不同种属的游蛇在遗传上有一定程度的变异性和差异性[9]。
%
注: 频率结果已取平均值。ii — 碱基一致数,si — 碱基转换数,sv — 碱基颠换数,R —碱基转换数/碱基颠换数。
将虎斑颈槽蛇J - 01 的Cytb基因片段和其他17条Cytb基因片段翻译成氨基酸后进行序列比对,发现J - 01 与GP613 和虎斑颈槽蛇氨基酸序列差异最小,但仍有4 个差异位点。从整体上看,变异的虎斑颈槽蛇J - 01 与同属蛇类的Cytb氨基酸序列差异性较小,与另外9 种同亚科不同属的蛇类在Cytb氨基酸序列有较多差异位点,有明显的遗传特异性和遗传差异性。
3. 4 J - 01 与参考物种系统发生树的构建
利用MEGA4. 0 软件,用最大简约法构建MP分子系统树,并设置Bootstrap的值为500 进行置信度检验,减少进化树拓扑结构的错误。对J - 01 与其他17 种同亚科蛇Cytb基因碱基序列和氨基酸序列进行对比,分别绘制MP系统发生树,见图2 和图3。
由图2 可以看出,虎斑颈槽蛇J - 01 与来自于俄罗斯滨海的虎斑颈槽蛇R - 02 碱基序列上亲缘关系最近。由图3 可以看出,虎斑颈槽蛇J - 01 虽然成单独分支,但是仍与虎斑颈槽蛇R - 02 、虎斑颈槽蛇GP613、虎斑颈槽蛇K - 01、虎斑颈槽蛇NI-BRRP0000100362 有较大亲缘关系。
4 讨论
由于线粒体Cytb基因是母系遗传,可单独合成蛋白质,因此Cytb基因常用于分子系统发生的研究[10,11,12,13,14]。对Cytb基因具体功能的研究表明,Cytb基因适用于属间和种间进化关系的进化研究。本试验就是根据Cytb基因的保守区设计出引物,成功扩增出350 bp和620 bp的虎斑颈槽蛇J - 01 的Cytb基因片段。虽然本试验测得的虎斑颈槽蛇J - 01 的Cytb基因片段与已知的虎斑颈槽蛇Cytb基因序列同源性较高,但还是有差异,这些差异可以用于遗传差异的研究。由表2 可以看出: J - 01 与虎斑颈槽蛇同源性最高,为99. 1% ,虎斑颈槽蛇来源于中国辽宁,虎斑颈槽蛇J - 01 来自于中国吉林; 而虎斑颈槽蛇J - 01与来自于中国台湾的T - 01 同源性较低,为90. 5% ;与来自于日本的虎斑颈槽蛇II - 02 同源性也较低,为93. 5% 。说明虎斑颈槽蛇J - 01 可能属于虎斑颈槽蛇大陆亚种R. t. Lateralis。在本试验中,蛇Cytb基因的碱基转换/颠换平均值R为3. 9,大于2. 0,说明游蛇科钝头蛇亚科的蛇类基因序列突变未达饱和态,各种蛇仍有变异趋势[15,16]。这一结果说明虎斑颈槽蛇J - 01 可能是一种变异的虎斑颈槽蛇。
%
日本学者利用蛇的Cytb序列进行的系统发育研究发现,日本、大陆和台湾的虎斑颈槽蛇有很近的亲缘关系,且Cytb序列的变化与地理位置的不一致性有关[17,18,19]。本试验采用MEGA4. 0 软件分析了包含虎斑颈槽蛇J - 01 在内的18 种蛇的系统进化关系,结果与上述试验结果相近。MP分子进化树适用于序列差异性非常小且序列数目较少的情形。由碱基序列MP分析可知,虎斑颈槽蛇J - 01 和来自于俄罗斯的虎斑颈槽蛇R - 02 亲缘关系最近,可能是因为中国吉林与俄罗斯滨海地理上较为接近。而在氨基酸序列MP树中,来自于俄罗斯滨海的虎斑颈槽蛇R -02 和来自中国辽宁的虎斑颈槽蛇GP613 亲缘关系最近,来自于俄罗斯的虎斑颈槽蛇K - 01 和来自于韩国的虎斑颈槽蛇NIBRRP0000100362 亲缘关系最近。虎斑颈槽蛇J - 01 虽与R - 02、GP613、K - 01、NIBRRP0000100362 都有较近的亲缘关系,但仍呈单独分支,证明其在氨基酸水平上与其他17 种蛇有明显的差异性。由碱基序列和氨基酸序列MP树联合对比可以看出,虎斑颈槽蛇J - 01 由于其特有的表型特征和遗传特性,在分类学上地位可以上升为新的虎斑颈槽蛇亚种,但是否能确定为新亚种还有待于对Cytb基因序列进一步的扩增比对,以及其他多种具有重要分类学意义的基因比对。
摘要：为了研究捕捉于吉林省白山市的1条蓝色虎斑颈槽蛇与其他同亚科游蛇的亲缘关系和其分类学地位,试验采用DNA测序技术、同源序列比较的方法提取其基因组DNA,并对其细胞色素b(Cytb)基因进行扩增并测序,然后与17种同亚科游蛇的细胞色素b基因进行同源性比较。结果表明:虎斑颈槽蛇基因突变位点未饱和,仍有变异趋势;虎斑颈槽蛇J-01变异与地理环境有关。说明虎斑颈槽蛇J-01为变异虎斑颈槽蛇,其是否可以上升为新的虎斑颈槽蛇亚种仍有待下一步研究。
细胞色素b基因 第2篇
目前,我国记载沙塘鳢属鱼类共计4种,为中华沙塘鳢(O.sinensis)、河川沙塘鳢(O.potamophila)、海丰沙塘鳢(O.haifengensis)和鸭绿沙塘鳢(O.yaluensis)[2]。关于沙塘鳢属鱼类人工繁、养殖方面的研究相对较多[3,4,5,6],在一些地区也进行了规模化人工繁养殖的实践生产。但关于沙塘鳢属鱼类系统发育方面的基础研究报道还相对较少。本文对河川沙塘鳢Cyt b序列进行了测定,并与塘鳢科其余种类进行比对分析,以期为沙塘鳢属及塘鳢科鱼类的分类及系统发育研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验所用河川沙塘鳢采集于浙江淳安千岛湖,为千岛湖野生个体,取鱼鳍完整、鱼体健康活泼的2尾作为试验对象。剪取鱼鳍,在95%乙醇中保存备用。
1.2 基因组DNA提取、PCR扩增及测序
取0.1 g乙醇保存鱼鳍样品,用蒸馏水、STE(0.1 mo L/LNa Cl、10 mmo L/L Tris-Cl、1 mmo L/L EDTA,p H值8.0)缓冲液浸泡洗涤直至将骨肉组织中的乙醇去除。加入900μL STE、90μL 10%SDS,10μL 20mg/m L蛋白酶K,56℃下至消化完全,加苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提,2倍体积无水乙醇沉淀,40μL TE溶解,电泳检测,4℃保存备用。
PCR扩增引物为L14724(5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′);H15915(5′-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC3′)[7]。PCR反应体系总体积为50μL,其中10×缓冲液5μL,d NTPs2μL(各2.5 mmo L/L),上、下游引物各1μL(20μmo L/L),Taq酶2 U。PCR反应条件为94℃预变性4 min,然后94℃变性45 s,54℃退火45 s,72℃延伸1 min,35个循环,最后72℃延伸10 min。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后用上海生工DNA凝胶回收试剂盒回收纯化,并送至上海生工生物工程公司进行双向测序,测序仪为ABI3730。
1.3 序列分析
将所测序列结合Genbank中得到的塘鳢科其余鱼类Cyt b序列(表1)运用Clustal W程序将测得序列进行比对,辅以手工校正,得到比对序列。然后使用mega 3.1软件对比对序列进行分析。并用邻接(Neighbor-Joining,NJ)法构建系统树,系统树各分支的置信度由1 000次自举法(Bootstrap)检验。相对遗传距离用Mega 3.1中的“Pairwise distance”计算。
2 结果与分析
2.1 序列特征分析
试验鱼Cyt b基因片段经PCR扩增、回收、纯化、测序,与Genbank中查得的塘鳢科其余22种鱼类Cyt b序列(表1)进行比对,辅以手工校正得到1 107 bp的比对序列。河川沙塘鳢Cyt b基因序列如图1所示,T、C、A、G平均碱基组成频率分别为31.3%、27.4%、28.9%、12.5%,A+T含量大于C+G含量(图2)。
24条Cyt b基因序列通过比对得到保守位点538个,变异位点569个,其中简约信息位点504个,平均转换/颠换为1.31。
2.2 分子系统树的构建
用分子系统学软件Mega 3.1中的NJ法获得唯一的1个系统树,其拓扑结构显示于图3。Bootstrap1000给出了各支的置信度,最高值为100。24条序列隶属于9个属,Eleotris、Hypseleotri 2个属构成1支,Odontobutis、Perccottus 2个属构成1支,Bostrychus、Butis、Oxyeleotris、Ophiocara 4个属构成1支,Ptereleotris heteroptera单独构成1支。各种间相对遗传距离如表2所示。
3 结论与讨论
目前记载的塘鳢科(Eleotridae)鱼类包括Butinae、Eleotrinae 2个亚科,23个属[8],其中在我国存在分布的有16个属[9]。本文中涉及的种类包括9个属,其中Bostrychus、Butis、Ophiocara及Oxyeleotris隶属Butinae,在构建的分子系统树中显示其构成1个分支,支持其为同一亚科;而其余5个属在分子系统树中分为3支,Eleotris与Hypseleotris构成1支,Odontobutis与Perccottus构成一支,Ptereleotris单独构成1支,未能在亚科水平上聚类。任岗等[10]用12S r RNA基因片段构建的系统树显示Oxyeleotris、Ophiocara与Butis聚类为1支,与本文的研究结果存在一定差异,说明选择不同的基因在系统发育研究中存在差异。对于更加准确的物种间研究系统发育需要综合多方面的研究进行综合分析。又由于本文研究未能包括塘鳢科中全部分属,对于塘鳢科分为2个亚科的结论有待进一步的探讨。
注:枝上显示Bootstrap 1 000个循环的置信度。
注:1:Odontobutis potamophila(1),2:Odontobutis potamophila(2),3:Eleotris acanthopoma,4:Eleotris oxycephala,5:Eleotris melanosoma,6:Eleotris fusca,7:Erotelis armiger,8:Eleotris pisonis,9:Eleotris amblyopsis,10:Eleotris picta,11:Eleotris sandwicensis,12:Eleotris smaragdus,13:Bostrychus sinensis,14:Perccottus glenii,15:Odontobutis obscura,16:Butis amboinensis,17:Ophiocara porocephala,18:Oxyeleotris marmorata,19:Oxyeleotris nullipora,20:Oxyeleotris selheimi,21:Oxyeleotris lineolata,22:Hypseleotris klunzingeri,23:Hypseleotris galii,24:Ptereleotris heteroptera。对角线以下是转换加颠换,对角线以上是转换比颠换。
本文中2尾试验鱼样本相对遗传距离为0.010,而Eleotris pisonis与Eleotris picta、Eleotris acanthopoma与Eleotris sandwicensis相对遗传距离分别为0.008、0.017,与2尾试验鱼间相对遗传距离相当。Eleotris pisonis与Eleotris picta、Eleotris acanthopoma与Eleotris sandwicensis属于种间关系或还是亚种关系,需要更多的证据进一步地判定。
动物的系统发育是动物地理学,尤其是系统发育动物地理学研究的主要方法,通过分析动物的系统发育,进而探讨物种生物地理格局的演化、种群基因谱系格局等情况。塘鳢科鱼类种类较多,分布较广,尤其是在东亚及东南亚地区的分布广泛,且海淡水均有分布,是研究动物地理学比较理想的材料。塘鳢科鱼类系统发育的研究,对探讨塘鳢科鱼类的物种离散、鱼类区系发展及地理演变具有一定的指导意义。
摘要：采用特异性引物PCR扩增获得了河川沙塘鳢细胞色素b基因序列,并与塘鳢科其余22种细胞色素b基因序列进行比对,运用Mega 3.1软件通过NJ法构建了塘鳢科鱼类系统发育树。结果显示:2尾试验鱼构成1支;Eleotris、Hypseleotri 2个属构成1支;Odontobutis、Perccottus glehni 2个属构成1支;Bostrychus、Butis、Oxyeleotris、Ophiocara 4个属构成1支;Ptereleotris heteroptera单独构成1支。该研究结果可为深入探讨沙塘鳢属及塘鳢科鱼类的系统分类与重新整理提供依据。
关键词：河川沙塘鳢,线粒体细胞色素b基因,系统发育
参考文献
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细胞色素b基因 第3篇
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取佛山市南海区第二人民医院心内科CADH患者274例，男性184例，女性90例，平均年龄为67岁。对照组选取佛山市进行调查的自然人群111例，男性76例，女性35例，平均年龄为60岁。接受氯吡格雷治疗者130例，男性90例，女性40例，其中抗血小板治疗方案为：氯吡格雷70mg qd，阿司匹林102mg qd，并同时检测患者服药前及服药10d后血小板聚集率。PCI治疗者52例，男性39例，女性13例。具体治疗方法如下： (1) 常规方法和药物治疗：通过行冠状动脉造影，按照2008年美国AHA和ACC关于心血管疾病诊断和治疗的报告来判断结果。PCI手术前患者使用阿司匹林/氯吡格雷（250mg/250mg）。患者PCI术后1周需皮下注射低分子肝素钠4500 q12h，并连续服用1个月阿司匹林250mg qd，根据病情好转适当减量并长期维持在150mg qd；至少口服氯吡格雷70mg qd, 10～12个月。 (2) 检测并记录患者口服氯吡格雷前及服用氯吡格雷10d后血小板聚集率。 (3) 通过再入院记录、门诊及电话随访对不良心血管事件再发生情况进行术后随访。
1.2 统计方法
所有数据应用SPSS 13.0统计分析软件进行统计学处理；计量资料以2检验或校正2检验；计数资料以t检验或t'检验；P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 口服氯吡格雷治疗的130例CAHD患者一般临床资料
274例CAHD患者中有130例患者口服氯吡格雷治疗，男性90例，CYP2C19 681 AA型、GA型、GG型分别有3、38、48例；女性40例，CYP2C19 681 AA型、GA型、GG型分别有2、20、19例。将此130例CAHD患者按基因型分组，其中服用氯吡格雷10d后实验室氯吡格雷抵抗发生情况、服药前后血小板聚集率降低幅度、最大血小板聚集率在CYP2C19 681 3种基因型组间差异有统计学意义，P<0.01;CYP2C19681各基因型间服用氯吡格雷前最大血小板聚集率差异无统计学意义，P>0.05。结果见表1～2。
2.2 52例PCI后患者的一般临床资料
口服氯吡格雷患者中52例进行了择期PCI，男性39例，CYP2C19681 AA型、GA型、GG型分别有1、18、20例；女性13例，CYP2C19681 AA型、GA型、GG型分别有1、6、6例。将此组病例按各基因基因型分组，经检验CYP2C19 681各基因型间如下因素无统计学意义（P>0.05）：服药前后最大血小板聚集率差异、年龄、体质量指数、高密度脂蛋白、左室射血分数、甘油三酯、血胆固醇、血小板数。
2.2.1 接受PCI治疗的患者服用氯吡格雷10d后，其最大血小板聚集率降低情况在各基因型组间的情况见表3。
从表3可看出，CYP2C19 681不同基因型的患者中，3组间平均血小板聚集率降低幅度具有统计学差异，P<0.01。不同基因型个体间平均血小板聚集率降低情况中，GG型个体降低幅度最大，GA型居中，AA型最小。突变杂合体（GA型）与突变纯合体间经多重比较，平均血小板聚集率降低幅度无差异，P>0.05；野生型（GG型）个体平均血小板聚集率降低幅度比突变纯合体（AA型）的个体要大，P<0.01，比携带一个等位基因A (GA型）也大，P<0.05。
2.2.2 接受PCI治疗的患者服用氯吡格雷10d后，实验室氯吡格雷抵抗在各基因型组间的发生情况见表4。
表4显示，此差异具有显著统计学意义（P<0.01）。CYP2C19681 (GA+AA）型个体氯吡格雷抵抗发生率较GG型个体实验室高，既A等位基因携带个体氯吡格雷抵抗发生率较野生型个体高。
2.2.3 严格要求PCI术后患者口服氯吡格雷治疗，并随访8个月，观察各基因型间是否再发生不良心血管事件情况，具体内容见表5。
表5显示，此差异有显著统计学意义（P<0.001）, CYP2C19 681 (GA+AA）型个体不良心血管事件再发生率较GG型个体高，既A等位基因携带个体不良心血管事件的再发生率较野生型个体高。
3 讨论
随着分子生物学、分子遗传学的发展以及人类基因组计划的实施, 近年药物基因组学发展迅速。它是一门研究基因水平和药物反应个体差别的新学科, 主要用来描述药物靶分子的基因多态性、药物转运、药物代谢和与药物活性效应或其他一些不良反应之间的关系与联系[1], 这些成果对合理运用临床药物具有非常重要的意义。它可以引导临床医师个体化用药, 而不是一味地采取经验性用药模式。细胞色素P450酶系是药物基因组学目前研究的热点, 它广泛存在于肝细胞的微粒体、内质网和线粒体的氧化酶中, 其主要用以氧化修饰药物及代谢产物。细胞色素P450的种类很多, CYP2C19是细胞色素P450家族2中C亚家族中的一种多肽, 也是氯吡格雷在体内的主要代谢酶。
21世纪以来, CAHD发病率随着人们生活水平的提高及年龄的增长明显上升, 现已成为心血管疾病致死的主要疾病之一。氯吡格雷作为一种抗血小板药物, 能明显减少动脉血栓、心肌缺血等, 然而临床上应用氯吡格雷进行抗血小板治疗[2]多采用标准方案或依据经验性用药以及固定剂量治疗, 这无疑增加了手术中的危险性和不稳定因素。因此, 开展细胞色素P450基因多态性研究具有非常重要的现实意义[3]。本研究结果显示, CYP2C19 681G/A突变是CAHD患者口服氯吡格雷治疗疗效及预后欠佳的主要影响因素, 它减弱了氯吡格雷对血小板的抑制作用。
摘要：目的 探讨细胞色素P450酶2C19基因 (CYP2C19) 681G/A多态性对氯吡格雷治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病 (CAHD) 的影响。方法 选取佛山市南海区第二人民医院心内科CADH患者274例, 其中130例口服氯吡格雷, 选取佛山市111例调查的自然人群为对照组, 口服氯吡格雷患者中52例进行了择期经皮冠状动脉介入术 (PCI) 治疗, 比较氯吡格雷治疗后患者各基因型与实验室氯吡格雷抵抗之间的关系, 并分别比较不同基因型组间血小板聚集率、实验室氯吡格雷抵抗和不良心血管事件的再发生情况。结果 氯吡格雷治疗后CYP2C19681AA型平均血小板聚集率降低幅度最小, GA型次之, GG型最高;PCI患者CYP2C19681A等位基因携带者组不良心血管事件再发率高、平均血小板聚集率降低幅度小、实验室氯吡格雷抵抗发生率高。结论 CYP2C19681G/A突变是CAHD患者口服氯吡格雷治疗疗效及预后欠佳的主要影响因素, 它减弱了氯吡格雷对血小板的抑制作用。
关键词：细胞色素P450酶,氯吡格雷,血小板
参考文献
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细胞色素b基因 第4篇
HCMV有近208个开放阅读框(Open reading frame,ORF),其中至少41个是病毒所必需,UL23恰恰相反不属此列。生物信息学分析表明,HCMV UL23基因为疱疹病毒保守基因,属US22基因家族成员[2]。目前所知HCMV UL23编码了pUL23蛋白,且属tugment蛋白,定位于细胞核周边[3];在基因组中缺失突变UL23后,导致了Towne病毒生长速度加快[4],这一特殊的生物学现象提示HCMV UL23可能在病毒与宿主共生方面发挥特别的作用,而对其分子机制的进一步研究将为阐明HCMV与人免疫系统的关系提供重要线索。利用部分互联网软件,综合分析预测p UL23的B细胞表位,将为应用合成肽抗原制备相应的抗体并进行下一步分子机制研究提供依据。
1 材料和方法
1.1 材料
应用微机从互联网数据库GenBank已公布的HCMV基因组中,确定UL23基因编码蛋白氨基酸序列。
1.2 方法
1.2.1 pUL23蛋白二级结构预测
在互联网软件http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl及http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.htmll分析模式中,输入pUL23蛋白氨基酸序列,点击查询功能键,等待软件预测的该蛋白二级结构结果输出,以β转折、无规卷曲结构出现的4~6个以上残基区域作为抗原表位的待选区。
1.2.2 pUL23蛋白的跨膜区预测
在互联网http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/、http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.htm软件分析模式中,输入p UL23蛋白氨基酸序列,点击查询功能键,等待软件预测蛋白跨膜区结果的输出,以非跨膜结构的4~6个以上残基区域作为抗原表位的待选区[5]。
1.2.3 pUL23蛋白亲水性、可及性、极性、柔韧性及抗原性参数预测
在互联网http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl软件分析模式中,分次选取Kyte&Doolittle、Emini、Zimmerman、Avrage flexibility等方案模式,点击查询功能键,依次分别预测pUL23蛋白亲水性、可及性、极性、柔韧性等对应的抗原表位,以脱离域值均线后出现峰值的4~6个以上残基区域作为抗原性待选区域(除亲水性抗原参数取负峰值外,其余均选正峰值);用互联网http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/软件分析模式,输入pUL23蛋白氨基酸序列,点击查询功能键,预测蛋白序列的抗原性片断,以分值靠前区域作为主要的抗原待选区域[6~9]。
1.2.4 综合分析
将上述方法汇总,兼顾各预测参数,推断细胞识别表位的重叠区域;用吴玉章等[10]建立的B细胞表位预测法进行综合判定。吴氏方法的基础是收集已经明确的病毒抗原性肽氨基酸序列的生物信息,分析统计后确定出各类氨基酸残基的抗原性分数值;在预测未知蛋白B细胞表位时,将待研究肽段中的氨基酸按上述已确立的统计分值计算各类氨基酸的抗原性数值总和,最后求待选各肽段的加权抗原性分值,通过比较评估,取分值大的肽段,作为该蛋白的B细胞表位区域。
2 结果
2.1 pUL23蛋白序列分析、二级结构预测
氨基酸序列分析表明,目前公布的AD169、Town和Toledo 3株病毒序列中,pUL23序列较为保守,故选用AD169的pUL23氨基酸序列进行结构分析及B细胞表位预测。如图1所见,pUL23二级结构柔性区域占总氨基酸数33.69%,其中无规卷曲占28.62%,以字母C标出;β转角占5.07%,以字母t标出。pUL23二级结构的α螺旋占44.93%、β折叠占21.38%,此两类结构含氢键,化学键能高、不易变形,是维持蛋白高级结构的关键因素。
2.2 pUL23蛋白的跨膜区预测
预测显示pUL23无跨膜螺旋结构,其序列全部位于膜外;全序列均为预测B细胞表位候选区。
2.3 pUL23蛋白亲水性、可及性、极性及柔韧性参数预侧
如图2,pUL23蛋白N-端第39~59为最高亲水性区域;N端氨基酸残基第12~40与73~102均出现最高可及性区域;N-端第33~58为最高极性区域;N-端第38~58为最高柔韧性区域。各方案预测中高于阈值区域的结果汇总于表1,这些片断被视为预测的B细胞表位。根据CBS Prediction Servers方案,预测N-端氨基酸残基15~29、51~57、85~90、138~143、202~203和267~276为高抗原性指数区域。
2.4 pUL23蛋白抗原表位综合预测及抗原性指数预测
KOLASKAR等[11]根据氨基酸残基的理化特性、在已知表位中出现的频率,提出并编制了预测抗原位点工具EMBOSS(http://liv.bmc.uu.se/cgi-bin/emboss/antigenic);用该工具及CBS Prediction Servers对p UL23进行了抗原性预测,其结果与各单参数方法预测的B细胞表位汇总于表1。从中可见,不同方法预测的B细胞表位数目和可能出现的区域有差异,但膜外N-端氨基酸残基174~186、88-~97、27~43、104~119和125~160区显示多种预测方法重复性较高。
根据吴玉章方法[10]计算pUL23可能的B细胞表位平均抗原指数,列于表2。对比表1、2,发现膜外N-端氨基酸残基174~186、27~43、104~119和125~160区显示有较好的亲水性、可及性、柔韧性,但174~186区在二级结构上缺乏易形成B细胞表位的β转角和不规则卷曲。因此,B细胞表位极可能在氨基酸残基27~43、104~119和125~160 3个区域内或者附近。
3 讨论
多种单参数综合预测模型和相应分子生物学软件预测蛋白质B细胞表位的方法,已经成功应用在多肽疫苗合成、诊断试剂制备和抗体筛选等领域[12]。随着互联网技术的发展,利用互联网服务器具备对蛋白质物化性质指标分析和比较的功能以及配套强大数据库的特点,可快捷地进行对目标蛋白分子B细胞表位的预测。
单参数亲水性指标是最早预测B细胞表位的方法,其后才逐步扩展到多参数、综合参数分析软件等。通常情况下,疏水性残基位于蛋白内部,而亲水性残基位于蛋白表面,可见蛋白的亲水部位与其抗原位点密切相关,亲水参数也成为预测B细胞表位最重要的依据;可及性是抗原中的氨基酸残基为溶剂分子接触的可能性;柔韧性则是抗原构象非刚性不变、多肽骨架具备某种程度的活动性,氨基酸残基活动性强则显现柔韧性好,易形成抗原表位;β转角显现凸出,多显于抗原表面,利于与相应抗体嵌合;无规卷曲比较松散,易扭曲、盘旋并展示在蛋白表面。因此,具备β转角、无规卷曲二级结构者易成为B细胞表位;与非极性氨基酸大多位于内部正好相反,极性的氨基酸残基多位于球状蛋白表面,也利于与相应抗体相结合[6~9]。
根据以上原理建立的B细胞表位单参数预测模型,仅能成功预测部分蛋白质B细胞表位,不能涵盖各种蛋白。目前,综合考虑多种参数或建立模型预测蛋白B细胞表位,可以克服单项参数预测局限性、提高预测准确率。在多参数综合模型中,公认有较好效果的参数主要包括:亲水性、可及性、柔韧性、二级结构、极性、其他如抗原性、电荷分布等,其中尤以综合考量亲水性、可及性、二级结构3项参数的预测最为重要[6~9],这是基于B细胞表位首先应易位于表面、且具有一定的柔韧性,利于与受体或抗体结合,而亲水性和可及性正是形成抗原表位的首要条件。尽管如此,具备亲水性和可及性并非就具抗原性,抗原表位形成还须与序列中特定氨基酸、片段活动性及二级结构构象有关。吴玉章等建立的预测方法[10]综合考虑了蛋白的许多性质,如片段活动性、结构、构象和氨基酸侧链排列等,而且其模型依据来源于病毒蛋白,此项研究对象亦属该类范畴,以吴氏方法对多参数预测结果进行重叠性检验,将能提高预测准确性。
通过使用互联网软件,获得了两种人巨细胞病毒UL23开放阅读框编码蛋白的B细胞预测表位数据,在经过亲水性、可及性、柔韧性单参数方案以及二级结构预测等重叠分析后,发现各方法预测的B细胞表位个数和区域有差异;在分析得到的5个重复性最高片断后,再与吴氏积分法[10]进行重叠比较后,进一步发现人巨细胞病毒UL23基因编码蛋白的B细胞表位极可能位于N-端27~43、104~119和125~160氨基酸残基区域内或其附近。利用该项预测结果,确定UL23基因编码蛋白的B细胞表位后,将为下一步制备相应抗体并进行人巨细胞病毒UL23基因基础研究工作提供重要的依据。
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