重组蛋白范文（精选9篇）
重组蛋白 第1篇
关键词：基因重组,外源基因,原核表达系统,真核表达系统
在遗传学、分子生物学、生物化学、微生物学等学科发展的基础上,20世纪70年代初出现了基因工程技术(又称重组DNA技术)。该技术通过在体外将核酸分子插入质粒、病毒或其他载体分子,构成遗传物质的新组合,并将其导入宿主细胞内,继而在新的遗传背景下得到稳定扩增及表达[1]。
重组蛋白表达技术是研究蛋白质功能、结构,以及筛选靶向药物的有力工具,在基础科学以及医药学领域发挥了重要作用。本文对一些常见的外源基因表达系统(包括原核、真核表达系统)的优缺点进行了综述,并对其最新的研究进展进行了简要的概括,以期对我们实验过程中如何选择表达系统,提高蛋白产量有所帮助。
1 原核表达系统
1.1 大肠杆菌(Escherichia coli)-典型的原核表达系统
1977年,Itakura等成功地在E.coli中表达了一种哺乳动物的肽类激素-生长激素抑制素,从而首次实现了外源基因在原核细胞中的体外表达。这被认为是基因工程发展史上的一座里程碑。
1.1.1 T7表达系统
基于T7 RNA聚合酶(T7 RNA polymerase,T7 RNAP)及其强启动子之间的特异性和转录的高效性建立的p ET系统(Novagen)是最常用的E.coli表达系统。T7 RNAP机制在诱导蛋白表达时,几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白,而且表达产物产量也特别高[2]。
由λp L/c I(例如Invitrogen p LEX)、Trc(例如Amersham Biosciences p Trc)、Tac(例如Amersham Biosciences p GEX)、lac/T5(例如Qiagen p QE)等启动子构成的其他原核表达体系也常用于重组蛋白的原核表达[3]。
1.1.2 目的蛋白表达形式及在细胞中的定位
一般来说,在E.coli中表达的外源蛋白可以分为三类:可溶性蛋白、分泌蛋白以及包涵体蛋白。
(i)可溶性蛋白是目的蛋白与一段融合标签序列(FLAG、His-Tag、GFP等)融合表达而形成。这些融合标签将为进一步的蛋白浓缩、提纯、检测等提供便利,同时也可以有效的抑制宿主蛋白酶的降解活性[4,5,6]。
(ii)采用信号肽序列可以将蛋白直接分泌到细菌的周质腔去。分泌表达可以显著降低胞内蛋白酶对蛋白的降解作用、简化蛋白纯化过程,同时有助于重组蛋白形成正确的空间结构。大肠杆菌中,已成功使用了各种不同类型的信号肽,将细胞质中表达的蛋白质转运到周质[7]。
(iii)包涵体蛋白的形成是由于肽链折叠过程中,部分折叠中间态发生特异性错误聚合,不能形成成熟的天然或完全解链的蛋白所致。包涵体表达虽然可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解,但对表达产物的活性不利。因此,需要后续的溶解与复性等。
1.1.3 外源基因在大肠杆菌中表达的优缺点
迄今为止,E.coli作为第一个用于重组蛋白生产的宿主菌,由于其遗传背景清楚、培养操作简单、转化效率高、生长繁殖快、成本低廉,且可以快速大规模地生产目的蛋白等优点而被广泛地用于外源蛋白的表达[8]。
但是,作为原核表达宿主的E.coli不能产生诸如N-和O-端糖基化、脂肪酸酰化、磷酸化以及二硫键的形成等翻译后修饰。而这些修饰作用对活性蛋白的生物活性、功能、结构、溶解度、稳定性,以及半衰期等都是非常重要的。而且,E.coli表达的蛋白还会保留它们氨基末端的甲硫氨酸,这会影响到目的蛋白的稳定性,并产生免疫原性[9,10]。
1.1.4 大肠杆菌表达系统的研究新进展
近几年来,对大肠杆菌表达系统的研究,已经从最初的构建不同的表达载体建立新的表达系统转移为完善现有的表达系统,解决表达系统中的各种缺陷,包括:采用RosettaTM(Novagen)代替BL21菌株来增强含有E.coli稀有密码子的重组蛋白的表达水平;采用BL21(DE3)、BL21(DE3)p Lys S以及BL21(DE3)p Lys E(Invitrogen)弥补高浓度的胞内酶环境对具有生物活性的目的蛋白在E.coli中表达的抑制等[11]。
最近几年来,研究人员逐步将研究重点放在通过将一些具有活性的小蛋白与目的蛋白融合,进而促进目的蛋白在E.coli中的表达[12],或者通过改造某种现有的表达载体,通过将各种促溶标签与载体融合,进而使得某些在E.coli中不表达的蛋白得以表达或使原本以包涵体形式表达的蛋白以可溶性形式表达[13]。这些标签包括FLAG、MBP、GST、thioredoxin等。
1.2 枯草杆菌-可替代E.coli的原核表达系统
枯草杆菌,学名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtili),细胞壁不含内毒素,是一些重要工业酶制剂的生产菌。1958年,Spizizen等首次发现枯草杆菌168菌株能够摄取外源基因。此后,随着基因重组技术的发展,以枯草杆菌为宿主细胞的表达系统迅速发展起来。
1.2.1 枯草杆菌作为外源基因表达宿主存在的优缺点
作为外源基因表达的宿主,枯草杆菌有以下优势:(1)非致病的土壤微生物,不产生脂多糖,而脂多糖作为E.coli表达产物之一,有可能会导致人类和动物的一些神经性退行病的发生。(2)遗传特性强,很多噬菌体和质粒都可以作为克隆载体。(3)蛋白分泌能力强,有利于目的蛋白的回收和纯化。(4)良好的发酵基础和生产技术,枯草杆菌在工业上长期被用于生产蛋白酶、α-淀粉酶等,在相对简单的培养基中就能生长到很高的密度[14]。
经过很多年的努力,许多原核和真核基因都已经在芽孢杆菌表达系统中得以克隆和表达,其中有的已应用于工业生产。但是,枯草杆菌作为产品生长菌也暴露出一些问题:蛋白酶对目的蛋白的降解、质粒的不稳定性、真核蛋白分泌量低甚至不能分泌表达等。目前,研究者已经对B.subtilis全基因序列进行测序分析,同时对源于细胞膜和质膜的蛋白酶的进行了研究[15,16,17]。因此,枯草杆菌作为表达宿主的这些弊端将在不久的将来得以解决。
1.2.2 枯草杆菌表达系统的研究新进展
与大肠杆菌相比枯草杆菌具有很强的向胞外分泌蛋白的能力,但是重组表达质粒在枯草杆菌中却不是很稳定。所以研究者一直致力于对该系统本身进行更详尽的研究上。通过寻找自然界中的这样一类枯草杆菌,它们不仅具有强分泌蛋白能力,并且没有胞外蛋白酶活性(如短芽孢杆菌)[18],进而减少蛋白酶对蛋白的降解,促进蛋白的分泌表达。
解决重组质粒不稳定的一种有效途径是将克隆基因整合到枯草杆菌的染色体上,随染色体的复制而复制[19]。
2 真核表达系统
2.1 酵母-最具商业价值的表达系统
2.1.1 几种常见的酵母表达系统
酿酒酵母(S.cerevisiae)是一种单细胞真核微生物,长久以来被称为真核生物中的“大肠杆菌”,最早应用于酵母基因的克隆和表达。目前利用酿酒酵母为宿主细胞表达了多种外源基因,如乙型肝炎疫苗、人胰岛素、人粒细胞集落刺激因子、人血管抑制素等[20,21]。
1983年,美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母(methylotrophic yeast)为代表的第二代酵母表达系统。甲基营养型酵母包括:Hansenula polymorpha、Pichia Pastoris、Candida Bodinii等[22]。以Pichia pastoris(毕赤巴斯德酵母)为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速,应用也最为广泛。
粟酒裂殖酵母(S.pombe)是所有酵母细胞中生理特性最接近高等生物的一种,其染色体结构和功能,细胞循环的控制,RNA剪接蛋白表达分泌机制及翻译后修饰等都与哺乳动物细胞很相似。因此,在S.pombe中表达的重组蛋白有可能更接近其本来的结构和生物活性。近年来,有学者提出它可能也是潜在的能有效表达真核膜蛋白的表达系统[23]。
2.1.2 酵母表达系统的优缺点
酵母表达系统具有一定的蛋白质翻译后加工能力,有利于真核蛋白的表达,特有的AOX强效启动子使得外源基因表达量很高,而且酵母的培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物,非常适合大规模工业化生产,另外用甲醇代替IPTG作为诱导物,部分甲醇酵母以甲醇等工业产物代替葡萄糖作为碳源,生产成本非常低。
但是酵母在表达外源基因时会造成产物蛋白的不均一、降解、信号肽加工不完全、多聚体形成等问题。而且,酿酒酵母表达蛋白时会出现蛋白切割问题、蛋白分泌效率低等问题。
随着酵母基因组测序的完成及后基因组的发展,人们对酵母的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力将更加清楚,相信不久的将来,这些问题都将得到解决[24]。
2.1.3 酵母表达系统的研究新进展
近年来出现的酵母展示技术利用酵母细胞壁上的某些蛋白:如酵母凝集素、酵母絮凝素等,可以实现外源蛋白再酵母细胞壁上的表达。但该技术仅限于蛋白在酵母中的分泌表达,融合蛋白再分泌表达途中由于其糖基化蛋白与细胞壁的结合作用,将外源蛋白锚定在细胞壁上[25]。目前,其技术还不是很成熟,后期纯化过程并未提到。
2.2 昆虫/杆状病毒表达系统-最具潜力的表达系统
杆状病毒表达外源蛋白的前提要将目标蛋白编码序列克隆至合适的杆状病毒转移载体上,目的基因与杆状病毒的基因组通过同源重组制备重组病毒DNA,进而感染昆虫细胞产生重组蛋白。
2.2.1 昆虫/杆状病毒表达系统的优缺点
杆状病毒做为外源基因表达的宿主,由于其可以对真核蛋白进行翻译后加工等过程而被广泛地用于真核基因的体外表达。目前,已经有近千种异源蛋白在此系统中得到高效表达,而且杆状病毒还可以用于生产疫苗、基因治疗以及制备杆状病毒杀虫剂等[26]。由于昆虫是杆状病毒的自然宿主,且每种杆状病毒都只能感染一种或几种昆虫,不会感染其他动物、植物及人类,所以认为在应用杆状病毒进行研究时不需考虑其安全性问题[27]。
但是,杆状病毒表达系统也存在着一定的缺陷。例如,随着感染宿主的多角体病毒的死亡,异源蛋白不能连续表达。每一轮新蛋白的合成都需要重新感染宿主细胞。此外,虽然杆状病毒表达系统能够对目的蛋白做翻译后修饰,但这种修饰存在着一定的限度;虽然其糖基化位点与在哺乳动物细胞中一样,但寡糖链的性质有所不同,无法产生复杂的糖基侧链,这可能是由于昆虫细胞不能将成熟糖链加工成哺乳动物细胞中类似的形式。
2.2.2 昆虫/杆状病毒表达系统的研究新进展
起初,杆状病毒系统的所用到的重组质粒都是通过同源重组的方法获得,利用杆状病毒基因组DNA与供体质粒DNA共转染昆虫细胞,这样重组病毒与原病毒混杂在一起,分离筛选效率非常低,重组效率仅为0.1%[28]。后来,研究者发现利用核多角体位点中的Bsu36I酶切位点将其病毒基因组线性化极大地推动了该系统发展,线性化的病毒DNA与转移质粒共转染昆虫细胞重组效率大大提高,大约为25%[29]。
利用病毒杆状病毒表达系统表达外源蛋白的过程中,病毒本身也表达出蛋白酶,尤其是半光氨酸蛋白酶v-cath,会对重组蛋白进行降解。研究发现通过该在杆状病毒基因组,删除导致导致重组蛋白降解的蛋白酶基因,可以有效保证外源基因表达产物的稳定性[30]。另外,多角体启动子及其上游序列对外源蛋白的基因转录也很重要,在新开发的杆状病毒转移载体中,为提高表达效率在3’端常添加真核增强因子SV40等序列。
2.3 哺乳动物细胞表达系统———一个相对成熟的真核表达系统
从最开始以裸露DNA直接转染哺乳动物细胞至今的几十余年间,哺乳动物细胞表达系统已成为多种基因工程药物的生产平台,且在新基因的发现、蛋白质的结构和功能研究中亦起了极为重要的作用[31]。根据表达产物用途不同,该表达系统既可以用于瞬时表达也可用于稳定表达。COS细胞常用于前者,CHO细胞用于后者。
2.3.1 哺乳动物细胞表达系统的优缺点
与其它真核细胞表达系统相比,目的基因在哺乳动物细胞中表达的蛋白与天然蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎完全相同,并且在蛋白合成起始信号、加工、分泌等方面具有独特优势。但是哺乳动物表达系统成本相对较高,技术复杂,表达过程中存在着潜在的动物病毒的污染。
2.3.2 哺乳动物细胞表达系统的研究新进展
由于哺乳动物细胞表达蛋白的成本较高,因此如果蛋白能够在胞外分泌表达,这样就会大大降低生产成本,有利于实现重组蛋白在哺乳动物细胞表达的工业化生产。为了方便蛋白大量生产以及后期纯化,研究者通常会选择在载体或者目的片段上添加信号肽序列,这样可以增强蛋白的胞外分泌能力。王洪亮等通过在载体上添加CD5L引导肽序列,使得重组蛋白在哺乳动物细胞中得到很好的表达[32]。
2.4 其他真核表达系统———一些新兴的表达系统
随着分子生物学技术的发展,人们对重组蛋白表达的研究也逐步深入,近些年来,除了上述一些常规的表达系统,研究者又逐步发现了一些新兴的表达系统,这些表达系统主要包括植物和动物细胞/组织表达系统。
2.4.1 转基因动物表达系统
利用现代分子生物学技术,我们可以将重组DNA导入到受精卵的细胞核去。这些DNA复合物通过一定的频率整合到宿主基因组中,依赖于不同的启动子,在机体的各组织和器官得到表达。到目前为止,已经有不少的转基因动物用于重组蛋白的生产[33,34,35]。
在各种器官和细胞中,乳腺组织可以进行大规模的翻译后修饰,并具有良好的渗透屏障。因而,为大多数研究蛋白质生产的研究人员选择作为定位器官来表达外源蛋白。
近年来,转基因动物乳腺生物反应器的研究已经成为生物工程领域研究的热点,一般用来高效、高质量生产具有生物活性的蛋白。但多数研究表明,乳腺特异性表达的成功率很低,蛋白在乳汁中的表达水平较低[36]。
除了动物的乳腺组织,母鸡的蛋清在也可以作为一种低廉、高效的生物反应器用于人类的制药行业。但是目前为止,还没有相应的商业化产品,这可能是由于转基因鸟类还难以实现的原因[37]。
2.4.2 转基因植物表达系统
外源基因可以使用带有分泌信号肽序列的植物体使重组蛋白分泌表达。利用植物做为生物反应器生产的重组蛋白在折叠和组装上与动物细胞更为相似,从而具有与高等动物细胞表达的产物基本一致的免疫原性和生物活性,并且不会存在被动物、病原体污染的可能性。但是,植物表达系统还处于发展阶段,也存在着外源蛋白表达量低等问题[38]。
3 讨论
本文介绍了几种常用的重组蛋白表达系统,并对各自优缺点及最新的而研究进展进行了相应的概括。随着我们对基因表达调控机制的深入研究,及其在生物技术领域的发展,所有的表达系统都可以在功能上有进一步的改善,同时我们也期待更多的新的表达系统的产生。但是,一些表达系统本身固有的缺陷也不能忽略。因此我们在选择表达系统时,应该综合考虑这些因素以及表达产物的生物学特性及用途等。例如,真核表达系统是表达生物活性蛋白及疫苗的理想选择。相反,原核表达系统可以提供足够的人工抗原用于诊断或不需要翻译后修饰的蛋白的结构分析。
重组蛋白 第2篇
重组类人胶原蛋白工程菌补料发酵过程建模
对产类人胶原蛋白的重组大肠杆菌Escherichia coli(E.coli)的批式和分批-补料培养动力学进行了研究.通过检测发酵过程的基质浓度、菌体量和产物浓度,建立了一组反映发酵的.动力学模型,并考虑了非工程菌存在的影响,分析了细胞生长、底物消耗、基因工程产物生成的过程,结果显示该动力学模型可以很好地拟合发酵过程.
作 者：米钰 花秀夫 范代娣 张兮 MI Yu HUA Xiu-fu FAN Dai-di ZHANG Xi 作者单位：西北大学化工学院,西安,710069刊 名：中国生物工程杂志 ISTIC PKU英文刊名：CHINA BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：26(4)分类号：Q815关键词：动力学 发酵 胶原蛋白
重组肠激酶融合蛋白纯化工艺的研究 第3篇
1材料与方法
1.1 材料
工程菌株大肠杆菌菌株BL21(DE3)/PET39b(+)/EKL本实验室保存。DEAE-Sepharose 6FF和IMAC购自美国GE公司。琼脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物购自英国OXOID。十二烷基硫酸钠、二硫苏糖醇、过硫酸铵购自北京鼎国生物技术公司。ITPG购自大连TaKaRa公司。主要设备:EXL800酶标仪购自美国基因公司,超声波破碎仪购自上海比朗仪器有限公司,AKTA Explorer 100蛋白质快速纯化系统购自美国通用电器(GE)公司。
1.2 方法
1.2.1 工程菌发酵培养与收集
①取-80℃保存的甘油菌种子200 μl,于含有50 μg/ml卡那霉素的100 ml LB培养基中,30℃、160 r/min培养过夜作为一级种子。②将培养好的一级种子1 ml转接于50 μg/ml卡那霉素的500 ml LB培养基中,37℃、230 r/min培养至OD600达到1.0～2.0作为二级种子。③将二级种子全部转接于8 L发酵罐中,控制发酵温度为35℃,空气通量10 L/min,灌压0.01 mPa,以自动调节转速控制溶氧为30%,以2 mol/L氨水调节pH 6.0～7.0。④当OD600>20时,加入IPTG浓度至0.5 mmol/L,继续培养4 h,停止发酵。⑤菌体发酵液以8 000 r/min 4℃ 离心10 min,弃上清得湿菌体。
1.2.2 超声破碎菌体
菌体按1 g ∶10 ml菌体破菌液的比例加入菌体破菌液(50 mmol/L Na2HPO4,10 mmol/L EDTA,pH=7.0)冰浴,以20 kHz功率超声破碎2次,每次10 min。离心(16 000 r/min,15 min,4℃),收集沉淀。
1.2.3 包涵体裂解
按1 g ∶20 ml裂解液(6 mmol/L盐酸胍,5 mmol/L EDTA,pH=8.5)溶解包涵体,调pH为8.5,37℃,向裂解液中加入DTT至2 mmol/L,搅拌1 h;再次向裂解液中加入DTT至30 mmol/L,搅拌1 h。离心(16 000 r/min,15 min,4℃),取上清液透析,透析液(10 mmol/L Tris-HCl 1 mmol/L EDTA,pH=3.0)。
1.2.4 包涵体的复性
将透析好的蛋白溶液以脉冲方式加入10倍体积的复性液(0.7 mmol/L Arg,1 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA,5 mmol/L Cysteine,pH=8.6)中,间隔20 min,共10次,室温放置,复性20～24 h。转入4℃冰箱中。5倍体积10 mmol/L Tris-HCl充分透析。
1.2.5 自切
在4℃冰箱中向上述透析液中加入CaCl2至2 mmol/L反应100 min,每隔20 min取样进行电泳分析。
1.2.6 IMAC层析
①平衡:用平衡液(20 mmol/L Tris-HCl,20 mmol/L咪唑,pH=7.4)平衡5个柱体积,至流出液与平衡液的电导以及pH一致,即可。②上样:向上样液中加入咪唑至终浓度为20 mmol/L,调pH值与平衡液一致,上样并收集流出液样品。③洗脱1:用上述平衡液洗涤3个柱体积,将其加入上样流出液中作为IMAC样品的收集液。④洗脱2:用洗脱液(20 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L咪唑,pH=7.4)洗脱杂蛋白。
1.2.7 DEAE层析
①平衡:用平衡液(20 mmol/L Tris-HCl,20 mmol/L NaCl,pH=7.4)平衡5个柱体积,至流出液与平衡液的电导以及pH一致。②上样:IMAC柱收集液补加NaCl调电导与平衡液一致后,再上样。③平衡:用洗脱液(20 mmol/L Tris-HCl,20 mmol/L NaCl,pH=7.4)洗涤10个柱体积。④洗脱:用洗脱液(20 mmol/L Tris-HCl,500 mmol/L NaCl,pH=7.4)洗脱,收集洗脱液,洗脱液为目的蛋白。⑤保存:将收集液用上述洗脱液稀释至0.5 mg/ml,在缓慢搅拌下加入等体积甘油,充分混匀后分装,保存于-20℃,备用。
1.2.8 酶切检验肠激酶的活性
取肠激酶底物1 ml于EP管中,用上述肠激酶分别以1∶100(W∶W)、1∶250(W∶W)、1∶500(W∶W)对肠激酶底物酶切验证EK酶活性。
2结果
2.1 rEKL蛋白纯化的结果
本实验中金属亲和层析(IMAC)利用Ni-NTA层析柱分离。样品通过亲和柱后,用5个柱体积20 mmol/L Tris-HCl和含20 mmol/L咪唑的过渡缓冲液洗去杂质,然后用复性缓冲液柱上复性,尽可能使亲和柱上只留下专一性吸附的亲和物;最后再以50 mmol/L咪唑作为洗脱液来竞争性抑制His-tag与镍的结合,使先前形成的络合物解离,从而将目的蛋白从柱床中冲洗下来。层析图谱见图1,由AKTA蛋白纯化系统纯化得出。
上样体积(ml)
横坐标表示上样体积,纵坐标表示蛋白含量,褐线表示电导走势,蓝线表示样品的UV吸收走势。收集上样流出液和洗脱液。
本实验中离子交换层析(DEAE)先以20 mmol/L Tris-HCl和20 mmol/L NaCl作为平衡缓冲液平衡约5个柱体积,至流出液与平衡液电导及pH值一致时开始以IMAC收集液上样,再以低浓度的盐溶液进行洗涤,最后用20 mmol/L Tris-HCl和500 mmol/L NaCl作为洗脱液,收集洗脱液作为目的蛋白。层析图谱见图2,由AKTA蛋白纯化系统纯化得出。
上样体积(ml)
横坐标表示上样体积,纵坐标表示蛋白含量,褐线表示电导走势,蓝线表示样品的UV吸收走势。收集上样流出液和洗脱液。
样品经IMAC和DEAE两次层析,纯化后,收取DEAE层析纯化后的洗脱液。由图3可知,该洗脱液为目的蛋白,经过SDS-PAGE电泳分析,可见其分子量约为31 kDa,与文献记载相符[5]。纯化后的样品纯度可达90%以上。
Lane l:DEAE层析样品;Lane M:蛋白分子量Marker
Lane 1:1∶100;Lane 2:1∶250;Lane 3:1∶500;Lane 4:肠激酶底物;Lane M:蛋白分子量Marker
2.2 酶切的结果分析
由图4可以看出在1 ml体系中,底物同肠激酶分别以1∶100(W∶W)、1∶250(W∶W)、1∶500(W∶W)的比例进行酶切,SDS-PAGE电泳结果发现酶切效率在99%以上。可见通过纯化后的酶的活性非常高,说明构建表达的rEKL专一性强、无其他蛋白水解酶污染。
3讨论
构建DsbA-rEKL融合蛋白在E.coli中表达EKL,目的是获得可溶的、具有生物活性的rEKL蛋白。笔者的研究表明,在37℃表达时,几乎无可溶形式的融合蛋白产生。以LB培养基200 ml培养至OD600为0.5左右时,将温度降低至30℃,加IPTG诱导12 h,收集菌体,超声波破菌10 000 r/min离心15 min,上清液中融合蛋白的比例很低,主要的融合蛋白在沉淀中,这与文献的报道一致[5,6,7]。因此,只收集并纯化可溶形式的融合蛋白无实际意义。
通常1个大肠杆菌细胞中有1个包涵体,所以包涵体的质量和数量与发酵水平成正比。包涵体一般含有50%以上的重组蛋白,其余为核糖体元件,聚合酶、膜蛋白、质粒DNA以及磷脂、脂多糖等,可以通过洗涤、蔗糖密度超离心等方法提高包涵体中重组蛋白的纯度,从而方便后续的变复性操作,提高复性率。
牛EKL含有8个Cys,因此DsbA-rEKL融合蛋白容易形成包涵体,而且包涵体也难以溶解。笔者在实验中发现,使用8 mol/L尿素仍有较多的包涵体不能溶解。使用6 mol/L盐酸胍可溶解大部分DsbA-rEKL包涵体。将溶解的包涵体溶液调pH=3.0后对其透析,一是低pH下-SH及-S-S-比较稳定,另一方面透析除去DTT,可使下一步操作受到的干扰较小。融合蛋白复性时先以胱氨酸处理,可使复性收率提高至少10倍以上,这可能是胱氨酸的处理减少了错配的二硫键,融合蛋白正确折叠的几率增加。具文献记载以GSSG代替胱氨酸,复性的收率稍高,但考虑到GSSG价格要贵几十倍,因此复性时还是以胱氨酸为最佳。
在包涵体中,重组蛋白处于错误折叠的状态,二硫键大部分也是错搭的,它们之间的聚集靠非共价键维持:包括疏水力、范德华力、氢键、静电引力等,惟一的共价键是半胱氨酸之间的二硫键。要获得正确折叠的蛋白首先是溶解包涵体使蛋白变性,变性即破坏非共价键,并用还原剂(如β-巯基乙醇或二硫苏糖醇)打开二硫键,常用5～6 mol/L的盐酸胍或6～8 mol/L的尿素。尿素和盐酸胍对蛋白质的变性作用符合Hofmeister规则。然而,尿素中的异氰酸盐或酯会引起蛋白质中氨基或巯基的不可逆修饰。而盐酸胍是一种离子型变性剂,它会影响下游的离子交换纯化。但是,盐酸胍的变性能力是尿素的1.5～2.5倍。实验表明,在变复性过程中,用尿素时蛋白质很难恢复活性,而用盐酸胍来溶解包涵体可以提高蛋白质的复性率。
脉冲稀释复性是DsbA-rEKL包涵体蛋白复性的最佳方式,倍比稀释或连续流加等方式复性,复性的效率要低很多。比较pH 8.0、8.6及9.3三个条件下的复性情况,pH 8.6复性要好。脉冲每次加量越小,则复性效率越高,但复性加样的时间更长,实际无法控制,因此选择脉冲每次加量为0.03 mg/ml。另外,复性溶液蛋白终浓度为0.3 mg/ml,是综合考虑单位蛋白浓度的复性效率及复性缓冲液有效利用的最佳方式。
本实验采用的是IMAC和DEAE两步纯化,DEAE纯化后的样品纯度为90%以上,分子量约为31 kDa,与文献报道相符[8]。且rEKL专一性强,酶切效率在99%以上。但使用了IMAC,限制工业化生产,考虑在以后的研究工作中进一步优化。
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重组蛋白 第4篇
目的 克隆表达SARS冠状病毒的主要结构蛋白(S蛋白).方法 合成SARS冠状病毒S蛋白特异性基因片断并克隆入pET32a原核表达载体,转化BL21菌,经IPTG诱导高效表达得到重组S蛋白,并通过Western印迹对重组蛋白质进行鉴定.结果 重组蛋白质经镍柱亲和层析得到了部分纯化,免疫动物后得到SARS病毒的`多克隆抗体.结论 经E1isa检测,表达的重组S蛋白基本具备检测病人血清中抗SARS病毒IgG和IgM的能力,可进一步用于S蛋白功能研究与SARS诊断试剂盒的研制.
作 者：颜桦 陈功 蒙世杰 陈超 YAN Hua CHEN Gong MENG Shi-Jie CHEN Chao 作者单位：颜桦,陈超,YAN Hua,CHEN Chao(国家微检测系统工程技术研究中心/西北大学生物芯片研发中心/陕西北美基因股份有限公司,陕西,西安,710069;西北大学,生命科学学院,陕西,西安,710069)陈功,CHEN Gong(国家微检测系统工程技术研究中心/西北大学生物芯片研发中心/陕西北美基因股份有限公司,陕西,西安,710069)
蒙世杰,MENG Shi-Jie(西北大学,生命科学学院,陕西,西安,710069)
刊 名：西北大学学报（自然科学版） ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF NORTHWEST UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE EDITION) 年，卷(期)：2006 36(5) 分类号：Q5 关键词：严重急性呼吸综合征(SARS) 重组S蛋白 表达 纯化★ 重组协议书参考
★ 重组协议书
★ 弯桥结构动力性能的有限元计算方法
★ 股权重组协议书
★ 脂多糖应激新分子融合蛋白的高表达及纯化
★ 重组人PD-1IgV融合蛋白的克隆、表达、纯化及生物学活性检测
★ 性能的近义词
★ 正撞击下双层墙结构防护屏防护性能仿真研究
★ 双探测器密度测井仪器结构参数对测井性能的影响
重组蛋白 第5篇
硒 ( Se) 是生物体必须的一种微量元素, 适量硒可以起到预防癌症与心血管疾病、延缓衰老、提高免疫力等重要作用[1]。果蝇硒蛋白dSelK是果蝇体内仅含有的3 种硒蛋白之一, 其同源基因存在于从低等到高等几乎所有动物体内[2,3,4], 说明此类硒蛋白在动物的生命过程及进化中具有重要作用。以人为研究对象进行人硒蛋白功能研究存在很多困难, 因此研究果蝇硒蛋白dSelK将为人硒蛋白Selk的研究打下坚实的基础。作者课题组在果蝇SL2 胚胎细胞系中发现了一种新的dSelK基因类型[2] ( GeneBank基因序列号为DQ285021) , 发现其表达量调控胞内Ca2 +浓度[3], 进一步调控细胞代谢与生长分化, 但是采用脂质体转染dSelK效率低, 制约了dSelK分子功能进一步研究, 本实验采用腺病毒体系构建高转染效率的dSelK基因重组表达载体来解决这一难题, 为其生化功能研究及阐释奠定基础。
1 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验材料
AdEasy Adenoviral vector购自美国安捷伦公司; AD - 293细胞购自上海酶联生物科技有限公司; pAc - GFP - dSelK -Secis - C1 质粒和E. coli菌株 ( DH5α) 作者实验室保存。
1. 1. 2 试剂
T4DNA连接酶、限制性内切酶SalⅠ、HindⅢ购自TaKaRa公司; PacⅠ和PmeⅠ购自沈阳金瑞祥生物科技有限公司, 上海生工生物公司引物合成和质粒测序。
1. 1. 3 培养基
LB液体及固体培养基 ( 卡那霉素浓度为50mg / L ) 。DMEM ( 髙糖) 培养基。
1. 2 方法
1. 2. 1 目的片段dSelK的扩增
根据GenBank中dSelK基因序列 ( DQ285021) 设计引物, 上、下游引物分别引入SalⅠ和HindⅢ酶切位点: 正向引物5’GCGTCGACACCATGGTGTACATCGACCATAATG 3’; 反向引物: 5’CCAAGCTTGGGTACTGTGACTTCGAATTTG 3’; 以pAc -GFP - dSelK - Secis - C1 质粒为模板进行PCR扩增, 反应条件为预变性95℃ 5min, 95℃ 30s, 退火55℃ 30s, 72℃ 2min, 30 个循环, 72℃延伸7min。产物1%琼脂糖凝胶电泳。
1. 2. 2 穿梭载体pShuttle - CMV - dSelK的构建
扩增的目的片段和腺病毒穿梭载体pShuttle - CMV分别进行SalⅠ和HindⅢ酶切, 回收后16℃过夜酶连接, 连接产物转化到DH5α 感受态细胞中, 涂布平板过夜培养, 挑取阳性克隆摇瓶培养保存菌种并测序。
1. 2. 3 重组病毒质粒AdEasy - dSelK的构建及鉴定
PmeⅠ酶切质粒pShuttle - CMV - dSelK, 电转化法转到BJ5183 电感受态细胞中, 挑取较小的克隆菌落摇瓶培养, 提质粒1%琼脂糖凝胶电泳鉴定, 及PacⅠ酶切和PCR验证。
1. 2. 4 重组腺病毒包装
重组质粒Ad - dSelK经PacⅠ线性化, 转染融合度70%的AD - 293 细胞。大约12d细胞全部病变, 收集病毒上清再次感染细胞提高滴度。TCID 50法测病毒滴度, Reed - Muench两氏法和Karber法计算重组腺病毒滴度。
1. 2. 5 目的蛋白表达鉴定
重组病毒转染胃癌BGC - 823 细胞, 对照组转染lac - Z病毒, 提取总蛋白进行SDS - PAGE、经转印、封闭、dSelK抗体一抗孵育和辣根过氧化酶标记的二抗, 显影鉴定。
2 结果与分析
2. 1 目的片段dSelK的扩增
通过设计带有SalⅠ、HindⅢ的引物, 成功扩增出总长为660bp的目的片段, 经1% 的琼脂糖凝胶电泳鉴定, 在700bp附近有扩增片段, 见图1。
2. 2 穿梭载体pShuttle - CMV - dSelK的构建及鉴定
用穿梭载体pShuttle - CMV和目的片段dSelK进行SalⅠ和HindⅢ酶切, 酶切产物经凝胶回收后进行连接, 挑取菌落提质粒, 进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定和PCR验证。经PCR扩增后在750bp左右出现目的条带, 对照组无目的条带, 见图2。测序结果正确。
M: DL2000 marker; 1: 对照组; 2: PCR 扩增产物。M: DL2000 marker; 1: Control; 2: Amplification of dSelK by PCR.
M1: DL10000 marker; 1: pShuttle - CMV - dSelK 质粒; 2: 对照组; 3: 质粒 pShuttle - CMV - dSelK 的 PCR 扩增产物; M2: DL2000 marker。M1: DL10000 marker; 1: the plasmid pShuttle - CMV - dSelK; 2: control; 3: amplification of pShuttle - CMV - dSelK by PCR; M2: DL2000 marker.
2. 3 重组病毒质粒AdEasy - dSelK的构建及鉴定
pShuttle - CMV - dSelK和AdEasy - 1 同源重组后挑选阳性克隆进行PacⅠ酶切, 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定, 出现35kb片段和4. 5kb片段, 说明质粒构建成功且重组位点在复制起始点附近, 见图3。
2. 4 重组腺病毒包装
用PacⅠ线性化的重组病毒Ad - dSelK质粒转染AD293细胞。正常AD293 细胞呈贴壁状态, 为扁平不规则多角形, 随着转染天数增加细胞出现形态改变, 且出现脱落现象最终导致出现空斑, 见图4。用TCID 50法测病毒滴度, 计算出重组腺病毒滴度为107. 5。
2. 5 目的蛋白表达鉴定
分别收集对照组和实验组细胞, 提取总蛋白做Western blot鉴定, 定影结果显示在分子量约24kDa处实验组出现目的条带而对照组无条带出现, 见图5。说明成功构建腺病毒质粒并在细胞中成功表达目的蛋白。
M: DL10000 marker; 1: 重组质粒 plasmid Ad - dSelK; 2: 重组质粒 plasmid Ad - dSelK 经 PacⅠ酶切。M: DL10000 marker; 1: the recombinant plasmid Ad - dSelK; 2: the recombinant plasmid Ad - dSelK digested with PacⅠ.
3 讨论
近年来越来越多的实验证明微量元素硒在预防和抗肿瘤、提高人体免疫力以及延缓衰老等方面具有重要作用[4]。在生物体内硒主要以硒蛋白的形式发挥作用, 硒以硒代半胱氨酸的形式通过终止密码子UGA及一种特殊的编码机制参与到多肽链的合成中[5]。在果蝇体内已鉴定出三种硒蛋白, 它们分别是BthD、SPS2 和dSelK ( 或G - rich) [6]。其中第三种硒蛋白dSelK是一种12kDa的富含甘氨酸的蛋白质, 是哺乳动物体内硒蛋白SelK的同源蛋白, 课题组前期工作发现硒蛋白dSelK定位于内质网和高尔基体膜上[2], 并且已经制备出其抗体[5], 果蝇SL2 细胞硒蛋白G - rich基因敲低后, 位于内质网上的与胞内钙稳态相关的基因InsP3R的表达水平显著降低, PI3 kinase1 的表达量显著升高, 细胞胞内钙离子浓度显著下降, 而转染含G - rich质粒获G - rich过表达的果蝇SL2 细胞中胞内钙离子浓度显著升高, 即G - rich表达量影响钙离子浓度, 胞内钙离子浓度与G - rich表达量正相关[3]。但受dSelK转染效率低的制约阻碍了其分子功能的进一步阐述。
腺病毒与其他载体相比具有转染效率高、不易整合到宿主基因中等特点, 另外腺病毒载体构建、制备、扩增相对简便, 且病毒滴度较高[7]。1998 年Tong - Chuan He[8]等建立的AdEasy系统, 将线性化的穿梭质粒与骨架质粒在细菌内同源重组, 经PacⅠ 线性化在AD293 细胞内包装成重组腺病毒。这种方法与以前的细胞内同源重组法相比较提高了同源重组效率、实验周期短、简便快捷[9]。本实验采用AdEasy腺病毒载体系统构建高转染效率的dSelK基因重组表达载体并成功表达, 为进一步研究阐释它的分子功能奠定了基础。
a: 对照组; b: 转染 24h; c: 转染 48h。a: control; b : after recombinant adenovirus infected into AD - 293 cells 24h; c: after recombinant adenovirus infected into AD - 293 cells 48h.
1: 对照组; 2: 重组腺病毒 AdEasy - dSelK 表达蛋白。1: control; 2: The expression of recombinant adenovirus AdEasy - dSelK.
摘要：目的:利用AdEasy腺病毒载体系统构建果蝇硒蛋白dSelK基因重组腺病毒并在AD-293细胞中包装扩增。方法:PCR扩增dSelK目的片段连接到穿梭载体pShuttle-CMV上, 用电转化法将线性化的pShuttle-CMV-dSelK穿梭载体转入含腺病毒骨架质粒AdEasy1的BJ5183大肠杆菌电感受态细胞中, 构建重组腺病毒载体AdEasy-dSelK, 线性化后转染AD-293细胞进行包装, 并传代扩增, TCID50法测病毒滴度, Western blot鉴定。结果:成功构建腺病毒载体AdEasy-dSelK, 经AD-293细胞包装扩增得到重组腺病毒, 滴度为107.5。Western blot鉴定AdEasy-dSelK成功表达。结论:成功构建重组腺病毒载体pAdEasy-dSelK, 为硒蛋白功能研究奠定基础。
关键词：硒蛋白,dSelK,腺病毒,病毒滴度
参考文献
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重组蛋白 第6篇
1 材料与方法
1.1 材料
猪型布鲁氏菌(Brucella suis)S2型减毒活菌疫苗:包头市防疫站购买并由实验室低温保存,其他常规基因克隆和表达菌株由作者实验室低温保存。
1.2 方法
1.2.1 菌株活化
在无菌条件下,按照1:100的比例,将低温保存的S2减毒活菌疫苗转接于牛肉汤液体培养基中,37 ℃条件下170 r/min摇床中震荡培养72 h;之后,离心分离菌液获得菌体,用于基因组DNA的提取[2]。
1.2.2 引物设计与目的片段的PCR扩增
根据NCBI网络数据库提供的关于猪型布鲁氏菌的bls全基因序列,我们设计了一对用于bls基因表达片段扩增的引物(F:CCG GAA TTC ATG AAC CAA AGC TGT CCG AAC,R:CCG CTC GAG TCA GAC AAG CGC GGC GAT GC,酶切位点分别为EcoRⅠ和XhoⅠ),以事先提取的基因组DNA作为模板进行目的片段的扩增。
1.2.3 大肠杆菌pET-28a(+)质粒载体的获得
将含有pET-28a(+)空质粒的大肠杆菌接种在LB液体培养基中,过夜37 ℃条件下震荡培养;次日,离心分离菌体并用于质粒提取[3]。
1.2.4 重组表达载体的构建
将目的基因DNA片段和pET-28a(+)质粒分别经EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切后,在16℃条件下过夜连接;次日,采用“热激法”转化克隆菌株DH5α。经菌落PCR鉴定后,选择阳性克隆菌进行液体培养;次日,提取DNA质粒进行验证[4]。
1.2.5 诱导表达与电泳检测
利用“热激法”,将pET-28a-bls重组子转化TL129表达性宿主菌株。次日,菌落PCR鉴定后,挑取阳性克隆菌落进行液体培养。之后,筛选到的含有pET-28a-bls重组子的TL129表达性宿主菌株就可以进行IPTG诱导表达,具体表达结果利用SDS-PAGE电泳检测[5]。
2 结果与分析
2.1 目的基因PCR扩增结果
以布鲁氏菌基因组DNA作为模板,利用设计的目的基因表达片段扩增引物F和R进行PCR扩增,得到了目的基因bls的表达片段。琼脂糖凝胶电泳结果显示:PCR扩增得到的目的片段长度与实际长度一致,为477 bp。
M:DNA标准分子量;1,2,3,4:分别为PCR扩增的4个重复样品。
M:DNA standard molecular weight;1,2,3,4:four repeated amplification samples of the PCR reaction.
2.2 转化DH5α后阳性重组子的菌落PCR鉴定
目的基因bls的表达片段与pET-28a(+)质粒载体经过双酶切、过夜连接后,转化克隆菌株DH5α。通过菌落PCR筛选阳性克隆子,电泳结果显示:筛选到3个含有pET-28a-bls阳性重组子的克隆子,而且,目的条带的大小与实际长度477 bp相符合。
2.3 转化TL129后阳性重组子的菌落PCR鉴定
将筛选得到的阳性重组子pET-28a-bls转化表达性宿主菌TL129之后,经过菌落PCR反应筛选含有pET-28a-bls的TL129阳性克隆菌株,电泳结果显示:筛选到2个阳性克隆子,而且,条带大小与bls基因的表达片段的实际477 bp的长度相一致。
2.4 重组蛋白质的诱导表达
将筛选得到的表达性宿主菌利用IPTG进行诱导表达,表达结果利用SDS-PAGE检测。电泳结果显示:经过0.1 mmol的IPTG的诱导,猪型布鲁氏菌的rBLS重组蛋白能够被大肠杆菌正确表达,加上表达载体上需要额外表达的组氨酸标签的大小为5.6 kDa,重组rBLS蛋白的实际大小约为21 kDa;同时,蛋白质凝胶电泳结果与rBLS蛋白的理论预测的分子大小相符。
M:DNA标准分子量;1,2,3,4:分别为菌落PCR反应扩增的4个重复样品。
M: DNA standard molecular weight. 1,2,3,4: four repeated amplification samples of the colony PCR reaction.
M:DNA标准分子量;1,2:分别为菌落PCR反应扩增的2个重复样品。
M:DNA standard molecular weight;1,2:two repeated amplification samples for colony PCR reactions.
M:蛋白质标准分子量;1:IPTG诱导前的菌体蛋白;2:IPTG诱导后的菌体蛋白。
M:protein standard molecular weight;1:total bacterial proteins without IPTG induction;2:total bacterial proteins after IPTG induction.
3 讨论
布鲁氏菌病是一种世界范围内常见的、可以在人畜之间传播的疾病;这种疾病的直接病原细菌就是布鲁氏菌,目前发现,布鲁氏菌存在6个种、20个生物型。不同种的布鲁氏菌的基因型十分保守,部分基因的序列几乎完全一致,这也为研制具有广泛作用的疫苗奠定了基础。目前,从免疫学的抗原决定簇观点出发,针对布鲁氏菌病的相关疫苗研究较多的是布鲁氏菌的外膜蛋白,研究者主要是想通过寻找布鲁氏菌的主要外膜蛋白分子,来揭示布鲁氏菌的主要抗原决定簇的构成,并且,进一步通过构建外膜蛋白缺失菌株或者制备外膜蛋白亚单位疫苗来彻底解决布鲁氏菌病的严重危害[6]。通过研究发现,不同种属的布鲁氏菌的外膜蛋白质分子十分保守,目前发现的这类分子包括Omp10、Omp16、Omp19、Omp25、Omp31等,虽然相关研究结果都证实这类分子是布鲁氏菌的抗原决定簇的主要构成部分,而且,Pasquevich KA等人通过分别构建布鲁氏菌Omp19与Omp10抗原分子的亚单位疫苗进行家畜免疫注射之后,发现布鲁氏菌的Omp19与Omp10分子都能在动物体内引起一定的免疫反应,因此,推测二者应该都是布鲁氏菌的抗原决定簇的主要构成部分,因为二者都具有较好的免疫保护作用,所以在疫苗开发方面具有一定的优势[7]。Jubier-Maurin V等人通过研究Omp25和Omp31分子的免疫学性质之后,发现Omp25和Omp31分子的存在直接影响着布鲁氏菌的毒力,缺少Omp25和Omp31抗原表位分子的基因突变菌株的侵染动物的能力会受较大的影响,从而证明了Omp25和Omp31分子属于布鲁氏菌重要的抗原表位分子[8]。此外,Cassataro J发现Omp31重组分子免疫小鼠之后,可以在小鼠体内激发长期的免疫应答记忆,刺激产生的抗体水平较高,而且,免疫保护效果较好[9]。这些结果都说明了外膜蛋白质分子在布鲁氏菌毒性方面的影响作用,然而,这些分子构建成的亚单位疫苗的免疫刺激强度并不理想,因此,没有在更广阔的范围使用。所以,如何解决外膜蛋白质分子免疫刺激强度低的问题就成为了研究的焦点。
此外,相关研究结果表明:布鲁氏菌内源性的BLS分子在细菌体内并不是单个分子来行驶酶分子的功能,事实上BLS分子合成之后首先会以“五聚体”的聚合形式出现在细胞中,之后又会以“十聚体”的形式聚合在一起来发挥酶分子的功能。这样,在构建蛋白质亚单位疫苗方面,如果能够将布鲁氏菌的抗原表位分子与BLS分子进行融合表达,从而形成融合肽,这样获得的蛋白质亚单位疫苗就非常有可能在免疫家畜之后,在动物体内发挥出更强的免疫刺激能力,产生出水平更高、持续时间更长的抗体。而且,这方面相关的研究工作已经证实:BLS分子与Omp分子融合后能够有效激发并且产生单克隆抗体[10]。因此,本文选择了布鲁氏菌的BLS分子进行研究,通过构建重组表达载体以及诱导表达,我们获得了rBLS重组蛋白,并且,进行了初步的纯化实验,这些实验结果为进一步研究rBLS分子的聚合功能提供了基础。
参考文献
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重组蛋白 第7篇
为了更好的开发药用真菌中的活性物质, 提高药用真菌种质资源的利用率, 本文以FIP-Cve为研究材料, 从巴斯德毕赤酵母p PIC9-fip-cve-m表达系统中诱导表达该蛋白, 并通过一系列纯化鉴定后检测其生物特性及生理活性。
1实验材料
毕赤酵母表达载体p PIC9-fip-cve-m为本实验室保存;MTT试剂盒购自于Sigma公司;其他生化试剂均为国产分析纯。
2实验方法
2.1 重组蛋白的大量诱导表达及鉴定:
取Fip-cve-m酵母菌体密度为0.5OD的菌液, 转接到含有甲醇的诱导培养基BMMY (p H值7.5) 中诱导表达4d。每隔24h加一次甲醇至终浓度为0.8%, 离心收集上清。通过离子交换层析方法纯化后冻干浓缩。SDSPAGE检测。
2.2 MTT法检测FIP-Cve对小鼠He La细胞增殖的抑制作用
将处于对数生长期的hela细胞 (宫颈癌细胞) 用0.25% 胰蛋白酶进行消化, 加入含10% 新生牛血清的DMEM培养液终止消化, 制成细胞悬液, 并计数。将细胞密度调整为3.0×104个/ml, 接种于96 孔板中, 每孔100μl, 在37℃湿度饱和的5% CO2孵箱下培养24h。将96 孔板中的培养液吸去, 向96 孔板中分别加入已配置不同浓度的免疫调节蛋白溶液, 每孔100μl, 每个浓度做3 个复孔, 将其于37℃湿度饱和的5%CO2孵箱下培养48h, 再加入20μl MTT溶液, 于37℃湿度饱和的5% CO2孵箱下培养4h, 小心吸去上清, 然后加入150μl DMSO, 室温下避光震荡10min, 在495nm下测定吸光度值, 观察不同浓度FIP-Cve对hela细胞增殖的抑制作用。
3. 结果与分析
酵母转化子菌液经超声破碎, 离心取上清经Ni亲和层析柱纯化后, 进行10% SDS-PAGE电泳分析, 在约13k Da处出现清晰的目的蛋白条带, 结果显示与预期大小相符, 且蛋白纯度高、杂质少, 测定蛋白总浓度为115.34mg/ml。
由图2 可知, 细胞培养48h后。MTT法证实Fip-cve蛋白对Hela细胞的分裂和增值具有明显的抑制作用。并呈明显的浓度依赖。随之免疫调节蛋白浓度的增加, 抑制率也随之上升。当蛋白浓度到200μg/m L, 抑制率最高达17.3%。通过实验也证明Fip-cve蛋白对小鼠脾淋巴细胞的催分裂效果。具体的条件和实验结果还在进一步的优化当中。
4结论
近年来, 毕赤酵母作为重组蛋白的生产宿主已经获得了广泛的应用。已被认为是最具有发展前景的生产蛋白质的工具之一。与大肠杆菌等原核宿主相比, 毕赤酵母具有很多优点, 如表达效率高, 表达的蛋白活性较高, 不会出现包涵体现象[5]。本研究对毕赤酵母表达的Fipcve重组蛋白进行了提取鉴定及生物活性分析, 这些工作为研究毕赤酵母表达外源基因奠定了技术基础。同时也为工业表达云芝Fip-cve重组蛋白, 以及为开发Fipcve重组蛋白药物奠定了物质和技术基础。
摘要：云芝作为名贵的药用真菌具有抗肿瘤等药理作用, 很多研究表明, 表明云芝免疫调节蛋白 (FIP) 是云芝发挥药理作用的重要药理成分, 天然提取的云芝免疫调节蛋白产量较低。本研究利用基因工程技术从毕赤酵母中提取重组云芝免疫调节蛋白FIP-Cve, 并对其免疫生物活性进行评价, 以期为云芝免疫调节蛋白的后续研究提供有价值的参考。
关键词：云芝,免疫调节蛋白,提取,免疫活性
参考文献
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重组蛋白 第8篇
关键词：骨硬化蛋白,多克隆抗体,Western blotting,系统发生分析
0 引言
人SOST蛋白是骨代谢的主要参与蛋白, 与骨细胞分化、生长及凋亡密切相关[1,2]。研究证实其特异性表达于骨组织中[3,4], 是骨形成的负调节因子[5];为213个氨基酸组成的分泌型蛋白, 包含1个内含子和2个外显子, 并存在2个N端糖基化位点、6个保守的半胱氨酸残基和1个保守的甘氨酸残基[6];其高表达可导致骨质疏松症[7,8], 而缺失或者突变引起骨组织的过度生长, 与骨肥大症和骨硬缩症产生有关[9,10]。因而, 对其研究可揭示骨形成相关疾病的发生机制。
本试验利用分子克隆方法获得人SOST蛋白原核表达菌株;纯化、复性SOST蛋白, 免疫小鼠, 制备小鼠多克隆抗体。为SOST蛋白调控骨形成相关研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
E.coli BL21菌株、E.coli DH5α菌株、p ET-32a质粒, 笔者实验室保存;昆明鼠购于西安交通大学实验动物中心;SOST蛋白基因全序列, 引物由西安沃尔森生物技术有限公司合成。
1.1.2 试剂
Taq酶、限制性内切酶、T4-DNA连接酶、Protein Marker、NDA Marker均为Takara公司产品;质粒提取试剂盒与胶回收试剂盒为上海生物工程公司;IPTG购于美国MP公司;二抗购于Sigma公司。
1.1.3 仪器设备
基因扩增仪、高速离心机、核酸蛋白凝胶图像系统均购于美国伯乐公司;电泳仪产自北京六一;酶标仪产自美国热电公司。
1.1.4 培养基
LB液体培养基:10 g/L蛋白胨, 5 g/L酵母提取物, 10 g/L Na Cl;使用前加入终浓度50μg/m L的氨苄青霉素, 并且加入相对应浓度的葡萄糖。
1.2 方法
1.2.1 重组质粒的构建
根据NCBI公布的人类SOST基因序列, 由西安沃尔森生物技术有限公司合成其全长序列。同时设计SOST基因引物:Primer 1:5′-ACAGGATCCATGCAGCTCCCACTGGCC-3′;Primer 2:5′-ATCCTCGAGCTAGTAGGCGTTCTCCAG-3′, 下划线为限制性内酶位点Bam HⅠ和XhoⅠ。将公司合成的全长SOST基因序列进行PCR扩增:PCR反应缓冲液5μl, 模板DNA 1μl, 10mmol/L d NTP 2μl, 25μmol/L引物各1.5μl, Taq酶0.5μl, 补水至50μl。PCR反应条件为:94℃变性3 min后, 30个循环 (94℃变性30 s, 55℃退火45 s, 72℃延伸60 s) , 最后72℃充分延伸10 min, 4℃保温。0.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR片段大小。将PCR产物与p ET-23a质粒载体双酶切后, 通过T4-连接酶连接, 转化E.coli DH5α克隆菌株, 提取重组质粒进行Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切检测, 并对重组质粒进行测序检测, 最后转化重组质粒入E.coli BL21表达菌株。
1.2.2 重组蛋白的表达检测、纯化与复性
选取经鉴定的重组菌株过夜培养, 以1:100倍转接入新鲜的LB培养基中, 待OD600约0.5时, 加入终浓度0.5 mmol/L IPTG, 37℃诱导培养5 h, 收集菌体, 蛋白电泳检测SOST蛋白表达情况;并利用SDS-PAGE电泳切胶的方法, 对SOST蛋白进行纯化。通过尿素浓度梯度的方法复性蛋白, 主要过程为:将纯化的SOST蛋白溶解于8mol/L尿素溶液, 置透析袋中, 然后放入含6mol/L尿素的50 mmol/L Tris-Cl (p H 7.4) 中, 4℃放置4 h;接着依次为4mol/L、2mol/L、1mol/L、0.5mol/L尿素, 最后置于50 mmol/L Tris-Cl (p H 7.4) 中;离心取上清, 最后取适量用SDS-PAGE电泳检测浓度。
1.2.3 重组蛋白小鼠多克隆抗体制备
选取4~5周龄的昆明鼠, 50μg/只免疫SOST蛋白, 第1次免疫采用弗氏完全佐剂, 之后采用弗氏不完全佐剂, 首次免疫14 d后进行第2次免疫, 7 d后, 进行第3次加强免疫, 免疫7 d后小鼠眼部取血。将血清于4℃冰箱中过夜析出, 离心后取上清, -80℃冰箱中保存备用。
1.2.4 重组蛋白抗体效价与特异性检测
利用ELISA法检测抗血清效价, 主要步骤为:将SOST蛋白溶解至0.05μg/μl, 于96孔板中加入50μl, 37℃孵育1 h;充分洗涤后加入300μl封闭液, 37℃孵育2 h;然后每孔加100μl一抗, 37℃孵育30 min;洗涤后加入100μl二抗 (1:4000倍稀释) , 37℃孵育后充分洗涤, 加入底物A与底物B的混合液100μl, 37℃避光显色10 min, 迅速加入终止液, 最后酶标仪450 nm读数。
采用Western blotting方法检测SOST小鼠抗血清特异性[11], 主要步骤为:将医院手术获得的患病股骨头在液氮下充分研磨, 加入蛋白上样缓冲液, 煮样5min后, SDS-PAGE蛋白电泳, 转NC膜, 与不同稀释度的小鼠抗血清 (对照加入阴性抗血清) 相作用, 洗涤后, 加入二抗孵育, 最后DAB显色, 确定SOST抗血清的特异性。
1.2.5 SOST蛋白序列系统发生分析
根据NCBI数据库已公布的动物SOST氨基酸序列, 利用DNAMAN软件进行同源性分析;采用MEGA5.02软件进行聚类分析, 并采用Neighbour-Joining方法构建系统发生树。
2 结果与分析
2.1 重组载体的构建
将SOST基因PCR扩增获得约650bp左右的片段, 与预期大小一致 (图1-A) 。将从E.coli DH5a克隆菌株中提取的重组质粒双酶切获得约650bp片段, 与目的基因大小一致 (图1-B) ;序列测序结果显示与预测基因序列相同。证明成功构建重组质粒。
2.2 重组菌株的表达检测与蛋白纯化、复性
为检测重组蛋白的表达情况, 将SOST表达菌株经IPTG诱导后, 蛋白电泳获得约44 k Da的蛋白条带, 包含SOST约24k Da, 以及p ET-32a质粒自带的20.4k Da融合蛋白标签, 重组蛋白表达情况与预期大小一致;并利用SDS-PAGE电泳切胶, 以及尿素浓度梯度复性的方法获得SOST蛋白, 如图2所示。
2.3 SOST抗血清效价与特异性检测
A:PCR扩增SOST基因:1, SOST基因;B:Bam HⅠ与XhoⅠ双酶切检测SOST基因重组质粒:1, SOST重组质粒;2, SOST重组质粒Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切。A:SOST gene by PCR;1, SOST gene;B:Identification of SOST gene recombinant plasmid by restriction enzyme analysis of Bam HⅠand XhoⅠ;1, SOST gene recombinant plasmid;2, SOST recombinant plasmid digested by Bam HⅠand XhoⅠ.
M, Protein marker;1, 未诱导菌株;2, IPTG诱导菌株;3, SOST蛋白纯化与复性。M, Protein marker;1, No induce strain;2, IPTG induced strain;3, Purification and renaturation of SOST protein.
小鼠3次免疫后, 获得的SOST蛋白抗血清经ELISA法测定, 发现其抗体效价可以达到1:6 400倍 (图3) 。利用Western-Blotting显色技术, 发现不同稀释度SOST抗血清出现明显条带;而对照阴性抗血清无对应条带 (图4) 。表明SOST抗血清可与SOST蛋白特异性结合, 成功制备SOST蛋白小鼠抗血清。
A1, 1:400倍稀释的抗血清;A2, 1:800倍稀释的抗血清;A3, 1:1 600倍稀释的抗血清;A4, 1:3 200倍稀释的抗血清;A5, 阴性对照 (1:400倍稀释的血清) 。A1, Dilution proportion of antibodies was 1:400;A2, Dilution proportion of antibodies was 1:800;A3, Dilution proportion of antibodies was 1:1600;A4, Dilution proportion of antibodies was 1:3200;A5, Negative control (dilution proportion of antibodies was 1:400) .
2.4 SOST蛋白序列系统发生分析
利用DNAMAN软件, 对选取的9种不同分类层次动物SOST蛋白氨基酸序列进行多重比对。表明SOST蛋白在第二、三环状结构中, 不同物种间存在较高的同源性。此外, 脊椎动物同源性高于无脊椎动物;在脊椎动物中哺乳类动物同源性较高;而哺乳类动物中灵长类同源性更高 (图5) 。采用MEGA软件构建的SOST系统进化树很好的将动物分为5种不同进化层次。其中脊椎动物有哺乳纲、鸟纲、爬行纲和鱼纲, 各自均聚为一类;无脊椎动物囊舌虫 (Saccoglossus kowalevskii) 单独聚为一类。在哺乳纲中, 高级动物灵长类亲缘关系更近, 聚在一起 (图6) 。
3 讨论
SOST蛋白与骨形成相关蛋白和因子存在相互作用关系。其通过抑制BMP活性间接控制骨细胞形成和分化[12];并可与成骨细胞分化的关键转录因子Cbfα1和Osx相互作用, 调节成骨作用[13,14]。此外, SOST蛋白还可作用于MAPK信号通路, 调节骨质的形成[15]。研究还证实SOST蛋白可抑制Wnt/β-链蛋白信号通路, 调节骨量的形成[16,17,18]。然而, 进一步研究SOST蛋白功能, 必须要制备其多克隆抗体。目前, 使用原核表达蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体仍是最常见的手段之一。本试验成功制备SOST蛋白多克隆抗体, 为揭示其功能及骨形成相关疾病的发生机制研究奠定基础。
A, 灵长目;B, 哺乳纲;C, 鸟纲;D, 爬行纲;E, 鱼纲;F, 肠鳃纲 (无脊椎动物) 。A, Primate;B, Mammalia;C, Aves;D, Reptilia;E, Pisces;F, Enteropneusta (Invertebrate) .
重组蛋白 第9篇
2004年、2013年, 我们在华美猪场进行试验, 证明免疫去势术与传统阉割去势术一样, 都能达到去势的效果, 而且能提高肉品质量。但对不同品种猪只是否有促进生长、降低料肉比、达到降低饲养成本作用有待进一步试验。为此, 在2009年, 我们曾在厦门牧兴实业有限公司的白沙伦猪场, 选择该场自主培育的园香黑猪 (母) 进行促生长试验, 取得了满意的结果。2014年我们又选择厦门市同安区银祥集团下属的莲花沃溪猪场的外三元 (杜长大) 白猪进行试验, 以求证该疫苗对白猪有否促进生长的作用。
1 材料和方法
1.1 试验用品
“重组LHRH融合蛋白去势注射液”, 由成都瑞盛高科技有限公司提供。 (生产日期2013.4, 有效期一年) 。
1.2 试验猪
由厦门银祥集团沃溪猪场提供。本次试验猪为杜长大外三元白猪, 共78头, 日龄在3~3.5月之间, 公母比例均等, 其中雄性小公猪均在哺乳期进行睾丸摘除去势, 雌性母猪都末去势。随机按栏分为试验组 (5栏) 57头和对照组 (2栏) 21头。秤取各组猪的重量。
1.3 试验方法
试验组当日每头猪肌肉注射3 m L去势疫苗, 对照组不注射疫苗。两组都喂给相同的本公司自制的全价饲料, 从2013年11月18日开始试验至2014年元月5日结束, 试验期64 d。试验结束时秤取各组试验终重量, 每日登记各组饲料用量和猪只健康状况, 最终计算各组总耗料和各组增重量及各组的料肉比值。
2 结果
2.1 在整个试验期内, 猪只吃食和生长正常, 没发现重大疫病。
试验组猪因为注射了去势苗, 所有母猪都不发情。而对照组猪没有注射去势苗, 一些母猪阴户红肿, 有明显的爬垮其它猪只的发情征状, 有的猪只不明显。
2.2 试验开始时, 试验组57头总重3 445 kg, 每头均重60.44 kg;试验结束时, 57头, 总重6 093 kg, 共耗料8 900 kg, 增重2 648 kg, 每头均重1 0 6. 9 0 kg, 平均每头增重46.56 kg, 料肉比3.36∶1。对照组21头, 试验开始时总重1 292 kg, 每头均重61.52 kg;试验结束时, 21头总重2 200 kg, 共耗料3 350 kg, 增重908 kg, 每头均重1 0 4.7 6 kg, 平均每头增重43.24 kg, 料肉比3.69∶1。
3 小结和讨论
3.1 选择3~3.5月龄、体重相近的杜长大外三元白猪进行‘重组LHRH融合蛋白去势注射液”对猪的促进生长试验, 在64 d试验期内, 生猪生长正常, 肌肉注射去势苗的试验组57头中的雌性母猪都不发情, 整组生猪生长速度较快, 每头平均增重46.46 kg, 料肉比3.36∶1;不注射去势苗的对照组猪2 1 头, 试验期内雌性母猪阴户肿大, 有的还有明显的爬垮其它猪只发情征状, 影响猪的正常饮食, 生长速度较慢, 每头平均增重43.24 kg, 料肉比3. 6 9∶1。每生产1 kg猪肉, 免疫去势组比对照组节省饲料0.33 kg。试验说明, 生猪注射去势疫苗有明显的促进生猪生长的功能, 而且能明显降低料肉比值。如果生猪在30 kg/头 (60日龄) 时注射去势疫苗, 养至100 kg出栏, 则可节约饲料23 kg, 按当下价格3.2元/kg计, 则可节约饲料费用76.6元;扣除去势苗费用10/头, 则每头猪可降低成本6 6. 6 元。
3.2 传统的人工阉割去势, 只能消除LHRH的受体睾丸或卵巢, 使动物不发情, 猪肉无膻味或腥味, 但不能阻断LHRH对动物机体的生长发育的支配 (从小猪—中猪—大猪—老猪) , 当小猪注射了“LHRH”去势苗后, 猪体内不断产生的抗“LHRH”抗体, 会不断的中和猪体内脑垂体分泌的“LHRH抗原”, 使猪体内“LHRH”保持在较低水平, 相当于中猪阶段水平, 这时猪只生长速度最快, 肉质也较好。因此, 不但对小母猪有抑制发情和促进生长作用, 对已阉割的小公猪也同样有促进生长作用。
kg/头
3.3 2013年我们在厦门牧兴实业有限公司, 对园香黑猪清一色的小母猪进行相同的试验, 结果也表明都能使生猪达到去势和促进生长的作用, 但料肉比有一定的差别, 见表2。对单一园香黑猪小母猪试验的料肉比好于对外三元白猪, 主要原因应当是园香黑猪带有60%以上本地士种猪的基因, 表现在发情比白猪明显, 持续时间长, 对猪的采食影响更大;当注射去势苗后, 小母猪不发情, 猪的生长就会更快。
摘要：应用“重组LHRH融合蛋白去势注射液”对三月龄外三元白猪进行免疫注射, 试验期64 d, 试验组猪不发情, 生长速度快, 料肉比3.36∶1, 而对照组猪只有发情, 料肉比3.69∶1, 说明该试剂对猪有去势和明显的促进生长作用。
关键词：生猪养殖,实验
参考文献
[1]黄印尧, 纪思智.LHRH试剂对猪的去势、猪肉品质和血清学的影响.福建畜牧兽医杂志, 2004 (04) :12-13.
[2]黄印尧, 李明星.动物免疫去势 (综述) .福建畜牧兽医杂志, 2013 (04) :15-16.
[3]黄印尧, 全胤飞.酒糟益生菌发酵饲料和LHRH试剂对猪的去势、生长及猪肉品质的影响.福建畜牧兽医杂志, 2013 (06) :26-28.