微生物限度测定论文（精选9篇）
微生物限度测定论文 第1篇
1 仪器与材料
1.1 仪器
SPX-150BS-Ⅱ型生化培养箱(新苗医疗器械制造有限公司);LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌器(申安医疗器械厂);800型离心机(常州国华电器有限公司);MSL(STV)集菌仪(新华检测仪器厂)。
1.2 供试品
阿奇霉素胶囊:批号:080601、080602、080603(河北赛克药业)。
1.3 菌种
大肠埃希菌[CMCC(B) 44102];金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26003];枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63501];白色念球菌[CMCC(F) 98001];黑曲霉[CMCC(F) 98003]。
1.4 培养基
胆盐乳糖培养基,批号030915;改良马丁培养基,批号060503;改良马丁琼脂培养基,批号060409;营养琼脂培养基,批号050520;pH6.8无菌磷酸盐缓冲液;玫瑰红钠琼脂培养基,批号20040308。
以上菌种、培养基均来源于中国药品生物制品检定所。
2 方法与结果
2.1 试验菌株菌液制备
①取经35℃培养24h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌斜面培养物适量,加入到适量的0.9%的无菌氯化钠溶液中,与标准比浊液浊度相当,作为原液,取原液倍量稀释至细菌数约为50～100cfu·ml-1,备用。
②取经25℃培养48h的白色念球菌菌液培养物适量,加入到适量的0.9%氯化钠溶液中,与标准比浊液浊度相当,作为原液,取原液倍量稀释至酵母菌数约为50～100cfu·ml-1,备用。
③取经25℃培养7d的黑曲霉斜面培养物,加适量0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子,取出霉菌孢子悬液倍量稀释至酵母菌数约为50100cfu·mL-1,备用。
2.2 供试液制备
称取供试品10g,加入到pH6.8无菌磷酸盐缓冲液100ml中,制成1:10的供试液,备用。
2.3 菌落计数方法
2.3.1 常规法取1:
10的供试液10ml及50～100cfu试验菌,分别注入平皿中,立即倾注营养琼脂培养基及玫瑰红钠琼脂培养基,依法检验。回收率测定:①试验组:按上述菌落计数方法进行试验菌的菌落计数。②菌液组:测定每一株菌的试验菌数。③供试液对照组:取1:10的供试液1ml按菌落计数方法测定供试菌的本底菌数。44稀释剂对照组:取稀释剂1ml和50～100cfu试验菌,按试验组菌数测定方法测定其菌数。结果见表1。
稀释剂对照组回收率=(稀释剂对照组平均菌落数÷菌液组平均菌落数)×100%。
各菌株回收率=[(试验组平均菌落数一供试品对照组平均菌落数)÷菌液组平均菌落数]×100%。
2.3.2 离心沉淀薄膜过滤法取1:
10的供试液10ml,置灭菌10ml离心管中,以500转/分离心5min,将上清液倾入另一灭菌10ml离心管中,以3 000转/分离心20min,取其底部溶液2ml,加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液至10ml,取此溶液1ml加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液50ml,混匀并通过滤膜,以该溶液600ml分次冲洗滤膜,每次100ml,在最后一次冲洗液中加入50～100cfu试验菌菌液通过滤膜,取出滤膜,菌面朝上贴于营养琼脂及玫瑰红钠琼脂培养基上,置规定温度培养24～72h,观察结果,照“2.3.1”项下方法测定菌落数,结果见表2。
稀释剂对照组回收率=(稀释剂对照组平均菌落数÷菌液组平均菌落数)×100%。
各菌株回收率=[(试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)÷菌液组平均菌落数]×100%。
3 控制菌检查方法的验证
3.1 试验组
取1:10的供试液10ml,置灭菌10ml离心管中,以500转/分离心5min,将上清液倾入另一灭菌10ml离心管中,以3 000转/分离心20min,取其底部溶液2ml,加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液至10ml,取此溶液10ml加入到pH6.8无菌磷酸盐缓冲液50ml中,混匀并通过滤膜,以该溶液600ml分次冲洗滤膜,每次100ml,取出滤膜,加入50～100cfu大肠埃希菌的胆盐乳糖培养基中,依相应控制菌检查法进行检查。
3.2 阴性菌对照组
取1:10的供试液10ml,置灭菌10ml离心管中,以500转/分离心5min,将上清液倾入另一灭菌10ml离心管中,以3 000转/分离心20min,取其底部溶液2ml,加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液至10ml,取此溶液10ml加入到pH6.8无菌磷酸盐缓冲液50ml中,混匀并通过滤膜,以该溶液600ml分次冲洗滤膜,每次100ml,取出滤膜,加入50～100cfu金黄色葡萄球菌的胆盐乳糖培养基中,依相应控制菌检查法进行检查。结果见表3。
4 结果
4.1 常规法菌落计数及回收率测定结果
见表1。表1结果表明,采用常规法验证,在三次独立平行试验中,人工污染大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收率均低于70%,其余试验组及稀释剂组的回收率均高于70%,说明该药物对细菌的生长具有抗菌作用,常规法不能用于阿奇霉素胶囊的细菌检查。应采用消除供试液抑菌活性的方法重新验证。而该方法对白色念珠菌和黑曲霉菌的回收率均大于70%,用于可霉菌和酵母菌菌数检查。
4.2 离心沉淀薄膜过滤法菌落计数及回收率测定结果
见表2。表2结果表明,采用离心沉淀薄膜过滤法,在三次独立平行试验中,人工污染大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌及对照组的回收率均高于70%,可消除该药物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的抗菌作用,该方法可用于阿奇霉素胶囊细菌菌数的检查。
4.3 控制菌检查结果
见表3。表3结果表明,采用离心沉淀薄膜过滤法(500转/分离心5min后,再3 000转/分离心20min后,取1:10供试液10ml过滤,600ml冲洗)进行验证,阳性对照菌检出,阴性对照菌未检出。
5 讨论
微生物限度检查法是检查非规定灭菌制剂及其原、辅料受微生物污染程度的方法,检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查[3]。如果药品中含有抗菌或抑菌成分,在进行微生物限度检查时应消除或抑制其抗菌或抑菌成分的活性,使药品中被污染的微生物能正常生长而被检出,以保证检验结果的准确性和可靠性[4]。药典规定采用加菌回收试验,其微生物的回收率应大于70%。
研究结果显示,进行阿奇霉素胶囊微生物检查时,可采用离心沉淀薄膜过滤法测定细菌数;采用常规法测定霉菌和酵母菌数;用离心沉淀薄膜过滤法可控制菌(大肠埃希菌)的检查;该方法可有效去除阿奇霉素胶囊中的抑菌成分,检验结果准确、可靠。
参考文献
[1]钱文静,张玫.银翘解毒片污染微生物的回收率探讨[J].中国药品标准,2006;7(3):19-21
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典:二部[S].北京:化学工业出版社.2005:附录,79
[3]吴晓玲.头孢泊肟酯胶囊的微生物限度检查方法研究[J].中国药业,2008;17(4):40-41
微生物限度检查法标准操作规程 第2篇
一、目的：建立微生物限度检查的基本操作规程，为微生物检查人员提供正确的操作规程。
二、适用范围：适用于品管化验室的微生物限度检查。
三、职责：品管微生物检验员对本标准的实施负责。
四、正文： 定义：微生物限度检查法：系指非规定灭菌制剂及其原辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。2 实验用具：
电热恒温培养箱、电热恒温水温箱、试管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培养皿、试管架、注射器、针头、注射器盒、研钵、75%酒精棉球、紫外灯（365nm 波长）。3 培养基：
3.1 营养琼脂培养基、孟加拉红培养基、乳糖胆盐培养基、蛋白胨水培养基。
3.2 培养基的管理、配制应符合检定菌、培养基管理规程、培养基配制规程。试液：甲基红试液、a-奈酚乙醇试液、40%氢氧化钾溶液、靛基质试液。稀释剂：0.9%无菌氯化钠溶液。供试品溶液的制备：取供试品（供试品如为固体，置研钵中研磨成细粉）放入试管中，加入适量的稀释剂制成1：10 浓度的供试品溶液。对照用菌液：控制菌检查均应作相应已知菌的对照试验，对照菌株为大肠杆菌[CMCC（B）441022]。取相应菌株的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物1 白金耳，接种至营养肉汤培养基内，培养18-20 小时，稀释至1：106，对照菌的加入量为50-100 个。8 检查法：
8.1 除另有规定外，细菌的培养温度为30-35℃，霉菌的培养温度为25-28℃，控制菌的培养温度为35±1℃。8.2 细菌、霉菌计数：
8.2.1平皿菌落计数法取均匀供试液，进一步稀释成1：102、1：103 等适宜的稀释级。分别取连续三级10 倍稀释的供试液各1ml，置直径约90mm 的平皿中，再注入约45℃的培养基约15ml，混匀，等凝固后，倒置培养，每个稀释级应作2~3 个平皿。
营养琼脂培养基用于细菌计数，玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌计数。8.2.2 菌数测定阴性对照试验取供试验用的稀释剂各1ml，置4 个无菌平皿中，分别按细菌、霉菌计数用的培养基制备平板，培养，检查，不得长菌。
8.2.3 细菌培养时间为48 小时，分别在24 小时及48 小时点计菌落数，一般以48 小时菌落数为准，霉菌培养时间为72 小时，分别在48 小时及72 小时点计菌落数，一般以72 小时菌落数为准。菌落如蔓延生长成片，不宜计数。
8.2.4 点计后，计算各稀释级的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。
8.2.5 菌数报告规则：细菌宜选取平均菌落数在30-300 之间的稀释级，霉菌宜选取平均菌落数在30-100 之间的稀释级，作为报告菌数计算的依据。如只有1 个稀释级菌落数在30-300（30-100）
之间时，将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告，如同时有两个稀释级在30-300（30-100）之间时，按下式计算两级比值。比值=低稀释级平均菌落数稀释倍数
高稀释级平均菌落数稀释倍数
.当比值≤2 时，以两稀释级的均值报告，当比值＞2 时以低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告，如同时有3 个稀释级的平均菌落数均在30-300（30-100）之间时，以后两个稀释级计算级间比值，如各稀释级的平均菌落数均不在30-300（30-100）之间，以最接近30 或300 的稀释级平均菌数乘以稀释倍数报告，如各稀释级平均菌落数均在300（100）以上，按最高稀释级菌落数乘以稀释倍数报告，如各稀释级平均菌落数均小于30 时，一般按最低稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告，如当1：10（1： 100）稀释级平均菌落数等于或大于原液（或1：10）时，应以培养基稀释法测定，按测定结果报告菌数。8.2.6 培养基稀释法：取供试液（原液或1：10 供试液）3 份，每份各1ml，分别注入5 个平皿内（每皿各0.2ml）每个平皿中倾注营养琼脂培养基约15ml，混匀，凝固后倒置培养，计数，每1ml 注入的5 个平板点计的菌落数之和即为每1ml 的菌落数，共得3 组数据，以3 份供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。
如各稀释级平板均无菌落生长，或仅最低稀释级平均菌落数小于1 时，则报告菌数为小于10 个。
8.3 控制菌检查除另有规定外，取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、cm2），直接或处理后接种，经增菌、分离培养后，进行革兰氏染色、生化试验等项检查。8.3.1 大肠菌群：
8.3.1.1 检样稀释及培养
① 以无菌操作，将检样25g（ml）放于含有225ml 灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠），经充分振摇或研磨做成1：10 的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好在均质器中以8000—10000r/min 的速度处理1min，作成1：10 的均匀稀释液。
② 用1ml 灭菌吸管吸取1：10 稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml 灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖不要接触管内稀释液），混合均匀，做成1：100 的稀释液。
③ 另取1ml 灭菌吸管，按上述操作顺序，做10 倍递增稀释液。如此每次递增稀释一次，即换用一支1ml 灭菌吸管。
④ 根据食品卫生标准要求或标本污染情况的估计，选择3 个合适的稀释度，每个稀释度接种三管。8.3.1.2 乳糖发酵试验
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1ml 以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1ml 及1ml 以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种三管，置36±1℃温箱内，培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。8.3.1.3 分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃温箱内，培养18~24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。
8.3.1.4 证实试验
在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1~2 个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±1℃温箱内，培养24±2h，观察产气情况。凡乳糖管产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。
8.3.1.5 报告：根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN 检索表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN 值。9 结果判断：
9.1 细菌菌落数、霉菌菌落数、控制菌三项均符合该品种微生物限度项下的规定，应判为供试品符合规定；其中任何一项不符合该品种项下规定，应判供试品不符合规定。
9.2 细菌菌落数、霉菌菌落数第一次测定超过该品种项下微生物限度规定时，应从同一批号样品中随机抽样，复试两次，以三次结果平均值报告。
微生物限度测定论文 第3篇
【摘 要】 目的：建立乙肝解毒胶囊的微生物限度检查方法。方法：采用2010年版《中国药典》规定的平皿法、培养基稀释法，验证确认所采用的方法是否适合该药品的微生物限度检查。结果：细菌数测定采用培养基稀释法；霉菌及酵母菌数测定采用平皿法；控制菌采用培养基稀释法。5种试验菌的回收率均高于70%。结论：该方法可用于乙肝解毒胶囊的微生物限度限度检查。
【关键词】 乙肝解毒胶囊；微生物限度限度检查；方法学验证
【中图分类号】R286.0 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）11-0010-02
Abstract：Objective To establish a method for the microbial limit test of Yiganjiedu Capsule. Methods The routine method and the dilution method regulated by the Chinese Pharmacopoeia （2010 edition） were adopted. Whether the adopted methods suiting for the microbial limit test of Yiganjiedu Capsule was affirmed by the validation. Results The total bacterial count was performed by a dopting medium dilution method and the total molds and yeasts count adopted the conventional plate -count method. The recovery rates of 5 kinds of test organisms were above 70%. Conclusion This method can be used for the microbial limit test of Yiganjiedu Capsule.
Keywords：Yiganjiedu Capsule；Microbial Limit Test； Methodological Validation
乙肝解毒膠囊是治疗乙肝的中成药，其执行标准为WS3-B-0002-89[1]。该药主要成份为黄柏、草河车、黄芩、大黄等8味中药，成品中含两种药材原粉。按照《中国药典》2010年版一部附录XⅢC微生物限度检查法[2]的要求，该药应进行细菌数、霉菌和酵母菌数、大肠埃希菌、大肠菌群测定，研究对该药的微生物限度具体检查方法进行了验证。
1 仪器与材料
1.1 仪器 高压灭菌锅；LRH-250生化培养箱；PYX-DHS电热恒温培养箱。
1.2 材料 乙肝解毒胶囊（规格：每粒装0.25g，批号：141202、150401、150902，健民集团叶开泰国药（随州）有限公司）。培养基：营养肉汤培养基，营养琼脂培养基，改良马丁琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基，4-甲基伞形酮葡萄苷酸培养基（MUG），pH7.0无氧氯化钠-蛋白胨缓冲液。
1.3 菌株 大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]；白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]；黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]。
2 方法与结果
2.1 菌液制备 取经35℃培养24h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌的肉汤新鲜培养物1ml，加入到9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-6～10-7约为50～100cfu/ml的菌悬液备用。
取经25℃培养24h的白色念珠菌改良马丁液体培养物1ml，加入到9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5约为50～100cfu/ml菌悬液备用。
取经25℃培养一周的黑曲霉斜面培养物，加0.9%无菌氯化钠溶液10ml，将孢子洗脱，然后吸出孢子液，用垫有脱脂棉的漏斗（湿热灭菌）过滤，除去菌丝，收集孢子悬液至另一无菌试管内作为菌原液取此菌原液0.1ml加入到9.9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，稀释至10-5每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液备用。
2.2 菌液计数 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌分别划线接种至营养琼脂培养基，置35℃培养2d；白色念珠菌、黑曲霉菌液分别划线接种至改良马丁琼脂培养基，置25℃培养3d。
2.3 供试液制备 取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，45℃水浴振摇助溶，制成1：10的供试液。
2.4 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证试验：
2.4.1 平皿法（1ml/皿）
2.4.1.1 试验组 取1∶10的供试液1ml和试验菌液1ml，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，分别制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。
2.4.1.2 菌液组 平皿法测定所加的试验菌数。
2.4.1.3 供试品对照组 取1∶10的供试液1ml，测定供试品本底菌数。
2.4.2 培养基稀释法
2.4.2.1 试验组 取1∶10的供试液0.2ml和试验菌液1ml，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，分别制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。
2.4.2.2 菌液组 测定所加試验菌数。
2.4.2.3 供试对照组 取1∶10的供试液0.2ml，测定供试品本底菌数。结果见表1。
由表1可知，采用培养基稀释法做验证试验，大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌人工染菌回收率达到70%以上；采用平皿法做验证试验，白色念珠菌、黑曲霉人工染菌回收率达到70%以上；采用以上方法，金黄色葡萄球菌人工染菌回收率低于70%。金黄色葡萄球菌验证，需改用离心沉淀取上层液进行试验。
2.5 金黄色葡萄球菌计数方法的验证试验（离心沉淀上层液）
2.5.1 试验组 取1∶10的供试液置尖底离心管，500转/分，离心5min，取上层液0.2ml和试验菌液1ml，分别注入平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，分别制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。
2.5.2 菌液组 平皿法测定所加的试验菌数。
2.5.3 供试品对照组 取上层液0.2ml，测定供试品本底菌数。结果见表2。
由表2可知，取离心沉淀上层液（0.2ml/皿）采用培养基稀释法做验证试验，可消除供试品对金黄色葡萄球菌的抑菌作用，回收率均达到了70%以上，取离心沉淀上层液（1ml/皿），采用平皿法做验证试验，人工染菌回收率为0。稀释剂对照组回收率达到了70%以上。
2.6 控制菌检查方法的验证
2.6.1 大肠埃希菌的验证（培养基稀释法）
2.6.1.1 试验组 取1∶[KG-*2]10的供试液10ml及大肠埃希菌液1ml，加入到200ml的胆盐乳糖增菌培养基中，35℃培养48h。取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内，35℃培养24h，在366nm在外灯下观察呈现荧光，同时用未接种供试品的MUG培养基做本底对照。结果试验管MUG阳性，靛基质试验阴性，本底对照管为阴性。
2.6.1.2 阴性菌对照组 除加金黄色葡萄球菌液1ml外，其它操作同实验组，结果金黄色葡萄球菌未检出，试验管MUG阴性，靛基质试验阴性，本底对照管为阴性。
2.6.2 大肠菌群的验证（常规法）
2.6.2.1 试验组 取10ml的胆盐乳糖发酵培养基管3支，分别加入1∶[KG-*2]10、1∶[KG-*2]100、1∶[KG-*2]1000的供试液1ml及大肠埃希菌液1ml，另取一支加入稀释剂1ml作为阴性对照，35℃培养24h后观察。供试液管产酸产气，分别划线接种曙红亚甲蓝琼脂平板，35℃培养24h，均可见典型菌落生长。
2.6.2.2 阴性菌对照组 取10ml的胆盐乳糖发酵培养管3支，分别加入1∶[KG-*2]10、1∶[KG-*2]100、1∶[KG-*2]1000的供试液1ml及加金黄色葡萄球菌液1ml，其它操作同大肠菌群试验组，各管未产酸产气，接种曙红亚甲蓝琼脂平板，35℃培养24h，无菌落生长。
3 结论
根据验证试验结果，乙肝解毒胶囊按照中国药典2010年版一部微生物限度检查法（附录XⅢC）检验，细菌数测定取离心沉淀上层液（0.2ml/皿）采用培养基稀释法进行试验，霉菌及酵母菌数测定采用平皿法进行检验，控制菌检查按培养基稀释法进行检验。
参考文献
[1]中华人民共和国药典委员会.卫生部药品标准中药成方制剂（第一册）[M].北京：人民卫生出版社，1989：1.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010：附录79-88.
粉刺合剂微生物限度检查方法的建立 第4篇
1 仪器与材料
CJ-820标准型净化工作台 (苏州吴净空调净化设备厂) ;Bs-600L电子天平 (上海友声衡器有限公司) ;MJ-160B霉菌培养箱 (上海跃进医疗器械厂) ;PYX-DHS细菌培养箱 (上海市医疗器械一厂) ; Heal Force-900c生物安全柜 (上海力申科学仪器有限公司) ;ZF-Ⅰ型三用紫外分析仪 (上海顾村电光仪器厂) 。试验菌种:大肠埃希菌 (Escherichia coli) [CMCC (B) 44102]、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus) [CMCC (B) 26003]、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) [CMCC (B) 63501]、白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC (F) 98001]、黑曲霉 (Aspergillus niger) [CMCC (F) 98003], 由中国药品生物制品检定所提供。
胆盐乳糖培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、改良马丁液体培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基、MUG培养基、改良马丁琼脂培养基, 由中国药品生物制品检定所提供。
2 方法[4]
2.1 菌液制备
2.1.1 取经35℃培养18～24h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜营养肉汤培养物1ml, 用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5～10-7, 约为50～100cfu·ml-1, 做活菌计数备用。
2.1.2 取经25℃培养24～48h的白色念珠菌改良马丁液体培养物1ml, 用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5～10-6, 约为50～100cfu·ml-1, 做活菌计数备用。
2.1.3 取经25℃培养1周的黑曲霉改良马丁斜面培养物, 加0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-4, 约为50～100cfu·ml-1, 做活菌计数备用。
2.2 供试液制备
取供试品10ml加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90ml, 摇匀, 作为1∶10供试液备用。
2.3 细菌、霉菌和酵母菌计数方法 (平皿法) 的验证
2.3.1 试验组。
取1∶10供试液1ml和上述制备好的阳性对照菌液1ml置平皿中, 加入营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基 (白色念珠菌用改良马丁琼脂培养基) , 混合均匀, 放置凝固后, 置规定的温度培养至规定的时间, 逐日观察结果, 做菌落计数。
2.3.2 菌液组。
分别取实验菌lml注入平皿中, 立即加入琼脂培养基, 每种实验菌平行制备2个平皿, 待凝固后, 置规定的温度培养至规定的时间, 逐日观察结果, 做菌落计数。
2.3.3 供试品对照组。
取“2.2”项下1∶10供试液lml置平皿中, 立即倾注琼脂培养基, 待凝固后, 置规定的温度培养至规定的时间, 逐日观察结果, 测定供试品本底菌数。
2.3.4 稀释剂对照组。
取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml置平皿中, 加入营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基 (白色念珠菌用改良马丁琼脂培养基) , 混合均匀, 放置凝固后, 置规定的温度培养至规定的时间, 逐日观察结果。
2.3.5 回收率的计算。
试验组的加菌回收率 (%) = (试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数) / 菌液组平均菌落数×100%;稀释对照组的加菌回收率 (%) =稀释对照组的平均菌落数/菌液组平均菌落数×100%。结果见表1、2。
2.4 培养基稀释法
取1∶10供试液2ml, 每毫升供试液等量分注5个平皿, 每10个平皿为1组, 即按培养基0.2ml稀释法进行微生物限度检查方法验证。取上述制备好的金黄色葡萄球菌阳性对照菌液1ml, 分组注入平皿中, 倾注琼脂培养基, 混匀, 凝固后, 倒置培养。计算回收率。经实验证明, 采用培养基0.2ml稀释法, 金黄色葡萄球菌的回收率均>70%, 故细菌可采用培养基稀释法进行微生物限度检查。结果见表3。
2.5 控制菌检查方法的验证
2.5.1 供试液的制备。
同“2.2”项下1∶10供试液的制备。
2.5.2 试验组。
取1∶10供试液10ml, 加入上述大肠埃希菌液50～100cfu, 置100ml胆盐乳糖培养基中, 35～37℃培养24h。取上述培养物0.2ml, 接种至含5ml MUG培养基的试管中培养, 于5h、24h在366nm紫外线下观察有荧光反应。沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液, 液面呈玫瑰红色。
2.5.3 阴性菌对照组。
取1∶10供试液10ml, 加入上述金黄色葡萄球菌50～100cfu, 置100ml胆盐乳糖培养基中, 35～37℃培养24h。取上述培养物0.2ml, 接种至含MUG培养基的试管中培养, 于5h、24h在366nm紫外线下观察无荧光反应。沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液, 液面呈试剂本色。结果见表4。
上述验证结果表明, 试验组检出了大肠埃希菌而阴性菌对照组未检出金黄色葡萄球菌。说明可采用常规法对本品进行控制菌 (大肠埃希菌) 检查。
2.6 结果
根据以上实验得出该品种微生物限度检查方法为:取供试品10g加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90ml, 摇匀, 作为1∶10供试液。采用培养基稀释法 (0.2ml/皿) 进行细菌限度检查, 采用常规法进行霉菌及酵母菌限度检查;控制菌 (大肠埃希菌) 检查亦采用常规法。
3 讨论
方法验证所用菌株选择的原则:选择代表性、普遍性低或非致病性的标准菌株。菌种的要求:传代不得超过5代, 采用适宜的方法保存, 应防止变异。菌液浓度也是影响方法验证的一个重要因素, 因此笔者将菌液浓度控制50～100cfu之间。
参考文献
[1]周志敏, 刘涛.5种含丹参中成药微生物限度检查方法验证 (J) .中国药业, 2010, 19 (23) :27-28.
[2]赵建英, 李爱玲, 陆蓓.含黄芩中成药微生物限度检查方法的验证 (J) .中国药业, 2004, 13 (11) :44-45.
[3]颜栋林, 李萍, 兰茜.冠心丹参片微生物限度检查法方法验证 (J) .医药导报, 2010, 29 (8) :1080-1081.
育宫丸微生物限度检查方法探讨 第5篇
1 药物及试剂
供试品:育宫丸 (批号20100118, 20100325, 20100826) , 由邢台市中医院生产。菌株枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉均来源于中国药品生物制品检定所。
2 方 法
采用常规法和培养基稀释法。
2.1 菌液制备[1]
(1) 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基, 培养24h, 取1ml加无菌氯化钠溶液9ml, 10倍逐级稀释至10-5, 细菌数为50～100cfu/ml, 做活菌计数备用; (2) 接种白色念珠菌新鲜培养物至改良马丁培养基, 培养48h, 取1ml加无菌氯化钠溶液9ml, 10倍逐级稀释至10-5, 细菌数为50～100cfu/ml, 做活菌计数备用; (3) 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基, 培养1周, 加盐水5ml洗下霉菌孢子, 吸取出菌液, 用标准比浊管比浊, 然后取1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml, 10倍逐级稀释至10-4, 孢子数为50～100cfu/ml, 做活菌计数备用。
2.2 供试品制备
取供试品10g, 加pH 7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液至100ml, 匀浆机研匀, 作为1∶10供试液。再取1ml上述供试品用pH 7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液逐级稀释制成1∶100、1∶1000的溶液。
2.3 菌回收率测定
2.3.1 实验组:
供试液1ml与50～100cfu验证用菌株加入平皿中, 立即倾注琼脂培养基约15ml, 混匀, 培养、计数。
2.3.2 菌液组:
测定所加验证菌株的菌数, 即50～100cfu验证用菌株加入平皿中, 立即倾注琼脂培养基约15ml, 混匀, 培养、计数。
2.3.3 供试液对照组:
取规定量的供试液加入平皿中, 立即倾注琼脂培养基约15ml, 混匀, 培养、计数。
2.3.4 稀释剂对照组:
取pH 7.0的无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液1ml替代供试液, 加入上述已稀释的阳性菌液1ml, 立即加入营养琼脂培养基约15ml, 混匀。每实验菌平行制备2个平皿。
2.3.5 结果判断:
稀释剂对照组菌回收率≥70%, 实验组菌回收率≥70%。菌回收率 (%) = (实验组平均菌落数-供试液对照组平均菌落数) /菌液组的平均菌落数×100%。 稀释剂对照组的菌回收率 (%) =稀释剂对照组的平均菌落数/菌液组的平均菌落数×100%。
2.4 细菌、霉菌和酵母菌计数方法验证
2.4.1 常规法:
将“2.3”项中各供试液1ml加约15ml琼脂培养基注皿, 混匀凝固后, 倒置, 细菌置30～35℃培养24～48h, 霉菌置23～28℃培养48～72h;计数, 测定菌回收率。见表1。
注:供试液对照组菌数为0
表1结果表明:人工污染5株代表菌株, 育宫丸供试液对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌有一定的抑菌性;对大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉无抑菌性。说明细菌计数不能采用常规法, 霉菌及酵母菌计数可采用常规法。
2.4.2 培养基稀释法:
将“2.3”项中各供试液1ml按0.1ml/皿加样至10个平皿, 再分别加约15ml琼脂培养基, 相应温度培养计数, 测定菌回收率。见表2。
表2结果表明:采用培养基稀释法 (0.1ml/皿) 可消除供试液对人工污染金黄色葡萄球菌、枯草杆菌的抑菌作用, 回收率超过70%, 因此培养基稀释法 (0.1ml/皿) 可用于细菌计数。
2.5 控制菌检查方法验证
2.5.1 试验组:取“2.2”项供试液10ml置100ml胆盐乳糖培
养基中, 同时加入1ml稀释至适宜浓度的大肠埃希菌菌液。
2.5.2 阴性菌对照组:
取“2.2”项供试液10ml置100ml胆盐乳糖培养基中, 加入1ml稀释至适宜浓度的金黄色葡萄球菌菌液。按方法[1] (常规法) 进行实验。实验结果见表3～5。
注:供试液对照组菌数为0
从表3～5结果可看出育宫丸控制菌检查 (大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌) 实验组均呈阳性, 阴性菌对照组呈阴性。实验组呈阳性表明各试验菌能够正常生长;阴性菌对照组呈阴性表明各试验菌对其相应的增菌液具有专属性。本品可采用常规法进行控制菌检查。
3 讨 论
育宫丸主要组成成分为当归、白芍、川芎、淫羊藿、丹参、香附、甘草等, 都有弱抑菌作用, 该样品对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有抑菌作用, 其加菌回收率<70%, 低于规定的70%的要求。而培养基稀释法可稀释药品中的抑菌成分, 从而消除其对细菌和霉菌生长的影响。故结合该样品的物理特性和常规法实验结果, 采用培养基稀释法进行实验后, 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的加菌回收率可>70%。结果细菌数检查可采用培养基稀释法, 霉菌及酵母菌数的检查采用常规法。
由控制菌检查方法的验证实验结果表明, 采用常规法实验时, 该样品对大肠埃希菌、大肠菌群的检查无干扰, 故育宫丸的控制菌检查可采用常规法。
参考文献
牛黄上清片微生物限度检查方法验证 第6篇
1 试验材料
1.1 材料
仪器:净化工作台、恒温培养箱(30℃～35℃)、生化培养箱(25℃～28℃)、电热干燥箱(250℃～350℃)、高压蒸汽灭菌器。样品:牛黄上清片( 批号: 20100301,20100513,20100815,均为市售品)。菌种:枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、黑曲霉[CMCC(F)98003],中国药品生物制品检定所。培养基:改良马丁琼脂培养基,玫瑰红钠琼脂培养基, 营养琼脂培养基,胆盐乳糖培养基,4-甲基伞形酮葡糖苷培养基。稀释液:pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。
1.2 方法[1]
1.2.1 供试液制备
取供试品10 g,研细,加稀释液至100 ml,使均匀分散,制成 1 ∶ 10供试液,备用。
1.2.2 菌液制备
大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌及黑曲霉菌液均按《中国药典》2010年版二部方法制备,浓度为50～100 cfu/ml。
1.2.3 试验方法
1.2.3.1 试验组
取1 ∶ 10的供试液各1 ml,分别等量注入5个平皿中(每个0.2 ml),加入50～100 cfu试验菌,立即倾注45℃溶化的相应琼脂培养基15～20 ml,摇匀,凝固后,将平板倒置,于规定温度培养至规定的时间,按《中国药典》2010年版菌落计数方法计数。
1.2.3.2 菌液组
测定所加的试验菌数。除不加供试液外,操作同试验组。
1.2.3.3 供试品对照组
测定供试品本底菌数。除不加菌液外,操作同试验组。
1.2.3.4 稀释液对照组
考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。取稀释液 1 ml替代供试品,其余同试验组。
1.2.3.5 菌回收率计算
稀释剂对照组的菌回收率(%) =(稀释剂对照组平均菌落数/菌液组平均菌落数)×100%;试验组的菌回收率(%) =[(试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数]×100%。
1.2.3.6 结果判断
试验组和稀释剂对照组的菌回收率均应不低于70%。
2 试验结果
经试验验证,各试验菌株及稀释剂对照组菌回收率>70%,符合规定。结果见表1。
2.1 控制菌检查方法的验证
2.1.1 大肠埃希菌
试验组:取1∶10的供试液10 ml,加到胆盐乳糖培养基100 ml中,作为供试品管。同法重复1份,加入大肠埃希菌10～100 cfu作为阳性对照管。另取与供试液等量的稀释剂加到胆盐乳糖培养基100 ml中作阴性对照管。30 ℃～35 ℃培养18 h～24 h,取上述增菌液0.2 ml,加入5 ml的4-甲基伞形酮葡糖苷培养基(MUG)试管中,置30 ℃～35 ℃培养5 h～24 h,观察荧光,再加入靛基质试剂观察结果。
2.1.2 大肠菌群
试验组:取10 ml的胆盐乳糖发酵培养基管3支,分别加入1 ∶ 10的供试液1 ml、1 ∶ 100的供试液1 ml、1 ∶ 1 000的供试液1 ml,作为供试品管。同法重复1份,加入大肠埃希菌10～100 cfu作阳性对照管。另取与供试液等量的稀释剂加到10 ml的胆盐乳糖发酵培养基管中作阴性对照管。30 ℃～35 ℃培养18～24 h,观察结果。
2.1.3 结果
控制菌检查阳性菌生长良好,阴性对照均未检出。说明本法具有专属性,符合验证规定。
3 讨论
由于牛黄上清片中所含大黄、黄芩、黄连、黄柏等成分对细菌有抑制作用,用常规法测定其微生物限度无法确保结果的准确性。我们采用培养基稀释法检查细菌、霉菌和酵母菌并进行了方法学验证,结果回收率均>70%。按照常规法进行控制菌的方法学验证试验及检查,结果阳性菌生长良好,说明本品对大肠埃希菌、大肠菌群没有抑菌作用,可以用常规法检查。
参考文献
头孢丙烯片微生物限度方法的验证 第7篇
1.1 仪器:HTY-2000A薄膜过滤器, 杭州泰林科技有限公司
1.2 试剂:氯化钠 (分析纯) , 上海化学试剂厂吐温80 (分析纯) , 上海化学试剂厂。
1.3 稀释剂及培养基:
营养琼脂培养基 (080303) 玫瑰红钠琼脂培养基 (080707) 胆盐乳糖培养基 (0805282) 营养肉汤培养 (070110) 改良马丁培养基 (080122) MUG培养基 (071010) PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 (0712202)
以上培养基均由中国药品生物制品检定所提供
1.4 试验用菌株名称及其编号 (见表1)
2 试验方法
2.1 菌液制备及供试液的制备
2.1.1 菌液制备。
取经34.1℃培养24小时的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌营养肉汤培养物1ml分别加入9ml0.9%的氯化钠溶液中, 10倍依次稀释, 金黄色葡萄球菌至10-6, 大肠埃希菌至10-7, 枯草芽孢杆菌至10-5, 约为50～100cfu/ml, 备用。取经26℃培养24小时的白色念珠菌液体培养物1ml, 加入9ml0.9%的无菌氯化钠溶液中, 10倍稀释至10-5, 约为50～100cfu/ml, 备用。取经培养6天的黑曲霉斜面培养物, 加入3ml0.9%的氯化钠溶液, 洗下孢子, 转移至另一试管, 取
1ml加入9ml0.9%的氯化钠溶液中, 10倍稀释至10-4, 约为50～100cfu/ml, 备用。
2.1.2 供试液的制备。
取本品10g, 溶于100ml无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中, 混匀, 制成1:10供试液。
2.2 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证过程
2.2.1 试验组:
吸取1:10供试液 (批号:080804) 20ml (10ml/管) ) 于无菌条件下离心, 500转/分、离心5分钟弃沉淀, 取上清液于另2个无菌离心管中, 3000转/分、离心20分钟弃去上清液, 留底部集菌液约2ml, 加稀释剂至10ml, 混匀, 加适量冲洗液于无菌滤器中以湿润滤膜。分别取1ml上述供试液于无菌滤器中过滤, 用冲洗液冲洗, 每个筒的总冲洗量为400ml。最后一次冲洗液中分别加入已制备好的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌悬液各1ml, 取出滤膜, 菌面朝上, 分别贴于营养琼脂平板上, 30～35℃培养48小时。
2.2.2 霉菌及酵母菌计数采用平皿法。
取1:10供试液1ml, 加入到无菌平皿中, 分别加入已制备好白色念珠菌和黑曲霉菌菌液各1ml, 立即倾注温度不超过45℃溶化的玫瑰红钠琼脂培养基15～20ml, 23～28℃培养72小时。
2.2.3 菌液组:
加适量冲洗液于无菌滤器中以湿润滤膜, 分别加入已制备好的金黄色葡萄球菌菌液、大肠埃希菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液各1ml, 用适量冲洗液冲洗滤膜, 取出滤膜, 菌面朝上, 贴于营养琼脂培养基平板上, 30～35℃培养48小时。
吸取白色念珠菌和黑曲霉菌菌液各1ml于无菌平皿上, 立即倾注温度不超过45℃溶化的玫瑰红钠琼脂培养基15～20ml, 23～28℃培养72小时。
2.2.4 供试品对照组。
细菌对照组:取1:10供试液10ml于无菌离心管中, 方法同试验组, 不加菌悬液。霉菌及酵母菌对照组:取110的供试液各1ml于无菌平皿上, 立即倾注温度不超过45℃溶化的玫瑰红钠琼脂培养基15～20ml, 23～28℃培养72小时。
2.2.5 稀释液对照组:
用稀释液代替供试液, 方法同试验组。
2.3 控制菌检查方法的验证
大肠埃希菌。试验组:吸取1:10供试液20ml (每筒10ml) 于无菌条件下离心, 500转/分、离心5分钟, 弃沉淀, 取上清液于另两个无菌离心管中, 3000转/分、离心20分钟弃去上清液气, 留底部集菌液约2ml, 加稀释剂至10ml, 混匀。加适量冲洗液于无菌滤器中以湿润滤膜。取上述供试液10ml溶于100ml稀释液中, 摇匀, 无菌操作加入到滤膜过滤器中过滤。用稀释液冲洗滤膜, 总冲洗量为300ml。在最后一次冲洗时, 加入已制备好的大肠埃希菌菌液1ml, 取出滤膜, 置于100ml胆盐乳糖培养基中, 于35～37℃培养24小时。阴性对照组:方法同试验组, 用1ml稀释好的金黄色葡萄球菌菌液代替大肠埃希菌菌液, 即得。
3 结果
从表2、表3中可以看出, 3次独立的平行试验中。所有验证用微生物均能在产品试验组中生长良好, 并且稀释剂对照组的菌回收率 (稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分数) 和试验组的菌回收率 (试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分数) 均不低于80%。由此说明头孢丙烯片就按眼标准操作规程的微生物限度检查不存在抑制微生物生长的因素。因此, 可按照此检验方法和检查条件进行头孢丙烯片的微生物限度检查。
4 结论
头孢丙烯片为第二代头孢菌素类药物, 具有广谱抗菌作用。其微生物限度检查采用薄膜过滤法, 以PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液为冲洗液, 冲洗量400ml, 即可消除样品对各菌株的抗菌活性, 此检验方法, 作为含抑菌成分要去的检验方法。
参考文献
[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典[S].2010年版, 北京:化学工业出版社, 2010.
[2]马绪荣, 苏德模.药品微生物学检验手册[M].北京:科学出版社, 2000:89-90.
微生物限度测定论文 第8篇
1 材料
1.1 样品
海金护卫散,规格5g(批号:080305,080306,080307,本院自制)。
1.2 实验菌株
金黄色葡萄球菌[CMCC (B) 26003]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63501]、白色念珠菌[CMCC (F) 98001]、黑曲霉[CMCC (F) 98003],均购于中国生物制品检定所。
1.3 培养基
营养肉汤培养基(070518)购于中国药品生物制品检定所,改良马丁培养基(060830)、营养琼脂培养基(080227)、沙门、志贺菌属琼脂培养基(060208)、胆盐乳糖培养基(070515)、玫瑰红钠琼脂培养基(070604)均购于北京三药科技开发公司,曙红亚甲蓝琼脂培养基(051223)购于北京陆桥技术有限责任公司,琼脂粉(860910)购于中国医药公司北京采购供应站,MUG培养基(20060606)购于北京奥博星生物技术有限责任公司;胆盐乳糖发酵培养基、靛基质试液、改良马丁琼脂培养基均为自制。
1.4 稀释剂
pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(070912)购于北京三药科技开发公司
1.5 仪器
电热恒温干燥箱(上海沪南科学仪器厂);LRH-250A生化培养箱(广东医疗器械厂);LRH-250生化培养箱(上海一恒科技有限公司);XG1-DI型手控小型灭菌器(山东新华医疗机械厂);UV-1三用紫外灯(上海顾村电光仪器厂);AEL-200天平(湘仪天平仪器设备有限公司);WHCD-净化工作台(北京五环空调净化工程公);JLQ-S1菌落计数器(无锡县金城仪器厂)。
2 方法
2.1 菌液制备
(1)分别取经35℃培养18～24小时的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌营养肉汤培养物1ml加9ml0.9%无菌氯化钠溶液,10倍稀释至10-5～10-7,菌数约为50～100cfu/ml,做计数备用。
(2)取经25℃培养24～48小时的白色念珠菌霉菌改良马丁培养物1ml加9ml0.9%无菌氯化钠溶液,10倍稀释至10-5,菌数约为50～100cfu/ml,做计数备用。
(3)取经25℃培养1周的黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养物,加3～5ml0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子,吸取出菌液,用标准比浊管比浊,取比浊后的菌液1ml加9ml0.9%无菌氯化钠溶液,10倍稀释至10-4,菌数约为50～100cfu/ml,做计数备用。
2.2 供试液制备
取样品5g,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,混匀,制成1:20供试液,备用。
2.3 回收率测定
2.3.1 常规法测定
(1)菌液组
取50～100cfu/ml的试验菌1ml加入平皿中,立即倾注不超过45℃的琼脂培养基20ml,待凝固后,置规定温度培养24～72小时观察结果。测定每一菌株的试验菌数,
(2)试验组
取1:20供试液、50～100cfu/ml的试验菌各1ml分别加入平皿中,立即倾注不超过45℃的琼脂培养基20ml,待凝固后,置规定温度培养24～72小时观察结果。
(3)供试品对照组
取1:20供试液1ml加入平皿中,立即倾注不超过45℃的琼脂培养基20 ml,待凝固后,置规定温度培养24～72小时观察结果。测定供试品本底菌数
2.3.2 按培养基稀释法(0.5ml/皿)测定
(1)菌液组
取50～100cfu/ml的试验菌1ml加入1个平皿中,每个平皿立即倾注不超过45℃的营养琼脂培养基20ml,待凝固后,置规定温度培养24～48小时逐日观察结果。测定每一菌株的试验菌数。
(2)试验组:
取1:20供试液0.5ml、50～100cfu/ml的试验菌1ml依次加入平皿中,立即倾注不超过45℃的营养琼脂培养基20ml,每株菌平行制备4个平皿,待凝固后,置规定温度培养24～48小时逐日观察结果。
(3)供试品对照组:
取1:20供试液2ml平均加入4个平皿中,每个平皿立即倾注不超过45℃的营养琼脂培养基20ml,待凝固后,置规定温度培养24～72小时观察结果。测定供试品本底菌数
2.4 控制菌(大肠埃希菌、沙门氏菌、大肠菌群)检查方法的验证
本品为含药材原粉及动物组织的口服制剂,因此须测定大肠埃希菌、大肠菌群及沙门菌。
2.4.1 大肠埃希菌
(1)试验组:取1:20供试液10ml、10～100cfu/ml的大肠埃希菌1ml分别加入100ml胆盐乳糖培养基中,置规定温度培养18～24小时。依照大肠埃希菌的检查方法检查。
(2)阴性对照组:采用金黄色葡萄球菌为阴性对照菌,检查方法同试验组。
(3)供试品组:取稀释液10ml,检查方法同试验组。
2.4.2 沙门菌
(1)试验组:取海金护卫散10g以及50～100cfu/ml的沙门菌1ml直接接种于200ml的营养肉汤培养基中,搅拌混匀,置规定温度培养18～24小时。取上述培养物1ml接种于10ml四硫磺酸钠亮绿培养基中,置规定温度培养18～24小时后,分别划线接种于沙门、志贺菌属琼脂培养基和曙红亚甲蓝琼脂培养基的平板上,置规定温度培养18～24小时。依照沙门菌的检查方法检查。
(2)阴性对照组:采用金黄色葡萄球菌为阴性对照菌,取海金护卫散10g以及50～100cfu/ml的金黄色葡萄球菌1ml直接接种于200ml的营养肉汤培养基中,搅拌混匀,置规定温度培养18～24小时。取上述培养物1ml接种于10ml四硫磺酸钠亮绿培养基中,置规定温度培养18～24小时后,分别划线接种于沙门、志贺菌属琼脂培养基和曙红亚甲蓝琼脂培养基的平板上,置规定温度培养18～24小时,检查方法同试验组。
(3)供试品组:取200ml的营养肉汤培养基中,搅拌混匀,置规定温度培养18～24小时。取上述培养物1ml接种于10ml四硫磺酸钠亮绿培养基中,置规定温度培养18～24小时后,分别划线接种于沙门、志贺菌属琼脂培养基和曙红亚甲蓝琼脂培养基的平板上,置规定温度培养18～24小时,检查方法同试验组。
2.4.3 大肠菌群
(1)试验组:取含10ml的胆盐乳糖发酵培养基管1支,加入1:20的供试液2ml以及10～100cfu/ml的大肠埃希菌1ml。置规定温度培养18～24小时。依照大肠菌群的检查方法检查。
(2)阴性对照组:采用金黄色葡萄球菌为阴性对照菌,检查方法同试验组。
(3)供试品组:取含10ml的胆盐乳糖发酵培养基管1支,加入1ml稀释液,作为对照,置规定温度培养18～24小时。检查方法同试验组。
3 结果
3.1 微生物限度检查回收率测定结果
常规法结果见表1,培养基稀释法结果见表2。
注:A:金黄色葡萄球菌;B:大肠埃希菌;C:枯草芽孢杆菌;D:白色念珠菌;a:供试品对照组;b:稀释剂对照组
从表1看出,用常规法试验时,对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉四种试验菌回收率均高于70%,仅对枯草芽孢杆菌回收率低于70%,说明对枯草芽孢杆菌有抑制作用,据此情况,采用培养基稀释法对枯草芽孢杆菌进行再试验。
注:A:金黄色葡萄球菌;B:大肠埃希菌;C:枯草芽孢杆菌;D:白色念珠菌;a:供试品对照组;b:稀释剂对照组
从表2结果看出,采用培养基稀释法(0.5ml)后去除了供试液对枯草芽孢杆菌的抑制作用,使回收率高于70%。
3.2 控制菌验证结果(见表3)
从表3结果看出,试验组检出说明本品在此条件下不抑菌,阴性菌未检出表明该控制菌检查方法的专属性好,可用于控制菌检查。
4 讨论
(1)本样品为药材原粉,吸湿性较强,不易溶解,所以我们加大了稀释倍数,制成1:20供试液。
(2)验证实验结果表明海金护卫散细菌计数采用培养基稀释法(0.5ml/皿),以枯草芽孢杆菌为阳性对照菌进行检验,霉菌及酵母菌计数可采用常规法检验;控制菌采用常规法检查时,阳性菌生长良好,说明该方法可用于控制菌检查。
参考文献
微生物限度测定论文 第9篇
1 仪器与材料
1.1 仪器 (见表1)
1.2 供试品
调元大补二十五味丸、沉香八味散、消食十味散、枫香脂十味散、白葡萄七味散、杜鹃十六味散、檀香清肺八味散、小儿清肺八味散等, 均来自新疆巴音郭楞蒙古自治州第二人民医院。
1.3 培养基、稀释剂及试液 (见表2)
1.4 试验用菌种 (见表3)
实验用菌种来自中国食品药品检定研究院。
2 方法学验证与结果
2.1 菌液制备方法
分别取适量枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌标准菌株转移至10mL灭菌后的营养肉汤中, 37℃恒温培养18~24h;取白色念珠菌适量, 接种于改良马丁培养基中, 在25℃下恒温培养24~48h。分别取1mL上述培养物, 分别置于盛有9mL无菌生理盐水溶液的试管中, 使其为10-5~10-7的菌悬液[1]。
将黑曲霉转移在改良马丁琼脂培养基上, 25℃培养7天, 用3mL无菌生理盐水洗脱孢子, 取1mL加入9mL无菌生理盐水溶液中, 使其为10-5~10-7的孢子悬液[1]。
2.2 供试液制备
取样品10g, 置锥形瓶中, 加无菌NaCl-蛋白胨缓冲液 (pH7.0) 至100mL, 2 000r/min振摇10min, 即得。
2.3 细菌、霉菌及酵母菌检查方法验证[1]
2.3.1 平皿法
取“2.2”项下供试液 (1∶10) 1mL, 及“2.1”中的验证用试验菌, 分别注入平皿中, 按规定培养并测回收率;平行做菌液组、稀释剂对照组和供试品对照组[2]。结果见表4。
2.3.2 培养基稀释法
取0.2mL“2.2”项下供试液/皿, 加入验证菌各10-5~10-7, 按照“2.3.1”项下方法进行试验。结果见表5。
2.4 控制菌检查方法的验证[1]
2.4.1 大肠埃希菌
取供试液 (1∶10) 10mL及1mL 10-5~10-7大肠埃希菌, 注入100mL胆盐乳糖培养基 (BL) 中, 于37℃下培养24h, 观察培养基澄清度的变化;之后取浑浊管中的培养物适量做荧光反应与靛基质试验。另取适量的培养物划线接种于MacC平板上, 37℃培养24h, 观察其菌落的生长形态特征[2]。同时以金黄色葡萄球菌代替大肠埃希菌, 照上述方法进行试验。结果见表6。
(%)
(%)
2.4.2 大肠菌群
取供试液 (1∶10) 1mL及10-5~10-7大肠埃希菌转移至9mL乳糖胆盐发酵培养基中, 37℃培养24h, 取适量发酵管中的培养物划线接种于MacC平板上, 37℃培养18~24h, 观察其菌落的生长形态特征[1]。同时将大肠埃希菌金换成黄色葡萄球菌, 按上述方法进行试验。结果见表7。
2.4.3 沙门菌
取供试品10g, 加200mL的无菌营养肉汤培养基, 2 000r/min, 5min混匀, 加入预先制备好的沙门菌悬液1mL, 培养18~24h, 取培养物1mL, 接种于10mL TTB中培养18~24h。同时取金黄色葡萄球菌代替沙门菌, 同上述方法进行试验。结果见表8。
3 讨论
微生物限度检查是药品安全性检查的重要项目。由于蒙药制剂是含有多种成分的复方制剂, 其成分种类繁多复杂, 处方中任一成分均有可能具有抑菌活性, 大多数蒙药还含有生药原粉或动物药, 可影响蒙药制剂微生物限度检查的准确性, 因此需按规定进行大肠菌群、沙门菌检查方法验证。
从表1中结果可以看出, 通过平皿法验证, 白葡萄七味散、杜鹃十六味散、消食十味散、檀香清肺八味散、调元大补二十五味丸等5种药品用常规平皿法验证, 可使5株试验菌的回收率均达到70.0%以上, 提示以上5种药品没有抗菌作作用用。。枫枫香香脂脂十十味味散散平平皿皿法法回回收收率率试试验验显显示示, , 采采用用平平皿皿法可完全回收白色念珠菌、黑曲霉菌和大肠埃希菌, 但金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收率很低, 分别为6.0%、0%;表明这两株菌的生长几乎完全被抑制, 药物有明显的抑菌作用。沉香八味散、小儿清肺八味散等2种药品除了枯草芽孢杆菌外, 其他4株菌的回收率超过70%, 而枯草芽孢杆菌无法回收, 回收率分别为0%、25.0%, 药物有明显的抑菌作用。以上结果表明枫香脂十味散、沉香八味散、小儿清肺八味散等3种药品含抑菌成分, 必须采用适当的方法去除抗菌活性, 重新进行菌落计数方法的验证。
从表2中可以看出, 为了消除蒙药制剂中的抑菌成分, 本次实验采用了培养基稀释法, 实验结果表明每皿0.2mL可消除抑菌成分对细菌生长的影响。沉香八味散、枫香脂十味散、小儿清肺八味散等3种药品的阳性对照菌的回收率均达到70.0%以上, 基本消除抑菌活性。因此培养基稀释法 (每皿0.2mL) 可用于以上3种蒙药制剂的细菌数检查。
从表3至表5可以看出, 以上8种蒙药制剂对控制菌 (大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌) 无抑制作用, 控制菌检查可采用常规法。
4 结语
调元大补二十五味丸、消食十味散、白葡萄七味散、杜鹃十六味散和檀香清肺八味散按平皿法进行细菌数检查;沉香八味散、枫香脂十味散、小儿清肺八味散采用培养基稀释法 (每皿0.2mL) 进行细菌数检查;本试验中8种药品的霉菌和酵母菌菌落数须用平皿法进行检查, 而控制菌的检查按常规法即可。本次试验结果可供药品检验部门参考。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:人民卫生出版社, 2010:附录79-88.